JPH0148759B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、動物細胞による生理活性物質の製造
法に関する。本発明は、抗癌剤として有用なイン
ターフエロンの細胞培養などに応用できるので医
薬品産業に有用である。 従来技術 無血清培地を用いる動物細胞の培養法としては
下記文献に記載の方法が知られている。 ジヤーナル・オブ・ジエネラル・ヴイロロジイ
（J.gen.Virol.）44，227−229（1979）によると、
RPMI−1640を基礎培地とし、１％（ｗ／ｖ）牛
血清アルブミン、0.25％メチルセルロース、0.75
％プリマトンRL（蛋白分解物）などを加えた無血
清培地の記載がある。ジヤーナル・オブ・テイツ
シユ・カルチヤー・メソツヅ（J.Tissue Culture
Methods）８ (4)，167〜171（1983）によると、
同上基礎培地に3μg／mlインスリン、5μg／mlト
ランスフエリンを蛋白成分とする無血清培地の記
載がある。 本発明のようにヒト細胞由来物質を用いる無血
清培地については知られていない。 発明の解決課題および解決手段 動物細胞を培養して生理活性物質を生産する方
法においては、従来培地中に血清を存在させて培
養するのが通常である。血清の存在は必須で、血
清の種類、ロツト差が細胞収量や物質生産に大き
な影響を与える。従つて血清を含まない培地の開
発が望まれている。 本発明者は、血清を含まない培地の研究を行つ
た結果、骨髄性白血病細胞株K562−T1が生産す
る新規蛋白性物質を血清の代りに培地に添加する
ことによつて動物細胞を効率よく培養し、生理活
性物質の生産を行うことができることを見出し、
本発明を完成した。 発明の構成 本発明は、骨髄性白血病細胞株K562−T1が生
産する蛋白性物質を含有する培地に動物由来細胞
を培養し、培養物中に生理活性物質を蓄積させ、
該培養物から該生理活性物質を採取することを特
徴とする生理活性物質の製造法を提供する。 本発明物質は、下記理化学的性質を有する (1) 分子量：20000±2000 分子量はSDS（Sodium dodecyl sulfate）−ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動法〔新実験化学講
座（20）生物化学（）p118、日本化学会（丸
善社出版）〕によつて測定した。濃縮ゲル３％お
よび分離ゲル16％のアクリルアミド濃度で分析し
た結果、流動サンプル量20μで単一バンドを示
した。 なお、染色には、第一化学薬品社製 銀染色試
薬「第一」を用いた。分子量マーカーとしては、
リゾチーム（MW14400）、大豆トリプシンインヒ
ビター（MW21500）、カーボニツク・アンヒドラ
ーゼ（MW31000）、卵白アルブミン
（MW45000）、牛血清アルブミン（MW66200）お
よびフオスフオリラーゼＢ（MW92500）を用い
た。分子量マーカーはすべてBIO−RAD Lab.社
製。 (2) Ｎ末端側蛋白質一次構造 Met−Gln−Ile−Phe−Val−Lys−Thr−Leu
−Thr−Gly−Lys−Thr−Ile−Thr−Leu−Glu
−Val−Glu−Pro−Ｘ−Asp−Ｘ−ILe−Ｘ−
Asn−Val−Ｘ−Ala−Ｘ−Ile− （Ｘは未同定アミノ酸を示す。） アミノ酸配列は、アプライド・バイオシステム
ズ（Applied Biosystems）社製470A型シーケン
サーおよびスペクトラ・フイジクス（Spectra
Physics）社製 高速液体クロマトグラフイーと
の組合せによつて決定した。 (3) 熱安定性：PH7.3，50℃，30分間の処理に安
