JPH0272872A - 新規なハイブリッド殺虫剤毒素 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は新規なハイブリッド殺虫剤毒素類に関する。

［従来の技術］ バシラス・チューリンゲンシス（Ｂ　、　ｔ、　、　）
は昆虫類の微生物的防除に広く使用される。活性成分は
、結晶とも呼ばれろダンバク性のバラ胞子として確認さ
れた。昆虫ホストに摂取されると、結晶は腸プロテアー
ゼにより、有毒な活性プロテアーゼ耐性型に加工される
。毒性は、昆虫細胞への活性型毒素の結合の後に生ずる
ものと考えられ、受容器を媒介とする過程を通して細胞
の一体性が破壊されるに至ると考えられている［ノール
ズ・ビー・エッチ（にｎｏｗｌｅｓ、　ｆｌ、Ｉｌ、）
ら、（１９８４年）ＦＥＦＩＳ１６８巻１９７−２０巻
真９７ プロテアーゼ活性型のバシラス・チューリンゲンシス・
バラエティφカースタキ（Ｂ、ｔｈｕｒ盲ｎｇｉｅｎｓ
ｓ　ｖａｒ、　ｋｕｒｓｔａｋｉ）Ｈｒｌ−１及びｌｌ
［１−７３のアミノ酸配列を比較すると、タンパクの７
ミノ末端（Ｎ−末端）側の半分が高度に保存されている
一方、カルボキシ末端（Ｃ−末端）は配列中で高度に置
換されているのが明らかとなった。合衆国特許第４，４
６７．０３６号で、８、チューリンケンシス・バラエテ
ィ争カースタキ１１ト１は、イリノイ州ビオリア、ＮＲ
ＲＬ培養基受託施設から人手できることが明らかにされ
ている。その呼出し番号はＮＲＲＬ　Ｆｌ−３７９２で
ある。Ｂ、チューリンゲンシス・バラエティ・カースタ
キＨＤ−７３も、呼出し番号ＮＲＲＬ　Ｆｌ−４４８１
’ｌによりＮ　ＲＲＬ　ｂ）ら人手できる。

ＨＤ−１と）１０−７３のほか、Ｂ、チューリンゲンシ
ス・バラエティ◆ヘルリナーとバラエティ・アイザワに
ついても、活性毒素中のＮ−末端の医存領域、即ち定常
領域とＣ−末端の高度置換領域、口μち可変領域の存在
が実証された。

シュネフ・イー・エッチ（Ｓｃｌ＋ｎｅｐｆ、Ｅ、Ｈ，
）及びホイットリー・エッチ・アール（Ｗｈｉｔｅｌｙ
、　Ｈ，Ｒ，）、１゜Ｒｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、　２６０
巻Ｂ２７３−６２９０頁は、アミン及びカルボキシ末端
の欠失で毒性が失われることを実証し、活性毒素の両領
域とも毒性に必要であることを示した。

［発明が解決しようとする課題］ 本発明はＰＪＴ現なハイブリッド殺虫剤毒素に間する。

特定的に例示されるものは、細胞毒剤と、細胞毒剤をホ
スト目標に導くための特異的な昆虫腸線＠認識（結合）
タンパクとを含めてなるハイブリッド遺１云子の単一ポ
リペプチド生成物として発現される殺虫性融合タンパク
である。ハイブリッドＢ、ｔ、毒素の構築についての詳
細が明らかにされている。細胞毒剤はＡｒ１Ｐ−リボシ
ル化酵素である。例えば、細胞毒剤は、ジフテリア毒素
のＡ断片に、真核細胞結合領域を除くためにカルボキシ
ル末端が切断されたジフテリア毒素のＢ断片を加えたも
のである。ジフテリア毒素遺伝子の３′認識領域は、合
成りＮＡクリンカ領域で置換され、これにＢ、チューリ
ンゲンシス・バラエティ・カースタキ１ｌｌ）−７３の
昆虫腸上皮ｍ胞認識部分をコードした遺伝子が連結され
る。

合成りＮＡクリンカの目的は、これを用いないと連結で
きないｒｌＮＡ切片の断片を一緒にすることである。本
発明では、このリンカ−は、昆虫プロテアーゼ開裂に対
する感受性を最小限に抑えるために適当な長さ及びアミ
ノ酸絹成のものでなければならないため、本発明の重要
な要素である。このため、ペプチドリンカ−はできるだ
け短く、例えば４個以下のアミノ酸とすべきであり、リ
ジン残基な含有すべきてない。適当なリンカ−を使用す
るには、他の考察すべき点もある。例えば、リンカ−は
正しい読取り枠を維持すべきて、タンパク−次構造のヒ
トロバシー（ｈｙｒｌｒｏｐａｔ、ｌ＋ｙ；水治療法）
プロフィールにおけろ連続性を維持すべきである。

ｆＪｉ　Ｌｌなハイブリッド’ｓ、ｔ、遺伝子は、適当
なホストへバａ質転換されると、標準的な生化学手法に
よって回収できる毒素をもたらす。その代わりに、ｖＩ
規なハイブリッＦＦ１．ｆ．遺伝子を含有する形質転喚
ホストを、以下に明らかにされるとおり、殺虫剤として
そのまま使用できる。Ｂ、ｔ、に、Ｈｌｌ−７３が特定
的に例示されているが、本発明は他の微生物殺虫剤も包
含している。

Ｍ１表は２分の１長ハイブリツト毒素をコードしたＴＩ
ＮＡを明らかにしている。

第２表は、４分の１長ハイアリツト毒素をコードしたＤ
ＮＡを明らかにしている。

第３表は、２分のｌ長ハイブリッド毒素のアミノ酸配り
１１を明らかにしている。

第４表は、４分の１長ハイアリツト毒素のアミノ酸配列
を明らかにしている。

第５表は、相対的電気泳動移動度から決定された５ｅＮ
ＰＶＱ　Ｕ　Ｈ７ＮＰＶ　ｌ、＋１　Ｖ　Ａ　Ｌ製剤中
に存在するポリペプチド類の分子量を示す。

７ｆＬｎ表は、ハイアリシトウィルスの感染力を示す。

第７表は、電気体動移動度から決定されたポリペプチド
類の相対的分子量を示す。

本明細書に記歓の方法は、バラエティ・カースクキ８１
１−フ３以外の活性Ｂ、チューリンケンシス毒素のＣ−
末端可変部分に適用できる。これらは活性毒素のＣ−末
端側の半分に可変領域をもつＢ、ｔ、を包含する。この
よろなり、ｔ、の例は、蚊に活性のあるＢ。

１、バラエティ・イスラエレンシス：鞘■目に活性のあ
ろＢ、ｔ、バラエティ・サンプイエゴ及びＢ、　ｔ、バ
ラエティ・テネブリオニス；及び蚊幼虫に活性のあろＢ
、スファエリクス（［１，５ｐｈａｅｒｉｃｕｓ）であ
る。

北記を例示している培養基は以下のとおりである。

Ｂ、チューリンゲンシス・バラエティ・カースタキＨＤ
−１−−　ＮＲＲＬ　Ｂ−３７９２；合衆国特許第４．
４４８．８８５号に開示。

Ｂ、チューリンゲンシス・バラエティ−イスラエレンシ
スー−ＡＴＣＣ３５ｆ１４Ｒ Ｂ、チューリンゲンシス争バラエティ・サンプイエゴー
−ＮＲＲＬ　Ｂ−１５９３９ 以下のＢ、チューリンゲンシス培養基はテキサス州ブラ
ウンスピルの合全国農務省（ＬＩ　Ｓ　ＦＩ　Ａ　）か
ら人手できろ。請求は合衆国７８５２０テキサス州ブラ
ウンスピル私書箱１０３３、ＩＰＩＳ務省典業研究サー
ビス（Ａ　Ｒ５）、綿昆虫研究ユニット、ジョー・カル
シアまで。

Ｂ、チューリンゲンシス＋１０２ Ｂ、チューリンゲンシス・バラエティ番フィニチムス（
ｖａｒ、　ｆｉ旧ｔ、ｉｍｕｓ）■）３Ｂ、チューリン
ゲンシス・バラエティ・アレスチ（ｖａｒ、　ａｌｅｓ
ｔ、１）ＨＤ４ Ｂ、チューリンケンシス・バラエティ・カースタキＩＩ
　ｎ　７３ Ｂ、チューリンゲンシス・バラエティ・ソットー（ｖａ
ｒ、　５ｏｔｔｏ）８１１７７０Ｂ、チューリンゲンシ
ス・バラエティ拳デンドロリムス（ｖａｒ、　＋Ｉｅｎ
＋Ｉｒ０１ｉｍｕｓ）８０７Ｂ、チューリンケンシス伊
バラエティ伊ケニャエ（ｖａｒ、　ｋｅｎｙａｅ）Ｈ５ Ｂ、チューリンケンシス・バラエティやガレリアエ（ｖ
ａｒ、　ｇａｌｌｅｒｉａｅ）Ｈ１１２９０、チューリ
ンゲンシス・バラエティ・カナデンシス（ｖａｒ、ｃａ
ｎａｒＬｅｎｓｉｓ）Ｈ１１２２４Ｂ、チューリンゲン
シス・バラエティ・エントモシダス（ｖａｒ、　ｅｎｔ
、ｏｎ＋ｏｃｉｄｕｓ）ＨＤ９Ｂ、チューリンゲンシス
・バラエティ・サブトクシクス（ｖａｒ、　５ｕｂｔｏ
ｘｉｃｕｓ）Ｈ旧０９Ｂ、チューリンゲンシス・バラエ
ティ・アイザワイ（ｖａｒ、　ａｉｚａｗａｉ）ＨＤＩ
ＩＢ、チューリンゲンシス寺バラエティ・モリソニ（ｖ
ａｒ、　ｍｎｒｒｉｓｏｎｉ）ＨＯ１２８、チューリン
ゲンシス・バラエティ・オストリニアエ（ｖａｒ、　ｏ
ｓｔｒｉｎｉａｅ）ＨＤ５０１８、チューリンゲンシス
・バラエティ・トルワーシ（ｖａｒ、　ｔｏｌｗｏｒｔ
ｈｉ）ＨＤ５３７Ｂ、チューリンゲンシス會バラエティ
番ダルムシュタジエンシス（ｖａｒ、　ｄａｒｍｓｔａ
ｄｉｅｎＳｉｓ）ｌ（［１１４６Ｂ、チューリンゲンシ
ス争バラエティートマノフ４　（ｖａｒ、　ｔｏｕｍａ
ｎｏｆｆｉ））１口２０１８、チューリンゲンシス争バ
ラエティφキューシュエンシス（ｖａｒ、　ｋｙｕＳｌ
＋ｕｅｎｓｉｓ）ＨＩＬ５４１８、チューリンゲンシス
番バラエティートンブソニ（ｖａｒ、　ｔｂｏｍｐｓｏ
ｎｉ）ｌＩＤＦｉ４２８、チューリンケンシス・バラエ
ティ・バキスタニ（ｖａｒ、　ｐａｋｉｓｔａｎｉ）Ｈ
１１３９５Ｌチューリンゲンシス・バラエティ・イスラ
エレンシス（ｖａｒ、　１ｓｒａｅｌｅｎｓｉｓ）ＨＤ
５６７８、チューリンゲンシス・バラエテ？・インデイ
アナ（ｖａｒ、　ｉｎｄｉａｎａ）Ｈｒ１５２１８、チ
ューリンゲンシス・バラエティ・ダコタ（νａｒ、＋ｌ
ａｋｏｔａ） Ｂ、チューリンゲンシス・バラエティ・トーホクエンシ
ス（ｖａｒ、　ｔｏｌ＋ｏｋｕｅｎｓｉｓ）ＨＤ８ｎ６
Ｂ、チューリンゲンシス・バラエティ・クマモトエンシ
ス（ｖａｒ、　ｋｕｍａｍｏｔｏｅｎｓｉｓ）ＨＤ８６
７Ｂ、チューリンゲンシス会バラエティ・トチギエンシ
ス（ｖａｒ、↑ｏｃｈｉｇｉｅｎｓｉｓ）ｌｌｒｌＲ（
３ＦＩＢ、チューリンゲンシス・バラエティ・コルメリ
（ｖａｒ、　ｃｏｌｍｅｒｉ）ＨＤ８４７Ｂ、チューリ
ンケンシス・バラエティ命つハｔ、ンシス（ｖａｒ、　
ｗｕｌ＋ａｎｅｎｃＮｉｓ）１１＋１５２５使用可能な
曲の殺虫剤毒Ｎ類は、ビューへり７′ハシアナ（Ｒｅａ
ｕｖｅｒｉａ　ｌ＋ａｓｓｉｎａ）のビューベリン及び
メタリジウム（ＭｅＬａｒｒｈｉｚ目＋ｎ＋）種のデス
トラフシン頚；又はストレプトミセス・アバーミチルス
（Ｓｌ、ｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ａｖｅｒｍｉ＋、１ｌ
ｕｓ）のアバーメクチン實頁のような広範囲の殺虫剤化
合物類である。Ｊ：、記を例示ずろ培養基は以下のとお
りである。

ハシラス・セレウス（Ｂ、ｃｅｒｅｕｓ）　　−ＡＴＣ
Ｃ２１２８１バシラス・モリタイ（Ｌｍｏｒｉｔａｉ）
−ＡＴＣＣ２１２８２ハシラス會ボピリアエ（Ｒ，ｐｏ
ｐｉ　ｌ　ｌ　１ａｅ）−−ＡＴ（：Ｃ１４７０６ ハシラス・レンチモルブス（Ｒ，ｌｅｎｔｉｍｏｒｂｕ
ｓ）−ＡＴＣＣ＋４７０７ ハシラス拳スフ７エリクス（Ｉｌ、５ｐｈａｅｒｔｃｕ
ｓ）−ＡＴＣＣ３３２０３ ビューへリアψバシアナ（Ｂｅａｕｖｅｒｉａ　ｂａｓ
ｓｉａｎａ）−ＡＴＣＣ９Ｆ１３５ メタリジウム・アニソブリアエ （Ｍｅｔａｒｒｈｉｚｉｕｍ　　ａｎｉＳｏｐｌ　１ａ
ｅ）　　　　　　−−ＡＴＣＣ２４３９８メタリジウム
・フラボヒリデ （Ｎｅｔ、ａｒｒｈｉｚｉ＋＋ｍ　ｆｌａｖｏｖｉｒｉ
＋Ｉｅ）　　　　−ＡＴＣＣ３２９６９ストレプトミセ
ス・アバーミチルス （Ｓｔｒｅｐｔ、ｏｍｙｃｅｓ　　ａｖｅｒｍｉｔｉｌ
ｕｓ）　　　　　　　　−−４ＴＣＣ３１２６？本発明
の技術は細胞毒剤としてのジフテリア毒素の使用に限定
されない。というのは、タンパク合成を抑制する種々の
酵素、例えばリシン、ジアンチン、サボリン、ゲロニン
、トリチン、アブリン、及びモデシン等のようなリボソ
ーム不活性化剤、並びにオオムギ種子、ライ麦種子、ワ
イルドビーンズ、及びトウモロコシ種子からの酵素を使
用できるからであろ［ストライブ・エフ（Ｓｔ、ｒｉｐ
ｅ。

Ｆ、）及びバービエリ・エル（Ｒａｒｂｉｅｒｉ　、　
Ｌ、）（１９８６年〉ＦＥＢＳＩ９５　ン合　１−８頁
　コ　。

本発明は昆虫に活性のある毒素に限定されず、動物（こ
寄生する線虫類や植物に寄生する線虫類に対して活性の
ある口、チューリンゲンシス毒素をも包含する。一般に
、任意の殺虫剤が使用できる。

