JPH07503857A - アフィディダエ科の害虫を抑制するためのバシラス・チューリンゲンシス単離体の用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の名称 アフィディダ工科の害虫を抑ル１するための一一バシラス・チューリンゲンシス 単離体の用途ＩＬ立ＩＪ 胞子形成性の微生物バシラス・チューリンゲンシス（Ｂ、ｔ、）は最も良く知ら れた対昆虫毒素を生産する。この毒素はδ−エンドトキシンと命名される蛋白質 である。

この蛋白質はバシラス・チューリンゲンシス胞子形成細胞によって合成される。

この毒素はその結晶・形で感受性の昆虫の幼虫により摂取されると昆虫のｉＩ液 液口白質分解酵素よって生物活性部分に変換される。主要な標的は騙の上皮の昆 虫ＩＩ胞であり、それらの細胞は急速に破壊される。経験によってＢ、　Ｌ、毒 素の活性は非常に高いので感受性の昆虫ｔｔ殺すのにナノグラム量しか必要とさ れないことが示されている。

Ｂ、ｔ、の報告されている活性スペクトラムは、！業及び林業に於ける昆虫の被 害を主とし・で生じる鱗翅目内の昆虫橿をカバーしている。その活性スペクトラ ムはまた双翅目の昆虫を含み、ここには蚊やブヨ（ブラックフライ）が含まれる 。デ　パルジャック、エイチ、（［１９９０］、Ｈ，デバルジャック、Ｄ、Ｊ、 サガラント（編）「蚊とブヨの細菌による防除（Ｂａｃｔｅｒｉａｌ　Ｃｏｎｔ ｒｏｌ　ｏｆ　Ｍｏ５ｑｕｉｔｏｅｓ　ａｎｄＢｌａｃｋｆｌｉｅｓ）　Ｊ　、 ルトカースユニバーシティープレス（Ｒｕｔｇｅｒｓ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　 Ｐｒｅｓｓ）　＋第２章）、米国特許第４゜７７１．１３１及び４，９９Ｇ、１ ５５は鞘翅目の甲虫に対し活性の毒素遺伝子を開示している。インセクタ科外の ものに対する活性も報告されている。線虫に対し活性を有するｓ、ｔ４株が米国 特許第４．９４８．７３４に開示されている。

アリマキ（ヘミブテラ（Ｈｅｗｉρｔｅ　ｒａ　）目、アフイディダエ（Ａｐｈ ｉｄｉｄａｅ）科）は多くの経済的に重要な植物に損傷を与えているサラキング インセクト（吸引昆虫）である。

植物の損傷はアリマキが多数で植物に蔓延るときに起きる。アリマキは単為性殖 により増殖できるので、アリマキの個体数は急速に増加する可能性を有している 。多数のアリマキは真菌類の繁殖に寄与し得る。アリマキに食へられることによ って生じるｔｊｌｌＩ＋の他に、アリマキは植物の多くのウィルス病に対し一病 原菌を媒介し得る。

経済的に重要な意味を持つアリマキには、グリーンピーチアフィツト（Ｍ　＞　 ｚ　ｕ　ｓ　ｐ　ｅ　ｒ　ｓ　ｉ　ｔ：　ａ　ｅ　）、エントウアリマキ（２Ｌ ＞ｒＬｌ＋ｏｓｉｐｈｏｎ　ｐｉｓｕＩｌ）、キャベツアリマキ（Ｂｒｅｖｉｃ ｏｒｙｎｅｂｒａｓ＞１ｃａｅ）、コ１）アフ１Ｆ（！ｐｈｉｓ　８ｏｓｓ＞ｐ 目）及びブラソクビーンアフイｌ゛（Ａ＋、ｌ＋ｉｓ　ｆａｂｈｅ）が含まれる 。

