JPS642358B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

〔産業上の利用分野〕 本発明は、トリプシン類縁酵素および／または
その前駆体の分離方法に関する。さらに詳しく
は、クロマトグラフイーによりトリプシン類縁酵
素および／またはその前駆体を分離する方法にお
いて、全多孔質の吸着体を用いることを特徴とす
る上記分離方法に関する。 トリプシン類縁酵素とは、アルギニンおよびリ
ジン残基のペプチド結合のほかに、エステル結合
に対して特異性を有する加水分解酵素である。上
記の酵素はトリプシン、プラスミン、ウロキナー
ゼ、トロンビン等を含む。 生化学や医学等の領域で上記の酵素および／ま
たはその前駆体を、それを含む混合物から分離分
析することは、重要な課題の一つである。 例えば、トリプシンは膵臓で特異的につくられ
る酵素であるが、膵障害時には血中に逸脱するた
め、血清中トリプシンの測定は膵疾患の診断上大
きな意義を有すると考えられている。 また、プラスミン、ウロキナーゼ、トロンビン
等の血液凝固や線溶に関係する諸酵素およびプラ
スミンの前駆体であるプラスミノーゲンは、例え
ば、いくつかの疾患においては体液中の存在量、
存在状態等を知ることは非常に重要なこととなつ
ている。 〔従来の技術〕 上記酵素および／またはその前駆体を分離する
方法としては、現在多くの方法が用いられてい
る。例えば、(1)溶解度差を利用する方法、(2)電荷
の差を利用する方法、(3)分子の大きさ、あるいは
形状の差を利用する方法、(4)化学的または物理的
親和力の差を利用する方法などが挙げられる。ま
た、生物学的に特異的親和性を利用して分離する
方法は、選択性が高く汎用されている。特にアフ
イニテイを示す物質の一方（以下、配位子分子と
いう）を不溶性担体に固定化して他方を選択的に
分離するアフイニテイクロマトグラフイーは操作
性の点から広く普及している（千畑一郎、土佐哲
也、松尾雄志著“アフイニテイクロマトグラフイ
ー”講談社参照）。 従来、アフイニテイクロマトグラフイー用の不
溶性担体として、特にアガロースが広く用いられ
てきた（例えば、商品名セフアローズ、フアルマ
シア社、スウエーデン）。しかし、アガロースは
以下のような欠点を有する。 〔発明が解決しようとする問題点〕 すなわち、アガロースは保持し得る水の量が極
めて多く湿潤時の強度が不十分なために操作上の
制約が多い。例えば、活性化、固定化等の操作中
に破壊されやすい。 また、例えば、体液中の存在量を知ることによ
り、病態の診断や治療等に役立てるために上記酵
素を分析する場合には、微量の試料量で分析でき
ること、迅速性、簡便性等が要求される。しか
し、従来のアフイニテイクロマトグラフイーで
は、例えば、アガロースを用いた場合は、その強
度が不十分なために、カラムに充填した場合に分
離すべき物質を含む液体を高流速で流すことがで
きない、また分離された成分の検出を溶出と同時
に連続的に行なうことが困難である等の欠点を有
するため迅速性、簡便性に欠けている。 そこで、従来のアフイニテイクロマトグラフイ
ーの上記のような欠点を解消すべく鋭意検討の結
果、主として高速アフイニテイクロマトグラフイ
ーにより上記酵素を迅速、かつ簡便に分離分析す
る方法を開発し、本発明に至つた。 〔問題点を解決するための手段〕 即ち、本発明は、トリプシン類縁酵素を液体ク
ロマトグラフイーにより分離する方法において、
ビニルアルコール単位に由来するアルコール性水
酸基を重合体重量当り、1.0〜14.0ｍmol／ｇの範
囲で有し、かつ、下記一般式（）で表される構
造を有する化合物 Ｘ−Ａ−Ｒ （） （但し、Ｘは

【式】（アミジノ基）又は

