JPH0266440A - 酵素電極及びアルコール濃度測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、高感度で安定的なアルコール濃度測定用酵素
電極及びアルコール濃度測定方法に関するものである。

（従来の技術） 固定化酵素作用電極を用いた計測装置は、簡便性・迅速
性・基質特異性を有する等の特徴を有し、臨床分析・食
品分析・環境計測等の広範な分野において、その応用範
囲を広げつつある。中でも、アンペロメトリックな計測
を行う装置、すなわち酵素反応により起きる電極活性物
質の増減を、定電圧を印加した作用電極からの電流出力
値の変化として捉える形式の装置は、高感度化が容易で
安定性も優れるため各種の電極、装置、方法が開発され
ている。

アンペロメトリックな計測方法の代表例としては、酸素
電極による計測と過酸化水素電極による計測方法がある
。この２種は固定化酵素電極に最もよく用いられている
が、応答速度、Ｓ／Ｎ比の点で過酸化水素電極法（過酸
化水素の生成を検出する方法）が優れている。

アルコール、特にエタノールの計測は、食品・＋ｉｚ＋
発酵・臨床分野等において開発の要望が多く各種の提案
がなされている。しかし、アルコール測定用酵素電極に
用いられるアルコールオキシダーゼは、下記の式に従い
エタノール等の酸化を触媒するが、活性が比較的低いも
のしか得られず、またその安定性も実用上不充分なもの
しか得られていない。

ＲＣＨｚ　ＯＨ＋　Ｏｚ　＝　　ＲＣＨＯ＋　Ｈ２０ｚ
従来、アルコールオキシダーゼの活性が低いため固定化
を行わずに、溶液系の酵素の触媒反応を酸素電極で検出
する方法が提案されている（Ｇ、Ｇ。

Ｇｕｉｌｂａｕｌｔ、　Ｇ、Ｊ、　Ｌｕｂｒａｎｏ；　
Ａｎａｌ、　Ｃｈｉｍ、　Ａｃｔａ、６９、１８９（１
９７４）　）。この報告によると、アルコールオキシダ
ーゼはその反応機構から過酸化水素を生成するはずであ
るにもかかわらず、過酸化水素電極での検出が困難であ
るとされている。そしてこの点に関しては以後詳細な研
究報告がなされた例はない。

その後、アルコールオキシダーゼの固定化方法に工夫が
なされ、固定化酵素電極の利用も報告されるようになっ
た。例えば酵素を失活させないように、架橋剤のグルタ
ルアルデヒドとの反応性が酵素よりも高いポリマーを共
存させ、穏やかな反応により固定化を行う方法、もしく
はｐＨ変化により不溶化するポリマーを用いる方法が提
案されている（特開昭第６０−１７６５８７号、特開昭
第６２−２１５３８７号）。しかしこれらの方法は失活
を防ぐ点では効果があるが、酵素の結合力が弱く、酵素
の漏出が起きる問題があり、まだ充分な対策とは言えな
い。また、本質的にアルコールオキシダーゼの活性、特
に前記の過酸化水素生成活性が低い点（過酸化水素電極
での検出が困難であること）を解決するものではなかっ
た。

（発明が解決しようとする課題） 本発明は、安定かつ強固にアルコールオキシダーゼを固
定化した酵素電極を提供することを目的とし、さらに過
酸化水素を検出する形式のアルコール測定用酵素電極を
高感度で動作させ得る測定方法を提供することを目的と
する。

（課題を解決するための手段） 本発明は、アルコールオキシダーゼと架橋剤を含有する
酵素液を塗布してなる固定化酵素膜又は固定化酵素層を
有する酵素電極において、該酵素液が更に還元型グルタ
チオンを含有することを特徴とする酵素電極である。

