JPH0262821B2 - - Google Patents

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JPH0262821B2
JPH0262821B2 JP55035809A JP3580980A JPH0262821B2 JP H0262821 B2 JPH0262821 B2 JP H0262821B2 JP 55035809 A JP55035809 A JP 55035809A JP 3580980 A JP3580980 A JP 3580980A JP H0262821 B2 JPH0262821 B2 JP H0262821B2
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JP
Japan
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iap
acidic protein
carrier
immunosuppressive acidic
antibody
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JP55035809A
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JPS56132563A (en
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Yoshikazu Asakura
Yoshitaka Ito
Juji Myauchi
Takeo Nomura
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Terumo Corp
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Terumo Corp
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    • GPHYSICS
    • G01MEASURING; TESTING
    • G01NINVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids

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  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 技術分野 本発明は、免疫抑制酸性蛋白の検査方法に関す
る。 先行技術 免疫抑制酸性蛋白は、正常人血清中に平均
250μg/ml含まれているが、患者、1部自己免疫
疾病患者等免疫力が低下している患者の血清中に
は400〜2500μg/mlと異常に多く含まれ、免疫能
を抑制する蛋白として各種〔IAP(松田ら,医学
のあゆみ,102巻,P.747昭和52年)α1−アシツド
グリコプロテイン、α1−アンテイトリプシン等〕
同定されている。従つて免疫抑制酸性蛋白の血清
中の量を検査することによつて患者の免疫能をチ
エツクすることができ、治療上の指針となる。従
来の免疫抑制酸性蛋白の検出方法として、例えば
ゲル電気泳動法、免疫電気泳動法、一元放射免疫
拡散法(SRID法)があるが、それぞれ以下の問
題点がある。 従来技術の問題点 ゲル電気泳動法は、免疫抑制酸性蛋白を定量的
に検出できず、又これを判別することが困難であ
るとともに酸性グロブリンやその他の蛋白と泳動
バンドが重なりやすい欠点がある。免疫電気泳動
法は、定量的な検出はある程度可能であるが、泳
動像がはつきりせず、又定量限界値が高いなどの
問題がある。一元放射免疫抑拡散法は、定量的な
検出が可能で定量限界値がいくらか低いなどの利
点はあるが、検出操作に時間がかかるとともに沈
降線が太くなることも多いために測定しにくい。
しかも塞天使用のため商品として保存に気をつけ
る必要があるなどの問題がある。 発明の目的 本発明は上記事情に鑑みてなされたものでその
目的とするところは、免疫抑制酸性蛋白を精度よ
く、短時間で検出でき、しかも商品として安定し
て保持しやすい生体物質検査試薬を用いた検査方
法を提供することにある。 本発明の生体物質検査方法は、検査容器内に、
希釈された免疫抑制酸性蛋白を含む液と抗免疫抑
制酸性蛋白抗体とを入れた後、直径5〜100μで、
比重が1.02〜1.20の有機質又は無機質の着色担体
に免疫抑制酸性蛋白を担持させた生体物質検査試
薬を加えて、該試薬と抗免疫抑制酸性蛋白抗体と
を反応させて上記免疫抑制酸性蛋白の量を検出す
ることを特徴とする。 発明の具体的説明 まず本発明に係る生体物質検査試薬について説
明する。この検査試薬1は、血清中あるいは腹水
中の免疫抑制酸性蛋白(以下IAPと称す)を定量