【式】（グアニジノ基）又はアミノ基 であり、Ａはフエニル基、シクロヘキシル基又は
炭素数４〜５個の直鎖のアルキル基であり、Ｒは
アミノ基、カルボキシル基、水酸基等の活性水素
を有する求核反応基である。） から誘導される配位子基を、線状分子の両端にあ
る強イオン性基でない親水性官能基が夫々配位子
分子及び活性基と共有結合した構造を有するスペ
ーサーを介して0.001〜3000μmol／ｇの範囲で有
し、重合体重量当り、保持し得る水の量が0.5〜
4.0ｇ／ｇ及び比表面積が５〜1000m²／ｇである
パーマネントポアを有する全多孔質の架橋共重合
体からなる吸着体を固定相として用いることを特
徴とするトリプシン類縁酵素の分離方法に関す
る。 本発明におけるトリプシン類縁酵素には、通常
のトリプシン型式酵素のほかにその前駆体も含ま
れる。通常のトリプシン型式酵素とは、アルギニ
ンおよびリジン残基のペプチド結合のほかに、エ
ステル結合に対して特異性を有する加水分解酵素
のことで、例えば、トリプシン、プラスミン、ウ
ロキナーゼ、トロンビン等が挙げられる。また、
その前駆体とは、生体内で通常のトリプシン型式
酵素になる前の物質で、例えば、トリプシノーゲ
ン、プラスミノーゲン等が挙げられる。 本発明のクロマトグラフイーの固定相には、ア
ルコール性水酸基およびトリプシン類縁酵素に対
して親和性のある配位子基を有する全多孔質の吸
着体が用いられる。吸着体中のアルコール性水酸
基は、吸着体乾燥重量あたり1.0〜14.0ｍmol／ｇ
の範囲で存在する。アルコール性水酸基をこの範
囲で含むことにより、この吸着体からなる充填剤
は親水性を有し、水中において多くの水溶性物質
に対して疎水的吸着や分配を示さない。水酸基の
量は、実用上は1.5〜11.0ｍmol／ｇの範囲にある
のがよい。アルコール性水酸基の中ではビニルア
ルコール単位に由来する水酸基が特に好ましい。 水酸基の量は、水酸基を無水酢酸と反応させて
消費した無水酢酸の量、または吸着体の重量変化
を測定することにより求めることができる。この
時、生体成分吸着用担体上の官能基も反応する場
合は、該官能基を保護した後、上記の方法により
求めることができる。乾燥した吸着体１ｇが１ｍ
molの無水酢酸と反応した時の水酸基の量を１ｍ
mol／ｇとする。 以下の物性測定においても、測定条件下で吸着
体上の官能基が反応する場合には、水酸基量の測
定の時と同様に官能基を保護して測定することに
より物性を知ることができる。 吸着体上の配位子基は、共有結合により固定化
されており、0.001〜3000μmol／ｇ、好ましく
は、0.001〜250μmol／ｇの範囲で存在する。配
位子基がこの範囲で存在することにより、本発明
で用いられる吸着体は高速アフイニテイクロマト
グラフイーに適した充填剤となる。 本発明で用いられる吸着体上の配位子基は、ア
ミジノ基またはグアニジノ基を有する。配位子基
は、トリプシン類縁酵素に対して親和性を有する
ことのほかに、(1)化学的に安定であること、(2)非
特異的相互作用がないか、または少ないことなど
の特性が望まれる。配位子分子は、配位子基のほ
かに、固定化反応に利用できる適当な官能基を持
つことが望まれる。好ましくは、次式で表わされ
る構造を有する化合物であることが望まれる。 Ｘ−Ａ−Ｒ （ただし、Ｘは

【式】（アミジノ基）また は

【式】（グアニジノ基）またはアミ ノ基であり、Ａはフエニル基、シクロヘキシル基
又は炭素数４〜５個の直鎖のアルキル基であり、
Ｒはアミノ基、カルボキシル基、水酸基等の活性
水素を有する求核反応基である。） 具体的な配位子分子の例としては、ｍ−または
ｐ−アミノベンツアミジン、ｍ−またはｐ−アミ