定。 本発明物質（凍結乾燥粉末）を培養上清の20倍
濃度となるようにPH7.3のPBS（−）（NaCl ８
ｇ／，KCl 0.2ｇ／，Na₂HPO₄1.15ｇ／，
KH₂PO₄0.2ｇ／）に溶かし、50℃の水浴中で
30分間加温後、リンパ芽球細胞ナマルバ株を用
い、下記方法で細胞増殖促進活性を測定した。 (4) PH安定性：４℃，PH２〜３，24時間の処理に
安定。 K562−T1株の培養上清を分子量カツト3000の
ホロフアイバーで200倍に濃縮し、これを0.1％酢
酸を用い４℃で24時間透析を行い、透析液の細胞
増殖促進活性をリンパ芽球細胞ナマルバ株を用
い、下記方法で測定した。 (5) 等電点：6.5±0.5 等電点電気泳動法は、110mlのLKB8100（LKB
社製スウエーデン）カラムを用い、両性電解質ア
ンホライトの濃度を1.9〜0.625％とし、PH３〜10
の勾配を用いる。４℃に冷却し、900V，10mA
で48時間の泳動を行い、終了後、フラクシヨンコ
レクターにて分画し、各フラクシヨンのPHおよび
活性を測定する。 (6) DNA合成促進活性および細胞増殖促進活性 DNA合成促進活性測定法 被検細胞１〜５×10⁵細胞／mlをRPMI−1640
培地（日水製薬社製）にグルタミン4mM、スト
レプトマイシン25μg／ml、ペニシリン25U／ml、
ヘペス10mM、重曹0.01％および仔牛血清10％を
加えた培地25mlで２日間、37℃で培養した。培養
物を800×ｇ、５分間遠心して細胞を集め、５×
10⁵細胞／mlの濃度となるように、上記培地から
仔牛血清を除いた培地に懸濁し、24穴マルチデイ
ツシユプレートに分注し、37℃で24時間培養後、
新鮮な培地に交換し、37℃、16時間培養した。再
び、新鮮な培地に交換し、試料0.1ml、培地0.9ml
を添加した。37℃，６時間培養後、トリチウムチ
ミジン0.5μCi／穴になるように加え、液体シンチ
レイシヨンカウンターにより、その取込み活性を
測定した。測定値は、２回以上の実験の平均値を
示した。 細胞増殖促進活性 被検細胞株５〜10×10⁵細胞／mlをRPMI−
1640培地（日水製薬社製）にグルタミン4mM、
ストレプトマイシン25μg／ml、ペニシリン25U／
ml、ヘペス10mM、重曹0.01％および仔牛血清10
％を加えた培地75mlで37℃で48時間培養した。培
養物を800×ｇ、５分間遠心して細胞を集め、上
記の培地から血清を除いた培地で洗浄し、24穴マ
ルチデイツシユプレートに分注し、0.9mlの血清
を含まない培地と、0.1mlの試料液を添加した。
37℃、CO₂インキユベーターで３日間培養後、細
胞数を血球計算板を用いて測定した。 接着依存性細胞の場合には、測定する直前に、
0.1％トリプシンを加えて、細胞を浮遊化した後
に測定した。活性は、試料液無添加のものを100
とし、試料添加の場合の細胞数を無添加の場合の
細胞数で割つた値をもつて示した。 以上の測定方法で得られた蛋白性物質の各種細
胞に対するDNA合成促進活性および細胞増殖促
進活性は第１表に示すとおりであつた。第１表中
の細胞は＊印以外はすべてヒト由来細胞である。 【表】 【表】 なしを示す。
本発明物質は、下記のごとく製造することがで
きる。 本発明に用いる蛋白性物質は、ヒト骨髄性白血
病細胞K562−T1株を培地に培養し、培養物中に
蓄積させ、該培養物から採取することによつて製
造することができる。 K562−T1株は、K562株を胎児子牛血清10％を
含有するハムF10培地から順次血清濃度を低下さ
せ、約１年間の馴化期間を経た後、得られた無蛋
白培地馴化細胞である。K562株は、プロシイー
デイング・オブ・ザ・ナシヨナル・アカデミイ・