また使用するアルコールオキシダーゼがメタノール資化
菌、特にカンディダ属酵母に由来するものを用いると、
熱安定性に優れた電極が得られる。

本発明は、アルコールオキシダーゼを架橋剤、特に多官
能基性アルデヒド、中でもゲルタールアルデヒドを用い
共存結合により固定化を行う酵素電極である。

さらに、ゼラチン、アルブミン等の異種タンパク質の少
なくとも１種を共存させて固定化するごとにより、強固
な固定化酵素膜を得ることが出来る。

また本発明は上記酵素電極を用い、アルコールが酸化さ
れる際に生成する過酸化水素を検出することを特徴とす
るアルコール濃度測定方法である。

アルコールオキシダーゼを架橋剤を用い共有結合により
固定化した酵素電極を使用し生成する過酸化水素を検出
することにより測定を行うにあたり、アジ化ナトリウム
を含む緩衝液中で使用することによって、より高感度な
測定が可能に入る。

（作用） アルコールオキシダーゼは担子菌、酵母等が生産する酵
素であるが、特にメタノール資化酵母のベルオキシソー
ム中に大量に含まれることが知られている。アルコール
オキシダーゼは分子量が３０万を越える比較的大きな酵
素であり、さらに化学共有結合による固定化において、
結合力が弱いことがわかった。この理由は化学共有結合
の形成によく用いられるアルデヒド類と結合するアミン
基が、酵素分子が大きいにもかかわらず分子表面に露出
していないか、あるいは結合に関与できるアミノ基を有
するアミノ酸自体の数が少ないためと思われる。

従って強固な固定化を行うにはアルデヒド類等の架橋剤
濃度を上げる必要がある。ところがこのような対策をと
ると酵素活性が急激に低下し、酵素の失活が起きてしま
う。

この失活をｖｉ止するために、ジチオスレイトール、シ
スティン、還元型グルタチオン等各種添加剤による安定
化を試みたところ、還元型グルタチオンがこの目的に合
致し、しかも固定化酵素膜の強度に優れたものを与える
ことがわかった。還元型グルタチオンにより失活が防げ
る理由は必ずしも明かではないが以下のように推測され
る。アルコールオキシダーゼは、銅や水銀イオンにより
失活する性質を有することから、反応機構に酵素分子内
のチオール基が関与すると思われる。そして、アルデヒ
ド類による架橋反応中にも酵素分子中の活性残基である
チオール基がアルデヒド類となんらかの反応をして失活
する可能性が強い。ところがそれ自体が千オール残基を
有するオリゴペプチドである還元型グルタチオンを共存
させると酵素分子中のチオール基を保護する作用がある
ものと考えられる。

還元型グルタチオンのアルコールオキシダーゼ含有溶液
中への添加量は０．１ｍＭから１０ｍＭの範囲が望まし
い。あまり低濃度では効果が認められず、一方高濃度に
すると固定化を阻害することがわかった。これは還元型
グルタチオン分子中の遊離アミノ基がアルデヒド類と反
応し、有効アルデヒド濃度を下げてしまうためと思われ
る。

アルコールオキシダーゼは、メタノール資化菌、特にカ
ンディダ属酵母由来の酵素が活性の保持特性の点で好ま
しい。アルコールオキシダーゼはメタノール資化酵母の
ペルオキシシーム（マイクロボディー）中に大量に含ま
れる。

アルデヒド類による固定化時に反応速度を上昇させ、強
固な架橋膜を作るため、室温以上の加熱を行うことが望
ましいが、酵素の耐熱性がカンディダ属由来のものでは
特に優れている。担子菌類の酵素では、２５℃以上に加
熱して固定化すると失活する恐れがある。しかしカンデ
ィダ属由来の酵素では４０°Ｃ程度に加熱しても６０分
以下ならば殆ど活性が低下することはない。

架橋剤としては、アルデヒド類が用いられ、ホルムアル
デヒド、グリオキザール、ゲルタールアルデヒド等を例
示出来るが、中でも多官能基性アルデヒド、特にグルタ
ルアルデヒドは活性低下が少ないため、好ましく用いら
れる。アルコールオキシダーゼ含有？８液中のアルデヒ
ド濃度は０．１重量％以上、１．０重世％以下が望まし
く、より望ましくは０．２重量％以上、０．７重量％以
下である。

