JPS6018010B2 - 媒体に対する試薬の適用およびそのための装置 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、分析用装置もしくは道具およびそれを使用す
る方法に関するものであり、更に詳しくは分子拡散もし
くは親和分離法に使用するための、計られた量の水溶性
もしくは水中分散性の試薬を水分含有の固形媒体に適用
する装置および方法に関する。

試料中に存在する種々な分子種類を、この試料を水分含
有の固形媒体に適用しそして該媒体中への該試料の分子
拡散をひき起こさせることにより「分離および同定する
ために勺各種の分析方法が開発されている。

特に、クロマトグラフィー、および免疫電気泳動法を含
む蝿気泳動が使用されており〜それらは全て水分含有の
固形媒体を通しての試料の拡散差によって種々な分子種
類の分離を行なう。そのような方法においては「試料中
の１種もしくはそれ以上の分子種類に対して相互作用す
る各種の試薬をも、該分子種類の分離または同定の助け
となる分離過程の前、最中〜 または後に、媒体に適用
することができる。これら試薬は「従来〜種々な方法で
媒体中に導入されていた。

或る場合には、それらは媒体を製造するときにその中に
導入されているが、大低の場合それらは必要とされると
きに水分含有固形媒体の表面に、試薬の液状溶液もしく
は分散液を媒体表面に適用しそしてこれを轍燈させるか
或いは固形媒体を適当な液体べヒクル中の試薬の溶液も
しくは分散液の中に浸渡させることによって、適用され
ている。いずれの場合にも「試薬を分散せしめる媒体の
量および位置を正確に測定しかつ制御することは困難か
つ不確定である。また〜 レィ（Ｒｅｙ）等の米国特許
第３６３０９５７号およびシヤーリス（Ｓｈｅｒｅｌｉ
ｓ）の米国特許第３６９４１６３号におけるように上記
のような試薬を固体の耐水性結合剤に分散せしめること
；およびフェアベツク（Ｖｅｒｂｅｃｋ）の米国特許第
３６７２８４５号におけるように試薬含有の団体の水不
落性結合剤を、水分含有のもし〈は水分吸収性のたとえ
ば紙のような媒体と接触させ続けることも提案されてい
る。

しかしながら、耐水性もしくは水不落性の結合剤中にお
ける試薬は水分含有の固形媒体中へ完全に抽出かつ拡散
させることが容易になしえず「媒体中へ導入される量の
制御および測定を実施不可能にする。本発明は、分子拡
散もしくは親和分離法に使用するための、固形の水分含
有媒体中への試薬の正確かつ定量的導入を容易ならしめ
る装置および方法を提供する。

本発明は、薄層媒体、即ち厚さ０．１〜２脇の層の形の
水分含有固形媒体もと結びついて特に有用である。本発
明は、分子拡散もしくは親和分離法に使用するための、
計られた量の水港性もしくは水中分散性試薬を水分含有
固形媒体に適用する装置を提供し、該装置は２０ｑｏに
おいて少なくとも１重量％の程度水に可溶であるフィル
ム形成性の固形有機重合体結合剤および該結合剤フィル
ムに混入された計られた量の該試薬より実質的に成る固
体フィルムであり、該フィルムは該試薬および結合剤を
該媒体中へ完全に拡散させるために該媒体と接触させて
殻鷹するのに適合した寸法および形状を有するへ こと
を特徴としている。

本発明は、また、試料を水分含有固形媒体における分子
拡散分離法にかけそして試料の成分を該媒体中の試薬と
反応させることによる試料の分析方法を提供し、該方法
は上記したような菱暦の一面を核媒体と接触させて設瞳
し、これを議論薬および結合剤が該媒体中に完全に拡散
しうるに足る時間接触させ続けることを特徴とする。

水に可溶である結合剤とは〜 コロイド性溶液もしくは
分散液を生成するような物質ならびに真正溶液を生成す
るようなものを包含することを意図する。

本発明に使用することができる結合剤には、各種の重合
体物質「たとえばデキストラン、水溶性ポリアクリルア
ミド「ポリアクリル酸およびその水溶性金属塩も水溶性
ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール、ポリ
エチレンオキサイド、ボリビニルピロリドン「清澄グア
ャガム〜水溶性カルボキシメチルセルロースふ水溶性ヒ
ドロキシェチルセルロース〜水溶性メチルセルロースも
アルギン「力ラギーナン「キサンタンガム〜殿粉「たと
えば米国特許第２０４？３９８号に記載されているよう
な無水マレィン酸と各種ピニル単量体との水溶性共重合
体〜特に無水マレィン酸とビニルェーテルもしくはビニ
ルェステルとの共重合体またはそれらの対応する塩が包
含されるＱ結合剤と一緒に、通常の湿潤剤または表面活
性剤（分散剤）をも存在せしめて〜結合剤の可捺性を保
ちかつ水中へのその分散ないし溶解を容易ならしめまた
は促進させることができる。