ノフエニルグアニジン、アルギニン、４−アミノ
ブチルグアニジン、trans−４−アミジノメチル
シクロヘキサンカルボン酸、trans−４−グアニ
ジノメチルシクロヘキサンカルボン酸、trans−
４−アミノメチルシクロヘキサンカルボン酸また
はリジンの中から選ばれ、２種以上の組合わせで
もよい。 配位子基は活性基とスペーサーを介して活性基
と共有結合している。活性基とは、配位子分子ま
たはスペーサー分子のアミノ基、カルボキシル
基、水酸基、チオール基等の活性水素を有する求
核反応基と置換および／または付加反応し得る基
を言い、具体的にはイミダゾリルカルバメート
基、イミドカーボネート基、シアネートエステル
基、エポキシ基、カーボネート基、ブロモアセチ
ル基、ハロゲン化トリアジン基等が挙げられ、好
ましくは、イミダゾリルカルバメート基、イミド
カーボネート基、シアネートエステル基およびエ
ポキシ基等であり、特に好ましくはイミダゾリル
カルバメート基である。スペーサーは、線状分子
の両端にある強イオン性基でない親水性官能基
が、それぞれ配位子分子および活性基と共有結合
した構造を有し、配位子基と目的とする物質とが
十分相互作用し得る長さであることが好ましい。
該線状分子はたとえば両末端の親水性官能基の間
に、メチレン鎖、アミド結合、エーテル結合など
を有し、炭素数１〜10に相当する分子長の分子よ
りなる。具体的には、６−アミノヘキサン酸、β
−アラニン、１，６−ジアミノヘキサン、ビス
（３−アミノプロピル）アミン、グリシン、グリ
シルグリシン、グリシルグリシルグリシン、スク
シンアミドエチルアミン、スクシンアミドブチル
アミン、アミノエタノール、２，2′−ジアミノジ
エチルエーテルなどが挙げられる。好ましくは、
６−アミノヘキサン酸、１，６−ジアミノヘキサ
ン、グリシルグリシンなどである。スペーサーは
単一種でもまた二種以上の共存でもよい。 固定化された配位子基およびスペーサーの量は
次のようにして求めることができる。例えば、配
位子分子が紫外および／または可視領域に吸収を
持つ物質である場合には、生体成分吸着用担体を
６規定塩酸等で加水分解した後、上澄の吸光度を
測定することにより固定化された配位子基の量を
求めることができる。この時、例えば、上記の線
状分子がアミノ基を有する物質である場合には、
上記の上澄をアミノ酸分析計等で分析することに
より固定化されたスペーサーの量を求めることが
できる。固定化された配位子基の量を知るための
より簡便な方法として、配位子分子の固定化反応
時に固定化されずに残る配位子分子を回収し、吸
光度測定などから、その量を求めることにより固
定化された配位子基の量を推定する方法も可能で
ある。また、固定化されたスペーサーの量を知る
ためのより簡便な方法として、スペーサーの末端
に、アミノ基やカルボキシル基等の滴定可能な官
能基が存在する場合には、スペーサーを固定化し
た段階で滴定に求める方法もある。 本発明で用いられる吸着体は架橋共重合体より
なる。架橋構造は特に限定されないが、トリアジ
ン環を有する架橋性単量体単位によつて架橋され
た構造、または、エピクロルヒドリンやビスエポ
キシ化合物が水酸基と結合して形成する構造が好
ましい。中でも、トリアリルイソシアヌレートや
トリアリルシアヌレート等のトリアジン環を有す
る架橋性単量体単位によつて架橋された構造が好
ましい。トリアジン環を有する架橋性単量体単位
とは、次式(A)、(B)で示される単量体が重合または
共重合して形成する構造を表わす。

【式】

【式】 （ただし、R₁、R₂およびR₃はそれぞれ独立に−
CH₂−CH＝CH₂、−CH₂−Ｃ≡CH又は

〔発明の効果〕

本発明で用いられる吸着体は硬質であり、高速