鈴りえはそれは、鞘８３１目、鱗翅目、双＠１目、半翅
目、革用目、及び直翅目等の昆虫類のような真核多細胞
害虫；又はクモ杉類、又は線虫類と扁形動物のようなぜ
ん虫類に対して毒性をもったポリペプチドでありうる。

感受性のある種々の昆虫類は甲虫類、ガ、ハエ、バッタ
、シラミ、及びハサミムシを包含する。

本発明はまた、核ポリへドロシスウィルス（Ｎ　ＰＶ）
の変更された昆虫ホスト範囲をもつハイブリッドウィル
スをつくるために、可溶化エンベロープタンパクを一つ
の閉じ込められたＮＰＶから別のＮＰＶへ再合体させる
ことにより、ＮＰＶの昆虫ポスト範囲を変更する方法を
も包含している。

Ｍ５ＲＫＬＦＡＳ　　工　Ｌ　工　ＧＡＬＬＶＤＳＳＫ
ＳＦＶＭＥＮＦＳＳＹ ＱＫＰＫＳＧＴＱＧＮＹＤＤＤＷ ＳＶＤＮＥＮＰＬＳＧＫＡＧＧＶ ＶＤＮＡＥＴ　　工　ＫＫＥＬＧＬＳＬＲＦＧＤＧＡＳ
ＲＶＶＬＳＬＰＦ ＡＫＡＬＳＶＥＬＥ　　工　ＮＦＥＴＲＣＡＧＮＲＶ；
ＲＲ５ＶＧＳ　　Ｓ　　ＬＳａＵ切ｑ　）−４＜日田べ
く Ｆ＜　＜　Ｑ　＜　）−４＞　’Ｚ　ｕ　工（１）＜国
くＨ切り国２＞０ ×〉＜すに）Ｏ＜＞ａ区 １１ｄｌｌｌ＋Ｅ−ＩＯ＞ＥＦ４ＣＱ２Ｉｂ１、＋Ｊ２
Ｅ−１＜Ｃ＋−＋＋−ＩＨ）−１ｔｊｃＱｃ／１ｇ”Ａ
＞２＋−×工〉す ＞Ｘ：Ｊ国１−４＞Ｑ＋）−１ＦｎメロＦ−４Ｅ−１−
に）＜ａｏ”ｗ＞ｗ ×〉２国＜Ｅ−１田ψ山２ ＋ｚＥ−４０Ｅ−ＩＬＸＱ％ＩＷ 山￥＜２０工ω２Ｘ＋２ 切ロＥ−１工＋０国〉山〉 閾閲閾工Ｏ山りＯ匡山 ｕ＞ｖｒｕ＞＞〉ｃ／１ｃＩＡＵ２ ２：ｔ−１０＜口ＨＬＸＬＥｎ ×国ＨＵ国、＜０ｃＥ−＋２ ２山〉ロｔｊｌｌｌ＋Ｅ−１山〉Ｈ ×田０べ〉氏匡Ｈ口国 ＨＩＪ２４Ｈ！：ｉ！、）−１１７１（Ｊ１％山−＞Ｃ
：Ｊ山−Ｈ山０Ｆ−１ ０＜ｚ工Ｈ切ψ−Ｈ− １日＞＞＜”ｚ、ｏＩ−１＜。

に）ａ＜ｔｎａ工国〉部す ｘｚ＋３：ｏ＜＞＞すＵ〉 Ａ＃＜Ｈ＞＞Ｅ−１＜匡８ ｒＪ１国＜ＯΣａ２　ＨＥ　ｇ 国−＞Ｏ４＋−２−よ山国− Ｈ−ｚＩ−１ψ−切一一一 ×〉くＨ史２〉山×ｚ 〉＜ＱＩＡ史２Ｅ−１ψ日り ＞＋ｚＨ＜＞ｚｒ、ａ日ｚ−− リＯｚα工−リク切切口 匡Σ−〉力国山山−力日 真８山＞Ｑ＜０＃ＨＥ−＋＜ ＜０匡く匡〃ψエクー日 口〉匡Ｃ／）工氏１−１１−１切く〉 Ｅ−１！＞Ｑ＋ｃＱ工＞１１＋２２１１＋＞山−−ＬＨ
（／ｌ＞（ｊ４）−Ｉ ＨＣＬ４ＥｎＺ（！ｌ（！ＩＪ：ＺＣ／ｌ−＋ｌ−Ｉ＋
ｔｎｔｎａｔｎ’ｚＨｚ国ｕ ）−４１ｈ　Ｃ／）り部−四２〉−鴎 ψ−−日山Σ−ｏｚ２国 ２山Ｅ−１（！＋山山−匡−〇ロ ー〇匡＞＞＜χ２ニーＨ Ｈψ＞＜２１部０ＯＨｑＨ Ｏ民〉−本＋Ｖ４＋へり〉 ２：ａＯＯ２０−１＞＋８り〇 −＞ａｅｃｙψ＜’ｚ、＞ａ＜ 工山ＬｊＵ山〉山０クー日 山ｒＡ１−１０１１＋ｌ／ＩＨＣ／）べ２Ｇｃ／１＜ａ
ｐＨｖｒａｔｒｒ＞ロク 氏Σべ〉国ｚＢ寓匡−一 ）−１１−１＞切口切Ｈ−〉θ２ ＩＡｏｌｌ−１＋−１＋−１−ψ区部８削匡工匡０切Ｕ
口〉〉り〉 国０００口勇ＣＩ’）−氏８０ ）−Ｉｔ／１０１２＞削く口＞べ〉 Ｕよ山２Ｆ４ＬＨ（ｊ削代Ｈ Ｏ＞ぺＨすΣＨ（ｊＥ−１＞２ 第３表と第４表で使用されているア ミノ酸の ！ 文 字記号は、 この技術で周知である。

例えば、 アミ ノ酸の３文字の略字と １文字記号との関係は以下 のとおりである。

ｌａ しｅｌｌ し ｒｇ ｙｓ に ｓｎ ｅｔ 門 ｓｐ ｈｅ ｙｓ Ｐｒ。

ｅｒ ε ｈｒ １ｙ ｒｐ 讐 ｉｓ ■ ｙｒ ■ ａ ■ ＭＳＲＫＬＦＡＳ　　工　Ｌ　工　ＧＡＩＬＩ、ＧＶＤ
ＳＳＫＳＦＶＭＥＮＦＳＳＹｆ（ ＫＶＴＹＰＧＬＴＫＶＬＡＬＫ　− ＶＤＮＡＥＴ　　工　ＫＫＥＬＧＬＳＬ’Ｉ’ＲＦＧＤ
ＧＡＳＲＶＶＬＳＬＰＦＡ ＡＫＡＬＳＶＥＬＥ　　工　ＮＦＥＴＲＧＣＡＧＮＲＶ
ＲＲ９ＶＧＳＳＬＳＣ Ｋ　工　ＥＳＬＫＥＨＧＰ　　工　ＫＮＫＭＳエ　ＬＰ
Ｇ　　工　ＧＳＶＭＧ　　工　ＡＤＧＡＶＰＬＰ　　工
　ＡＧＶＬＬＰＴ　　工　ＰＧＫＬＫ　工　ＲＭＲＣＲ
Ａ　　工　ＤＧＤＶＴＦＣＧＡＡＰＭＦＳＷ　工　ＨＲ
５ＡＥＦＮＮ　エ　エＡＳＤＳ　　工ＴＱ　工　ＰＡＶ
　　−４ＫＧＮＦＬＦＮＧＳＶ　　工　５ＧＰＧＦＶ　
工　工　ＤＲＦＥＦ　　工　ＰＶＴＡＴＬＥＧＷ　　工
　ＶＧＶＲＮＦＳＧＴＡＧｄ？ ！ 第５表 Ｓ　ＯＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で第６表　
ハイブリッドウィルスの感染力ｅＮＰＶ ＩＩ　ｚ　Ｎ　Ｐ　Ｖ ７２．０００ ７６．０００ ６２．０００ ６５．０００ ４５．０００−−−−−− ４５．０００　　　　４５，０００ ４２．０００　　　　４０，０００ ３４．０００　　　　３４，０００ ３３．０００ 説明［レムリ串ニー伊ケイ（Ｌａｅｍｍｌｉ、　Ｕ、に
、）（１９７０年）Ｎａｔ、ｕｒｅ（ロンドン）２２７
巻６ＦＩＯ−ｆ１８５頁］のとおり、５ＰＮＰＶ及びＨ
ｚＮＰＶ　ＬＯＶＡＩ−％Ｊ剤中に存在するポリペプチ
ド類は、ＳＯ５の存在下にポリアクリルアミドゲル電気
泳動（７，５＄）によって分離された。

４０ＩＩＩＭトリスアセテート、ｌ　ｍＭ　ＥＤＴＡ、
　ｐ）Ｉ　Ｆｌ、０（ＴＡＥ）を含有する緩衝液にＬＯ
ＶＡＩ、を懸濁させた。オクチルグルコシドをｌ：２（
ｗ／ｗ）の比で添加し、混合物を２００　ｒｐｍで絶え
ず振とうしながら、３７℃で４時間培養した。非可溶化
ウィルスタンパクを１００，０００　ｘｇで、４℃１時
間の遠心分離によって除去した。２４時間にＴＡＥｉｉ
衝液を３回変えながら、上澄み液を１＝１（ｗ／ｗ）の
比の１＋　Ｚ　Ｎ　Ｐ　Ｖ　Ｌ　Ｉ）Ｖ　Ａ　１．で透
析した。透析物を１００．０００　ｘｇで４℃、１時間
の遠心分離にかけた。上澄み液を捨て、ハイブリッドウ
ィルス（Ｓｅ零Ｈｚ　Ｎ　Ｐ　Ｖ）を含有するペレット
を、生物検定や５０Ｓ−ＰＡＧＥでの分析用に使用され
るＴＡＥ緩衝液に再懸濁した。

第７表　相対的分子量 Ｇｆｉ、０ＯＯ−−−−−− ５ｅＮＰＶのオクチルグルコシド可溶化によって抽出さ
れた３ポリペプチド類のうち、どれがスボドブテラ・エ
クシグアに対する毒性（ｙｉ　１ｕｌｅｎｃｅ）をＨｚ
ＮＰＶハイブリッドウィルス（Ｓｅ−ＨｚＮＰＶ）に付
与する原因となっているかを決定するために、次の実験
を（〒なった。オクチルグルコシドで抽出された３つの
５ｅＮＰＶタンパクに１２５１の標識を付けた。放射性
標識付きのタンパクと未標識ＨｚＮＰＶとを用いて、」
二記のようにハイ１リツトウイルスをつくった。ハイブ
リッドウィルスの５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲルのオ
ートラジオグラムは、３タンパクのすべてがＨｚＮＰＶ
と結びついていることを示した。

第１図：　ＭＲ４３６コード配列の部分制限酵素地図。

第２図：　ＣＦ−１細胞への８１１−７３毒素の結合を
示す。

細胞を指示濃度の未標識ＨＤ−７３と一緒に２０分培養
し、次に放射性ヨウ素化毒素と一緒に更に３０分培養し
た。結合放射能を〔材料及び方法〕に既述されたとおり
に測定した。

第３図：ＣＦ−１細胞への結合に対するＣＮＢｒペプチ
ドと放射性ヨウ素化ＨＤ−７３のとの競合。ＨＤ−７３
毒素をＣＮＢｒで消化させ、透析した。ＣＦ−１細胞を
指示濃度の消化ペプチドと一緒に３０分培養し、次に放
射性ヨウ素化ＨＤ−７３毒素と一緒に更に３０分培養し
た。

結合放射能を〔材料及び方法〕に既述されたとおりに測
定した。

第４図：　ＥＦ−２のジフテリア毒素で触媒されたＡ　
１１Ｐ−ノボシル化。小麦胚芽からの部分精製されたＥ
Ｆ−２を指示濃度のジフテリア毒素と一緒に１０分培養
し、次に１４Ｃ−ＮＡｎと一緒に３７℃で更に３０分培
養した。

冷たいＴＣＡの添加によって反応を停止させ、沈殿する
タンパクを回収し、〔材料及び方法〕で記述されたとお
り放射能を計測した。リボシル化の程度をジフテリア毒
素の飽和濃度で得られる程度の百分率として表わした。

第５図：　ＥＦ−２のハイブリッド毒素で触媒されたノ
ボシル化。小麦胚芽ＥＦ−２を指示講度の４分の１長（
ロ）及び２分の１長（ム）ハイブリッド毒素と一緒に１
０分、次に１４Ｃ−ＮＡＩ’）と一緒に更に３０分培養
した。

試料を第３図に記述されたとおりに処理した。リボシル
１ヒをジフテリア毒素の飽和濃度で得られる程度の百分
率として表わしである。

第６図：　Ｈｒｌ−７３１素によるＣＦ−１細胞タンパ
ク合成の阻止。細胞を指示；凋度の毒素と一緒に２０分
培養し、次に〔材料及び方法〕で記述されたとおりにタ
ンパクへの″〇−ロイシンの取込みについて検定した。

結果を毒素の不在下にＣＦ−１胞で得られるものの百分
率として表わしである。

第７図：ハイブリッド毒素によるＣＦ−１胞タンパク合
成の阻止。細胞を４分の１長及び２分のｌ長ハイブリッ
ド毒素に１ないし２４時間露出し、次に〔材料及び方法
〕で記述されたとおりに、タンパクへの１４Ｃ−ロイシ
ンの取込みについて検定した。タンパク合成の阻１Ｅ率
は、ハイブリッド毒素の不在下に同一時間間隔て培養さ
れた対照細胞との比較により決定された。

［課題を解決する手段］ 析現なハイブリッド毒素類は、殺虫毒素と細胞毒剤との
融合によってつくられる。特定的には、Ｂ、ｔ、遺伝子
の昆虫腸上皮細胞認識領域とジフテリア毒素Ｂ鎖との融
合でつくられるハイブリッドＢ。

ｔ、ｉ素が、本明細書に例示されている。

本発明のハイブリッド毒素遺伝子は、広範囲の微生物ホ
ストへ導入できる。毒素遺伝子の発現は、直接又は間接
に殺虫剤の細胞内生産と保持をもたらす。適当なホスト
、作１え＋、ｆシュードモナスの場合、微生物は晴翅目
毘虫発生位置に施用されると、そこで増殖し、昆虫に摂
取される。その結果、望んでいない昆虫を防除できる。

その代わりに、毒素遺伝子をもった微生物を、細胞内で
つくられろ毒素の活性を持続させるような条件下に処理
できる。次に処理細胞を目標害虫環境に施用できる。

生ずる生成物はＢ、ｔ、毒素の毒性を保持している。

Ｂ、　Ｌ、毒素遺伝子は適当なヘクターを経て微生物ホ
ストへ導入されて、このホストが生きている状態で環境
へ施用される場合に、あるホスト微生物を使用すること
が必須である。微生物ホストは、一つ以上の重要作物の
「植物領域」（葉面、葉領域、根領域、及び／又は根面
）を占有することが知られたものを選択する。これらの
微生物は、特定環境（作物及び他の昆虫生息地）中で野
性型微生物と順調に競合できるように選ばれ、ポリペプ
チド殺虫剤を発エルさせる遺伝子の安定な維持と発現を
提供し、環境的劣化と不活性化からの改良された保護を
殺虫剤に提供するものが望ましい。