本　明の短いまとめ 本発明は殺アリマキ性を有し、ているバシラス・チューリンゲンシス単離体に関 する。より詳しくは、本発明は環境中のアリマキを抑制する為の、Ｂ、ｔ、ＰＳ １５７ＣＩ　（Ｂ、ｔ、ＭＴｉＯ３としても知られる）　、　［１，Ｌ、Ｉ”５ ８ＧＡＩ、及び［１，Ｌ、ＰＳ７５Ｊｌと命名されるバシラス・チューりンゲン ンス単２１体の用途に間するものである。

本発明のＲ，Ｌ、単離体の殺アリマキ用途は、本明細書中エントウアリマキのア シルソシホン　ビスム（Ａｃｙｒｔｈｏｓｉｐｈｏｎ　ｐｉｓｕｌｌ）に対する それらの活性によって実施汐１ζこより示される。従って、これらの単離体はこ の７１ノマキ及びアフィデ、・クエ（Ａ　ｐ　ｈ　ｉ　ｄ　ｉ　ｄ　ａ　ｅ　） 科の池の７１ノマキを抑制するのに使用できる。更にｅ、ｔ、単離体からの６・ エンドトキシン（δ−内毒素）は標準の手順、例え′ｃｌイオン交１負によって 単Ｍ出来、これらの昆虫の害虫を抑制する為に標準手順によって処方出来る。更 ζこ、殺アＩ）マキ青紫をコートしている本発明のＢ、ｔ、単離体からの遺伝子 ζよ、単離体からクローン化でき、そして次に池の宿主、例えば原核生物、真核 性物又は植物を形質転換するのＬこ使用出来、それらの形質転換宿主はアリマキ を抑ル１するのζこ使用てきるか、またはトランスジエニ・ツクな植物の場合に はアリマキに対し、抵抗性とすることｆ）Ｉ出来る。

本明細書に特定して例示されているのはＢ、ｔ、ＰＳ８６Ａｌ力）ら得られる遺 伝子８６Ａ１のクローニングである０本発明の教えを使用して、当業者は他のＢ 、ｔ、殺アリマキ毒素並びにそのような毒素をコートする遺伝子を同定出来る。

図面の簡単な記載 図１は本発明の単離体のアルカリ可溶性蛋白質を示してる１２％ＳＯＳポリアク リルアミドゲルの写真である。

図２はブラスミＦ　ｒ）　Ｍ　Ｍ　Ｃ２３２０の制限地図である。

配列の簡単な記載 ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、１はＢ、ｔ、ＰＳ８６Ａｌ遺伝子のＤＮＡ配列である。

ＳＥＱ　１０　Ｎｏ、２はＢ、ｔ、ＰＳ８６ＡＩの遺伝子によつてコードされる 毒素のアミノ酸配列である。

ＳＥＱ　１０　Ｎｏ、３は本発明に従うペプチド配列である。

ＳＥＱ　１０　Ｎｏ、４は本発明に従うペプチド配列である。

ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、５は本発明に従うペプチド配列である。

ＳＥＱ　１０　Ｎｏ、６は本発明に従うペプチド配列である。

ＳＥＱ　１０　Ｎｏ、７は本発明に従うペプチド配列である。

ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、８は８６ＡｌのＮ−末端アミノ酸配列である。

ＳＥＱ　１０　Ｎｏ、９は８６ＡｉＡと命名される　ＳＥＱ　１０　Ｎｏ、３か ら設計されるオリゴヌクレオチドプローブである。

ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、ＩＯは本発明に従うヌクレオチド配列である。

ＳＥｏ　１０　Ｎｏ、ｌｌは本発明に従うヌクレオチド配列である。

ＳＥｏ　１０　Ｎｏ、１２は本発明に従うヌクレオチド配列である。

ＳＥＱ　１０　Ｎｏ、Ｉ３は本発明に従うヌクレオチド配列である。

ＳＥＱ　１０　Ｎｏ、Ｉ４は本発明に従うヌクレオチド配列である。

発明の詳細なシ載 本発明は殺アリマキ活性を有しているバシラスやチューリンゲンシス単離体に関 するものである。これらの単離体は１ｌｔ１１される殺アリマキ活性の役割をな す毒素であるδ−エンドトキシンをコードしている遺伝子を含んでいる。従って 、本発明は殺アリマキｅ、ｔ、単離体、殺アリマキ８．ｔ、毒素、及びこれらの 毒素をコードする遺伝子に間するものである。更に本発明の具体例は、殺アリマ キＢ、ｔ、毒素に対しコードする遺伝子で形質転換された組替え宿主に間する。

