JPH0260264B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

［産業上の利用分野］ 本発明は生物学的流体試料中の特定成分を定量
する為の多層分析素子に関し、更に詳しくは生物
学的流体試料中のアルブミンを定量する為の多層
分析素子に関する。 ［発明の背景］ 従来、生物学的流体試料中の特定成分を分析す
る方法が多数開発されてきた。特に臨床化学の分
野では種々の分析機器が開発され、多くの病院の
臨床検査室等に導入されている。この中でも、特
公昭53−21677号明細書に開示された多層分析素
子はその操作の簡便性、高い定量性から注目され
ている。 しかしながら、蛋白質、特にアルブミンの定量
においては用いられる蛋白質結合染料のアルブミ
ンに対する結合の特異性が小さい為、共存する他
の蛋白質、例えばグロブリン等の妨害により誤差
を受けやすい事が知られている。 この為、特開昭57−50660号明細書では試薬層
中に上記染料を含有せしめ、試料液中の蛋白質が
展開層に残存し、試薬層中の染料、例えばブロモ
クレゾールグリーンが展開層に移行し、ここで蛋
白質−ブロモクレゾールグリーンとのコンプレツ
クスを形成する。この際、PH及びブロモクレゾー
ルグリーンの移行速度を調節する事で、アルブミ
ンに対する染料の特異性が増大する事が開示され
ている。 又、特開昭58−179359明細書では、光学的に検
出可能な指示薬を担持した蛋白質吸着剤を、蛋白
質を透過させうる非蛋白質性バインダー層中に含
ませて試薬層とする方法が開示されている。 しかしながら、前者の方法はアルブミン以外の
蛋白質との妨害を十分排除しているとはいいがた
く、また、後者は製造面からも種々の困難が生じ
るものである事が明白である。 ［発明の目的］ 本発明の目的は、生物学的流体試料中のアルブ
ミンを、例えばグロブリン等の他の妨害蛋白質の
影響をうける事なく測定し、かつ製造面でも安定
したアルブミン測定用多層分析素子を提供する事
にある。 ［発明の構成］ 本発明の上記目的は、液体不浸透性で、かつ、
光透過性の支持体上に非蛋白質性親水性ポリマー
層及び、多孔性展開層を順次積層して成る多層分
析素子において、所定PH条件下でアルブミンと結
合した時に検知可能な色変化を起こす化合物を、
上記多孔性展開層中に層内及び／又は層間を実質
的に移動しない形で含有させた多層分析素子を用
いることにより達成される。 ［発明の具体的構成］ 本発明において、アルブミンと結合して検知可
能な色変化を起こす化合物（以下、単に本発明に
係る化合物という）とは発色、変色、消色などの
呈色反応をする呈色指示薬及びアルブミンと結合
して蛍光強度、波長等に大きな変化を示す蛍光指
示薬が挙げられる。 呈色指示薬の具体例としては、メチルオレン
ジ、ブロモクレゾールグリーン、ブロモクレゾー
ルパープル、ブロモフエノールブルー、アミドブ
ラツク10B、アシドオレンジＲ、バツフアローブ
ラツク、オレンジＧ、アゾスルフアチアゾール、
２−ｐ−トルイジルナフタレン−６−スルホネー
トなどが挙げられる。 蛍光指示薬としては、例えばエオシンＹ、サフ
ラニンオレンジ、トリニトロベンゼンスルホン
酸、１−アニリノナフタレン−８−スルホン酸、
５−（4′−アルセノアニリノ）−２−クロロ−７−
メトキシアクリジン、フルオレスアミン、チアミ
ン、１−（ジメチルアミノ）ナフタレン−５−ス
ルホニルクロリドなどが挙げられる。 これらのうちで特に好ましく用いられるものと
しては、例えばメチルオレンジ、ブロモクレゾー
ルグリーン、ブロモクレゾールパープル、ブロモ
フエノールブルー等の呈色指示薬が挙げられる。 本発明に係る化合物は多孔性展開層中に実質的
に層内及び／又は層間の移動がない形で含有され
る。 本発明に係る化合物を多孔性展開層中に含有せ
しめる方法としては、例えば特開昭57−197466
（米国特許第4427632号）に開示されたバラバラの
繊維と反応性基を有するポリマーバインダーとか
ら成る多孔性展開層の場合、前記繊維に上記本発
明に係る化合物をあらかじめ含浸させておくか、
又は本発明に係る化合物を微分散させておく方法
が有効である。 この時、本発明に係る化合物は含浸、微分散に
かかわらず、反応性基を有するポリマー、例えば
スチレン−グリシジルメタアクリレート共重合体