広範囲の重要作物の葉面（植物の葉の表面）と根の領域
＜Ｖｌ物の根の周囲の土壌）に生息する多数の微生物が
知られている。これらの微生物は細菌、藻類及びｉ類（
ｆｕＢｉ）を包含している。特に興味あるものは、組［
例えばシュードモナス（Ｐ　ｓ　ｅ　ｕｄｏｍｏｎａｓ
）、エルウィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）、セラティア（Ｓ
ｅｒｒａｔｉａ）、クレブシェラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌ
ａ）、キサントモナス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）、ス
トレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、リゾビ
ウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、ロードシュードモナス（
Ｒｈ　Ｏ（１０１１Ｓ　ｅ　ｔ＋　ｄ　ｏ　ｍ　ｏ　ｎ
　ａ　ｓ　）、メチロフィリウス（Ｍｅｔｈｙｌｏｐｈ
ｉ　ｌ　１ｕｓ）、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｈａ
ｃｔｅｒｉｕｍ）、アセトバクター（Ａｃｅｔｏｂａｃ
ｔ、ｅｒ）、ラクトバシラス（１，ａｃ＋、ｏｈａｃｉ
　ｌ　１ｕｓ）、アースロバフタ−（Ａｒｔ　１１ｒ　
ｏ　ｂ　ａ　ｃ　ｔ　ｅ　ｒ　）、アゾトバクタ−（Ａ
ｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ）、リューコノストック（ｌ、ｅ
ｕｃｏｎｏｓｔ、ｏｃ）及びアルカリゲネス（Ａｌｃａ
ｌ　ｉｇｅｎｅｓ）［の線菌；菌類（ｆｕｎｇｉ）、特
に酵母、例えばサツカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙ
ｃｅｓ）、クリプトコツカス（Ｃｒｙｐｔ、ｏｃｏｃｃ
ｌ＋ｓ）、クルイベロミセス（にｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃ
ｅｓ）、スポロボロミセス（Ｓｐｎｒ浦ｏｌｏｍｙｃｅ
ｓ）、ロートトルラ（Ｒ１＋ｏｄｏｔ、ｒ＋ｒｕｌａ）
、及びオーレオバシジウム（Ａｕｒｅｏｈａｓｉ＋Ｉｉ
＋＋ｍ）属なとの微生物である。特に重要なものは、シ
ュードモナス・シリンカニ（Ｐｓｅｕｄｏｉｏｎａｓ　
ｓｙｒｉｎｇａｅ）、シュードモナス・フルオレッセン
ス、セラティア・マルセスケンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ　
ｎ＋ａｒｃｅｓｃｅｎｓ）、アセトバクター・キシリヌ
ム（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ　ｘｙｌｉｎｕｌｍ）、ア
グロバクテリウムφツメファシェンス（Ａｇｒｏｂａｃ
ｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）、ロードシュ
ードモナス・スフエロイデス（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｒｌ
ｏｍｏｎａｓ　５ｐｈｅｒｏｉｃｊｅｓ）、キサントモ
ナス・カンペストリス（Ｘａｎｔ、ｈｏｍｏｎａｓ　ｃ
ａｍｐｅｓｔｌｌｓ）、リソビウム。メリオチ（Ｒｈｉ
ｚｏｈｉｕｍ　ｍｅｌ　１ｏｔｉ）アルカリゲネス・エ
ントロフス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ　ｅｎｔｒｏｐｈ
＋ｉｓ）、及びアゾトバクタ−・ヴインランデ（（Ａｚ
ｏｔ、ｏｂａｃｔｅｒ　ｖｉｎｌａｎｄｉｉ）のような
植物領域の価菌種；及びロードトルラ・ルブラ（Ｒｈｏ
ｄｏｔｏｒｕｌａｒｕｂｒａ）、Ｒ，グルチニス（Ｒ、
ｇ　Ｉ　ｕ　ｆ、　ｉ　ｎ　ｉ　Ｓ）、Ｒ，マリーナ（
Ｒ，ｍａｒｉｎａ）、Ｒ，オーランティアカ（Ｒ，ａｕ
ｒａｎｔｉａｃａ）、クリプトコツカス令アルビダス（
Ｃｒ　ｙ　ｐ　ｔ　ｏ　ｃ　ｏ　ｃｃＩＩｓ　ａｌｂｉ
ｄｕｓ）、Ｃ，ジフルエンス（Ｃ，ｄｉｆｆｌｕｅｎｓ
）、Ｃ。

ローレンティ（Ｃ，１ａｕｒｅｎｔ、ｉ　ｉ＞、す・フ
カロミセス・ロセイ（Ｓ、　ｒｏｓｅｉ）、Ｓ、プレト
リエンシス（Ｓ、　ｐｒｅｔｏｒｉｅｎｓｉｃＮ）、Ｓ
、セレビシェ（Ｓ、　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、スボａ
ボロミセスＩＩｌ：７ゼウス（Ｓｐｏｒｏｈｏｌｏｍｙ
ｃｅｓ　ｒｏｓｅｕｓ）、５．オトルス（Ｓ、　ｏｄｏ
ｒｎｓ）、クルイヘロミセス拳ヴエローナエくにｌｕｙ
ｖｅｒｏｍｙｃｅｓ　ｖｅｒｏｎａｅ）及びオーレオハ
シジウム・ポルランス（Ａｕｒｅｏｈａｓｉｄｉｕｍ　
ｐｏ１１目ａｒ＋ｓ）のような植物領域の酵母種である
。特に重要なのは有邑素微生物である。

遺伝子の安定な（７持と発現を可能とするような条件下
に、毒素を発現させる１１．ｔ、遺伝子を微生物ホスト
に導入するには、さまざまな方法を利用できる。毒素遺
伝子発現用の転写翻訳調節信号とその調節制御下の毒素
遺伝子、及び絹込みを行なうためのホスト生物内の配列
と相同のＤＮＡ配列、及び／又は絹込みや安定な維持が
起こるための、ホスト内で機能的なＴｔｉ製系などを含
んだＨＡ構遺体を用意することができろ。

転写開始信号はプロモータと転写開始出発位置を包含し
よう。ある場合には、毒素の調節的発現を提供して、毒
素の発現が環境への放出後にのみ生ずるようにするのが
望ましいこともある。これはオペレータ、又はアクチヘ
ータやエンハンサに結合する領域、によって達成でき、
これらは微生物の物理的又は化学的環境の変化によって
誘発てきる。例えば、温度感受性ｙＪ！節領域を使用す
ると、生物は毒素を発現せずに実験室で生育でき、環境
へ放出されると発現が始まる。他の手法は、実験室で毒
素の発現を抑制する特定的な栄養培地を使用し、一方環
境中での栄養培地は毒素発現を可能とするものを使用で
きる。転写開始には、リボソーム結合位置と開始コドン
が存在しよう。

メンセンジャーＲＮＡの安定性を強化する配列を使用す
ると共に、特に活性プロモータを使用してメツセンジャ
ーの発現を強化するために種々の操作を使用できる。開
始及び転写終結領域は停止コドン、終結領域、及び任童
にポリアデニル化信号を包含しよう。

転写の方向、すなわちコーディング又はセンス配列の５
°から３゛への方向で、構造体は転写調節領域（これが
ある場合）とプロモータ（制御領域はプロモータの５′
又は３′のいずれかにある）、リボソーム結合位置、開
始コドン、開始コドンと同調する開放読取り枠をもった
構造遺伝子、停止コドン、ポリアデニル１ヒ信号配列（
使用する場合）、及び終結領域を包含しよう。二本鎖と
してのこの配列はそれ自体微生物ホストの転写に使用で
きるが、通常マーカーを含めたＤＮＡ配列を伴っており
、この第二のＤＮＡ配列はホストへのＤＮＡ導入中に毒
素発現構造体に結合させることができる。

マーカーとは、変更又は肪質転換されたホストの選定を
行なうための構造遺伝子のことである。

マーカーは通常、選択的利点を提供するもので、例えば
抗生物質や重金属への耐性なとの殺生物耐性や、栄養素
要求ホストに原栄養性を与える相補性を提供する。変更
されたホストが選定されるだけでなく、野外で競合的で
あるように、相補性を使用するのが好ましい。構造体の
開発に、またホストの変更に、一つ以上のマーカーを使
１打てきる。

野外で曲の野性型微生物に対する競合的利点を提供する
ことによって、生物を史に変更できろ。例えは、金属キ
レート剤、例えばシデロフォア類の発現用遺伝子を、毒
素発現用の構造遺伝子と一緒にホストへ導入できる。こ
の方法で、シデロフォアの強化された発現が毒素生産ホ
ストに競合的利点を提供するため、ホストは野性型微生
物と効果的に競合し、環境中で安定した生態的地位を占
めるようになる。

機能的な複製系が存在しない場合、構造体はホスト内の
配列と相同な、少なくとも５０塩基対（ｂρ）、好まし
くは少なくとも約＋００　ｂρ及び通常約１　、０００
ｈｐまでの配列を包含しよう。こうすると正当な組換え
の確率が高まるため、遺伝子はホストへ組込まれ、ホス
トによって安定に保持される。毒素遺伝子が相補性を提
供する遺伝子並びに競合的利点を提供する遺伝子に近接
しているのが望ましい。

従って、彬素遺伝子が失われる場合、生ずる生物は相補
性遺１云子及び／叉は競合的利点を提供する遺伝子も失
う可能性が強く、このため集傷の構造体を１呆侍してい
る遺伝子とは環ｊｑ中で競合できなくなる。

細菌、バクテリオファージ、シアノバクテリア、藻類、
カビ等のような広範囲の微生物ホストから多数の転写調
節領域が人手できる。種々の転写調節領域はｔｒｐ遺伝
子、ｌａｃ遺伝子、ｇａｌ遺伝子、ラムダ左及び右ブロ
モーダ、Ｔａｃプロモータ、及びホスト中で機能的な場
合は毒素遺伝子と関連して天然に生ずるブロモーダを包
含する。例として合衆国特許第４，３３２，８９８号、
第４，３４２，８３２号、及び第４．３５１３．２７０
号を参照のこと。終結領域は、普通は転写開始領域と関
連する終結領域か、又は異なる転写開始領域でありうる
（二つの領域がホスト内で適合的で機能的である限りに
おいて）。

安定なエピゾーム保持又は組込みを所望する場合は、ホ
スト中で機能的な複製系をもったプラスミドが使用され
よう。複製系は染色体、ホスト又は別のホスト内に通常
存在するエビソーム要素、又はホスト内で安定なウィル
スの複製系から誘導すＪＬ　ル。ｌ）　ＲＲ３２２、ｐ
ＡＣｖＣＩ８４、ＲＳＦＩＯＩＯ１ｐＲｕ旧４等のよう
な多数のプラスミドが人手てきる。例として、オルソン
（Ｏｌｓｏｎ）ら、（１９８２年）　Ｊ、ＲａＣｔ、ｅ
ｒｉｏｌ。

１５０巻６０６９頁、及びバグダサリアン（Ｂａｇｄａ
ｓａｒｉａｎ）ら、（１９８１年）　Ｇｅｎｅ　１６巻
２３７頁、並びに合衆国特許第４，３５６，２７０号、
第４，３６２，８１７号、及び第４，３７１゜６２５号
を参照のこと。

Ｓ、ｔ、遺伝子は開始領域の調節制御下にあるように、
転写翻訳開始領域と転写翻訳終結領域との間に導入でき
る。この構造体はプラスミドに含有され、プラスミドは
少なくとも一つの複製系を包含するが、一つ以上を包含
でき、その場合−つの複製系はプラスミドの開発中にク
ローニング用に使用され、第二の複製系は最終ホストで
の機能発揮に必要である。更に、すでに述べた一つ以上
のマーカーが存在できろ。組込みを望む場合は、プラス
ミドはホストゲノムと相同の配列を含むのが望ましい。

形質転換体は、通常、未変更生物や運搬生物が存在する
時は、それらに対して所望生物を選定できるように、慣
用の方法に従って選定手法を使用して単離できる。次に
形質転換体を殺虫活性のために試験できる。

殺虫剤含有細胞を処理して処理細胞を目標害虫環境に施
用する時に、細胞内毒素の活性を持続させるのに適した
ホスト細胞は、原核生物か真核生物を包含するが、通常
、は乳類のような高等動物に有毒な物質を生しない細胞
に限定される。しかし、毒素が不安定か、踊乳類ホスト
への毒性の可能性を回避するのに十分な低い施用水準で
ある場合には、高等生物に有毒な物質をつくる生物も使
用できる。ホストとして、特に興味あるものは、原核生
物と、カビのような低級真核生物である。

グラム陰性・陽性双方の原核生物の例は、エシエＪキア
（ＥｓＣｈｅｒｉｃｔ＋ｉａ）、エルウィニア（Ｅｒｗ
ｉｎｉａ）、シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、サルモネラ
（Ｓａ　ｌ　ｎｏｎｅ　ｌ　ｌａ）及びプロテウス（Ｐ
ｒｏｔ、ｅｕｓ）のような腸内細閘科（Ｅｎｔｅｒ。

１ａｃｔ、ｅｒｉａｃｅａｅ）　：バシラス科（８ａｃ
ｉ　ｌ　１ａｃｅａｅ）　：リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂ
ｉｕｍ）のようなりソビウム科（Ｒｈｉｚｏｂａｃｅａ
ｅ）　：発光細菌、シモモナス（Ｚｙｍｏｎ＋ｏｎａｓ
）、セラティア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）、アエロモナス（
Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）、ビブリオ（Ｖｉｈｒｉｏ）、デ
スルホビブリオ（Ｄｅｓｕｌｆｏｖｂｒｉｏ）、スピリ
ルム（Ｓｐ　ｉ　ｒ　ｉ　ｌ　Ｉｕｍ）のようならせん
菌科；乳酸かん菌科；シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍ
ｏｎａｓ）及びアセトバクター（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅ
ｒ）のようなシュードモナス科；アゾトバクタ−科及び
ニトロバクタ−科を包含する。真核生物には藻菌類（Ｐ
ｈｙｃｎ…ｙｃｅｔ、ｅｓ）と子のう菌類（ＡＳｃｏｍ
ｙｃｅｔｅｓ）のようなカビカアリ、これはサツカロミ
セス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）とシゾサツカロミ
セス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）のよ
うな酵母、ロードトルラ（Ｒｈｏｄｏ（、ｏｒｕｌａ）
、オーレオバシジウム（Ａｕｒｐｏｂａｓｉｄｉｕｍ）
、スポロボロミセス（Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ）
のような担子菌類（Ｂａｓｉｄｉ。

ｎ＋ｙｃｅｔｅｓ）酵猷を包含する。

生産目的のためにホスト細胞を選択する上で特に＠要な
特性は、Ｒ、ｔ、　、遺伝子のホストへの導入の容易さ
、発現系の人手性、発現効率、ホスト中の殺虫剤の安定
性、及び補助的遺伝能力の存在を包含する。殺虫剤ミク
ロカプセルとして使用するのに重罪な特性は厚い細胞壁
、邑素肘成、及び細胞内パッケージング又は封入体の形
成のような殺虫剤保護性；葉親和性；対哨乳類毒性の欠
如：害虫に摂取させるための誘引力；毒素に損害を与え
ない殺菌固定の容易さ等を包含する。池の考慮としては
、処方と取り扱いの容易さ、経済性、保存安定性等があ
る。

特に重要なホスト生物は、ロードトルラ種、オーレオバ
シジウム種、サツカロミセス種、スポロボロミセスｆ１
１のような酵母；シュート′モナス種、エルウィニア種
、及びフラボバクテリウム種のような葉面に生、白、す
る生物；叉はエシェリキア、乳酸杆菌種、バシラス種等
の他の生物を包含する。