重合体結合剤のフィルムは任意所望の厚さであってもよ
いが、好ましくは０．０１〜２胸である。

紙または水不溶性プラスチックフィルムの形の一時的な
取外し可能な支持体または姿打を施すこともできるが」
そのような支持体または磯打は極めて弱いもし〈は脆い
フィルムに対してのみ重要でありも自己支持性フィルム
の場合には省略することができる。支持体または裏打を
用いる場合、これは透明であることが望ましい。適当な
薮打には、種々の厚さのたとえばポリエステル、ポリス
チレン、酢酸セルロ−ス、ポリアミドなどのようなプラ
スチックから作られたものが包含される。舞打の厚さは
トコストを最少にするため、通常最低に保たれるが、同
時に所望の機械的補強または強度を与えるように保たれ
る。菱打フィルムに対する試薬−結合剤フィルムの結合
の程度は臨界的でない。結合剤フィルムを裏打フィルム
の表面上に溶液もしくは溶融物からその場で形成させる
ならば、通常十分な結合が得られる。重合体結合剤のフ
ィルム中に混入することのできる試薬は如何なる水瀞性
もしくは水中分散性の物質であってもよいが、それらの
うちの多くは分析法に普通に用いられるもの、たとえば
抗体、抗原「酵素「酵素基質、沈降素ブライトナー「着
色剤、沈殿剤、微生物およびノまたはその栄養分、緩衝
剤、塩など、ならびに放射能をラベルしたまたは蛍光性
を有する上記種類の試薬である。

装置中における試薬および水溶性重合体結合剤の相対的
割合は、所望とされかつ選択上もしくは便宜上の事柄で
ある寸法または計量に応じて、広範囲に変えることがで
きる。通常「水溶性重合体結合剤の量がフィルムの約１
０〜９５重量％を占め、試薬が残余部分を占めるような
装置を用いるのが最も便利である。２種もしくはそれ以
上の異なる試薬を互いに混合して用いることもできる。

また、２種もしくはそれ以上の異なる重合体結合剤の混
合物を用いることもできるが、そのような混合物を用い
ても通常利点はない。試薬は種々な方法で重合体結合剤
のフィルム中に混入させることができるが、通常試薬を
重合体結合剤の物質全体にわたってできるだけ均一に分
配させることが重要であるということに留意する。

試薬は、重合体結合剤が溶融した形または樽発性溶媒中
の溶液の形である間に、該蚤合体結合剤と混合すること
ができ、その後に混合物を所望の厚さのフィルムに成形
し、乾燥または冷却してフィルムを固化させる。水落性
重合体結合剤のフィルムは、結合剤の溶液または溶融物
から別途に成形することもできｔその後に適当な液体べ
ヒクル中の試薬の溶液もしくは分散液をフィルムの表面
に施こし、フィルム中に拡散せしめそしてフィルムを乾
燥させることができる。或る場合には「乾燥した微細な
微粒子形の試薬を水溶性重合体結合剤のフィルム表面に
展延させることができ、その後該フィルムを溶融させか
つ再固化させる。フィルムを形成せしめかつノまたはフ
ィルム中に試薬を混入するには通常強制通風乾燥を用い
ることができるが、熱に敏感な物質の場合には真空−ま
たは凍結−乾燥を用いることもできる。本発明袋魔の寸
法は選択しうる事柄でありＬ これは実施される分析法
の性質に応じて定められる。

