JPH02668B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

〔産業上の利用分野〕 本発明は全多孔質のスペーサー分子付担体に関
する。更に詳しくは、主として高速アフイニテイ
クロマトグラフイー用充填剤の前駆体として適す
る全多孔質で硬質のスペーサー分子付担体に関す
る。 〔従来の技術〕 生化学の領域で、蛋白質や酵素その他の生体物
質を、それを含む混合物から分離することは重要
な課題の一つであり、過去多大の努力がはらわれ
てきた。 生体物質の分離する方法としては、現在多くの
方法が用いられている。たとえば、(i)溶解度差を
利用する方法、(ii)電荷の差を利用する方法、(iii)分
子の大きさ、あるいは形状の差を利用する方法、
(iv)化学的または物理的親和力の差を利用する方法
などが挙げられる。また生物学的に特異的親和性
を利用して分離、精製、除去する方法は、選択性
が高く汎用されている。特に生物学的親和性を示
す物質（以下、配位分子という）の一方を不溶性
担体に固定化して他方を選択的に分離するアフイ
ニテイクロマトグラフイーは操作性の点から広く
普及している（千畑一郎、土佐哲也、松尾雄志共
著“アフイニテイクロマトグラフイー”講談社参
照）。 従来、アフイニテイクロマトグラフイーに対し
ては、アガロース、セルロース等の天然の不溶性
担体をプロムシアンやエピクロルヒドリン等で活
性化した後、１，６−ジアミノヘキサン等をスペ
ーサー分子として固定化したものが多く用いられ
てきた。特に、アガロースが広く用いられてきた
（たとえば商品名セフアローズ、フアルマシア社、
スウエーデン）。しかし、アガロースは以下のよ
うな欠点を有する。すなわち、アガロースは保持
し得る水の量が極めて多く、湿潤時の強度が不十
分な為に操作上の制約が多い。たとえば、活性
化、固定化等の操作中に破壊されたり、カラムに
充填した場合に目的とする物質を含む液体を高流
速で流すことができない等の欠点を有する。 〔発明が解決しようとする問題点〕 ところで配位子分子を担体に固定化するのは、
共有結合による方法が好ましい。配位子分子は担
体上の活性基と直接、共有結合してもよいし、あ
るいは、スペーサー分子と呼ぶ線状の分子を活性
基に共有結合させた後に、スペーサー分子の末端
に配位子分子を共有結合させてもよい。アフイニ
テイクロマトグラフイーを有効に行なう為には、
スペーサー分子を担体と配位子分子の間に入れる
のが好ましい。この為には配位子分子と共有結合
し得る官能基を末端に有するスペーサー分子の固
定化された、いわゆるスペーサー分子付担体が必
要である。 スペーサー分子付担体は、(i)担体からの距離が
目的とする物質と相互作用するのに十分である位
置に配位子分子を固定化できるように、適当な分
子長を持つスペーサー分子が固定化されているこ
と、(ii)配位子分子を、その生物学的親和性を失な
わずに、担体に固定化されたスペーサー分子の末
端に共有結合できること、(iii)目的によりスペーサ
ー密度を変化させ得ること、(iv)配位子分子を結合
してクロマトグラフイーを行なう場合に、目的と
する物質のみを特異的に吸着するように、担体の
非特異吸着が少ないこと、(v)配位子分子を固定化
する操作の際に、担体が破壊されないこと、(vi)多
孔質であること、(vii)クロマトグラフイーを行なう
場合に、使用する溶媒、変性剤、PHの変化、温度
に耐えること、(viii)保存中に腐敗しないことなどの
特性が望まれる。また、アフイニテイクロマトグ
ラフイーは、配位子分子の固定化された担体をカ
ラムに充填して行なわれることが多い。その場合
には液体を高流速で流せるように十分な機械的強
度が要求される。また、場合によつては凍結乾燥
してエチレンオキサイド滅菌、熱滅菌や放射線滅
菌を行なう必要が生じるので、これらの滅菌によ
つて担体の化学構造が破壊されないことが望まし
い。 ここで、高速液体クロマトグラフイーにアフイ
ニテイクロマトグラフイーの原理を応用した高速