特定的な生物は、シュードモナス・アエルギノサ（Ｐｓ
ｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、シュー
ドモナス会フルオレッセンス（Ｐ、ｆｌｕｏｒｅｓｃｅ
ｎｓ）、サツカロミセス争セしビシエ（Ｓａｃｃｈａｒ
ｏｍｙＣｅＳｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、バシラス・チユ
ーリンゲンシス、大腸菌、枯草菌（１３゜５ｕｈｔｉｌ
ｉｓ）を包含する６ 細胞は通常、証傷てあって、処理時に胞子型よりも実質
的に増殖型にあるが、ある場合には胞子も使用できる。

微生物細胞、例えばＢ、↑、Ｔｉ素遺伝子を含有する微
生物の処理は、毒素の性状に悪影響を及ぼさないか、又
は毒素を保護する細胞能力を消滅させない限り、化学的
又は物理的手段によるか、又は化学的及び物理的手段の
糾合わせによる。化学的試薬の例はハロゲン化剤、特に
原子番号＋７−８０のハロゲンである。もっと特定的に
は、ヨウ素を温和な条件下に、所望の結果を達成するの
に十分な時間に使用できる。池の適当な手法は、ホルム
アルデヒドとグルタルアルデヒドのようなアルデヒド類
；塩化ゼフィランと塩化セチルピリジニウムのような抗
Ｃ％染剤；イソプロピルアルコールとエタノールのよう
なアルコール類；ブアン固定剤とへノー固定剤［フマソ
ン（Ｈｕｍａｓｏｎ）、グレッチェン・Ｊ−ル（Ｇｒｅ
ｔｃｂｅｎ、　１．、）　ｒ動物組織手法」ダブリュー
・エッチ・フリーマン社、１９６７年、を参照コのよう
な種々の組織学的同定剤等での処理；又はホスト動物に
細胞を投与する時に磯抱中につくられる毒素の活性を保
存し、持続させるような物理的処理（加熱）と化学薬剤
処理との絹合わせを包含する。物理的手段の例は、ガン
マ放射線とＸ線のような短波長放射線、ｉｆ結、Ｕｖ照
利、凍結乾燥等である。

一般に細胞は、環境条件に対する耐性を強化するような
、強化された構造安定性をもつであろう。

殺虫剤がプロ型の場合は、目標害虫病原体による殺虫剤
のプロ型から成熟型への加工を抑制しないように、不活
性化方法を選定すべきである。例えはホルムアルデヒド
はタンパクを架橋し、プロ型ポリペプチド殺虫剤の加工
を抑制できろ。不活性化ないし殺菌方法は、毒素の少な
くとも実Ｍｆｌの生物学的利用率又は生物活性を保持す
る。

Ｒ、ｔ、　、殺虫剤遺伝子を含有する細胞ホストは任意
慣用の栄養培地で生育できるが、ｒｌＮＡ構遺体は選択
的利点を提供するため、細胞の全量又は実質的全量がＢ
　、　ｔ　、　ｉｆ伝子を保持するように選択培地とな
る。次にこれらの細胞を慣用方法に従って取り入れる。

その代わりに、細胞を取り入れる前に処理することもで
きる。

Ｂ．ｔ．細胞を種々の方法で処方できる。これらを無機
鉱物（フィロ珪酸塩、炭酸塩、硫酸塩、燐酸塩等）又は
植物材料（粉末トウモロコシ穂軸、もみ殻、クルミ殻等
）と混合することにより、水和剤、粒剤叉は粉剤として
使用できる。処方剤は廣粘着助剤、安定剤、その他殺中
助剤、又は表面活性剤を包含できる。液体処方剤は水性
基盤又は非水性基盤のもので、フオーム、ゲル、懸濁液
、乳剤等として使用できる。成分は流動剤、表面活性剤
、乳化剤、分散剤又は重合体を包含できる。

殺虫Ｍｆ！４度は特定処方剤の性質、特に濃厚液か直接
使用されるかによって、広範囲にわたる。殺虫剤は少な
くとも＋ｉ、ｅｚで存在し、１００重！　＄でありうる
。ｆ２燥処方剤は約１−９５ｆｆｉｔｋ！の殺虫剤をも
つが、γα体処方剤は一般に約１−６０重量２の固形分
を液相中にもってあろう。処方剤は概してｍｇ当たり約
１０２ないし約１０４個の細胞をもつであろう。これら
の処方剤はへクタール当たり約５０　ｍｇ（、？α体又
は乾燥）ないしＩ　Ｉ＜８以上の率で投与されよう。

処方剤は鱗翅目害虫環境、例えば植物、土壌、叉は水に
噴霧、散布、散水等によって施用できる。

以下は本発明実施の最善の態様を含めた手順を例示した
実施例である。これらの実施例は限定的に考えられては
ならない。他に注意がなければ、百分率はすべて重量、
溶媒混合物割合はすべて容量による。

実施例１　ジフテリア毒素のＢ鎮に融合されたほぼ全長
のＢ．ｔ．毒素を含有するハイブリット毒素の構築 Ｍ　Ｒ４３Ｇプロ毒素コ一ト配列の部分制限酵素地図を
第１Ａし１と第１８図に示す。開始剤メチオニンからＸ
ｌ＋ｏ１位置の先までのタンパクコード配列は、Ｂ、ｔ
。

菌株ＨＤ−７３毒素から誘導された。アミン末端側のプ
ロ毒素の約半分が活性毒素に相当する。ＩＩ）−７３で
は、Ｘｈｏ　Ｉ位置は毒素とプロ毒素の配列を都合よく
隔てている。はぼ全長の１１　Ｄ　−７３毒素コ一ド配
列を含有するブラスミＦ’ＭＲ４３６＃）らの断片は、
Ｎ５ｉＩ及びＸｌ＋ｏｌでの二重消化とゲル精製によっ
て単離された。この断片はＨｒｌ−７３（７）　ｃｙＳ
’Ｏカラｇｌｕ”３まてのアミノＭ　（ＡＡ）を含んで
いる［アダング・エム・ジエイ（Ａｄａｎｇ、　Ｍ、Ｊ
−）ら、（１９８５年）Ｇｅｎｅ３６巻２８９−３００
頁］。ジフテリア毒素のＢ鎖を含有するプラスミドｐ　
Ｂ　＋〕５　ＯＲ［制限地間については、マーフイ・ジ
エイ・アール（ＭｕｒＩ＋ｈｙ、　　、１．Ｒ，）ら、
（１９Ｆｔ６年）　Ｐｒｏｃ。

Ｎａ↑、　　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　　ｌｌ５Ａ　８３
巻８２５２−８２６２頁を参照コは、５ｐｂｒとＨｉｎ
ｄｍて消化させた。消化・ゲル精製ずみｐ＋ｕ：５０Ｆ
ｔ（マイナスＳｐｈ　Ｉ　−１１ｉｎｄｌｌＴ小断片）
のＳｐｈ　Ｔ位置をＨＤ−７３ＤＮＡのＮＳｉ１位置に
結合したが、これには次の合成り　Ｎ　Ａオリゴスクレ
オチドアダプターセットを使用した。

５°　−ＣＡＧＧＴＴＧＣＡ−３’ ３’　　−ＧＴＡＣ＋；ＴＣＣ：Ａ−５’アダプターは
Ｓｐｌ＋Ｉ（ｉ２置を再生し、ＮＳｉ　Ｔ位置を除去し
、正確な翻訳読取り枠を維持し、かつジフテリア毒素Ｒ
１ｌｆｌ　１１１８４８４と旧１−７３　ｃｙｓｌｏと
の間に２制のアミノ酸（ａｌａ−ｇｌｙ）を付加する。

　アダプターを囲い込んだ融合部を下に示す。

Ｇｌｙ　Ｖａｌ　Ｈｉｓ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｃｙｓ　Ｉ
ｌｅ　Ｐｒ。

ジフテリア毒素　　　　　＋１Ｏ−７３Ｂ鎖 ｌｌ０−７３のＸｈｏ　１位置を次の合成オリゴヌクレ
オチドアダプターセットによってｐＦｌｃ５０８のＨｉ
ｎｄｍ位置に結合した。

５　’　　−Ｔ白；　Ａ　ＧＴ　Ａ　＋：　Ｔ　Ａ　Ｇ
　＋；　Ｔ白’；ＡＣ−３“３’　−ＣＡＴＣＡＴＣＣ
ＡＧＣＴＧＴＣＧＡ　−５’アダブダーセツトはＸｌｌ
ｏｌ位置を再生し、二次クローニング用に構造体に５ａ
ｌｔ位置を付加し、Ｈｎｄｍ位置を排除し、かつ２個の
枠内翻訳終結コドンを挿入する。アダプターを囲い込ん
だ融合部の詳細を下に示す。

Ｔｈｒｌ、Ｃｕ　Ｇｌｕ末端末端 旧１−７３　　　　　　　　　　　　　ｐＨｃ５０８正
確な構造体は制限酵素分析で確認された。１（Ｄ−７３
コ一ト配列は、特異な５ｓｔｌ及びＡｓｕ１７位置の存
在によって裏１寸られた。５ｐｌ＋　Ｉ　Ｉｆｆ置は再
生され、５ａ１１位置は創造されていて、リンカ−の存
在を裏付けている。ＥｃｏＲｌでの消化は、ジフテリア
毒素のＢ鎖に対するｌｌ［１−７３のコード配列の正確
な方向っけを確証した。最後に、融合部でハイブリッド
毒素構造体（１２６と指定）を切断するか、ゲル系の分
割限界内で、ＭＲ４３＋１（ＮＲＲｌ、　８−１８２９
２）の同等な消化物を生ずる断片と同時に移動するＤＮ
Ａ断片を内部的に与えるような酵素の組合わせを下に示
す。

匹１ ＭＲ４３Ｒ ５ｓｕＩＩ　　　Ｙ　　Ｘｈｏｌ　　　　　　　　Ａｓ
ｕｒＴ　　ｘ　　Ｘｈｏｌジフテリア毒素Ｂ鎖と）１０
−７３コ一ト配列との間の融合部の正確な翻訳読取り枠
は、ジフテリア毒素遺伝子のヌクレオチド５００〜５２
３［マーフィ・ジエイ・アール、（１４１８５年）　Ｃ
ｕｒｒｅｎｔ　Ｔｏｐｉｃｓ　Ｍｉｃｒｏ−ｂｉｏｌ、
　１ｍ１Ｉｌｕｎｏ１．１１８巻２３５−２５１頁］に
対応する合成オリゴヌクレオチドブライマーを用いて、
ｐ２６のジデオキシＤＮＡ配列決定によって確証された
。

５°・ＧＡＣＧｆ；ＴＧＡＴＧＴＡＡｌ”ＴＴＴＴＴＧ
ＴＣＧＣ−３’実施例２　ジフテリア毒素Ｂ鎖に融合さ
れた短めの１ｌｒｌ−７３コ一ト配列を含有するハイブ
リッド毒素クローンの構築 上記のプラスミド１）２６は、追加のハイブリッド毒素
Ｉｌｌ用の基質としての役目をもっていた。シフ千すア
毒素Ｂ鎖のＨＩＳ４８４をＨｆ）−７３のアミノ酸Ａｒ
ｇ２５８〜Ｇ　ｌ　ｕ　６１’に融合（プラスミド構造
体ｐ１５１）又はジフテリア毒素Ｂ鎖のＨ１９４８４を
Ｈｌｌ−７３のアミノ酸Ａｌａ”θ〜Ｇ１１１６１３に
融合（プラスミド構造体ｐＨ）させる２構造体をつくっ
た。ハイブリッド毒素プラスミドｐ１５１は、Ｓｐｌ＋
ｒ及びＡｑｎ口によるｐ２６の制限消化、（＋　Ｂ　Ｃ
５０８と、Ａｒｇ２５１’ｔから合成Ｘｌ＋ｏｌ　−Ｈ
ｉｎｄｍアダプター（上記）まてをコードした＋１１１
−７３とを含有するＩＩＮＡＤＮＡ断片精製、及びｓｐ
ｈ　ＩからＡｓｕｒＴ位置と次の配列の合成オリゴヌク
レオチドアダプターセットとの再結合によってつくられ
た。

５　’　−ＬＴＡＡ（、ｆ：Ｔｆ；ＴＴＴ　−３３’　
−ＧＴＡＣＧＡＴＴＧＧＡＬ、ＡＡＡＧＣ−５゜アダブ
ダーセ・ソトはＳｐｈ　ＴとＡｓｕｎ泣置を位置し、正
確な翻訳読取り枠を維持し、ジフテリア毒素Ｂ鎖の１ｌ
ｉｓ４８’とＩＩ　Ｄ　−７３コー１”　ｌ！ｌａ列の
４１ｇ２５１３の間に４個のアミノ酸（Ａｌａ−Ａｑｎ
−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ）を挿入する。合成アダプターを囲い
込んだ予測構造体の融合部の詳細を下に示す。

Ｇｌｙ　　Ｖａｌ　　１ｌｉｓ　　Ａｌａ　　Ａｓｎ　
　Ｌｅｕ　　Ｐｈｅ　　Ａｒ８　Ｔｈｒジフテリア毒素
　　　　　　　　　　ＨＤ−７３Ｂ鎖 ５ｐｈｌＢ２置の存在から組換えプラスミドを選定した
。挿入体の正確な大きさは、ＥｃｏＲｌで消化したｐ２
Ｇとｐ１５１のアガロースゲルサイジングや、ｐ２６（
ＡｓｕＩＩ　　ｘ　Ｓａｌ　Ｉ　）をｐ１５１（Ｓｐｈ
ｌ　　ｘ　Ｓａｔ　Ｉ　）と比較する二重消化によって
例証された。

融合部での正確な翻訳読取り枠は、ｐ２６（上）で用い
た合成配列決定用ブライマーでの、及びジフテリア毒素
構造遺伝子のヌクレオチド類４７９−４９９［前掲マー
フィ・ジエイアールら（１９８５年）］に対応する第二
の合成オリゴヌクレオチド配列決定用ブライマーでのρ
１５１のジデオキシＤＮＡ配列決定によって確証された
。

５’　−ＡＧＧＡＴＧＣＧＴＴＧＣＡＧＡＧＣＴＡＴＡ
　−３’ハイブリッド毒素プラスミドｐＨは、ｓｐｈ　
Ｉ及び５ｓｔｌによるｐ２６の制限消化、ｐＢｃ５０８
と、Ａｔａ４５０から合成Ｘｈｏ　Ｉ　４１ｉｎｄｒＴ
Ｔ　７ダブター（上記）までをコードしたＨＤ−７３と
を含有するＤＮＡ断片のゲル精製、及びＳｐｔ＋Ｉ〜Ｓ
ｓｔ、１位置の合成オリゴヌクレオチドアダプターセッ
トとの再結合によって構築された。

５’　−ＣＡｔ’；ＧＴ＋；ｃａｔ；ｃＴ−３’３’　
−ＧＴＡＣＧＴＣ（：ＡＣＧ　−５アダプターセツトは
Ｓｐｈ１位置を再生し、Ｓｓｆ、ｒ位置を排除し、正確
な翻訳読取り枠を維持し、かつジフテリア毒素Ｂ釦のＨ
Ｈ５４８４とｌｌｆ＋−７３コ一ト配列のＡ　ｌ　ａ　
４５０の間に３個のアミノ酸（Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｌａ
）を挿入する。合成オリゴヌクレオチドを囲い込んだ融
合部の予測構造の詳細を下に示す。