アフイニテイクロマトグラフイー用充填剤として
用いた場合、溶離液を高流速で流すことができ、
迅速分析が可能になる。また、本発明で用いられ
る吸着体は、広いPH範囲で安定であり、例えば、
シリカゲルを骨格とする吸着体では適用できない
アルカリ条件下でも変質がなく安定に使い得るメ
リツトを有している。さらに、本発明で用いられ
る吸着体は、多量の水酸基を有するため十分な親
水性を有し、生体成分等に対し疎水的吸着が少な
い利点を有している。 本発明の分離方法は、上記の吸着体を充填剤と
する高速アフイニテイクロマトグラフイーによる
ため、トリプシン類縁酵素を迅速かつ簡便に分離
分析することが容易になる。本発明の分離方法に
よると、プラスミンの前駆体であるプラスミノー
ゲンの血中での主な存在形態であるGlu−プラス
ミノーゲンとLys−プラスミノーゲンを特異的に
分離することができるため、血液凝固線溶系の疾
患の診断あるいは各種のプラスミノーゲン試料の
純度検定等への応用が可能となる。 以上のように、本発明の分離方法は生化学や医
学の分野における寄与が著しく大きい。 〔実施例〕 以下の実施例において、本発明をさらに詳細に
説明するが、本発明は実施例に何ら限定されるも
のではない。 実施例 １ 酢酸ビニル100ｇ、トリアリルイソシアヌレー
ト45.4ｇ、酢酸ｎ−ブチル80ｇ、デカリン40ｇお
よび２，2′−アゾビスイソブチロニトリル3.4ｇ
よりなる均一混合液と、少量のポリビニルアルコ
ールおよびリン酸ナトリウムを溶解した水800ml
とを還流冷却器、窒素導入管、撹拌棒を備えた３
の三つ口フラスコに入れ十分撹拌したのち、65
℃で18時間、さらに75℃で５時間加熱して懸濁重
合を行ない粒状共重合体を得た。次に、過、水
洗、ついでアセトン抽出後、カセイソーダ65ｇを
溶解したメタノール２と共に還流冷却器、窒素
導入管、撹拌棒を備えた５三つ口フラスコ中で
15℃で20時間撹拌して共重合体のケン化反応を行
なつたのち粒子を過、水洗、さらに乾燥した。 該粒子10ｇを500mlのビーカーにれ、モレキユ
ラーシーブ4Aで乾燥したジオキサン100ml、１，
1′−カルボニルジイミダゾール3.24ｇを加えて撹
拌しつつ、室温で15分間反応を行い、イミダゾリ
ルカルバメート基を活性基として有する活性化担
体とした。該活性化担体は、上記の乾燥ジオキサ
ンで洗浄したのち、吸引過した。該活性化担体
を、６−アミノヘキサン酸26.2ｇを含む1M炭酸
ナトリウム水溶液（PH10.0）200mlに加え振盪し
つつ、４℃で25時間反応させることにより、スペ
ーサー分子として６−アミノヘキサン酸を固定化
したスペーサー分子付担体を得た。該スペーサー
へ分子付担体に固定化されたスペーサー分子の量
は40μmol／ｇスペーサー分子付担体であつた。 上記のようにして得られたスペーサー分子付担
体を乾燥させたもの２ｇを50mlビーカーに入れ、
さらに、0.2M−２−（Ｎ−モルホリノ）エタンス
ルホン酸水溶液（PH4.75）15ml、１−エチル−３
−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミ
ド塩酸塩0.27ｇを加え、室温で30分間撹拌した。
この懸濁液にｐ−アミノベンツアミジン塩酸塩
25.8mgを加え、PHを4.75に調整したのち、懸濁液
を100mlの三角フラスコに移し、室温で24時間浸
盪して、スペーサー分子として６−アミノヘキサ
ン酸、配位子分子としてｐ−アミノベンツアミジ
ンを有する生体成分吸着用担体を得た。得られた
生体成分吸着用担体は、水、0.05N水酸化ナトリ
ウムを含む1M塩化ナトリウム水溶液、0.05N塩
酸を含む1M塩化ナトリウム水溶液、水の順で洗
浄した。洗液を回収してその292nｍにおける吸