一般に「フィルムの寸法が約５ミリ平方よりも小さいよ
うな菱鷹を用いることは便利でないが、試薬を媒体の局
部的小区域に留めることを望む特殊の場合にはそれより
小さい袋贋を用いることもでき、また試薬が施こされる
媒体の全藤路表面を覆うほど大きなものを含めて、より
大きな装簿を使用することもでき、これは１６平方イン
チもしくはそれ以上の程度とさえすることができる。フ
ィルムは、環状または有孔を含めて、任意所望の形状と
することができる。本発明の装置は「分子拡散もしくは
親和分離法たとえばクロマトグラフィーおよび亀気泳鰯
特にゲル、膜「細胞状生成物または組織のいずれの形態
であっても薄層の形のもの（即ち最大厚さ２地）に使用
される任意の水分含有固形媒体に対して試薬を施こすの
に使用することができる。

特に重要なものは、アガロース〜寒天、ポリアクルレァ
ミド（溶解を防ぐために架橋させたもの）、または酢酸
セルロースから作られた水和ゲルであり、紙および酢酸
セルロースの膜も重要である。本発明の装置を使用する
場合、試薬含有フィルムの面は単に水分含有固形媒体と
接触させて設置させ、そして試薬および重合体結合剤の
完全な溶解もしくは拡散が起こりかつ試薬および結合剤
が媒体中に拡散するまでその状態に保たせる。この段階
は通常室温で行なわれるがｔｌ℃乃至６０００のその他
温度も用いることができる。水不港性の裏打または支持
体を装置の一部としてフィルムに施こす場合には、これ
を水分含有媒体の表面上に留燈させることができ、或い
は所望に応じてこれを試薬および結合剤の拡散が完了し
たときに取除くこともできる。本綾贋は「 また、試薬
をバクテリャ培養用に使用される培地の中に導入するた
めにも使用することができ、また色素含有装置を組織と
接触せしめて組織染色をする場合にも使用することがで
きる。以下の実施例は本発明の本質を例示する鶴のであ
りへ決して本発明の範囲を制限するものとして作用する
ものではない。

実施例 １ 乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤ日）確認試薬の溶液を市販
の基質一染料（ｓ■ｓｂａｔｅ−ｄｙｅ）および緩衝剤
混合物から製造した。

この溶液１地にもポリエチレングリコール４０００結合
剤の０．５重量％水溶液９地を加えｔそして混合物を磯
拝した。次いで「この混合溶液５私をも商品名ｒクロナ
ール（Ｃｒｏｎａて）」の下で販売されている水不港鰹
かつ親水性のポリエチレンテレフタレートの３１〆傘×
４インチの大きさの翼打または支持ブイ小ム上に一様に
導き「 そして強制通風オーブン中で４８鰭にて急速に
乾燥せしめ〜麹打上に厚さ約０．０２棚の結合剤−ＬＤ
Ｈフィルムを形成せしめた。通常の水和アガロース電気
泳鰯媒体（クロナ−ル品フィルムの支持体上における厚
さ１〜８燭の水和アガロースの層）を標準緩衝水溶液で
平衡化せしめ〜人間血清を植えもそして露気泳動にか俊
た。

竜気泳動が完了した後も１８Ｈ−結合剤フィルムを裏打
を外側にしてアガロース媒体上に瞳き、そしてこのサン
ドイッチ状アセンブリを３７Ｇの恒塩器中に１時間置い
た。可視的な紫色の線が媒体中に現われもこれはＬＱＨ
が反応した血清成分の位置を示している。次いでも裏打
フィルムを媒体表面から取外し〜媒体を流水で簡単に洗
い「次いで５重量％酢酸水溶液中に浸漉して、着色した
線を固定させ〜そして乾燥して永久的記録を形成させた
。所望ならば〜調製後の試薬神結合剤フィ小ムはも３ミ
ルのポリエチレン製の袋の中にスれも４〜８００軍こ保
つことにより使用前に糠眼に貯蔵することができる。

実施例 ２ 実施例１におけると同様な種類の試薬−結合剤フィルム
を製造したがトこの場合ポリエチレングリコール４００
０の溶液を裏打フィルム上に別途に蝿きそして乾燥させ
た。

次いでもＬＤＨ可視化溶液（１地）をポリエチレングリ
コール４０００の表面上に一様に分配しもそして乾燥さ
せた。このようにして作った装置を実施例１に記載した
のと同じ方法で使用した。実施例 銭 ポリビニルピロリドン結合剤の０．５％水溶液１０灘に
も山羊において製造した抗人間血清０．４の‘を試薬と
して加え〜そしてこの混合物を轍単に渡洋したＱこれの
５羽を実施例１のようにして３１ゾ４×４インチの麹打
フィルム上に分配し「そして強制通風オーブン中で２５
やにて乾燥せしめ〜裏打フィルム上に厚さ約Ｑ１燭の試
薬一緒合剤フィルムを形成せしめたねこのようにして作
った装置を〜通常のサンプル用ウヱル（ｗｅｌｌ）を与
えた３ｙ４×４インチの平面的な水和アガロ的ス蝿気泳
鰯用フィルム媒体の表面と試薬一緒合剤フィルムとを接
触させて鰹くことにより電気的免疫拡散用に使用した。