アフイニテイクロマトグラフイーは、目的成分に
特異的な相互作用を利用する為、たとえば、特定
の酵素に着目した臨床検査装置等に有効であると
予想される。 〔問題点を解決するための手段〕 そこで、高速アフイニテイクロマトグラフイー
用充填剤（以下、充填剤という）の前駆体として
用いた場合に、特に有効である担体を開発すべく
鋭意検討の結果、アルコール性水酸基1.0〜14.0
ｍmol／ｇを有し、保持し得る水の量が0.5〜4.0
ｇ／ｇ、比表面積が５〜1000m²／ｇであり、スペ
ーサー分子が共有結合した構造を有する架橋共重
合体よりなるスペーサー分子付担体が好適である
ことを見い出し、本発明をなすに至つた。 本発明のスペーサー分子付担体は、アルコール
性水酸基を1.0〜14.0ｍmol／ｇの範囲で含む。ア
ルコール性水酸基の中ではビニルアルコール単位
に由来する水酸基が好ましい。水酸基をこの範囲
で含むことにより、このスペーサー分子担体から
得られる充填剤は親水性を有し、水中において多
くの水溶性物質に対して疎水的吸着や分配を示さ
ない。水酸基の量は、実用上は1.5〜11.0ｍmol／
ｇの範囲にあるのがよい。 水酸基の量は、水酸基を無水酢酸と反応させて
消費した無水酢酸の量、またはスペーサー分子付
担体の重量変化を測定することにより求めること
ができる。このとき、固定化されたスペーサー分
子末端の官能基も反応する場合は該官能基を保護
した後、上記の方法により求めることができる。
乾燥したスペーサー分子付担体１ｇが１ｍmol／
ｇの無水酢酸と反応したときの水酸基の量を１ｍ
mol／ｇとする。 以下の物性測定においても、測定条件下で固定
化されたスペーサー分子末端の官能基が反応する
場合には、水酸基量の測定のときと同様に該官能
基を保護して測定することにより物性を知ること
ができる。 スペーサー分子付担体に共有結合しているスペ
ーサー分子は、0.001〜3000μmol／ｇ、好ましく
は、0.001〜250μmol／ｇの範囲で存在する。ス
ペーサー分子がこの範囲で結合していることによ
り、高速アフイニテイクロマトグラフイーの目的
に適した充填剤を作ることができる。 固定化されたスペーサー分子の量は、たとえば
スペーサー分子がアミノ酸またはペプチドである
場合には、スペーサー分子付担体を６規定塩酸等
で加水分解した後、上澄中のアミノ酸量をアミノ
酸分析計等で分析するという方法で求められる。
スペーサー分子の末端に、アミノ基やカルボキシ
ル基等の滴定可能な官能基が存在する場合は、簡
便な方法として滴定による方法で求めることがで
きる。 スペーサー分子付担体に固定化されたスペーサ
ー分子は、２つ以上の親水性管能基を持ち、線状
で、かつ強イオン性基を持たないものであること
が好ましい。スペーサー分子の分子長は、スペー
サー分子の末端に固定化される配位子分子と、目
的とする物質とが十分に相互作用し得る長さであ
る必要がある。通常はスペーサー分子の両末端の
官能基の間に、メチレン鎖、アミド結合、エーテ
ル結合などを有し、炭素数１〜10に相当する分子
長の分子よりなる。代表的なスペーサー分子の例
としては、６−アミノヘキサン酸、β−アラニ
ン、１，６−ジアミノヘキサン、ビス（３−アミ
ノプロピル）アミン、グリシン、グリシルグリシ
ン、グリシルグリシルグリシン、スクシンアミド
エチルアミン、スクシンアミドブチルアミン、ア
ミノエタノール、２，2′−ジアミノジエチルエー
テルなどが挙げられる。 スペーサー分子付担体中には、単一種のスペー
サー分子が結合していてもよく、２またはそれ以
上の種類のスペーサー分子が結合していてもよ
い。 本発明のスペーサー分子付担体は架橋共重合体
よりなる。架橋構造は、エピクロルヒドリンやビ
スエポキシ化合物が水酸基と結合して形成する構
造でも良いが、トリアジン環を有する架橋性単量
体単位によつて架橋された構造が好ましい。なか
でも、トリアリルイソシアヌレートやトリアリル
シアヌレート等のトリアジン環を有する架橋性単