的に検出するための試薬で、第1図に示すように
担体2にIAP3を担持している。 担体2として有機質又は無機質のものをいずれ
も使用でき、例えば赤血球、プラスチツクビー
ズ、ガラスビーズ等があげられる。ここでプラス
チツクビーズ、ガラスビーズを用いる場合には赤
色等に着色して識別を容易におこなえるようにす
る。プラスチツクビーズとしては、スチレンポリ
マー、アクリルポリマー、ポリカルボン酸、ナイ
ロン等およびそれらの誘導体が適当である。これ
ら担体2は、その直径5〜100μで、比重が1.02〜
1.20である。これは担体2を検査容器4内に入れ
た際に、ここに担持されたIAPが抗免疫抑制酸性
タンパク抗体(以下抗IAP抗体と称す)と有効に
反応し、しかも適度の沈降速度で底部に沈むよう
にするためである。なお赤血球は、その直径7〜
8.5μ、比重が1.090〜1.100で上述した条件を満し
ている。 この担体2に担持するIAP3は、従来公知の方
法例えば癌患者の腹水又は血清の硫安塩析、クロ
マトグラフイー等の処理をおこなうことによつて
得られる。 この担体2にIAPを担持する方法は、従来公知
の方法をそのまま適用できる。 例えば赤血球にIAPを担持するには、グルタル
アルデヒドを加えて撹拌処理した赤血球を、
NaClを含むリン酸緩衝液(PBS)で洗浄した後、
これをPBSに懸濁してタンニン酸溶液を加えて
撹拌し、更にこれをPBSで洗浄後懸濁する。次
いでこのように処理された赤血球とIAP溶液とを
混合、撹拌した後、PBSで洗浄することにより
得られる。 一方ナイロン製の合成樹脂ビーズIAPを担持さ
せる場合は、塩酸で処理したビーズを蒸留水で洗
浄後グルタルアルデヒドを加えて撹拌して、これ
を洗浄する。次いでこのように処理されたビーズ
にIAP溶液を加えて反応させた後PBSで洗浄する
ことにより得られる。 次に上述した生体物質検査試薬1を使用して、
血清中に含まれるIAPを定量的に検出する方法に
ついて述べる。 まず第1図に示すように検査容器4に、所定の
倍率で希釈されたIAP5を含む血清、腹水等の液
6とともに所定量の抗IAP抗体7を入れる。この
検査容器4としてはガラス製試験管、プラスチツ
ク製試験管でもよいが、マイクロプレートが好ま
しい。マイクロプレートはポリスチレン、アクリ
ル等のプラスチツク製のもので、例えば1枚のプ
レートに96個のU底あるいはV底のウエルのある
ものである。 抗IAP抗体7は、従来公知の方法、例えばIAP
を動物に投与して免疫し、その血清を分離する方
法により得られる。 この検査容器4内では、第2図に示すように体
液中のIAP5と抗IAP抗体7とが反応する。 次いで第3図に示すように上記生体物質検査試
薬1を添加する。ここで未反応の抗IAP抗体が存
在している場合、すなわち投入した抗IAP抗体よ
りIAPの量が少ない場合(第3図)は第4図に示
すように検査容器4底面において凝集反応が生じ
て担体2が底面に広がり、この広がりからこれを
検知することができる。一方未反応の抗IAP抗体
が存在していない場合、すなわち投入した抗IAP
抗体よりIAPの量が多いか、あるいは等量の場
合、第5図に示すように担体2に担持したIAPは
凝集反応をおこすことなく検査容器4の底面中央
に集まつて点状に見え、このことからこれを検知
することができる。 本発明においては、IAPを含む血清の希釈倍率
を変えてそれぞれにつき、抗IAP抗体及び生体物
質検査試薬を順に投入することにより、希釈倍率
の低いものでは凝集反応が生じないが、ある希釈
倍率以上とすることにより凝集反応が生じる。従
つて凝集反応が生じ始めたときの希釈倍率を知る
ことにより、もとの血清中に含まれるIAPの濃度
を知ることができる。 発明の具体的効果 上述した生体物質検査試薬を用いた検査方法に
よれば、凝集反応の生じない状態から凝集反応が
生じた状態へ変化した場合の希釈倍率を検知すれ
ばよいので、血清中のIAP濃度をばらつきなく精
度よく検出することができる。 更に担体2をプラスチツクビーズ又はガラスビ
ーズで形成した生体物質検査試薬は、経済的に品
質が劣化することがないので商品として安定し、
保存しやすい。 次に本発明の効果を確認すべくおこなつた以下
の実施例につき説明する。 まず以下の製法により得た担体にIAPを担持し
て本発明に用いる生体物質検査試薬を得た。ここ
でのIAPは松田ら(医学のあゆみ,102巻,P.747
昭和52年)の報告したいわゆる免疫抑制酸性蛋白
とする。 (1) 担体の作製 赤血球及びナイロン製の赤色担体を用いた。 赤血球はひつじの赤血球で、平均径7μ、比重
1.095である。ナイロン製の担体は、蟻酸にナイ
ロン及びフエノールレツドを溶解して均一な溶液
とし、これを高圧スプレーによつて150℃の容器
内へ噴霧し、蟻酸を飛ばし、これを水で洗浄し