室温で３投げ間の後〜麹打フィルムを敗除き「 サンプ
ル用ゥェルから残留液を洗い取り「そして血清の試料を
ウェルの中に入れた。１００ボルトで４接合間電気泳鰯
させた後「試薬と血清成分との相互作用が起こった場所
に所望の可視的なｒロケット一決沈降素模様が現われた
。

実施例 ４ 実施例乳こ記載したようにして作った試薬−結合剤フィ
ルムを「塩化ナトリウムＱ。

８５％およびナトリウムアジド０．０５％を含有する厚
さ１脚の新たに作った水性アガロ岬スゲル媒体であって
そこに直径２欄の２個のウェルが放射状免疫拡散用に瓢
除されているものと、接触させて魔し、た。

室温で３０分後〜裏打フィルムを取除き〜 そして残留
液をウェルから除去した。人間血清試料５舷そをウヱル
中に入れトそしてこのゲル媒体を湿った部屋の中に置い
た８ ２戦時間後〜ゲルはウェルの周囲に所望の沈降素
リングを示しもこれは拡散後にあげる試薬と血清との反
応生成物の位鷹を示している。実施例 ５実施例３およ
び４に記載した方法に対して有用な試薬−結合剤フィル
ムは〜抗血清０．４脇Ｚとポリビニルピロリドン結合剤
のＱ．５％水溶液１０の‘とを混合しも この混合溶液
を凍結乾燥させ〜そしてこの凍結乾燥した固体を湿潤ポ
リビニルピロリドンフィルムの滋層もしくさまその他接
触接着剤のいずれかのプラスチック製裏打の上に展延さ
せることによっても〜作ることができた。

実施例 総実施例３母 ４および５におけると同じ手順
にしたがったが、この場合結合剤フィルム中の試薬とし
ては抗原貝０ち正常の人間血清を使用しそして試験試料
としては抗体を使用した。

実施例 ７ 実施例３と同じ手順を使用したが、この場合ポリビニル
ピロリドン結合剤の代りにそれぞれボリビニルアルコー
ル、ポリエチレンオキサイド、ポリエチレングリコール
２０，０００ ポリアクリルアミド（水溶液）、アルギ
ン酸ナトリウム、メチルセルロース、清澄化グァャガム
、水溶性ヒドロキシェチルセルロース、キサンタンガム
、可溶性殿粉およびデキストランを結合剤として使用し
た。

更に、裏打フィルムの代りに「ポリビニリデンクロライ
ド（サラン−ラップ）、ポリカーポネ−ト「 ポリメチ
ルメタクリレートおよび酢酸セルロースのフィルムを使
用し、これらは全て水不落性であった。試薬−結合剤の
自己支持性フィルムは、裏打としてポリテトラフルオロ
ェチレンフィルム（テフロン）を用い次いで乾燥した試
薬−結合剤フィルムを使用前に髪打からはがすことによ
って、上記混合物から製造した。実施例 ８ リポプロティン用色素フアツト。

レッド７Ｂ（シグマ）０．２夕の量をポリエチレングリ
コール４００の０．２私中に溶解し「そしてこの混合物
を十分に燈拝しながら熔融ポリエチレングリコール４０
００の２２中に入れ、次いでこの混合物を親水性ポリエ
チレンテレフタレートの３１′４×４インチの裏打フィ
ルム上に急速かつ一様に展延させ「そして硬化させた。
この試薬一結合剤表面を、予め血清蛋白が露気泳動にか
けられている水和アガロースのゲル媒体の表面と接触さ
せて置くことにより、その他の変化を行なわずにトフイ
ルムを使用した。室温で１０分間接触させた後、繁打フ
ィルムを取除くと、反応したりポプロテインの帯が媒体
中に見えた。別の具体例において〜試薬一結合剤混合物
に、非イオン性表面活性剤、即ちトリトン（Ｔｒｉｔｏ
ｎ）×−１００の商品名の下で販売されているオクチル
フエノキシボリエトキシ（９〜１０）エタノール〜００
１２を加えた。