オブ・サイエンス（Proc.Natl.Acad.Sci.），
USA.，76，1293（1979）、ブラツド（Blood），
45，321（1975）、ガン（GANN），73，97（1982）
などに記載されている公知の細胞株で一般的に入
手可能な細胞株である。 培地としては、ハムF10培地、ハムF12培地
（以上フローラボ社製）、ダルベツコMEM培地、
MEM培地、RPMI−1640培地（以上日水製薬社
製）などの無蛋白培地およびそれらの混合培地が
用いられる。培地には、必要により、グルタミン
0.5〜5mM、抗生物質〔ペニシリン25U／ml、ス
トレプトマイシン25μg／mlなど〕、重曹0.01％な
どを適量加えてもよい。 培養には、種々の培養ビン、シヤーレ、ローラ
ボトル、スピンナーフラスコ、ジヤーフアーメン
ターなどを用いることができる。培地は、通常種
細胞密度５×10⁴×１〜10⁶細胞／mlとし、30〜40
℃、２〜４日間行うと、各細胞密度に応じ、本発
明物質が主に培養液中に生成する。たとえば、１
×10⁵細胞／mlの種細胞密度、37℃、２日間の培
養では、培養液中に300単位／mlの活性物質が生
成する。 培養物からの本発明物質の採取は次のとおり行
う。すなわち、得られた培養液上清を、凍結乾
燥、限外濾過、強酸性イオン交換樹脂などを用い
て濃縮する。溶出には、弱塩基性の緩衝液または
低濃度のアルカリ溶液を用いる。 濃縮液中には、低分子の塩や不純物が多く含ま
れるので、１％酢酸で透析する。これによつて多
くの不純蛋白が沈澱として除かれる。凍結乾燥に
よつて酢酸を除き、さらに濃縮し、粗精製物とす
る。粗精製物を陽イオン交換樹脂に通塔する。活
性物質は陽イオン交換樹脂に弱い相互作用を有す
るのみで吸着せず溶離してくる。この活性画分を
集め、凍結乾燥などで濃縮後、さらにゲル濾過法
により、培地由来の低分子物質を除く。ゲル濾過
剤としては、セフアデツクス類（フアルマシア・
フアイン・ケミカル社製）、バイオゲル類（バイ
オラツド社製）、コントロール・ポア・グラス
（コーニング・グラス・ワークス社製）、トヨパー
ル（東洋曹達社製）などを用いる。 Bio−Gel Ｐ−60などを用いると、活性画分は
ボイドボリウム（Vo）と塩などの低分子物質と
の間に位置する。 上記操作で得られる濃縮物は、さらに高速液体
クロマトグラフイーを行うことによつて単一成分
として精製することができる。 本発明に用いる蛋白性物質の具体的製造法は参
考例１に示す。 本発明方法に用いる動物細胞としては、
Namalva，Luk などのＢ−リンパ球細胞、
CCRF−CEMなどのＴ−リンパ球細胞、K562な
どの非Ｔ非Ｂリンパ球系細胞、KBなどの上皮細
胞、SK−Ly−18，RPMI−8226などのMyeloma
系細胞、HL−60などのMonocyte系細胞などが
あげられる。 本発明方法で製造される生理活性物質としては
インターフエロン−α，−β，−γ、インターロイ
キン−，−，−，TNF、リンホトキシン、
IgGなどのモノクローナル抗体、免疫抑制物質な
ど、動物細胞が生産し得るものであればいかなる
ものも含む。 本発明方法で、動物細胞の培養に用いる培地と
しては、基礎培地としてRPMI−1640，MEM，
DME（以下日水製薬社製）、ハムF10、ハムF12，
GEM（以上フローラボ社製）、DM160，DM170
（以上極東製薬工業社製）など一般に市販されて
いる培地があげられる。 培地には、必要により、グルタミン0.5〜
5mM、ペニシリン10〜50U／ml、ストレプトマ
イシン10〜50μg／ml、重曹0.05〜0.5％、ヘペス
1.0〜50mM、ピルビン酸ソーダ0.5〜50mM、亜