好まし・い具体例で形質転換さらた宿主は、植物であり、その植物はｅ、　Ｌ、 遺伝子での形質転換の為にアリマキに対し抵抗性である０本発明は更にアリマキ を抑制する為の方法に間し、この方法は本発明の単離体、［Ｌ遺伝子及び朝替え 宿主の使用を含んでいる。

本明細書で特定して例示されるのは、Ｂ、Ｌ、ＰＳＩ５７Ｃ１，Ｂ。

ｔ、Ｐ５８６ＡＩ、及び［１，ｔ、ＰＳ７５ＪＩと命名される単離体で、Ｓる。

またここで特定して例示されるのはＰＳ８０Ａ＋と命名される［Ｌ及びこの毒素 をコードする遺伝子である０本出願に記載される発見は、殺アリマキ活性を有す る他の！ｌ素（及びその毒素をコートする遺伝子）を当業者が同定出来るように するものである０本発明の毒素は殺アリマキ性であること、及び次の特性の１又 はそれ以上を有することにより特徴付けられる。

！　、　ｌ＊８６Ａｌとの高程度のアミノ酸相同性。

２、毒素をコートし、ここに開示されるプローブ又は遺伝子とハイブリダイズす るヌクレオチド配列。

３、毒素をコートし、本明細書で開示されるプライマーを使用してＰＣＲによっ て増幅できるヌクレオチド配列。

４、本明細書に示される一般式に適合するアミノ酸配列。

５、毒素８６Ａ１を生しる抗体に対する免疫反応性。

本発明のＢ　、　！、　、単離体は従って以前にしられたＢ、ｔ、単離体とは区 別される特徴を有し・でいる０表１は、本発明のＢ、ｔ、単離体と、良く知られ たＢ、ｔ、菌株テするＢ、ｔ、ＨＤ−１及びＢ、ｔ、ｓ、ｄ、の比較を示してい る。

ＣＰ８＝　コロラドボテドビートル（Ｃｏｌｏｒａｄｏ　Ｐｏｔａｔｏ　Ｂｅｅ ｔｌｅ）、ＡＷ＝アルファルファウィービル（Ａｌｆａｌｆａ　Ｗｅｅｖｉｌ） 、ＣＲＷ＝コーンルートウオーム（Ｃｏｒｎ　Ｒｏｏｔ、ｗｏｒｇ＋）ＳＲＦＢ ＝レイプフリアビートル（Ｒａｐｅ　Ｆｌｅａ　Ｂｅｅｔｌｅ）、更に単離体は 次の一般的名特徴を有している。

コロニー形態−一一大きなコロニー、くすんだ表面、Ｂ　、ｔ。

に典型的なもの。

成長細胞形態−−−典型的なり、ｔ、のちの。

本発明の８．ｔ、単離菌又はその変異体は標準の知られたの培地及び発酵技術を 使用し・て培養てきる。発酵サイクルが完了すると細菌はまずＢ、ｔ、胞子及び 結晶を、この分野で良く知られた手段によってＲ，酵７０スから分層することに よって収穫できる０回収された８、ｔ、胞子及び結晶は特定の標的害虫に対し取 扱いと適用を容易にするために表面活性剤、分散剤、不活性担体及びその池の成 分を添加することにより水和粉末、液体濃縮物、顆粒、又は他の処方に処方でき ろ、これらの処方剤及び適用手順は全てこの分野で知られ、市販の菌株で使用さ れている。