Ｇｌｙ　Ｖａｔ　ＨｉｓＡｌａ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ａｌ
ａ　Ｐｒ。

ジフテリア　　　　　　　ＨＤ−７３ 毒素Ｂ釦 組換えプラスミドをＳｐｌ＋１位置の存在から選定し、
挿入体の正確な大きさはｐ２６と比較したｐＨのＥｃｏ
Ｒｌ消化物のアガロースゲルサイジングにより、また以
下のようにｐＨをｐ２Ｒと比較した多重酵素消化物によ
り例証された。

ｌ　　　　　　　　　　　庄 ＳＨ＋ｈｌ　　ｘ　Ｓａｌ　Ｔ　　Ｙ　５ｓｔＴ　　　
Ｓｐｌ＋Ｉ　　ｘ　Ｓａｌ　ＴＳｓｔｌ　　Ｘ　５ａｌ
ｔ　　　　　　　５ｐｈｌ　　ｘ　５ａｌｌ融合部での
正確な翻訳読取り枠は、ｐ１５１で使用した２個の同一
合成オリゴヌクレオチドブライマーでのｐｌ＋のジデオ
キシ［ＩＮＡ配列決定によって例証された。

実施例３　ジフテリア毒素Ａ鎖と、切断されたＢ鎖及び
Ｈ１１−７３の融合コード配列を含有するハイプリ・ソ
ト毒素発工見ベクターの構築 ｌ１１１−７３コ一ト配列ｎＮＡ断片をＳｐｈ　Ｉ及び
Ｓａｌ＋での消化によってブラスミＦ’９２Ｇ、ｐ１５
１及びＰｌ＋から切り出し、ゲル精製した。これらのゲ
ル精製断片をこれらのゲル精製断片を、ジフテリア毒素
Ａ及びＢ鎖とＩＩ　Ｏ−７３コード配クリを含有するハ
イブリッド毒素発現ベクターの構築に使用した。ハイブ
リッド毒素発現ベクターの矧み立てを１４−３封じ込め
条件下に行なった。インターロイキン２（ＩＬ−２）コ
ード配列ｒｌＮＡを除くためにプラスミドｐＡＲＩ５０
８をＳｐｈ■と５ａｌｌで消化させた。ベクター（マイ
ナスｌ　Ｌ　−２）をゲル精製した。精製５ｐｈｒλＳ
ａｌ　Ｉ　ＨＤ−７３挿入体を別個に、精製Ｓｐｈ　ｒ
　ｘ　Ｓｐｈ　ｌ　ｐＡＢ１５０８ベクターＤＮＡに再
結合した。再結合混合物を大腸菌菌株５ｙ３２７細胞の
形質転換に使用した。正確な紺み立でのハイブリッド毒
素プラスミドは、ジフテリア毒素遺伝子の構成的に利用
されるｐＬｏｘ１０モータの制御下に抗ＨＤ−７３免疫
反応材料を生ずる能力によって、ウェスタンプロット法
で＠　ＭＥされた。３種の大きさの免疫反応材料の合成
が検出された。ｐ２６５ｐｈＩＸＳａｉｌ旧１−７３１
’ｌ　Ｎ　Ａで得られたハイブリッド毒素は、１Ｉ６ｋ
ｄと１８０　ｋｄのタンパク鎖の間を移動するＱ疫反応
材料を生じた（コンビニーダで得られた分子量は約＋２
６　ｋｄてあった）　、　ｐ１５１５ｐｈｌ　ｘ　５ａ
ｔＴ　ＨＤ−７３挿入体によって得られたハイブリッド
毒素は、５８　ｋｄと８４ｋｄのタンパク鎖の間を移動
する免疫反応性タンパクを生した（コンピュータで予測
した分子量は約７６ｋｒｌであった）。

実もト例４　大腸菌でのハイブリッド毒素発現８　Ｌ　
−３月し込め条件下に、ＬＲ培地（アンピシリンを伴う
場合又は加えない場合）中で、大腸菌細胞を一夜３０９
Ｃで生育させた。細胞を遠心分離で集め、以下の３方法
の一つで処理した。

（ａ）丸ごとの細胞を紫外線照射で殺菌し、氷上に保持
した。

（ｈ）ｍ胞質タンパク抽出物を丸ごとの細胞からつくっ
た。細胞ペレットを２０１ｙ！、糖／１０　ｍＭ）リス
−ＨＣＩ（ｐｌ！　８．０）及びＩ　ｍＭエチレンジア
ミン四酸酢酸ＥＤＴＡ）を含有する水冷緩衝液中に再懸
濁させた。再懸濁に使用した容量と同し容量の、１．５
慣ｇｅｍ　Ｉリソチームを含有する冷たいｌ１ｌＩ南液
を添加し、培養を４℃、２０分間処理した。細胞を遠心
分離で除去し、細胞質ダンバクを含有する上澄み液を音
波処理し、０．４５／ＺＭフィルターに通して濾過した
。濾過抽出液を凍結させた。この抽出液中のハイブリッ
ド毒素分子の大多数はジフテリア毒素リーダー配列（ア
ミノ酸−１ないし−２５）［前掲マーフィ（１９８５年
）］を欠いているへきで、これらを細胞質空間への分泌
中に切り取るべきである［マーフィ・ジョン・アール（
Ｍｕｒｐｈｙ　ｊｏｌ）ｎ、　Ｒ，）合衆国特許第４，
６７５゜３８２号］。

（Ｃ）フレンチプレス（フレンチ圧力セルー実験室油圧
プレス）で次のように破裂させて、丸ごとの細胞抽出液
をつくった。２０％クリセロール１５０　ｍＭトリス−
ＭＣＩ（ｐＨ７，４）／Ｉ　ｍＭ　Ｅｒ１ＴＡ／Ｉ　ｍ
Ｍジチオスレイトール（ＤＴＴ）／約Ｉ　ｌ１１Ｍフッ
（ヒフェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）を含有する
水冷緩衝液に、細胞ベレットを再懸濁させた。１２，０
００〜１４，０００　ｐｓｉのフレンチプレスで細胞を
２回破裂させた。細胞抽出物を冷凍した。ハイブリッド
毒素は、ジフテリア毒素リーダー配列（アミノ酸−１な
いし−２５）の存在に間しては、ある分子が分泌されな
いこともあるため、分子の混合集団とすべきである。

実施例５　ハイプリ・ソト！＃素の精製馬のポリクロー
ナルジフテリア毒素抗体（コノート研究所、ペンシル・
＼ニア州スイフトウォーター）を臭化シアン（ＣＮＢｒ
）で活性化されたＳ　Ｅ　Ｐ　ＨＡ　ＲＯＳＥＴＭ　４
Ｂ（）７−マシア・ファインケミカルズ社、ニュージャ
ージー州ビス力タウエー）へ、このメーカーの手順に従
って結合させて、免疫吸着剤樹脂をＩＩ築した。簡単に
述べろと、凍結乾燥されＣＮＢｒで活性化された５ＥＰ
ＡＲｎＳＥ”をＩ　ｍＭ　ＨＣｌ中に循環させ、繰り返
し洗った。生ずる膨張ゲルをカップリング用Ｅｌ　衝ｉ
ｆｆ　（０，５Ｍ　ＮａにｌとＯ，ＩＭ　ＮａＨＣＩ）
３．　ｐＨ８，３）で洗った。Ｉ’１０ｍｇに相当する
ジフテリア毒素抗体の７リコードを、緩１φｉγα５１
に対しダンバク５ｍｇの最終濃度でカップリング緩衝液
にｑ３ｉＩｌさせた。

次にＳ　Ｆ：　Ｐ　ＨＡ　Ｒ１１Ｓ　Ｅ　”　”と抗体
の溶液を一緒にし、回転混合しながら室温で２時間培養
した。培養期間後、樹脂を短時間遠心分離（＋０００　
ｖｚ　ＸＩ５　ｎ＋ｉｎ）シ、上澄みγαを除去した。

樹脂基村上の残留する床占有反応基ｉ＝ｏ、２Ｍグリシ
ン（ｐＨＦｌ、Ｏ）の添加によって阻止し、前と同様に
培両した。最後に免疫吸着剤を高低ｐ）ｌの緩衝１夜（
カップリング緩衝液及び、Ｏ，１ＭＮａＣｌと０，１卜
Ｉ　ＮａＨＣＯ，からなる緩衝液（ｐＨ４））で次々に
洗った。イオン結合された遊離リガントが確実に除去さ
れろように、この洗浄を４回繰り返した。

この手順は全体で９５Ｓのカップリング効率をもたらし
た。得られた免疫吸着剤は、樹脂１当たり５゜７　ｍｇ
のりカントを含有した。クロマトグラフィに先立って、
充填用！１術液（１００１ＩＭトリス−ＨＣｌ、ｐ）Ｔ
７．４，２０１グリセロール、Ｉ　ｍＭ　Ｎａ２ＥＤＴ
Ａ、Ｉ　ｍＭ　ＰＭＳＦ、０．１ｔノニデットＰ−４０
（ＮＰ−４０）及び０．１　ｍＭ　ＤＴＴ）で免疫吸着
剤を４０で事前串間化した。

他に注意かなけれは、４°（二で以下の段階の全部を行
なった。疎水性凝集物の溶解を促進するために、ハイア
リット毒素を含有する破裂させた細胞ベレ・ソトを、０
．１１（ν／Ｖ）の最終濃度までのＮＰ−４０ｉ、会加
により、部分的に可溶化した。全ダンバク５０　ｍｇに
相当する部分可溶化材料のアリコードを、回転混合しな
がら、Ｓ　Ｅ　Ｐ　ＨＡ　Ｒ１１Ｓ　Ｅ　”’０．５　
ｍｌに相当する樹脂のスラリーと一緒に３時間培養した
。洗浄用緩衝ｔｌＹ（１００ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ
７，４，２０％グリセロール、０．２＄ＮＰ−４０及Ｕ
Ｏ，１％塩素酸）中へ繰り返し循環させることにより、
非特異的に結合された材料を樹脂から除去した。これに
続いて、痕跡量の洗剤を除くために、Ｏ，ＩＭ＋＝リス
−０１中で次々に洗った。

最後に、Ｏ，１Ｍトリス−ＣＩ（ｐＨ７，４）中の４Ｍ
グアニジン−１１Ｃ１と一緒に短時間培養して、ハイブ
リッド毒素７！−溶離した。次に、適切な再折り畳みを
促進するために、２０ＩＩＩＭトリスーＣＩ（ｐＨ７，
４）、Ｏ，ＩＭ　ＮａＣ１及び０．２５　ｍＭ還元グル
タチオンを含有する［ｉ液に対してこのフラクションを
完全に透析した。

実施例〇　毒素遺伝子の植物への挿入 木明′４ａ書で明らかにされているＩＪＴ規な殺虫剤毒
素をコードした新規な遺伝子は、アグロバクターψツメ
ファシェンス（Ａｇｒｏｈａｃｔｅｒ　ｔ、ｕａ＋ｅｆ
ａｃｉｅｎｓ）からのＴ１プラスミドを使用して、植物
細胞へ挿入できろ。次に植物細胞を植物へ再生させる［
ザンブリスキ・ビー（Ｚａｍｂｒｙｓｋｉ、　Ｐ、）、
ジョースφエッチ（、ＩｎＯ２，Ｈ，）、ジエンテロ・
シー（Ｇｅｎｔｅｌｌｏ、　Ｃ，）、Ｊ−マンス、ジエ
イ（ＬｅｐＩＩｌａｎｓ、　ｊ、）、パン・モンタギュ
ー・エム（Ｖａｎ　Ｍｏｎｔ、ａｇｕｅ、　Ｍ、）、及
びシェル・ジエイ（Ｓｃｈｅｌｌ、　　ｊ、）（１９８
３年）Ｃｅｌｌ　　３２巻＋０３３−１０４３頁］、こ
の点て、特に有用なベクターはｐＥＮｒ１４にである［
クリｍ−エッチ・ジエイ（Ｋｌｅｅ、　Ｈ，Ｊ、）、ヤ
ノフスキー・エム・エフ（Ｙａｎｏｆｓｋｙ、　Ｍ、Ｆ
、）及びネスター・イー拳ダブリ：ｔ−（ＮｅＳｔｅｒ
、　Ｅ、Ｗ、）（１９８５年）Ｂｉｎ／Ｔｅｃｈｎｏｌ
ｏｇｙ　３巻６３７−Ｒ４２頁コ。このプラスミドは、
植物細胞と細菌中で複製でき、パラセンジャー遺伝子に
対して複数のクローニング位置をもっている。例えは毒
素遺伝子はｐＥＮ０４にのＲａｍＨ１へ１φ人され、大
ＩＩＩ菌中で増殖し、適当な植物細胞へ形質転換される
。

実施例７　新規なハイブリッドＲ，スリンギエンシス遺
伝子のバクロウィルスへのクロー ニング 本発明の新規なハイアリット遺伝子を、オートグラフ？
’カリフォルニカ（Ａ＋＋ｔｏｇｒａｐｈａ　ｃａｌｉ
ｆｏｒ−ｎｉｃａ）核ポリへトロシスウィルス（ＡｃＮ
ＰＶ）のようなバクロウィルスへクローン化できる。ｐ
ｕｃｓのような市販のクローニングベクターにクローン
化されたＡｃＮＰＶゲノムを含有するプラスミドを構築
できる。　ＡｃＮＰＶゲノムを変中し、ポリヘトリン遺
伝子のコード領域が除かれて、パラセンシャー遺伝子の
特異なりローニングＩｆｆ　＃がポリヘトリンプロモー
タの真後ろに置かれるようにする。このようなベクター
の例は、ベノ・ツクら［ペノック◆ジー・デイ−（Ｐｅ
ｎｎｏｃｋ、　Ｇ、ｎ、）、シューメーカー・シー（Ｓ
ｈｏｅｍａｋｅｒ、　Ｃ，）及びミラー壽エル・ケイ（
旧Ｉ　ｌ　ｅｒ。

１、！、）（１９８４年）Ｍｏ１．　ｔ’：２１１　　
Ｂｉｏｌ、　　４巻３９り−４０６頁］に記述されたｐ
ＧＰ−ＲｆｌＦ１７４、及びスミスら［スミス・シー−
イー（Ｓｍｉ　ｔ、ｌ＋、Ｇ、Ｅ、　）、サマース醗エ
ム・デイ−（Ｓｕｍｍｅｒｓ、　Ｍ、ｒｌ、）及びフレ
ーザーφエム・ジエイ（Ｆｒａｓｅｒ、　Ｍ、Ｊ、）（
１９８３年）Ｍｏ１．（：ｅｌｌ　　Ｒｉｏｔ、　　３
巻２１５６−２１６５頁］に記述されたｐＡＣ３８０で
ある。本発明の新規なタンパク毒素をコードした遺１云
子は、コード領域から上流及び下流の適当な領域で、Ｆ
ｌａｎ＋１リンカ−によって変更でき、ＡｃＮＰＶベク
ター類の一つのもののパラセンジャー位置に挿入できる
。その他のバクロウィルス、例えばスボドブテラ・エク
シグア核ポリへトロシスウィルス（ＳｅＮＰＶ）やヘノ
オシス・ジー核ポリへトロシスウィルス（ＨＺ　Ｎ　Ｐ
Ｖ）も使用できろ。これらのウィルスの各々はそれ自身
のポストに対して特異的であり、他の昆虫に対して殆ど
活性をもたない（すなわち、５ｅＮＰＶはスボトアテラ
・エクシグアにＥ％染するが、ヘリオシス・ジーにζま
感染せず、その逆も同じである。）実施例日　ウィルス
の増殖 ウィルスは適当な幼虫に感染させることにより増殖され
る。これは、マルニアック［マルニアック・ジエイ壷イ
ー（Ｍａｒｕｎｉａｋ、　Ｊ、Ｅ、）（１９８６年）「
バクロウィルスの生物学」第１巻＋２９−１７５頁、ア
ール・アール・グラントス及びヒー・エイゆフエデリッ
チ編、ＣＲＣプレス］の記述のとおり、飼料カップ表面
に挟挿ウィルスを直接塗布し、第４齢の幼虫を飼料の中
に入れることによって達成される。次に幼虫を感染後６
日に取り入れ、ＮＰＶを次のように単離する。幼虫を集
めて、均質化し、チーズ布に通して濾過する。ｎＡ液を
８．０００　ｘｇで１５分の遠心分離にかける。生ずる
ペレットをＯ，ＯＩＭ）リス−１ＩＣ１（ｐＨ７，）ｌ
）及び１．０　ｍＭ　ｌ’：ＩＩＴＡを含有する緩衝液
（ＴＥ緩衝液）中に再懸濁する。懸濁液を２０−９０％
庶糖勾配で相分離し、！００．０００　ＹＲで６０分遠
心分離する。ポリへトラは約６０１で定義されたバンド
として局所化されており、これを取り出してＴＥ緩衝液
中で希釈する。次にポリへドラを１０，０００にｇで３
０分の遠心分離にかけて単離する。