セレン酸10^-6〜10^-8M、ガラクトース0.1〜10
mg／mlなどを適量加えてもよい。 蛋白性物質は１〜1000ng／mlの濃度で培地に
加える。 培養には、種々の培養ビン、シヤーレ、ローラ
ボトル、スピンナーフラスコ、ジヤーフアーメン
ターなどを用いることができる。培養は、通常種
細胞密度５×10⁴〜１×10⁶細胞／mlとし、30〜40
℃、２〜４日間行うと、各細胞密度に応じ、生理
活性物質が主に培養液中に生成する。 培養物からの生理活性物質の採取は次のとおり
行う。すなわち、得られた培養液上清を、凍結乾
燥、限外過、ゲル過、イオン交換樹脂などを
用いて採取する。 本発明の無血清培地は、前記基礎培地に、必要
によりグルタミン0.5〜5mM、ヘペス１〜5mM、
ペニシリン10〜50U／ml、ストレプトマイシン10
〜50mM、重曹0.05〜0.5％、ピルビン酸ソーダ
0.5〜50mM、亜セレン酸10^-6〜10^-8M、ガラクト
ース0.1〜10mg／mlなどを加え、これに骨髄性白
血病細胞が生産する蛋白性物質を5.0％以下好ま
しくは2.0〜0.01％（Ｗ／Ｖ）加えたものである。 実施例 １ RPMI−1640培地（日水製薬社製）を基礎培地
とし、4mMグルタミン、10mMヘペス、25U／
mlペニシリン、25μg／mlストレプトマイシン、
0.01％重曹および参考例１で製造されるLGF−１
１％（ｗ／ｖ）を含む無血清培地10mlに、５×
10⁵個／mlのナマルバ細胞を浮遊させ、25cm²コー
ニング社製培養フラスコで37℃２日間培養した。 培養後、30mlになるように同無血清培地を加え
75cm²コーニング社製培養フラスコで37℃２日間培
養した。培養後、さらに90mlになるように同無血
清培地を加え、250mlスピンナーフラスコ（柴田
ハリオ社製）で37℃２日間培養した。培養後、
500mlとなるように同無血清培地を加え、ソジウ
ムブチレイトを1mM加え、37℃でさらに１日間
培養した。このときの細胞密度は７×10⁵細胞／
mlであつた。 培養物にHVJ（センダイウイルス）50HAU／
mlとなるように加え、37℃で５時間放置してウイ
ルスを吸着させ、次いで28℃で16時間放置してイ
ンターフエロンを誘導した。培養物を5000rpm、
５分間遠心分離し、細胞を分離し、上清500mlを
トレーに入れてUVランプでウイルスを殺菌し
た。 上清中のインターフエロン活性を前記方法で測
定した結果を第２表に示す。 【表】 【表】 実施例 ２ 無血清培地LGF−R1用いて各種細胞の培養を
行つた。各細胞５×10⁵個／mlを24穴マルチタイ
タープレートに分注し、CO₂インキユベータ内で
37℃、３日間培養した。培養液中の細胞数を血球
計算板を用いて測定した。LGF−１無添加培地
を１としたLGF−１各濃度における増殖率を第
３表に示す。 【表】 実施例 ４ 基礎培地に下記物質を混合して無血清培地
LGF−R1とする。 基礎培地RPMI−1640（日水製薬社製） グルタミン 4mM ペニシリン 25U／ml ストレプトマイシン 25μg／ml ヘペス 10mM 重 曹 0.01％ LGF−１ 2.0〜0.01％(W/V) （参考例１で製造）（用途に応じて適宜調整） 実施例 ５ 基礎培地に下記物質を混合して無血清培地
LGF−D1とする。 基礎培地 ダルベツコらのMEM（日水製薬社
製） グルタミン 4mM ペニシリン 15U／ml ストレプトマイシン 15μg／ml 重 曹 0.01％ LGF−１ 2.0〜0.0125％(W/V) （用途に応じて適宜調整） 参考例 １ 骨髄性白血病細胞株K562−T1株を８×10⁵
個／mlの濃度で、８の下記培地を含む20大型
スピンナフラスコに入れ、37℃で３日間培養し