量体単位によつて架橋された構造が好ましい。ト
リアジン環を有する架橋性単量体単位とは、次式
(A)、(B)で示される単量体が重合または共重合して
形成する構造を表わす。

【式】

【式】 （ただし、R₁、R₂およびR₃はそれぞれ独立に−
CH₂−CH＝CH₂、−CH₂−Ｃ≡CH又は

〔発明の効果〕

本発明のスペーサー分子付担体は硬質であり、
たとえば高速アフイニテイクロマトグラフイー用
充填剤にして用いた場合、溶離液を高流速で流す
ことができ、迅速分析が可能になる。 また、本発明のスペーサー分子付担体は、広い
PH範囲で安定であり、たとえばシリカゲルを骨格
とする担体では適用できないアルカリ条件下でも
変質がなく安定に使い得るメリツトを有してい
る。 さらに、本発明のスペーサー分子付担体は、多
量の水酸基を有するため、十分な親水性を有し生
体成分等に対し疎水的吸着が少ない利点を有して
いる。 本発明のスペーサー分子付担体上のスペーサー
分子末端の官能基と配位子分子を反応させること
により、あるいは、該官能基の全部または一部を
活性化試薬等により活性化して活性基をスペーサ
ー分子の末端に有するスペーサー分子付担体とし
た後、該活性基と配位子分子を反応させることに
より、配位子分子の固定化された充填剤を得るこ
とができる。配位子分子として、たとえば、酵
素、基質、競争阻害剤、アミノ酸、オリゴペプチ
ド、ポリペプチド、抗原、抗体等を挙げることが
できる。 以上のような特性から、本発明のスペーサー分
子付担体から得られる充填剤を用いると、生体物
質の分離、精製、除去が容易にでき、高速アフイ
ニテイクロマトグラフイーも可能となるため、生
化学分野における寄与が著しく大きい。 以下の実施例において、本発明をさらに詳細に
説明するが、本発明は実施例に何ら限定されるも
のではない。 〔実施例〕 実施例 １ 酢酸ビニル100ｇ、トリアリルイソシアヌレー
ト45.4ｇ、酢酸ｎ−ブチル80ｇ、デカリン40ｇお
よび２，2′−アゾビスイソブチロニトリル3.4ｇ
よりなる均一混合液と、少量のポリビニルアルコ
ールおよびリン酸ナトリウムを溶解した水800ml
とを還流冷却器、窒素導入管、撹拌棒を備えた３
の三つ口フラスコに入れ十分撹拌したのち、65
℃で18時間、さらに75℃で５時間加熱した懸濁重
合を行ない粒状共重合体を得た。次に、過、水
洗、ついでアセトン抽出後、カセイソーダ65ｇを
溶解したメタノール２と共に還流冷却器、窒素
導入管、撹拌棒を備えた５三つ口フラスコ中で
15℃で20時間撹拌して共重合体のケン化反応を行
なつたのち粒子を過、水洗、さらに乾燥した。 該粒子10ｇを500mlのビーカーに入れ、モレキ
ユラーシーブ4Aで乾燥したジオキサン100ml、
１，1′−カルボニルジイミダゾール3.24ｇを加え
て撹拌しつつ室温で15分間反応を行ない、イミダ
ゾリルカルバメート基を活性基として有する活性
化担体とした。該活性化担体は上記の乾燥ジオキ
サンで洗浄したのち、吸引過した。該活性化担
体を、６−アミノヘキサン酸26.2ｇを含む1M炭
酸ナトリウム水溶液（PH10.0）200mlに加え、し
んとうしつつ４℃で25時間反応させることによ
り、スペーサー分子として６−アミノヘキサン酸
を固定化したスペーサー分子付担体を得た。該ス
ペーサー分子付担体の平均粒径は9.0μｍ、水酸基
密度は4.9ｍmol／ｇ・スペーサー分子付担体、
固定化されたスペーサー分子の量は40μmol／
ｇ・スペーサー分子付担体、保水量は1.9ｇ水／
ｇ・スペーサー分子付担体、比表面積は42m²／
ｇ・スペーサー分子付担体であつた。 実施例 ２ 実施例１で得られた粒状共重合体のケン化反応
を行なつたのちの粒子10ｇを500mlのビーカーに
入れ、モレキユラーシーブ4Aで乾燥したアセト
ン100ml、1.1′−カルボニルジイミダゾール4.05ｇ
を加えて撹拌しつつ室温で15分間反応を行ない、
イミダゾリルカルバメート基を活性基として有す
る活性化担体とした。実施例１と同様の方法でス