精製ポリへトラペレットをＴＥ１１１衝γαに再懸濁し
、同１　ノ０．２Ｍ　Ｎａ２ｆ：０３（ｐＨ１０，９）
、０．１７Ｍ　ＮａＣｌ、及び、ＯｍＭ　ＥＤＴＡでア
ルカリ抽出する。室温でがきませを続けながら抽出を６
０分行なう。幼虫内に閉じ込められアルカリで解放され
たウィルス（ｌａｒｖａｎｃｃｌ＋ｎ１ｅｒｌ　　ｖｉ
ｒｕｓ　　ａｌｋａｌｉ　　ｌｉｌ＋ｅｒａｔ、ｅｄ、
ＬＯＶＡｌ、）は、２０−９０１庶糖て１００，０００
　ｘｇ、６０分の遠心分離によって単離される。これら
は−重、二重、又は多重に埋め込まれたウィリオン（ｖ
ｉｒｉｏｎｓ）である。バントはすべて回収し、ＴＥ緩
衝液で希釈し、１００，０００Ｘｇで６０分の遠心分離
にかける。生ずるペレットを、１．０　ｍＭ　ＰＭＳＦ
含有のＴＥ緩衝潰に再懸濁する。

５ｅＮＰＶ及びＨｚＮＰＶ　ＬＯＶＡＬフラクションの
ポリペプチド成分は、レムリの方法［レムリ・ニー・ケ
イ（Ｌａｅｍｍｌｉ、　Ｕ、に、）（１９７０年）Ｎａ
ｔｕｒｅ（ロンドン）２２７巻６８０−ｆｌＦ１５頁］
で、ドデシル硫酸ナトリウム＜ＳＯＳ＞の存在下にポリ
アクリルアミドゲル電気泳動によって分析した。相対的
電気泳動移動度がら決定される分子型を第５表に示す。

上の手１１１ａに従って、ｌ−１ｚＮｒ’ｖ及び５ｅＮ
ＰＶ　ＩＩＩＶＡｌ’Ｎ剤について、それぞれ１３及び
１４ポリペプチドが確認された。

これらの製剤の生物検定は、ヘリオナス。ジー幼虫への
５ｅＮＰνＬＯＶＡＩ、の最少限の感染力を示した。

逆も真であることがわかった。スボトブテラ・エクシグ
アへのＨ２ＮＰＶ　Ｌｌ’１ＶＡ１．の感染力は限定さ
れていた。

実施例９　ハイブリッドウィルスの構築バクロウィルス
の毒性／特異性は、ウイリオンエンベローブ中の融合ｊ
ｑ酸成分よって付与される。

再合体センダイウイルスエンヘローブによってエプスタ
イン：バーウィルスの目標認識を変更するための既知手
法［シャピロ・アイ・エム（Ｓｈａｐｉｒｏ。

、Ｍ、）ら、（１９８０年）Ｐｒｏｃ、　　Ｎａ１１．
　　Ａｃａｄ、　　Ｓｃｉ、　　ＵＳＡ７７巻５４５３
−５４５７頁：オルスキφデイ−・ジエイ（Ｖ。

ｓｋｙ、　　ｎ、Ｊ、）ら、（＋９７！１年）Ｐｒｏｃ
、　　ｔｌａｔｌ、　　Ａｃａｄ、　　Ｓｃｉ。

１１ｓＡ　７６巻５４４０−５４４４頁］を用いて、我
々はＳ　ｅ　Ｎ　Ｐ　Ｖ　ＬＯＶＡｌ、からの可溶化エ
ンヘローブタンパクをＨ２ＮＰＶと再合体させることに
より、ハイブリッドウィルスを構築した。手順は、１．
０　ｍＭ　ＥＩＩＴＡを含有する４０ｍＭ　）　’、）
　ス−７セテ−ト（ｐＨ８，０）（ＴＡＥ緩衝ｉ＆　）
　ニＬＯＶＡ１４フラクシヨンを懸濁させることを含む
。この懸濁γ音をオクチルクルコシト（１：２　ｖ／ｖ
）と一緒に、絶えずかきまぜながら、３７℃で４時間培
養した。

不溶性ダンバクをＩｎ（１，０００ｘｙ、で６０分の遠
心分離によって除去した。可溶化ウィルスタンパクを含
有する上澄みｚαを精製Ｈ２ＮＰＶ　１ｌｌＶＡＬ（Ｉ
　：　Ｉ　ｗ／ｗ）と一緒にした。ＴＡＥ緩衝液を３回
代えて４℃、２４時間の透析によって洗剤を除去した。

ハイブリッドウィルスは、１０１庶糖クツシヨンを通し
て、１００，０００　ｘｇでＨＤ分の遠心分離によって
単離された。

次に生ずるハイブリッドウィルスを使用して、スボトブ
テラ・エクシグア及びヘリトチス・ジー双方の幼虫に感
染させた。この研究の結果を第６表に示す。これらのデ
ータは、ハイブリッドＳｅ”ＨｚＮＰＶにはｔｌ　２　
Ｎ　Ｐ　Ｖのもっていないスボトブテラ・エクシグアに
対する活性があることを示している。

とのポリペプチドに毒性を付与する原因があるかを決定
するため、５ｅＮＰν＋、＋ＩＶＡ１．のオクチルグル
コシド抽出Ｔ夜に１２５１で放射性標識を付け、未標識
Ｈ７ＮＰＶ　ＬＯＶＡＬと一緒にした。オクチルグルコ
シド抽出１１ｓｅＮｐνのＳ［１Ｓ−ＰＡＧＥのオート
ラジオグラムは・可溶性フラクション中に存在する三つ
のポリペプチドを示した。ハイブリッドウィルスの同様
な分析は、三つの５　ｅＮ　Ｐ　Ｖタンパク全部がＨ２
ＮＰＶハイブリッドと関連していることを示した。７１
Ｌ気泳動の移動度で決定されたこれらのポリペプチドの
相対的分子量を第７表に示す。

我々はハイブリッドウィルスの構築に続いて、ＮＰＶホ
スト範囲の変更を例証した。オクチルグルコシド抽出液
中に含まれるタンパクの一つがスボドブテラ・エクシグ
アに対する毒性をＨｚ　Ｎ　Ｐ　Ｖに付与しているもの
と、我々は結論している。このように、エンヘローブタ
ンパクの再合体を通して、一つの閉じ込められたＮＰＶ
から池のＮＰＶへと毒性を付与できることを我々は例証
した。

実施例１０　Ｂ、チューリンゲンシス認識タンパクと　
　　　　取替えるためにＮＰＶ融合原タンパクを　　　
　　使用してのハイブリッド毒素の構築ハイブリッドウ
ィルスの構築は、ＮＰＶエンヘローブ中のダンバクが毒
性変更の原因であることを例証している。我々はこの認
識に関わる三つの想定タンパクを確認し、観察される毒
性変更に必要な認識イベントへの個々の寄与を決定する
ため、これらをｖ４製した。この決定は、上記のように
、オクチルグルコシドフラクションから単離される３Ｍ
製タンパクとＨｚＮＰＶにより三つの異なるハイブリッ
ドウィルスを構築することによって達成できろ。どのハ
イブリッドウィルスが毒性を付与するかを決定するため
、これらを個々に生物検定した。こうして確認される認
識原因タンパクを精製し、逆相ＨＰＬＣて精製されたタ
ンパクのトリプシン断片からアミノ酸配列を決定した。

アミノ酸配列を用いてオリゴヌクレオチド・プローブを
構築でき、次にこれを用いて、標準的な分子遺伝学手法
により、ウィルスＤＮＡについて作成される遺伝子ライ
ブラリーから、認識融合原をコードした遺伝子を確認、
単離できろ。次に確認単離されたｌｌ５Ａは、タンパク
をコードする解放読取り枠を定義するために配列決定さ
れる。認識融合原をコードしたＤＮＡは、既述の手法を
用いて、Ｂ、チューリンゲンシス認識配列の代わりに、
ハイブリッド毒素構造体へクローン化できる。

この技術で周知のように、タンパクのアミノ酸配列は、
ＤＮＡの又クレオチド配列によって決定される。遺伝暗
号の主動性のため、すなわちタンパクをつくるのに使用
されろアミノ酸のほとんどに対して一つ以上の暗号化ヌ
クレオチドトリブレット酸に対して異なるヌクレオチド
配列がコードできる。二のだぬ、遺骸暗号を次のように
描くことができる。

フェニルアラニン（Ｐｈｅ）　　　ＴＴにロイシン（１
．ｅｕ）　　　　　　　　ＸＴＹイソロイシン（Ｉｌｅ
）　　　　　４７Ｍメチオニン（ト１ｅ會．）　　　　
　　　ＡＴＧバリン（Ｖａｔ）　　　　　　　　　ＧＴ
セリン（Ｓｅｒ）　　　　　　　　　ＱＲＳプロリン（
Ｐｒｏ）　　　　　　　　ＣＣＬスレオニン（　Ｔ　ｈ
　ｒ　）　　　　　　Ａ　Ｃ　Ｌアラニン（Ａｌａ）　
　　　　　　　ＧＣＬチロシン（Ｔｙｒ）　　　　　　
　ＴＡＫヒスチジン（Ｈｉｓ）　　　　　　ＣＡにグル
タミン（Ｇｌｎ）　　　　　　　ＣＡＪアスパラキン（
ＡＳｎ）　　　　　　ＡＡＫリジン（ＬｙＳ）　　　　
　　　　　ＡＡｊアスパラギン酸（Ａｓｐ）　　　　Ｇ
Ａにグルタミン＃（Ｇｌｕ）　　　　　　ＧＡＪシステ
ィン（Ｃｙｓ）　　　　　　ＴＧにトリプトファン（Ｔ
ｒｐ）　　　　　ＴＧＧアルギニン（Ａｒｇ）　　　　
　　ＷＧＺグリシン（Ｇｌｙ）　　　　　　　　ｔ’；
ａｔ。

終結信号　　　　　　　　　Ｔ　Ａ　、１解読法：各三
文字のデオキシヌクレオチドの三つ組は、左側に５′末
端、右側に３゛末端をもつ伝令ＲＮＡのトリヌクレオチ
ドに対応する。本明細書に記載のＤＮＡはすべて、ウラ
シルにはチミンを置き換えた、ｍＲＮＡの配列に対応す
る配列のＤＮＡ鎖のものである。文字はデオキシヌクレ
オチド配列を形成するプリン又はピリミジン塩基を示す
。

Ａ＝アデニン Ｇニゲアニン Ｃ＝シトシン Ｔ：チミン ＹがＡまたは（ｊの場合は、Ｘ＝Ｔ又はＣ６ＹがＣまた
はＴの場合は、×＝Ｃ１ Ｘがイ〕の場合は、Ｙ＝Ａ、　Ｇｌ　（’：叉はＴ。

ＸがＴの場合は、Ｙ＝Ａ又はＧ。

２が八又はＧの場合は、Ｗ＝Ｃ叉はＡ。

２がＣ又はＴの場合は、−：Ｃ１ −がＣの場合は、Ｚ：Ａ、　Ｇ、　Ｃ叉はＴ。

−がＡの場合は、Ｚ＝Ａ又はＧ。

Ｓが八、Ｇ、（又はＴの場合は、ＱＲ＝ＴＣ、叉はその
代わりにＳがＴ又はＣの場合は、　ＱＲ＝ＡＧ。

、１＝八又は（； に＝Ｔ又はＣ 、＝Ａ、　　Ｔ、　　Ｃ又はＧ。

Ｍ＝Ａ、　　Ｃ又はＴ。

上記は、８　、　ｔ、　、毒素の新規なアミノ酸配列が
、このタンパクの同じアミノ酸配列をコードした同等な
ヌクレオチド配列によってｖ４！！できることを示す。

従って、本発明はこのような同等なヌクレオチド配列を
包含する。史に、アミノ酸配列の変更がタンパクの二次
構造を変更しないならば、確認された構造及び機能のタ
ンパクが、このような変更によって構築できることが示
された［カイザー・イー・ティー（Ｋａｉｓｅｒ、　Ｅ
、Ｔ、）及びケズディ・エフ・ジエイ（Ｋｅｚｄｙ、　
Ｆ、ｊ、）（１９８４年）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２２３巻２
４９−２５５頁］。このように、本発明はタンパクの二
次構造を変更しないような本明細書に記載のアミノ酸配
列の変異体、又は構造が変更される場合、生物活性があ
る程度保持されるような変異体を包含する。

ハイブリッド毒素の生化学的分析 に使用される材料及び方法 〔（オ　料　〕 コリストニューラ・フミフエラナ（Ｃｈｏｒｉｓｔｏｎ
ｅｕｒａ　ｆｕｎ＋１ｆｅｒａｎａ）から誘導されるＣ
Ｆ−１細胞系統を、カナダ森林研究所［ニス・ソーヒ（
Ｓ、　５ｏｈｉ）Ｉｌｌ±、カナダ、オンタリオ州マリ
−ソールト・ストリート］から得た。切断ジフテリア毒
素をカルバイオケム（カリフォルニア州すンディエゴ）
から購入し、同位元素（１４Ｃ−ロイシン及び１’Ｃ−
ＮＡＤ）のそれぞれ３０８及び６００　ｍＣｉ／ｍｍｏ
ｌの特定活性のものをデュボンハＥＮ（マサチューセッ
ツ州ボストン）から購入した。ＨＤ−７３８，チューリ
ンゲンシス毒素結晶をＮａＢｒ勾配遠心分離によって単
離した。その池すべての薬品と試薬は、市販の最高純度
のものであった。

〔方法〕

細胞培養基 １０χ牛脂児血清、２　ｍＭ　Ｌ−グルタミン及び２．
７ｇ／ｌトリプトースブロス粉末（Ｄ　Ｉ　ＦＣＯ、ミ
シガン州デトロイト）を補充したブレース昆虫培地（Ｇ
ＩＲＣＯ、カリフォルニア州コンプトン）を入れた７５
ｃｉ２のＴ−フラスコ中で、ＣＦ−ＩＩＮ胞培養基保存
物を２８℃に保持した。培養基を１：１の分割によって
毎日処理した。