た。培地は、基礎培地として、ハム−F10培地
（フローラボ社製）およびダルベツコらのMEM
培地（日水製薬社製）を３：１の比率で混合した
ものに、ピルビン酸5mM、亜セレン酸1.25×
10^-7M、ガラクトース１mg／ml、グルタミン
4mM、ペニシリン25U／ml、ストレプトマイシ
ン25μg／mlおよび重曹0.01％を加えた無蛋白培地
を用いた。培養物上清120をホローフアイバー
（分子量カツト−3000、アミコン社製）を用い約
100mlに濃縮した。濃縮物約100mlを１％酢酸を用
い、４℃24時間透析した。生じた沈澱物を遠心分
離（12000rpm、10分間）で除き、上清を酢酸除
去のために凍結乾燥し粉末を得た。これを蒸留水
120mlに溶解した。 160ml容量のQAE−Sephadex−A50（フアルマ
シア・フアイン・ケミカル社製）カラムに上記で
得られた溶液を60mlずつ二度に分けて通塔した、
PBS（−）150mlで溶出し、さらに0.1％の酢酸190
mlで溶出し、PBS（−）で溶出した活性画分300
mlを得た。活性回収率は、約8.3％であり、活性
は1.9倍に上昇した。 この活性画分300mlを凍結乾燥し、20mlの蒸留
水に溶解し、Bio−Gel Ｐ−60 400mlを含むカラ
ムにSV5.0で２回に分けて通塔した。PBS（−）
で溶出し、溶出液を６mlずつに分画し、41〜45番
目の画分60mlを得た。活性の回収率は1.7％で、
比活性は13.3倍に上昇した。この活性画分をフア
ルマシア・フアイン・ケミカル社製FPLC（Fast
protein liquid chromatography）Mono Ｓ ５
mlを含むカラムに通塔した。PBS（−）で洗浄
し、０〜0.5M食塩水で溶出した。溶出液を１ml
ずつに分画し、53番目の画分に活性が認められ
た。活性の回収率は0.2％で、比活性は3600倍に
上昇した。本活性物質をLGF−１とよぶ。 上記精製工程の結果は第４表のとおりである。 【表】 発明の効果 本発明は、動物とくにヒト由来の細胞を培養す
るに適した無血清培地を提供する。本発明の無血
清培地はヒト由来の蛋白質を含み異種蛋白の混入
がないのでヒト由来細胞の培養に適しており、培
養物からの有用物質の採取精製にも有利である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 骨髄性白血病細胞株K562−T1が生産し、か
   つ下記理化学的性質を有する蛋白性物質を含有す
   る培地に動物由来細胞を培養し、培養物中に生理
   活性物質を蓄積させ、該培養物から該生理活性物
   質を採取することを特徴とする生理活性物質の製
   造法。 １ 分子量：20000±2000（SDS−PAGE法） ２ Ｎ末端側蛋白質一次構造 Met−Gln−Ile−Phe−Val−Lys−Thr−
   Leu−Thr−Gly−Lys−Thr−Ile−Thr−Leu
   −Glu−Val−Glu−Pro−Ｘ−Asp−Ｘ−Ile−
   Ｘ−Asn−Val−Ｘ−Ala−Ｘ−Ile−（Ｘは未同
   定アミノ酸を示す。） ３ 熱安定性：PH7.3、50℃、30分間の処理に安
   定。 ４ PH安定性：４℃、PH２〜３、24時間の処理に
   安定。 ５ 等電点：6.5±0.5 ６ 下記細胞に対し増殖促進作用を有する。 ヒトＢリンパ球系細胞 ヒトＴリンパ球系細胞 ヒトMyeloma系細胞 ヒトMonocyte系細胞 ヒト非Ｔ非Ｂ系細胞 ７ 下記細胞に対してDNA合成促進作用を有す
   る。 ヒトＢリンパ球系細胞 ヒトＴリンパ球系細胞 ヒトMyeloma系細胞 ヒトMonocyte系細胞 ヒト非Ｔ非Ｂ系細胞 ヒト上皮細胞