アルデヒド２９度が低すぎると固定化酵素膜の強度が低
下し、また高すぎると還元型グルタチオンを添加しても
活性低下を充分に防げない。

さらに、架橋剤との反応時にアルコールオキシダーゼ以
外のタンパク質を共存させると、これらのタンパク質が
巨大なアルコールオキシダーゼの間隙に入り、より強固
な固定化酵素膜が形成される。この目的には、比較的低
分子量でアミノ基の多いタンパク質が望ましく、ゼラチ
ン、アルブミン等はこの条件に合致し、かつ価格的にも
安価で好ましい。固定時に加えるタンパク質量は重量比
でアルコールオキシダーゼ量の１０分の１から１０倍程
度が実用上望ましい。

このアルコールオキシダーゼの固定化は白金等の電極上
に直接行っても良いし、過酸化水素を検出する際に妨害
物を除去するために作成された各種選択透過膜上に固定
化してもよい。

このようにして作成した酵素電罹は、酸素の消費を検出
する方法（酸素電極）をとる限り高活性なものが得られ
るが、過酸化水素を検出する場合（過酸化水素電極）に
は必ずしも充分な活性が得られない。本発明者は、この
理由を確かめるため、電極にアルコールではなく過酸化
水素を作用させてみたところ、過酸化水素の検出感度自
体が低いことがわかった。さらに酵素標品自体について
過酸化水素の分解活性を調べると、顕著な過酸化水素分
解活性、すなわちカタラーゼ活性が認められた。これは
、アルコールオキシダーゼ中に精製分離が困難なカタラ
ーゼが混入しているためである。

従って優れた過酸化水素電極を得るためには、カタラー
ゼ活性のみを抑制する必要がある。カタラーゼはシアン
イオンやアザイド等により活性が抑制されるが、シアン
イオンはその毒性から好ましいものではない。

酵素の溶液状態での活性を調べたところ、アジ化ナトリ
ウムを加えた緩衝液中で、カタラーゼ活性は確かに低下
するが、同時にアルコールオキシダーゼ活性も低下して
しまった。カタラーゼおよびアルコールオキシダーゼ活
性の阻害は０．０１ｍＭ程度のアジ化ナトリウムを反応
系に添加することにより観測されはじめ、０．１ｍＭで
アルコールオキシダーゼ活性の５−１０％程度が失われ
た。

ところが共有結合による固定化後の酵素電極においては
、アルコールオキシダーゼの対アザイドイオン耐性の著
しい向上が認められ、アルコールオキシダーゼは殆ど抑
制されないが、カタラーゼ活性は効果的に抑制されるこ
とがわかった。

測定時に用いる緩衝液、たとえば１００ｍＭ、ｐＨ７，
５のリン酸ナトリウム緩衝液に０．１μＭ以上で１ｍＭ
以下のアジ化ナトリウムを添加すると、カタラーゼ活性
のみを抑制することが出来る。アジ化ナトリウム濃度が
低すぎると、カタラーゼ活性を充分抑制できず、高すぎ
るとアルコールオキシダーゼ活性まで阻害されてしまう
。

なお、高濃度、例えば１００ｍＭのアジ化ナトリウムを
含む緩衝液中に固定化酵素電極または固定化酵素膜を浸
漬し、４℃程度で一夜放置後アジ化ナトリウムを含まな
い緩衝液にもどし、さらに室温で５時間程度放置すると
、カタラーゼ活性は失われてアルコールオキシダーゼ活
性は７０％程度回復することがわかった。これもアルコ
ールオキシダーゼが固定化により対アザイド耐性を増し
、カタラーゼは対アザイド耐性があまり変わらないため
と考えられる。この処理方法は、条件のコントロールが
必ずしも容易ではないため、常時低濃度のアジ化ナトリ
ウムを測定系に添加する方法が好ましい。

（実施例） 以下に実施例を示し本発明をより具体的に説明するが、
もちろん本発明はこれのみに限定されるものではない。

なお、％は重量％を表す。

実施例１ （１）電極の作成方法 直径２ｍｍの白金線の側面を熱収縮テフロンで被覆し、
その線の一端をやすりおよび１５００番のエメリー紙で
平滑に仕上げる。この白金線を作用極、１ｃｍ角型白金
板を対極、飽和カロメル電極（以下ＳＣＥと略す）を参
照極として、０．１　Ｍ硫酸中、＋　１．４　Ｖで１０
分間の電解処理を行った。