放射性ヨウ素化 ５０　ｍＭ　ＣＡＰＳ緩１ｉ液（ｐＨＩ＋）中に溶解さ
れたＨＤ−７３結晶（ｌ係ｇ／ｍｌ）をトリプシン（０
，１＋Ｉ１ｇ／ｍｌ）で消化させて、■）−７３の６４
　ｋｒｌの有毒成分をつくった。振どう浴で３７　’Ｃ
１３時間の消化を行ない、続いて２０　ｍＭグリシン−
トリス緩衝液（ｐ）ｌ　Ｆｌ、５）に対して透析した。

毒素１００７１ｇ、クロラミン−Ｔ　５０Ｊ１ｇ、　Ｎ
ａ１２Ｊ　１ｍＣ１、及び十分量の１００　ｍＭ　Ｎａ
Ｐｉ緩衝液（ｐＨ７，０）からなる反応混合物中で欣Ｉ
」性ヨウ素化を行なうと、最終容＠１．ｏｍｌを得た。

混合物を４℃で５分反応さぜ、未結合の１２５１を除く
ために遠心分離濾過（セントリコン、アミコン社製、マ
サチューセッツ州ダンバーズ）にかけた。

臭化シアン消化 ＨＤ−７３のＦ！４　ｋｄ毒素７Ｉｌ１ｇに８１（Ｘ蟻
酸８１と（ＮＲｒ２１２ｍｇを添加した。混合物を暗黒
中４℃で２４時間反応させ、次に２０ｍ門グリシンート
リス緩衝潰（ｐＨ８，６）２す・ソトルずつを５回取り
替えて透析した。

結合検定 ＣＦ−１胞を遠心分離によって取り入れ、Ｉ　ｍｇ／ｍ
の牛血清アルブミンを含有するタイロード液（ｇｍ／１
でＮａＣ１，７，０：　ＣａＣ１ｐ、２Ｈ２０，０，２
；　ＮａＨ２ＰＯ４，０，２：　ＫＣｌ、　０．２：　
ＭｇＣｌ２．６１１２０．０．１；　ＨＥＰＥＳ、　４
．８；グルコース、８．０：　ｐＨｆｌ、３）に２．９
４　Ｘ　１０５／ｍｌの濃度で再懸濁させた。結合検定
には、細胞懸濁液４５０７ｚを未標識毒素又はＣＮＲｒ
消化物５０’７ｚｌと一緒に２５℃で２０分培養し、次
にヨウ素化毒素２５７１１と一緒に更に２０分培養した
。次に細胞を回収し、ホワットマンＧＦハフイルターデ
ィスクでの真空濾過によって洗浄しく５０　ｍＭ　ＣＡ
ＰＳ緩Ｉｉ液３ｘ５　ｍｌ、ｐＨＩＩ）、細胞に結合し
た放射能を液体シンチレーションで定量した。対照の結
合は上記のように決定したが、競合リガントの不在下に
行な、つた。フィルターディスクへの背景の結合は、細
胞の不在下に行なった培養から決定された。

１’：Ｆ−２リボシル化検定 伸張因子２（ＥＦ−２）を凍麦胚芽から抽出し、既述［
レボツキ・エイ・ビー（ＬｅＨｏｃｋｉ、　Ａ、Ｒ，）
（１９７９年）Ｍｅｔ、ｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、　
５０巻７０３−７１２頁］のとおり、部分的に精製した
。！４Ｃ−ＮＡ１１を脱イオン水で２４０　ｍｃ／ｍｍ
ｏ　ｌの特定活性まで希釈した。リボシル化検定は、Ｅ
Ｆ−２（０，８ｍｇ）１７０Ｉｚ　Ｉ、ハイブリッド毒
素又はジフテリア毒素（対照）２０７ｚｌ、及び１４Ｃ
−ＮＡＤ　１０ノｌを含有する２００１１１の罎終容量
で行なった。毒素及びＥＦ−２を３７（〕で２０分ＩＰ
ｉ黄し、続いて＋４（ニーＮＡＤを加え、再び３７℃で
３０分の培養を行なった。水冷５％）ノクロロ酢＃（Ｔ
ＣＡ）３　ｏｗｌの添加で反応を停止させ、沈殿するタ
ンパクをＧＦハフイルターディスクでの真空濾過によっ
て集め、液体シンチレーションで計測した。

ＣＦ−１１１１での１４（−ロイシンのタンパクへの取
込み培養は典型的には、５ｘｌＯ’／ｍｌの濃度で細胞
培地に懸濁されたＣＦ−１細胞４５０μＩと、ハイブリ
ッド毒素、ジフテリア毒素、■）−７３又は適当な対照
緩衝液５０７＋ｌを含有する５００μｍの容量で実施さ
れた。

種々の間隔でｌ００７Ｌｌの７リコードを取り出し、１
４Ｃ−ロイシン１０７１１と共に３０分培養した。細胞
を遠心分離によってベレット化し、上澄み液を捨てた。

！Ｉ胞ペレットを０．ＩＮ　ＫＯ）Ｉ　２００μｍの添
加によって可溶化し、タンパクを水冷２０ＸＴＣＡ２０
０７Ｌｌの添加によって沈殿させた。氷上で１５分後、
ＴＣＡ沈穀物をホワットマンＧＦ／Ｂディスク（ホワッ
トマン・ラボラトリ−・プロダクツ社、ニューシャーシ
ー州りリフトン）での真空濾過によって集め、冷たい１
０％ＴＣＡ　３　ｍｌで２回洗った。フィルターディス
クについて、既述のとおり放射能の計測を行なった。

放射性ヨウ素化ＨＤ−７３のＳＩ’１Ｓ−ＰＡＧＥゲル
から展開されたオートラジオグラムは、トリプシン消化
によってつくられる６４　ｋｄの活性毒素タンパクの標
識付けを例証した。標識付きタンパクの特異活性は３ｘ
１０１６ｃｐｍ／ｍｏｌと推定された。第２図は、３５
７１ｇ／ｌのＩＣ５゜によろＣＦ−１細胞への結合のた
めに、未標識ＨＤ−７３が標識付き毒素と競合すること
を示している。史に、放射性標識１：１き毒素の結合は
急速に（＜５分）平衡化し、ｔ’＊　浄手１１１ａによ
って逆転されなかった。飽和研究は細胞当たり＞ｌＸｌ
０６結合位置の推定値を与えた。これらの知見は、培養
基中でＨＤ−７３の放射性標識付きの６４に＋Ｌトリプ
シン消化ペプチドのＣＦ−１昆虫細胞への特異的結合を
例証している。

６４　ｋｒｌ成分は従って、ハイブリッド毒素構造体の
結合位置認識部分に対する有効な候補と考えられる。

更に６４　ｋｄ毒素の結合位置認識領域を脱線状化する
ために、ＣＮ　Ｒｒでの消化を行なって、分析用の小ペ
プチド類を生しさせた。＋４　ｋｄの切取り膜に通して
透析後、５Ｏ５−ＰＡ（：Ｅで立証されたとおり、１８
及び１９ｋｄの分子量のペプチドが得られた。ＣＦ−１
細胞での結合実験は、このペプチド混合物がヨウ素化さ
れた６４　ｋｄの結合に対して部分的に競合することを
例証した（第３図）。従って、ＨＤ−７３の結合領域は
、ＣＮ８ｒで生ずるこれらの２ペプチドの少なくとも一
つに１Ω置づけられるμ込みである。

第４図は、小麦旺芽ＥＦ−２のジフテリア毒素で刺激さ
れたＡ　ＩＩ　Ｐ−リボシル（ｈの濃度依存性を示す。

半晟大リボシル化は０．８　ｎｇ／ｒＲ１のジフテリア
毒素濃度で得られた。ジフテリア毒素飽和濃度でのＡＩ
ＩＰ−ノボシル化のｆｖ度は、我々の手で極めて再現性
があり、従ってハイブリッド毒素で触媒されたリボシル
化の定＃を指数として使用した。第５図はこのような測
定結果を与えるもので、４分のｌ長及び２分の１長のハ
イブリッド毒素がジフテリア毒素より５．０００分の１
の効力ではあるが、リボシル化能力に関してほぼ同等で
あることを示す。しかし、ハイブリッド毒素製剤の相対
的純度の不確実性のため、後者の比較が近似的なものと
なり、低めの効力予測値となっているのはほぼ確実であ
る。

第６図は、放射性標識付きロイシンのＣＦ−１細胞タン
パクへの取込みに対するＨＤ−７３毒素の阻止効果を例
証している。半最大阻止は４０７ｚｇ／ｍｌの）ＩＤ−
７３Ｊ度で得られ、上に挙げた結合データとよく一致し
ている。ＨＤ　−７３の結合とタンパク合成の阻止との
間の補足的な一致が、阻＋ｈ効果の時間経過及び不可逆
性について確立されたう ４分の１長及び２分の１長ハイブリツト毒素と一緒にＣ
Ｆ−１細胞を培養すると、ダンバク合成の阻止が徐々に
進む結果となる（第７図）。２４時間露出データから、
ｌＩＤ−７３で確定された効力に対して、４分の１長ハ
イブリツト毒素では４０倍の効力増加、及び２分の１長
では１００培の効力増加が推定される。ハイブリッド毒
素で見られる長い時間経過と効力増加は、その作用機構
がＨＤ−７３のそれと異なることを示している。更に、
ジフテリア毒素は２００μｇ／ｍｌまでの濃度では、Ｃ
Ｆ−１細胞のタンパク合成を阻止しない。従って、ハイ
ブリッド毒素製剤で生しる阻止がジフテリアかＲ、ｔ　
、の毒素領域に関連していることはありえない。もっと
も、ハイブリッド構造体のこれらの二部外が実験条件下
に解離するならば関連があるかもしれない。むしろ、こ
れらの知見は、無１瑳のハイブリッド毒素に独特な阻止
機構を実証しているものと、我々は結論している。

プラスミドの調製とホスト生物の形質転換に使用される
種々の方法はこの技術で周知である。これらの手順はす
べて、マニアチス・ティー（Ｍａｎｉａｔｉｃ．　Ｔ、
）、フリフシ１’イー・エフ（Ｆｒｔｔ、ｓｃｈ、　Ｅ
。

Ｆ、）及びサムブロック・ジエイ（ＳａｍｈｒｏｏＪ　
Ｊ、）（１９８２年）、「分子クローニング：実験マニ
ュアル」（コールｌ”−スプリング争ハーバー研究所、
ニューヨーク州）に記述されている。このように、微生
物細胞からＤＮＡを抽出し、制限酵素での消化を行ない
、ＤＮＡ断片を電気泳動にがけ、プラスミドのテーリン
グとアニーリングを行ない、ＤＮＡを挿入、再結合し、
細胞を形質転換し、プラスミドＤＮＡを調製し、タンパ
クを電気泳動にかけ、ｒｌＮＡの配列を決定するのは、
遺伝子工学の当業者の技術範囲にある。

本明細書で明らかにされている制限酵素は、ヘセスダ研
究所（メリーラント州ゲイサーズバーグ）及びニューイ
ングランド・バイオラブ（マサチューセッツ州ビバリー
）から購入できる。酵素は、供給側から提供されろ指示
に従って使用される。

ｐＭＹｃ２６としても知られるプラスミドｐ２６を含有
するホストの二次培養基は、現在、カリフォルニア州す
ンディエゴのマイコジエン・コーポレーション培養基保
存施設に寄託されている。これは合えば透明溶菌イソピ
クリン酸密度勾配手順等を使用して得ることができる。

３７　ＣＦＲｌ、＋４及び３５　ＵＳＣＩ２２（７）下
で適格性を特許庁長官に認められた者は、本特許出願の
係属中に、培養基を人手できることを保証される条件で
本培４基が寄託された。

また、本米国出！Ｉ２１ｉ又はその子孫の対応特許出願
が提出されている国々の米国以外の外国特許法で要求さ
れろならば、寄託物は人手できる。しかし、寄託物が人
手できるからといって、行政行為によって付与された特
許権を損わしめて本発明の実施する権利を構成するもの
ではないことを理解すべきである。

史に、本培養基寄託物は、ブタベストｔａ＋生物寄託条
約の規定に従って保存され、一般の人々に人手可能とさ
れる。すなわち、寄託物の試料堤供に対する最も最近の
請求後少なくとも５年間、かつとんな場合も、寄託明日
から少なくとも３０年間か、又は培養基を開示して発行
される特許の権利行使可能な間開中、これらの寄託物は
、生育可能で汚染されていない状態に１呆つために必要
なあらゆる配慮をもって保存される。要求を受けた受託
施設が、寄託物の状態のために試料を供給できない場合
には、寄託者は寄託物を補充する義務を認めるものであ
る。本培養基寄託物の一般への人手可能性に関するすべ
ての制限は、これらを開示した特許の付与に際して永久
に取り除かれる。

【図面の簡単な説明】

第１図はＭ　Ｒ４３６コ一ト配列の部分制限酵素地図で
ある。 第２図はＣＦ−１細胞へのＨＤ　−７：’ｌ毒素の結合
を示すグラフである。 第３図はＣＦ−１細胞への結合に対するＣｔｌＢｒペプ
チドと放射性ヨウ素化旧）−７３のとの競合を表す折れ
線グラフである。 第４図はＥＦ−２のジフテリア毒素で触媒されたＡ　Ｏ
Ｐ−リボシル化を表すグラフである。 第５図はＥＦ−２のハイブリッド毒素で触媒されたリボ
シル化を表すグラフである。 第６図は）Ｉ　Ｄ　−７３毒素によるＣＦ−１細胞タン
パク合成の阻止を表すグラフである。 第７図はハイブリッド毒素によるＣ　Ｆ　−１細胞タン
パク合成の阻止を表す棒グラフである。 出願人　マイコゲン　コーポレーション代理人　佐々井
　弥太部　（外１名） ＰｖｕｘＩ Ｒｓａｌ ａｃＩ ａｕ３ＡＩ ａｕ９６１ ｃｉＮＸ ｂａＸ ｈｏｌ ×ｈ口ＩＩ ｍｎ１ １工 ｌ　　：Ｓ　　エ 手 事件の表示 平成０１年特許願第１０７１１９４号 補正をする者 事件との関係