光度から算出したｐ−アミノベンツアミジンの固
定化量は乾燥した生体成分吸着用担体１ｇあたり
13μmolであつた。なお、該生体成分吸着用担体
の平均粒径は、9.0μｍ、水酸基密度は4.9ｍmol／
ｇ生体成分吸着用担体、保水量は1.9ｇ水／ｇ生
体成分吸着用担体、比表面積は40m²／ｇ生体成分
吸着用担体であつた。 上記のようにして得られた吸着体を、パイレツ
クスガラス製カラム（内径６mm×長さ10cm）に充
填し、50ｍＭリン酸ナトリウムと100ｍＭ塩化ナ
トリウムを含む水溶液（PH7.4）を移動相として、
室温、流速0.5ml／minで牛トリプシン0.5μｇを注
入したところ、トリプシン活性を持つ蛋白質は溶
出しなかつた。続いて、移動相を50ｍＭリン酸ナ
トリウム、100ｍＭ塩化ナトリウムおよび20ｍM6
−アミノヘキサン酸を含む水溶液（PH7.4）に切
替えると、トリプシン活性を持つ２つの蛋白質を
主成分とする成分が溶出した。 なお、移動相送液ポンプとしては、KHU261/
２（協和精密(株)）、検出器としては、蛋白質の検出
にはRF−530（(株)島津製作所）励起波長285nｍ、
検出波長340nｍ、酵素活性の検出にはFD−110
（日本分光工業(株)）励起波長36nｍ、検出波長
460nｍを用いた。トリブシン活性の検出には、
合成基質ｔ−ブトキシカルボニル−Ｌ−グルタミ
ル−Ｌ−リシル−Ｌ−リシン４−メチルグマリル
−７−アミドがトリプシンにより分解されること
により遊離される７−アミノ−４−メチルクマリ
ン螢光を利用した。 実施例 ２ 実施例１で充填したカラムに、50ｍＭリン酸ナ
トリウムと100ｍＭ塩化ナトリウムを含む水溶液
（PH7.4）を移動相として、室温、流速0.5ml／min
でヒトプラスミノーゲン（ミドリ十字）10μｇを
高分子量型ウロキナーゼ（ミドリ十字）15Uを用
いて、３分間、37℃で活性化した混合物を注入し
た。酵素活性を持たないプラスミノーゲンが素通
り部分に溶出したのみであつたが、続いて移動相
を50ｍＭリン酸ナトリウム、100ｍＭ塩化ナトリ
ウムおよび20ｍM6−アミノヘキサン酸を含む水
溶液（PH7.4）に切替えると、プラスミン活性を
持つ蛋白質が溶出した。なお、装置、合成基質等
は実施例１と同じものを用いた。 実施例 ３ 実施例１で得られた粒状共重合体のケン化反応
を行なつたのちの粒子10ｇを500mlのビーカーに
入れ、モレキユラーシーブ4Aで乾燥したアセト
ン100ml、１−1′−カルボニルジイミダゾール
4.05ｇを加えて撹拌しつつ、室温で15分間反応を
行ない、イミダゾリルカルバメート基を活性基と
して有する活性化担体とした。実施例１と同様の
方法でスペーサー分子として６−アミノヘキサン
酸を該活性化担体と反応させて、６−アミノヘキ
サン酸が固定化されたスペーサー分子担体を得
た。固定化された６−アミノヘキサン酸の量は
119μmol／ｇスペーサー分子付担体であつた。 実施例１と同様にして、配位子分子としてｐ−
アミノベンツアミジン固定化した。ｐ−アミノベ
ンツアミジン塩酸塩の量を89.2mgとしたほかはす
べて実施例１と同様とした。固定化されたｐ−ア
ミノベンツアミジンの量は、乾燥した生体成分吸
着用担体１ｇあたり86μmolであつた。 上記の吸着体をパイレツクスガラス製カラム
（内径６mm×長さ10cm）に充填し、50ｍＭリン酸
ナトリウムと100ｍＭ塩化ナトリウムを含む水溶
液（PH7.4）を移動相として、室温、流速0.5ml／
minで牛トリプシン0.5μｇを注入したところ、ト
リプシン活性を持つ蛋白質は溶出しなかつた。続
いて移動相を50ｍＭリン酸ナトリウム、100ｍＭ
塩化ナトリウムおよび24ｍM6−アミノヘキサン