その後白金線をよく水洗した後、４０　’ｃで１０分間
乾燥し、１０％γ−アミノプロピルトリエトキシシラン
の無水トルエン溶液に１時間浸漬後、洗浄した。このア
ミノシラン化した白金線上に酵素を以下のように固定化
した。

アルコールオキシダーゼ（シグマ社製、Ｃａｎｄｉｄａ
　　ｂｏｉｄｉｎｉｉ由来）５ｍｇ、および牛血清アル
ブミン（シグマ社製、ＦｒａｃｔｉｏｎＶ）５ｍｇを１
００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝ｔ＆　（ｐＨ７，５）１
ｍ／に溶解し、その中に還元型グルタチオンを１ｍＭ、
グルタルアルデヒドを０．５％になるように加える。こ
の混合液を手早く先に用意した白金線上に５μ！のせ、
４０’Ｃで３０分間乾燥硬化する。その後、１００ｍＭ
ＩＪン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７，５）中に保存した
。このようにして白金線上に、固定化酵素層を有する酵
素電極を得た。

（２）測定方法 作成した酵素電極を作用電極、Ｉｃｍ角白金白金板状電
極極とし、参照電極としてＳＣＥを用い、これらをポテ
ンシオスタットに接続した。作用電極に対Ｓ　ＣＥ　Ｏ
，６Ｖの電圧を印加して測定系を構成した。測定に用い
た緩衝液は５０ｍＭの塩化カリウムを含む１００ｍＭリ
ン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７，５）である。測定温度
は３０℃（±０．２℃）とした。マグネチンクスクーラ
ーで溶液を撹拌しながら、系内にエタノールを１ｍＭず
つ添加し電流出力値の増加をレコーダーに記録した。

そして、１〜１０ｍＭのエタノールに対する検量線を作
成し、この検ｆｔ線の勾配からエタノール１ｍＭ当りの
電極の感度をもとめた。同様にして作成した２０本の電
極の感度を測定し、その平均値と標準偏差を第１表に示
した。このような作成方法により得られた電極が安定し
て高感度を示していることがわかる。

比較例１ （１）電極の作成方法 電極を作成する際に還元型グルタチオンを除いた以外は
実施例１と同様に電極を作成した。

（２）測定方法 実施例１と同様に測定を行った。

そして、検ｆｆｉ線の勾配からエタノール１ｆｆＬＭ当
りの電極の感度をもとめた。同様にして作成した２０本
の電極の感度を測定し、その平均値と標準偏差を第１表
に示し実施例１の結果と比較した。

このような作成方法により得られた電極では実施例１に
比べて約３分の１程度の感度しか得られないことがわか
る。以上のように還元型グルタチオン添加の効果が確認
された。

実施例２ （１）電極の作成方法 実施例１と同様に電極を作成した。

（２）測定方法 作成した酵素電極を作用電極、１ｃｍ角白金白金板状電
極極とし、参照電極としてＳＣＥを用いこれらをポテン
シオスタットに接続した。作用電極に対Ｓ　ＣＥ　０．
６　Ｖの電圧を印加して測定系を構成した。測定に用い
た緩衝液は５０ｍＭの塩化カリウムを含む１００ｍＭリ
ン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７，５）である。測定温度
は３０°Ｃ（±０．２’ｃ）とした。マグネチソクスク
ーラーで溶液を撹拌しながら、系内にエタノールを１ｍ
Ｍずつ添加し電流出力値の増加をレコーダーに記録した
。

そして、検量線の勾配からエタノール１ｍＭ当りの電極
の感度をもとめた。次に測定に用いた緩衝液を新しいも
のに交換し５時間撹拌を続けたのち再度測定を行った。

この結果を第２表に示した。

第２表かられかるように、このような作成方法による電
極は感度変動を起こしていない。

実施例３ （１）電極の作成方法 牛血清アルブミンを除き、またアルコールオキシダーゼ
を１０ｍｇ用いた以外は実施例１と同様に電極を作成し
た。

（２）測定方法 実施例２と同様の測定を行った。

検量線の勾配からエタノール１ｍＭ当りの電極の感度を
もとめた。次に測定に用いた緩衝液を新しいものに交換
し５時間撹拌を続けたのち再度測定を行った。この結果
を第２表に示した。第２表かられかるように、このよう
な作成方法による電極は感度の低下を起こした。目視判
定によれば固定化酵素膜の剥離が認められ、アルブミン
等の異種タンパク質が存在しない場合は固定化膜の強度
がやや劣ることがわかる。