によつて不動化される事になる。 又、特公昭53−21677号（米国特許第3992158
号）に開示された非繊維の等方的多孔性層（例え
ばブラツシユポリマー層）の場合、微分散により
本発明に係る化合物を含有させる事が好ましい。 更に、特開昭55−164356に開示されている親水
化処理をした織物の場合、織物に含浸した後、例
えば上記共重合体で不動化の処理を行つて用いる
事が出来る。 しかしながら、これら多孔性展開層の中でも特
開昭57−197466号に開示された展開層は製造上容
易で、しかも含浸と微分散の両方を選択できる事
から有用である。 本発明に係る化合物は多孔性展開層において約
0.1ｇ／m²から約5.0ｇ／m²、好ましくは約0.5ｇ／
m²から約3.0ｇ／m²の範囲で含有される。 更に、上記多孔性展開層の膜厚は約100ミクロ
ンから約350ミクロンの範囲である事が好ましい。 この目的にそつて展開層、非蛋白質性親水性ポ
リマー層、その他の機能層に酸、アルカリ、塩、
緩衝剤、解離剤、界面活性剤等を適宜含有させる
ことができる。 特にアルブミン分析においては、用いる本発明
に係る化合物とアルブミンとの結合反応がPHによ
つて大きく左右する為にその選択にあたつては慎
重に行なわなければならない。 多孔性展開層中のアルブミンとの結合反応のPH
は、用いられる本発明に係る化合物によつて異な
るが、一般に約2.0から約7.0の範囲、好ましくは
PH約3.0から約6.5の範囲である。PHをコントロー
ルするための酸又は緩衝剤は、非蛋白質性親水性
ポリマー層に含有されるが、必要に応じて該親水
性ポリマー層以外の層に含有させる事が出来る。 例えば、本発明に係る化合物がブロモクレゾー
ルグリーンの場合PHは4.0、ブロモクレゾールパ
ープルの場合はPHは5.2が好ましい。 本発明の多層分析素子は支持体上に非蛋白質性
親水性ポリマー層及び本発明に係る化合物を含有
する多孔性展開層が積層されている。 上記非蛋白質性親水性ポリマー層を形成するた
めに用いられる親水性ポリマーとしては、例えば
ポリアクリルアミド、ポリビニルピロリドン、ポ
リビニルアルコール等の合成ホモポリマー及びこ
れらの共重合体、カルボキシメチルセルロース・
ナトリウム塩、ヒドロキシエチルセルロース、メ
チルセルロース等の親水性セルロース誘導体、ア
ガロース、マレイン酸共重合体、ポリアクリル
酸、ポリメタアクリル酸及びその塩、などが挙げ
られる。中でもアクリルアミドのホモポリマー及
びコポリマーが好ましい。 本発明の多層分析素子において非蛋白質性親水
性ポリマー層の膜厚は、一般に約５ミクロンから
約50ミクロン、好ましくは約10ミクロンから約30
ミクロンの範囲にある。 前述のアルブミンの定量にあたつては、PH、イ
オン強度などが重要な因子となるので、これらの
因子を最適条件に設定する事は、良好な分析結果
を得るうえで重要である。 多孔性展開層中のPHをコントロールするために
用いられる酸又は緩衝剤としては、例えば脂肪族
ヒドロキシカルボン酸（例えば、グリコール酸、
乳酸、α−ヒドロキシ酪酸、グリセリン酸、タル
トロン酸、りんご酸、酒石酸、くえん酸）、脂肪
族ジカルボン酸（例えばマロン酸、こはく酸、
３，３−ジメチルグルタル酸、α，α′−ジメチル
グルタル酸）、脂肪族カルボン酸（例えば酢酸、
プロピオン酸、酪酸）、これらの塩と上記酸の組
み合わせによる緩衝剤などが挙げられる。 好ましい酸又は酸とそれ自身の塩とを共に用い
る緩衝剤としては、リンゴ酸、乳酸、コハク酸、
マロン酸、クエン酸、酒石酸等が挙げられる。 本発明の多層分析素子に適用できる液体不浸透
性で光透過性の支持体としては、約200nmから約
900nmの範囲内の波長（１つの波長又は複数の波
長）の電磁輻射線（紫外線、近紫外線、可線光、
又は近赤外線）を少なくとも約40％、好ましくは
少なくとも約65％透過し、且つ液体、例えば水を
実質的に透過させないフイルム状、シート状、薄
板状又は他の形態の支持体であり、具体的には、
セルロースアセテート、セルロースアセテートブ
チレート、セルロースアセテートプロピオネー
ト、ポリエチレンテレフタレート、ポリスチレ
ン、ポリカーボネート等のポリマー及びガラスが
代表的な例として挙げられる。 本発明によれば、上記支持体に前記非蛋白質性
親水性ポリマー層及び多孔性展開層を順次積層し