酸を含む水溶液（PH7.4）に切替えたが、蛋白質
は溶出しなかつた。次に、移動相を50ｍＭリン酸
ナトリウム、100ｍＭ塩化ナトリウム、20ｍM6−
アミノヘキサン酸および3M尿素を含む水溶液
（PH7.4）に切替えると、トリプシン活性を持つ２
つの蛋白質を主成分とする成分が溶出した。な
お、装置、合成基質等は実施例１と同じものを用
いた。 実施例 ４ 実施例１で得られた粒状共重合体のケン化反応
を行なつたのちの粒子2.5ｇを100mlのビーカーに
入れ、モレキユラーシーブ4Aで乾燥したアセト
ン25ml、１，1′−カルボニルジイミダゾール28.4
ｇを加えて、実施例１と同様にしてイミダゾリル
カルバメート基を活性基として有する活性化担体
としたのちに６−アミノヘキサン酸が固定化され
たスペーサー分子付担体を得た。固定化された６
−アミノヘキサン酸の量は369μmol／ｇスペーサ
ー分子付担体であつた。 実施例１と同様にして、配位子分子としててｐ
−アミノベンツアミジンを固定化した。ｐ−アミ
ノベンツアミジン塩酸塩の量を249.6mgとしたほ
かは、すべて実施例１と同様とした。固定化され
たｐ−アミノベンツアミジンの量は、乾燥した吸
着体１ｇあたり134μmolであつた。 上記の吸着体をステンレス製カラム（内径６mm
×長さ10cm）に充填し、50ｍＭリン酸ナトリウム
と100ｍＭ塩化ナトリウムを含む水溶液（PH7.4）
を移動相として、室温、流速1.0ml／minでGlu−
プラスミノーゲン7.5μｇおよびLys−プラスミノ
ーゲン3.0μｇを含む試料液を注入したところ、
Glu−プラスミノーゲンが素通り部分より遅れて
溶出した。続いて、移動相を50mMリン酸ナトリ
ウム、100ｍＭ塩化ナトリウムおよび20ｍM6−ア
ミノヘキサン酸を含む水溶液（PH7.4）に切替る
と、Lys−プラスミノーゲンが溶出した。なお、
検出された蛋白質はいずれもプラスミン活性を持
たなかつた。また、装置は移動相送液ポンプとし
てTWINCLE（日本分光工業(株)）を用いたほか
は、実施例１と同じものを用いた。 実施例 ５ 実施例１で得られたスペーサー分子付き担体を
乾燥させたもの２ｇを50mlビーカーに入れ、さら
に0.2Mの２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン
酸水溶液（PH4.75）15ml、１−エチル−３（３−
ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩
0.27ｇを加え、室温で30分間撹拌した。この懸濁
液にグアニジノ基を有する配位子分子としてＬ−
アルギニン26.1mgを加え、PHを4.75に調整した
後、懸濁液を100mlの三角フラスコに移し、室温
で24時間震盪して、スペーサー分子として６−ア
ミノヘキサン酸、配位子分子としてＬ−アルギニ
ンを有する生体成分吸着用担体を得た。得られた
生体成分吸着用担体は、水、0.05N水酸化ナトリ
ウムを含む1M塩化ナトリウム水溶液、0.05N塩
酸を含む1M塩化ナトリウム水溶液、水の順で洗
浄した。洗浄液中のＬ−アルギニンの量をアミノ
酸分析計を用いて測定することにより求めたＬ−
アルギニンの固定化量は、乾燥した生体成分吸着
用担体１ｇあたり10μmolであつた。 上記の吸着体をステンレス製カラム（内径６
mm、長さ10cm）に充填し、50ｍＭリン酸ナトリウ
ム水溶液（PH6.0）を移動相として、室温で、流
速1.0ml／minで牛トリプシン0.5μｇを注入したと
ころ、トリプシン活性を持つ蛋白質は溶出しなか
つた。続いて移動相を0.005N塩酸水溶液に切り
替えると、トリプシン活性を持つ蛋白質が溶出し