このようにして作った試薬−結合剤フィルムはアガロー
スゲル媒体中への一層急速な拡散を示した。実施例 ９ ０．雌イオン強度の餌８．２のバルビタール緩衝液およ
びポリエチレングリコール４００Ｍ吉合剤の１％水溶液
の各同容量を混合し、この混合物５の‘を４ミルの親水
性ポリエチレンテレフタレート裏打フィルムの表面上に
注ぎ、そして強制通風オーブン中で４０ｑｏにて乾燥さ
せた。

得られた厚さ約０．５職の試薬−結合剤フィルムを厚さ
約２脇の水和ァガロースゲルフィルム媒体の表面と接触
させて置き、燦体から離れた試薬−結合剤フィルムの側
に姿打フィルムを残しておいた。室温で１０分間の後、
姿打フィルムを取除き、かくして蟹気泳敷過程に先立っ
て試験試料を受入れるためのゲル媒体が準備できた。実
施例 １０ デキストラン・サルフエート瓢ちリポプロテイン用の特
異的沈殿剤を、試薬−結合剤フィルム中に混入させたと
きのま）使用することができる。

デキストランサルフェート試薬約０．５夕を水１必中に
溶解し、予め調製かつ乾燥した厚さ約０．２５帆のポリ
エチレングリコール４００増葺合剤フィルムの表面上に
一様に展延し、次いで強制遺風オーブン中で４０ｑｏに
て乾燥させた。親水性ポリエチレンテレフタレートフィ
ルムの裏打上に支持された厚さ約１肋の通常の水和ァガ
ロースゲル媒体において、人間血清試料を電気泳鱗にか
けた。

蟹気泳動が完了した後「試薬−結合剤フィルムの表面を
ゲル媒体と接触させて置きｔそしてこの状態に室温で１
５分間保ち、その後に媒体の表面を水洗した。リボブロ
ティンとデキストランサルフェートとの沈殿した反応生
成物の白色帯が媒体中に見え、その測定によりリポプロ
ティンの量の決定が可能であった。実施例 １１ ０．８５％食塩溶液中の１：５アルファ・０アンチトリ
プシン。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 試料を水分含有固形媒体において分子拡散分離操作
   にかけそして試料中の成分を該媒体中の試薬と反応させ
   ることによつて試料を分析する方法において、２０℃で
   少なくとも１重量％程度水に可溶であるフイルム形成性
   の固体有機重合体結合剤の固形フイルムに計られた量の
   水溶性又は水分散性試薬を混入したものを準備し、前記
   フイルムの一面を前記水分含有固形媒体と接触させて設
   置し、そしてこれを該試薬と結合剤とが該媒体中に完全
   に拡散するに足る時間接触させ続ける、ことを特徴とす
   る試料分析法。 ２ フイルムがその他面に結合された水不溶性合成プラ
   スチツクの支持用裏打を有する、特許請求の範囲第１項
   記載の方法。 ３ 拡散が完了した後に支持用裏打を取除くという工程
   を更に含む、特許請求の範囲第１項記載の方法。 ４ ２０℃で少なくとも１重量％程度水に可溶であるフ
   イルム形成性の固形有機重合体結合剤と、該結合剤フイ
   ルムに混入された計られた量の試薬とから実質的に成る
   固形フイルムより成り、該フイルムは該試薬および結合
   剤を媒体中に完全に拡散させるために該媒体と接触させ
   て設置するのに適合した寸法および形状を有することを
   特徴とする、分子拡散もしくは親和分離操作に使用する
   ための、計られた量の水溶性もしくは水中分散性の試薬
   を水分含有の固形媒体に適用する装置。 ５ フイルムの一面に結合された水不溶性合成プラスチ
   ツクの支持用裏打を含む、特許請求の範囲第４項記載の
   装置。 ６ 結合剤がデキストラン、ポリアクリルアミド、ポリ
   アクリル酸、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリ
   コール、ポリエチレンオキサイド、ポリビニルピロリド
   ン、グアヤガム、カルボキシメチルセルロース、ヒドロ
   キシエチルセルロース、メチルセルロース、アルギン、
   カラギーナン、キサンタンガム、殿粉、および無水マレ
   イン酸とビニル単量体との共重合体より成る群から選択
   される、特許請求の範囲第４項記載の装置。