て、本発明の多層分析素子とされる。この際、支
持体表面と該非蛋白質性親水性ポリマー層との接
着性を改善する為に下引き層を設けるか、又は支
持体表面を化学的処理（例えば酸処理、アルカリ
処理）又は物理化学的処理（例えばコロナ放電処
理、グロー放電処理、紫外線照射処理、火焔処
理）を施す事が出来る。 本発明の多層分析素子の製造にあたつては、例
えばスライドホツパー塗布法、浸積塗布法、カー
テン塗布法等種々の公知の方法を用いる事が出来
る。更に、多孔性展開層が特開昭55−164350号に
開示されているように、親水化処理された織物の
場合、例えば本発明の非蛋白質性親水性ポリマー
層又は同様の素材から成り、該ポリマー層上に積
層された接着層がそれぞれ半乾きの状態の時、又
は親水性ポリマーを水、又は界面活性剤を含む水
で湿潤させておいてから、展開層として用いる多
孔性のシート状、フイルム状、又は膜状の素材を
適当な圧力で上記層上に接着する事が出来る。 更に、本発明の多層分析素子の製造に当つては
各層に各種界面活性剤を添加する事が出来る。用
いることのできる界面活性剤としては、例えばア
ルキルフエノキシポリエトキシエタノール［例え
ばTriton Ｘ−100（ロームアンドハース社）］、ポ
リエチレンオキシドアルキルエステル［例えばエ
マルゲン−120（花王アトラス社）］、アルキルフエ
ノキシグリセリン［例えばサーフアクタント10G
（オリーン社）］が代表的な例として挙げられる。 本発明の多層分析素子には、所望に応じて種々
の機能の層及び層構成をとる事が可能である。例
えば特開昭51−40191（特公昭58−18628）、米国特
許第4110079号、特開昭58−131565等に記載され
ている層及び層構成を任意に選択する事が可能で
ある。 このようにして製造された多層分析素子は、分
析方法に依存して種々の形状にする事が可能であ
る。例えば所望の巾の伸長テープ、シート又はプ
ラスチツクマウントに装着されたスライドを含む
種々の形状にする事が出来る。 本発明の多層分析素子は、多孔性展開層中に本
発明に係る化合物が実質的に移動しない形で含有
されているため、生物学的液体試料中のアルブミ
ンを他の妨害蛋白質の影響をうけることなく測定
できる。 以下に本発明の多層分析素子を実験例及び実施
例をもつて詳細に説明するが、これによつて本発
明が限定されるものではない。 実験例 本発明のアルブミン分析用多層分析素子におい
て、本発明に係る化合物が層内及び／又は層間で
移行しない事の確認を行つた。 本発明の多孔性展開層 (1) キシレン84mlにトリトン（Triton）Ｘ−100ロ
ームアンドハース（Rhom ＆ Hass Co.）3.0
ｇ、スチレン−グリシジルメタアクリレート共重
合体（９：１）45ｇを溶解し、更にブロモクレゾ
ールグリーン0.585ｇを混合し、ガラスビーズを
入れ、サンドスターラーで５時間攪拌を行なつて
分散した後ガーゼでろ過し、分散液をガラスビー
ズからろ別した。この分散液30mlに対し粉末ろ紙
Ｃ（東洋ろ紙(株)300メツシユ以上）を10.5ｇ混合
し、超音波分散を行つた後、厚さ180ミクロンの
下引き済ポリエチレンテレフタレート支持体上に
375ミクロンの間隙を有するドクターブレードを
用いて塗布を行い、膜厚180ミクロン（乾燥時）
の多孔性展開層を形成し、これを乾燥した。 本発明の多孔性展開層 (2) （ブロモクレゾールグリーン含浸繊維の作成） アセトン4.25ml及びキシレン40mlの混合溶媒に
ブロモクレゾールグリーン0.5ｇを加え攪拌溶解
した後、純水４mlを加え攪拌を行ない、ブロモク
レゾールグリーンを水相に移行させる。ここに粉
末ろ紙Ｃ（東洋ろ紙(株)300メツシユ以上を17.4ｇ加
え、混合攪拌した後、静置する。上澄液にブロモ
クレゾールグリーンの着色がなくなつた事を確認
の後、ろ過し乾燥を行なう。 （多孔性展開層の作成） キシレン84mlにトリトン（Triton）Ｘ−100
（ローム＆ハース社）3.0ｇとスチレン−グリシジ
ルメタアクリレート共重合体（９：１）4.5ｇを
溶解した液に、上記ブロモクレゾールグリーン含
浸繊維28.9ｇを加え攪拌を行ないながら超音波を
照射し分散液とした。この分散液を厚さ180ミク
ロンの透明な下引き済ポリエチレンテレフタレー
ト支持体上に375ミクロンの間隙を有するドクタ