た。なお、装置は実施例４と同じものを用いた。 実施例 ６ 実施例４で得られたスペーサー分子付き担体を
乾燥させたもの２ｇを50mlビーカーに入れ、更に
0.2Mの２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸
水溶液（PH4.75）15ml、１−エチル−３（３−ジ
メチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩
0.27ｇを加え、室温で30分間撹拌した。この懸濁
液にアミノ基を有する配位子分子としてＬ−リジ
ン212.7mgを加え、PHを4.75に調整した後、懸濁
液を100mlの三角フラスコに移し、室温で24時間
震盪して、スペーサー分子として６−アミノヘキ
サン酸、配位子分子としてＬ−リジンを有する生
体成分吸着用担体を得た。得られた生体成分吸着
用担体は、水、0.05N水酸化ナトリウムを含む
1M塩化ナトリウム水溶液、0.05N塩酸を含む1M
塩化ナトリウム水溶液、水の順で洗浄した。洗浄
液中のＬ−リジンの量をアミノ酸分析計を用いて
測定することにより求めたＬ−リジンの固定化量
は、乾燥した生体成分吸着用担体１ｇあたり
151μmolであつた。 上記の吸着体をステンレス製カラム（内径６
mm、長さ10cm）に充填し、50ｍＭリン酸ナトリウ
ムと100ｍＭ塩化ナトリウムを含む水溶液（PH
7.4）を移動相として、室温、流速1.0ml／minで
Lys−プラスミノーゲン3.0μｇを含む試料液を注
入したところ、蛋白質は溶出しなかつた。 続いて移動相を50ｍＭリン酸ナトリウム、100
ｍＭ塩化ナトリウム及び20ｍＭの６−アミノヘキ
サン酸を含む水溶液（PH7.4）に切り替えると、
Lys−プラスミノーゲンが溶出した。なお、検出
された蛋白質はプラスミン活性を持たなかつた。
又、装置は実施例４と同じものを用いた。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ トリプシン類縁酵素を液体クロマトグラフイ
   ーにより分離する方法において、ビニルアルコー
   ル単位に由来するアルコール性水酸基を重合体重
   量当り、1.0〜14.0ｍmol／ｇの範囲で有し、か
   つ、下記一般式（）で表される構造を有する化
   合物 Ｘ−Ａ−Ｒ （） （但し、Ｘは【式】（アミジノ基）又は 【式】（グアニジノ基）又はアミノ基 であり、Ａはフエニル基、シクロヘキシル基又は
   炭素数４〜５個の直鎖のアルキル基であり、Ｒは
   アミノ基、カルボキシル基、水酸基等の活性水素
   を有する求核反応基である。） から誘導される配位子基を、線状分子の両端にあ
   る強イオン性基でない親水性官能基が夫々配位子
   分子及び活性基と共有結合した構造を有するスペ
   ーサーを介して0.001〜3000μmol／ｇの範囲で有
   し、重合体重量当り、保持し得る水の量が0.5〜
   4.0ｇ／ｇ及び比表面積が５〜1000m²／ｇである
   パーマネントポアを有する全多孔質の架橋共重合
   体からなる吸着体を固定相として用いることを特
   徴とするトリプシン類縁酵素の分離方法。 ２ 一般式（）で表わされる構造を有する化合
   物が、ｍ−又はｐ−アミノベンツアミジン、ｍ−
   又はｐ−アミノフエニルグアニジン、アルギニ
   ン、４−アミノブチルグアニジン、trans−４−
   アミジノメチルシクロヘキサンカルボン酸、
   trans−４−グアニジノメチルシクロヘキサンカ
   ルボン酸、trans−４−アミノメチルシクロヘキ
   サンカルボン酸又はリジンである特許請求の範囲
   第１項記載のトリプシン類縁酵素の分離方法。