第２表 実施例４ （１）電極の作成方法 実施例１と同様に電極を作成した。

（２）測定方法 作成した酵素電極を作用電極、１ｃｍ角白金白金板状電
極極とし、参照電極としてＳＣＥを用いこれらをボテン
シオスタントに接続した。作用電極に対Ｓ　ＣＥ　０．
６　Ｖの電圧を印加して測定系を構成した。測定に用い
た緩衝液は５０ｍＭの塩化カリウムを含む１００ｍＭリ
ン酸ナトリウム緩衝液（ｐ　Ｈ７，５）に１０μＭのア
ジ化ナトリウムを添加したものである。測定温度は３０
°Ｃ（±０．２°Ｃ）とした。マグネチソクスクーラー
で溶液を撹拌しながら、系内にエタノールを１ｍＭずつ
添加し電流出力値の増加をレコーダーに記録した。同様
に既知濃度の過酸化水素を用いて測定を行った。

そして、検量線の勾配からエタノールおよび過酸化水素
１ｍＭ当りの電極の感度をもとめた。別個に作成した２
０本の電極の感度を同様に測定し、その平均値と標準偏
差を第３表に示した。このような測定方法を用いること
によりエタノールに関して、実施例１に比べてさらに５
倍程度の感度が得られることがわかる。さらに以下に述
べる実施例５の結果から過酸化水素に対する感度も向上
していることがわかる。以上のようにアジ化ナトリウム
添加の効果が確認された。

実施例５ （１）電極の作成方法 実施例１と同様に電極を作成した。

（２）測定方法 アジ化ナトリウムを除いた緩衝液を用いた以外は実施例
４と同様の測定を行った。

検量線の勾配からエタノールおよび過酸化水素１ｍＭ当
りの電極の感度をもとめた。この結果を第３表に示した
。明らかにエタノール、過酸化水素共、実施例４に比べ
て感度が低い。これはカタラーゼにより過酸化水素が分
解されるためである。

第３表 （効果） 本発明により、安定にアルコールオキシダーゼを固定化
することが可能となり、優れたアルコール測定用酵素電
極が得られた。さらに本発明により高感度な測定が極め
て容易に実施できた。

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. （１）アルコールオキシダーゼと架橋剤を含有する酵素
   液を塗布してなる固定化酵素膜又は固定化酵素層を有す
   る酵素電極において、該酵素液が更に還元型グルタチオ
   ンを含有することを特徴とする酵素電極。
2. （２）アルコールオキシダーゼがメタノール資化菌に由
   来するものである請求項（１）記載の酵素電極。
3. （３）メタノール資化菌がカンディダ属酵母である請求
   項（２）記載の酵素電極。
4. （４）架橋剤が多官能基性アルデヒドであることを特徴
   とする請求項（１）記載の酵素電極。
5. （５）多官能基性アルデヒドがグルタルアルデヒドであ
   ることを特徴とする請求項（４）記載の酵素電極。
6. （６）酵素液が、更にアルコールオキシダーゼ以外のタ
   ンパク質を含有することを特徴とする請求項（１）記載
   の酵素電極。
7. （７）請求項（１）記載の酵素電極を用い、アルコール
   が酸化される際に生成する過酸化水素を検出することを
   特徴とするアルコール濃度測定方法。
8. （８）酵素電極を、アジ化ナトリウムを含む緩衝液中で
   使用することを特徴とする請求項（７）記載のアルコー
   ル濃度測定方法。
9. （９）緩衝液中のアジ化ナトリウム濃度が０．１μＭ以
   上で１ｍＭ以下であることを特徴とする請求項（８）記
   載のアルコール濃度測定方法。