ーブレードを用い塗布し、膜厚180ミクロン（乾
燥時）の多孔性展開層を形成し、これを乾燥し
た。 （比較試薬層の作成） 更に比較として、特開昭57−50660号記載の要
素製造に従い、180ミクロンの下引き済ポリエチ
レンテレフタレート支持体上にポリアクリルアミ
ド32.28ｇ／m²、ブロモクレゾールグリーン1.08
ｇ、サーフアクタント10G（オリーンマチエソン
社）0.32ｇ／m²から成る試薬層を作成した。但
し、ポリアクリルアミドが水に溶解しないように
ポリアクリルアミドに対してホルムアルデヒド37
％水溶液を1.0％添加した。 ３種のフイルムを各々一定の面積になるように
切り、蒸留水３mlに浸積し各時間毎にｎ＝３で日
立分光光度計220−Ａ型を用い435nmの吸光度を
測定した。結果を表−１に表す。

【表】 上記表−１から、比較の特開昭57−50660号記
載の試薬層はすみやかに層中から呈色指示薬であ
るブロモクレゾールグリーンが移行しているが、
本発明に用いられる多孔性展開層(1)及び(2)は呈色
指示薬である染料が全く移行しない。又、浸積中
に上記フイルムを振とうさせても吸光度の結果に
全く差が認められなかつた事から、ブロモクレゾ
ールグリーンは層間、層内の移行は起こしていな
いものと考えられる。 実施例 １ 本発明のアルブミン分析用多層分析素子とし
て、下記の組成の塗布液を180ミクロンの下引き
済の透明なポリエチレンテレフタレート支持体上
に塗布した。 （非蛋白質性親水性ポリマー層） ポリアクリルアミド10％水溶液35ｇにクエン酸
2.5ｇ、エマルゲン120（花王アトラス社製）50％
水溶液５mlを加え、攪拌溶解した液に水酸化ナト
リウム30％水溶液を加えてPH3.7に調整した後に、
蒸留水で50mlにし、間隙500ミクロンのドクター
ブレードを用いて厚さ180ミクロンの透明な下引
き済ポリエチレンテレフタレート支持体上に塗布
し乾燥した。 （多孔性展開層） 前記、実験例で示した展開層(1)及び(2)の塗布液
を前記で作成した非蛋白質性ポリマー層上に間隙
375ミクロンのドクターブレードを用いて各々膜
厚180ミクロンで（乾燥時）塗布し、乾燥した。
これらを本発明の多層分析素子（）及び（）
とした。 （比較多層分析素子の作成） 特開昭57−50660号の記載に従つて比較多層分
析素子を作成した。 （試薬層） ポリアクリルアミド 32.28ｇ／m² ブロモクレゾールグリーン 1.08ｇ／m² りんご酸 5.4ｇ／m² サーフアクタント10G（オリーン社）
0.32ｇ／m² から成る試薬層。 （展開層） 微結晶性セルロース 53.80ｇ／m² ポリビニルピロリドン 1.35ｇ／m² から成る展開層。 これらの多層分析素子は1.5cm×1.5cmに載断
し、中央に１cmの開孔部を有する2.4cm×2.8cmの
直方形のプラスチツクマウントに装着し、分析ス
ライドとした。 上記の如く作成した本発明の分析素子及び
と比較分析素子とを用意し、検体として人血清ア
ルブミンを2.0、3.5、5.0、6.5、7.5ｇ／dlになる
ように生理食塩水に溶解したもの及び上記のアル
ブミンレベルの標準液に更にヒトグロブリンを５
％含む標準液を用意し、各々の分析素子の多孔性
展開層上に10μの標準液を点着し37℃７分間イ
ンキユベーシヨンを行つた後、支持体側から
545nmで反射濃度を測定した。結果を表−２に示
す。

【表】

【表】 表中のアルブミンのみはアルブミン標準液を滴
下した時の反射濃度、グロブリン含むはアルブミ
ン＋グロブリン５％標準液の時の反射濃度、ズレ
はこの両者の差の百分率を示す。 表−２から明らかなように本発明の多層分析素
子は比較分析素子に比べて著しく妨害蛋白質の影
響を低減させたものである事が判明した。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ 液体不浸透性で、かつ、光透過性の支持体上
   に非蛋白質性親水性ポリマー層及び、多孔性展開
   層を順次積層して成る多層分析素子において、所
   定PH条件下でアルブミンと結合した時に検知可能
   な色変化を起こす化合物を、上記多孔性展開層中
   に層内及び／又は層間を実質的に移動しない形に
   して含有させた事を特徴とするアルブミン測定用
   多層分析素子。