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、細胞毒剤と、タンパクの害虫腸上皮細胞認識部分と
   を含めてなる、ハイブリッド殺虫剤タンパク毒素。 ２、細胞毒剤がＡＤＰ−リボシル化酵素である、特許請
   求の範囲第１項による毒素。 ３、該ＡＤＰ−リボシル化酵素がジフテリア毒素である
   、特許請求の範囲第２項による毒素。 ４、該細胞毒剤がリシン、ジアンチン、サボリン、ゲロ
   ニン、トリチン、アブリン、及びモデシンからなる群か
   ら選ばれるリボソーム不活性化酵素である、特許請求の
   範囲第１項による毒素。 ５、該細胞毒剤がオオムギ、ライ麦、トウモロコシ、及
   びワイルドビーンからなる群から選ばれる種子から得ら
   れるリボソーム不活性化酵素である、特許請求の範囲第
   １項による毒素。 ６、使用のジフテリア毒素が、ジフテリア毒素のＡ断片
   に、真核生物認識領域を除くためにカルボキシル末端で
   切断されたジフテリア毒素のＢ断片を加えたものである
   、特許請求の範囲第３項による毒素。 ７、該殺虫剤タンパク毒素がバシラス・チューリンゲン
   シスのタンパク毒素である、特許請求の範囲第１項によ
   る毒素。 ８、該バシラス・チユーリンゲンシスタンパク毒素が、
   バシラス・チューリンゲンシス・バラエティ・カースタ
   キＨＤ−７３からの遺伝子断片で発現される、特許請求
   の範囲第７項による毒素。 ９、該細胞毒剤とタンパクの害虫腸上皮細胞認識部分と
   が、昆虫プロテアーゼ開裂に対する感受性を最少限に抑
   えるために、適当な長さとアミノ酸組成のペプチドリン
   カーによって一緒に連結される、特許請求の範囲第１項
   による毒素。 １０、該ペプチドリンカーが４個以下のアミノ酸からな
   る、特許請求の範囲第９項による毒素。 １１、該ペプチドリンカーがリジン残基を含有しない、
   特許請求の範囲第９項による毒素。 １２、細胞毒剤とタンパクの害虫腸上皮細胞認識部分を
   含めてなるＤＮＡ運搬ベクターで形質転換させた微生物
   と、不活性殺虫剤担体との組合わせを含めてなる微生物
   殺虫剤組成物。 １３、該細胞毒剤がＡＤＰ−リボシル化酵素である、特
   許請求の範囲第１２項による殺虫剤組成物。 １４、該ＡＤＰ−リボシル化酵素がジフテリア毒素であ
   る、特許請求の範囲第１３項による殺虫剤組成物。 １５、該細胞毒剤がリシン（ｒｉｃｉｎ）、ジアンチン
   （ｄｉａｎｔｈｉｎ）、サポリン（ｓａｐｏｒｉｎ）、
   ゲロニン（ｇｅｌｏｎｉｎ）、トリチン（ｔｒｉｔｉｎ
   ）、アブリン（ａｂｒｉｎ）、及びモデシン（ｍｏｄｅ
   ｃｃｉｎ）からなる群から選ばれるリボソーム不活性化
   酵素である、特許請求の範囲第１２項による殺虫剤組成
   物。 １６、該細胞毒剤がオオムギ、ライ麦、トウモロコシ、
   及びワイルドビーンからなる群から選ばれる種子から得
   られるリボソーム不活性化酵素である、特許請求の範囲
   第１２項による殺虫剤組成物。 １７、使用のジフテリア毒素が、ジフテリア毒素のＡ断
   片に、真核生物認識領域を除くためにカルボキシル末端
   で切断されたジフテリア毒素のＢ断片を加えたものであ
   る、特許請求の範囲第１４項による殺虫剤組成物。 １８、該殺虫剤タンパク毒素がバシラス・チューリンゲ
   ンシスのタンパク毒素である、特許請求の範囲第１２項
   による殺虫剤組成物。 １９、該バシラス・チューリンゲンシスタンパク毒素が
   、バシラス・チューリンゲンシス・バラエティ・カース
   タキＨＤ−７３からの遺伝子断片で発現される、特許請
   求の範囲第１８項による殺虫剤組成物。 ２０、該細胞毒剤とタンパクの害虫腸上皮細胞認識部分
   とが、昆虫プロテアーゼ開裂に対する感受性を最少限に
   抑えるために、適当な長さとアミノ酸組成のペプチドリ
   ンカーによって一緒に連結される、特許請求の範囲第１
   ２項による殺虫剤組成物。 ２１、該ペプチドリンカーが４個以下のアミノ酸からな
   る、特許請求の範囲第２０項による殺虫剤組成物。 ２２、該ペプチドリンカーがリジン残基を含有しない、
   特許請求の範囲第２０項による殺虫剤組成物。 ２３、第３表に示すアミノ酸配列をもつた２分の１長の
   ハイブリッドＢ．ｔ．毒素をコードしたＤＮＡ。 ２４、第４表に示すアミノ酸配列をもった４分の１長の
   ハイブリッドＢ．ｔ．毒素をコードしたＤＮＡ。 ２５、第１表に示すヌクレオチド配列をもつた、特許請
   求の範囲第２３項によるＤＮＡ。２６、第２表に示すヌ
   クレオチド配列をもった、第２４項によるＤＮＡ。 ２７、第３表に示すアミノ酸配列をもった鱗翅目昆虫に
   活性のある毒素、及びタンパクの二次構造が変更されて
   いないか、又は構造が変更されていても、生物活性があ
   る程度保持されるようなその毒素の変異体。 ２８、第４表に示すアミノ酸配列をもった鱗翅目昆虫に
   活性のある毒素、及びタンパクの二次構造を変更しない
   か、又は構造が変更される場合、生物活性がある程度保
   持されるような毒素変異体。 ２９、第３表に示すアミノ酸配列をコードしたヌクレオ
   チド配列の全部又は一部をもったＤＮＡを含めてなる組
   換えＤＮＡ運搬ベクター。 ３０、第４表に示すアミノ酸配列をコードしたヌクレオ
   チド配列の全部又は一部をもったＤＮＡを含めてなる組
   換えＤＮＡ運搬ベクター。 ３１、原核又は真核生物ホストへ運搬され、そこで複製
   される、特許請求の範囲第２９項によるＤＮＡ運搬ベク
   ター。 ３２、原核又は真核生物ホストへ運搬され、そこで複製
   される、特許請求の範囲第３０項によるＤＮＡ運搬ベク
   ター。 ３３、第３表に示すアミノ酸配列をもった２分の１長ハ
   イブリッドＢ．ｔ．毒素を発現させるために形質転換さ
   れる細菌ホスト。 ３４、第４表に示すアミノ酸配列をもった４分の１長ハ
   イブリッドＢ．ｔ．毒素を発現させるために形質転換さ
   れる細菌ホスト。 ３５、２分の１長ハイブリッドＢ．ｔ毒素遺伝子が第３
   表に示すアミノ酸配列をもった２分の１長Ｂ．ｔ．毒素
   をコードしている場合の、この遺伝子を含んだプラスミ
   ドベクダーで形質転換される、特許請求の範囲第３３項
   によるシュードモナス・フルオレツセンス（Ｐｓｅｕｄ
   ｏｍｏｎａｓ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）。 ３６、４分の１長ハイブリッドＢ．ｔ．毒素遺伝子が第
   ４表に示すアミノ酸配列をもつた４分の１長Ｂ．ｔ．毒
   素をコードしている場合の、この遺伝子を含んだプラス
   ミドベクダーで形質転換される、特許請求の範囲第３４
   項によるシュードモナス・フルオレッセンス。 ３７、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、ア
   ゾトバクター（Ａｚｏｔｏｈａｃｔｅｒ）、エルウィニ
   ア（Ｅｒｗｉｎｉａ）、セラティア（Ｓｅｒｒａｔｉａ
   ）、クレブシェラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌ−ｌａ）、リゾビ
   ウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、ロードシュードモナス（
   Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、メチロフィリウ
   ス（Ｍｅ−ｔｈｙｌｏｐｈｉｌｉｕｓ）、アグロバクテ
   リウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅ−ｒｉｕｍ）、アセトバク
   ター（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）又はアルカリゲネス（
   Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）の種である、特許請求の範囲
   第３３項と第３４項による微生物。 ３８、微生物が有色素で葉面接着性である、特許請求の
   範囲第３７項による微生物。 ３９、特許請求の範囲第３７項による微生物を鱗翅目昆
   虫に、又は該昆虫の環境に投与することを含めてなる、
   鱗翅目昆虫類の防除法。 ４０、投与が根の周辺に対してである、特許請求の範囲
   第３９項による方法。 ４１、投与が葉面に対してである、特許請求の範囲第４
   ０項による方法。 ４２、投与が水に対してである、特許請求の範囲第３９
   項による方法。 ４３、目標害虫環境に施用されると持続的な殺虫活性を
   もった、実質的に無傷の処理細胞を含有する殺虫剤を含
   めてなる殺虫剤組成物であって、該殺虫剤が鱗翅目昆虫
   に有毒なポリペプチドで、細胞内にあり、第３表又は第
   ４表に示すアミノ酸配列をもったハイブリッドＢ．ｔ．
   毒素を発現できる形質転換された微生物の発現の結果と
   してつくられる場合の殺虫剤組成物。 ４４、環境中で殺虫活性を持続させるために処理細胞が
   化学的又は物理的手段によって処理される、特許請求の
   範囲第４３項による殺虫剤組成物。 ４５、細胞が原核生物又は低級真核生物である、特許請
   求の範囲第４４項による殺虫剤組成物。 ４６、原核生物細胞が腸内細菌科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃ
   −ｔｅｒｉａｃｅａｅ）、バシラス科（Ｂａｃｉｌｌａ
   ｃｅａｅ）、リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ
   ）、らせん科（Ｓｐｉｒｉｌｌａｃｅａｅ）、乳酸杆菌
   科（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ）、シュードモ
   ナス科（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ）、アゾト
   バクター科（Ａｚｏ−ｔｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ）及
   びニトロバクター科（Ｎｉｔｒｏｂａｃ−ｔｅｒａｃｅ
   ａｅ）からなる群から選ばれる、特許請求の範囲第４５
   項による殺虫剤組成物。 ４７、低級真核生物細胞が藻菌類（Ｐｈｙｃｏｍｙｃｅ
   −ｔｅｓ）、子のう菌類（Ａｓｃｏｍｙｃｅｔｅｓ）、
   及び担子菌類（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｅｔｅｓ）からな
   る群から選ばれる、特許請求の範囲第４５項による殺虫
   剤組成物。 ４８、細胞が有色素細菌、酵母又はカビである、特許請
   求の範囲第４３項による殺虫剤組成物。 ４９、第３表又は第４表に示すアミノ酸配列のポリペプ
   チド毒素をコードした、鱗翅目昆虫に有毒なバシラス・
   チューリンゲンシス毒素遺伝子の発現結果である細胞内
   毒素を含有する処理された実質的に無傷の単細胞微生物
   であって、該細胞を目標昆虫環境に施用する時に殺虫活
   性を持続させるような条件下に細胞が処理される場合の
   微生物。 ５０、環境中で殺虫活性を持続させるために細胞が化学
   的又は物理的手段によって処理される、特許請求の範囲
   第４９項による細胞。 ５１、微生物がシュードモナスであり、毒素が第３表又
   は第４表に示すアミノ酸配列をもったＢ．ｔ．毒素であ
   る、特許請求の範囲４９項による細胞。 ５２、細胞がヨウ素で処理される、特許請求の範囲第５
   １項によるシュードモナス細胞。５３、シュードモナス
   ・フルオレッセンスである、特許請求の範囲第４９項に
   よる細胞。５４、細胞毒剤とタンパクの害虫腸上皮細胞
   認識部分とを含めてなるＤＮＡ運搬ベクターで微生物を
   形質転換させ、この微生物を昆虫に、又は該昆虫環境に
   投与することを含めてなる昆虫防除法。 ５５、該昆虫が鱗翅目、鞘翅目、双翅目、半翅目、革翅
   目、及び直翅目からなる群から選ばれる目に属している
   、特許請求の範囲第５４項による方法。 ５６、該昆虫がクモ形類（ａｒａｃｈｎｉｄｓ）である
   、特許請求の範囲第５４項による方法。 ５７、該昆虫が腹足類（ｇａｓｔｒｏｐｏｄｓ）である
   、特許請求の範囲第５４項による方法。 ５８、該昆虫がぜん虫（ｗｏｒｍｓ）である、特許請求
   の範囲第５４項による方法。 ５９、該ぜん虫類が線虫類（ｎｅｍａｔｏｄｅｓ）であ
   る、特許請求の範囲第５８項による方法。 ６０、該ぜん虫類が扁形動物である、特許請求の範囲第
   ５８項による方法。 ６１、該細胞毒剤とタンパクの害虫腸上皮細胞認識部分
   とが、昆虫プロテアーゼ開裂に対する感受性を最少限に
   抑えるために、適当な長さとアミノ酸組成のペプチドリ
   ンカーによって一緒に連結される、特許請求の範囲第５
   ４項による方法。 ６２、該ペプチドリンカーが４個以下のアミノ酸からな
   る、特許請求の範囲第６１項による方法。 ６３、該ペプチドリンカーがリジン残基を含有しない、
   特許請求の範囲第６１項による方法。 ６４、該細胞毒剤とタンパクの害虫腸上皮細胞認識部分
   とを含めてなるハイブリッド殺虫剤タンパク毒素をコー
   ドした遺伝子を、植物へ挿入することを含めてなる、植
   物上の昆虫の防除法。 ６５、細胞毒剤がＡＤＰ−リボシル化酵素である、特許
   請求の範囲第６４項による方法。６６、該ＡＤＰ−リボ
   シル化酵素がジフテリア毒素である、特許請求の範囲第
   ６５項による方法。 ６７、該細胞毒剤がリシン、ジアンチン、サボリン、ゲ
   ロニン、トリチン、アプリン、及びモデシンからなる群
   から選ばれるリボソーム不活性化酵素である、特許請求
   の範囲第６４項による方法。 ６８、該細胞毒剤がオオムギ、ライ麦、トウモロコシ、
   及びワイルドビーンからなる群から選ばれる種子から得
   られるリボソーム不活性化酵素である、特許請求の範囲
   第６４項による方法。 ６９、使用のジフテリア毒素が、ジフテリア毒素のＡ断
   片に、真核生物認識領域を除くためにカルボキシル末端
   で切断されたジフテリア毒素のＢ断片を加えたものであ
   る、特許請求の範囲第６６項による方法。 ７０、該殺虫剤タンパク毒素がバシラス・チューリンゲ
   ンシスのタンパク毒素である、特許請求の範囲第６４項
   による方法。 ７１、該細胞毒剤とタンパクの害虫腸上皮細胞認識部分
   とが、昆虫プロテアーゼ開裂に対する感受性を最少限に
   抑えるために、適当な長さとアミノ酸組成のペプチドリ
   ンカーによって一緒に連結される、特許請求の範囲第６
   ４項による方法。 ７２、該ペプチドリンカーが４個以下のアミノ酸からな
   る、特許請求の範囲第７１項による方法。 ７３、該ペプチドリンカーがリジン残基を含有しない、
   特許請求の範囲第７１項による方法。 ７４、ウィルス類ＳｅＮＰＶＬＯＶＡＬ及びＨｚＮＰＶ
   のエンベロープ部分を含めてなる、ウィルスＨｚＮＰＶ
   のハイブリッドウィルス。 ７５、変更されたＮＰＶ昆虫ホスト範囲をもつハイブリ
   ッドウィルスをつくるために、可溶化エンベロープタン
   パクを一つの閉じ込められたＮＰＶから別のＮＰＶへ再
   合体させることを含めてなる、ＮＰＶ昆虫ホスト範囲を
   変更する方法。 ７６、ウィルス類ＳｅＮＰＶＬＯＶＡＬ及びＨｚＮＰＶ
   のエンベロープ部分を含めてなるハイブリッドウィルス
   を、スポドプテラ・エクシグア（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ
   ｅｘｉ−ｇｕａ）及び／又はヘリオチス・ジー（Ｈｅｌ
   ｉｏｔｈｉｓｚｅａ）の幼虫に、又は該幼虫の環境に投
   与することを含めてなる、該幼虫の防除法。 ７７、タンパクの該害虫腸上皮細胞認識部分がＮＰＶ融
   合原タンパクである、特許請求の範囲第１項による毒素
   。 ７８、該ＮＰＶ融合原タンパクが、昆虫プロテアーゼ開
   裂に対する感受性を最少限に抑えるために、適当な長さ
   とアミノ酸組成のペプチドリンカーによって細胞毒剤に
   連結される、特許請求の範囲第７７項による毒素。 ７９、該ペプチドリンカーが４個以下のアミノ酸からな
   る、特許請求の範囲第７８項による毒素。 ８０、該ペプチドリンカーがリジン残基を含有しない、
   特許請求の範囲第７８項による毒素。