た。得らたプラスチツクビーズは、赤色で約15μ
の径を有し、比重は1.10であつた。 (2) IAPの調製 癌患者腹水の60%硫酸アンモニウム塩飽和によ
る上清にさらに硫酸アンモニウム塩を加え、90%
飽和とし、遠心し、沈殿を得る。この沈殿を
0.02M酢酸緩衝液(PH4.0)に溶かし、同緩衝液
で透析し、次に透析内液を同緩衝液で平衡化した
DEAE−セルロースカラム(フアルマシアフアイ
ン・ケミカル社製)にかけ、同緩衝液で洗浄した
のち、0.4M酢酸緩衝液を流す。溶出液を濃縮し
たのち、PBSで平衡化したセフアデツクスG−
100カラム(フアルマシアフアイン・ケミカル社
製)にかけ、溶出された第2のピークを集める。
これを濃縮したものをPH2.5〜6.0のカラム型等電
点電気泳動にかけ、等電点がPH3.0から3.4の画分
を集め、PBSに対し充分に透析し、この透析内
液をIAPとする。 (3) 担体へのIAPの担持 担体が赤血球の場合 5%ひつじ赤血球100mlに2.5%グルタルアルデ
ヒド20ml加えて室温で2時間撹拌する。処理赤血
球を、0.9%NaClを含む0.01Mリン酸緩衝液(PH
7.5:PBS)で洗浄し、PBSに5%になるよう懸
濁し、0.01%タンニン酸溶液を等量加え、37℃で
10分間撹拌する。その後PBSで洗浄後、PBSに
5%になるよう懸濁し、この100mlと0.8%IAP溶
液100mlとを混合し、37℃で1時間撹拌する。反
応後PBSで洗浄してこれを生体物質検査試薬と
した。 担体がナイロン製プラスチツクビーズの場合 プラスチツクビーズを3.5M塩酸中に浸漬し、
45℃で8分間処理する。蒸留水で洗浄後1.25%グ
ルタルアルデヒドを加え、40分間撹拌する。この
ビーズを水で洗浄後、等量の0.2%IAP溶液を加
え、4℃で1晩おく。この後ビーズをPBSで洗
浄して生体物質検査試薬を得た。 次にこのようにして得られた生体物質検査試薬
による検査方法につき説明する。 まず、あらかじめ投入される抗IAP抗体の調製
について示す。 上述した方法で得られたIAPをフロインドの完
全アジユバントとともにウサギ足の筋肉に2週間
間隔で、1回2mgを5回投与し、最終免疫の1週
間後に全血採血する。血清成分をとり、常法によ
つてγ−グロブリン分画を分離する。これを
0.01Mりん酸緩衝液(PH8.0)で平衡化したDEAE
−セロルースカラムにかけ、素通り分画を集め
る。これを濃縮したのちセフアデツクスG−100
ゲルクロマトグラフイーにかけ、最初のピークを
集めて、これを抗IAP抗体とした。 本発明方法では、IAP既知濃度溶液(100μg/
ml,No.1;500μg/ml,No.2)、正常人血清(No.
3〜No.5)、癌患者血清(No.6〜No.8)及び肝癌
患者腹水(No.9)を2%牛胎児血清を含なPBS
で500倍に希釈し、その後適当に希釈したのちそ
れぞれの25μを96穴U底マイクロプレートに入
れる。それに0.03%抗IAP抗体溶液を25μづつ
加え、プレートをよく振とうしたのち0.8%IAP
感作赤血球を25μ加え、さらに振とうしたのち
室温で2時間静置する。その後管底像すなわち凝
集反応の有無を肉眼で観察した。管底像及びそこ
から計算されるIAP値を第1表及び第2表に示
す。なおこの場合担体が赤血球の場合でも、プラ
スチツクビーズの場合でも同様の結果が得られ
た。 これに対し従来のSRID法でNo.1〜No.9のもの
について同様にIAP値を検出した。その結果を第
2表に併記する。
【表】

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 1 検査容器内に、希釈された免疫抑制酸性蛋白
    を含む液と抗免疫抑制酸性蛋白抗体とを入れた
    後、直径5〜100μで、比重が1.02〜1.20の有機質
    又は無機質の着色担体に免疫抑制酸性蛋白を担持
    させた生体物質検査試薬を加えて、該試薬と抗免
    疫抑制酸性蛋白抗体とを反応させて上記免疫抑制
    酸性蛋白の量を検出することを特徴とする生体物
    質検査方法。 2 担体が、赤血球、プラスチツクビーズまたは
    ガラスビースである特許請求の範囲第1項記載の
    生体物質検査方法。
JP3580980A 1980-03-21 1980-03-21 Reagent for testing biological material and use thereof Granted JPS56132563A (en)

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JPH05259752A (ja) * 1992-03-16 1993-10-08 Fujitsu Ltd 光受信機

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