ペーサー分子として６−アミノヘキサン酸を該活
性化担体と反応させて、６−アミノヘキサン酸が
固定化されたスペーサー分子付担体を得た。固定
化された６−アミノヘキサン酸の量は119μmol／
ｇ・スペーサー分子付担体であつた。 実施例 ３ 実施例１で得られたスペーサー分子付担体を乾
燥させたもの２ｇを50mlビーカーに入れ、さらに
0.2M2−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸水
溶液（PH4.75）15ml、１−エチル−３−（３−ジ
メチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩
0.29ｇを加え、室温で30分間撹拌した。この懸濁
液にｐ−アミノベンツアミジン塩酸塩25.8mgを加
え、PHを4.75に調整したのち、懸濁液を100mlの
三角フラスコに移し、室温で24時間しんとうして
スペーサー分子として６−アミノヘキサン酸、配
位子分子としてｐ−アミノベンツアミジンを有す
る吸着体を得た。得られた吸着体は、水、0.05N
水酸化ナトリウムを含む1M塩化ナトリウム水溶
液、0.05N塩酸を含む1M塩化ナトリウム水溶液、
水の順で洗浄した。洗液を回収してその292nｍ
における吸光度から算出したｐ−アミノベンツア
ミジンの固定化量は乾燥吸着体１ｇ当り13μmol
であつた。 この吸着体を、パイレツクスガラス製カラム
（内径６mm×長さ10cm）に充填し、50ｍＭリン酸
ナトリウムと100ｍＭ塩化ナトリウムを含む水溶
液（PH7.4）を移動相として、室温、流速0.5ml／
minで牛トリブシン0.5μｇを注入したところ、ト
リプシン活性を持つ蛋白質は溶出しなかつた。続
いて移動相を50ｍＭリン酸ナトリウム、100ｍＭ
塩化ナトリウムおよび20ｍM6−アミノヘキサン
酸を含む水溶液（PH7.4）に切りかえると、トリ
プシン活性を持つ２つの蛋白質を主成分とする成
分が溶出した。 なお、移動相送液ポンプとしては、KHU26
１／２（協和精密(株)）、検出器としては、蛋白質の検
出にはRF−530（(株)島津製作所）励起波長285nｍ、
検出波長340nｍ、酵素活性の検出にはFD−110
（日本分光工業(株)）励起波長365nｍ、検出波長
460nｍを用いた。トリプシン活性の検出には合
成基質ｔ−プトキシカルボニル−Ｌ−グルタミル
−Ｌ−リシル−Ｌ−リシン−４−メチルクマリル
−７−アミドがトリプシンにより分解されること
により遊離される７−アミノ−４−メチルクマリ
ンのけい光を利用した。 実施例 ４ 実施例３で充填したカラムに、50ｍＭリン酸ナ
トリウムと100ｍＭ塩化ナトリウムを含む水溶液
（PH7.4）を移動相として、室温、流速0.5ml／min
でヒトプラスミノーゲン（ミドリ十字）10μｇを
高分子量型ウロキナーゼ（ミドリ十字）15Uを用
いて３分間、37℃で活性化した混合物を注入し
た。酵素活性を持たないプラスミノーゲンが素通
り部分に溶出したのみであつたが、続いて移動相
を50ｍＭリン酸ナトリウム、100ｍＭ塩化ナトリ
ウムおよび20ｍM6−アミノヘキサン酸を含む水
溶液（PH7.4）に切りかえると、プラスミン活性
を持つ蛋白質が溶出した。なお、装置、合成基質
等は実施例３と同じものを用いた。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ 重合体重量当り、ビニルアルコール単位に由
   来するアルコール性水酸基1.0〜14.0ｍmol／ｇを
   有し、保持し得る水の量が0.5〜4.0ｇ／ｇへ、比
   表面積が５〜1000m²／ｇであり、２以上の親水性
   官能基を持ち、線状でかつ強イオン性基を持たな
   いスペーサー分子が共有結合した構造を有する、
   トリアジン環を有する架橋性単量体単位により架
   橋された架橋共重合体よりなる高速アフイニテイ
   クロマトグラフイー用充填剤のための全多孔質の
   スペーサー分子付担体。