ｉ／ｉＩｊ！な８．シ単離体及びその変異体は標的害虫を抑制する為に使用出来 る。

本出願の培養基はアメリカ合衆国６１６０４イリノイ州ペオリア　ノースユニバ ージティー１８１５、北部研究所、農業研究サーヒス特許培養基コレクション（ ＮＲＲＬ）　（ＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＲｅｓｅａｒｃｈＳｅｒｖｉｃｅＰａ ｔｅｎｔＣｕｌｔｕｒｅ−二ｏｌｌｅｃｔｉ。

ｎ（ＮＲＲＬ）、Ｎｏｒｔｌ＋ｅｎ　Ｒｅｇｉｏｎａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｃ ｅｎｔｅｒ、　１８１５　Ｎｏｒｔｈ　Ｌｌｎｉｖｅｒｓｉｊ＞５ｔｒｅｅｔ、 、　Ｐｅｏｒｉａ　ｌ１ｌｉｎｏｉｓ　６１６０４．　Ｕ、Ｓ、Ａ。

）に寄託された。

培養基　寄託新番号　寄託日 ８、ｔ、ＰＳ７５ＪＩ　ＮＲＲＬ　Ｂ−１８７８１１９９１年３月７日Ｂ、ｔ、 ＰＳ８６ＡＩ　ＮＲＲＬ　Ｂ−１８４００１９８８年８月１６日Ｂ、ｔ、　ＰＳ １５７１ＴＩ （ａ、に、ａ、ＭＴＩ０４）　ＮＲＲＬ　Ｂ−１８２４０１９８７年７月１７日 大１１１Ｉ菌ＮＭ５２２ｃ＋団Ｓ’Ｃ２３２０）　ＮＲＲＬ　Ｂ−１８７６９１ ９９１年２月１４日本培糞基は、３７　ＣＦＲｌ、１４及び３５　ＵＳＣＩ２２ の下に特許庁長官が１原ありと認める者が本特許出願の係属中にｋｆｌ　ｌ基を 人手できることを匡正されるという条件下に寄託された。また、本出願又はその 子孫の対応特許出願が提出されている国々の外国特許法で要工されるならば、寄 託物は人手できる。しかし、寄託物が入手できるからといって、行政１テ為によ って１寸与された特許権を侵害して本発明を実施する権利を構成するものではな いことを理解すべきである。

更に、本培義基寄託物は、ブタ・＼スト微生物寄託条約の規定に従って保存され 、一般の人々に入手可能とされる。すなわち、寄託物の試料提供に対する最も最 近の請求後少なくとも５年間、かつとんな場合も、寄託期日から少なくとも３０ 年間か、又は培養基を開示して発行される特許の権利行使可能な期間中、これら の寄託物は、生育可能で汚染されていない状態に反っために必要なあらゆる配慮 をもって保存される。要求を受けた受託施設が、寄託物の状枯のために試料を供 給できない場合には、寄託者は寄託物を補充するａ務を認めるものである０本培 糞基寄託物の一般への入手可能性に関するすべての制限は、これらを開示した特 許が１寸与されると永久に取り除かれる。

本発明は、本発明の毒素の全て又は一部又は殺アリマキ活性を有している他の毒 素、をコードしている遺伝子を有している本発明の単離体の変異体（バリアント ）も含む。そのような微生物変異体は単離できるか又は当業者によくしられた技 術によって造ることが出来る０例えばＵＶ照躬を使用して宿主生物の変異体を遣 ることが出来る。同様にそのような変異体はこれもこの分野で良く知られた手順 によって造ることが出来る胞子非形成性の宿主細胞を含み得る０例えば、胞子非 形成変異株は新規な単離体のエチルメタンスルホネー）（ＥＭＳ）変異誘発によ って得られる。小さな割合の胞子非形成変異株は無傷にととまり、長期の発酵の あいだ溶菌しない、これらの菌株は溶菌マイナス（−）と指定される。溶菌マイ ナス菌株は厖とうフラスコの培地中で胞子非形成変異株をスクリーニングし、発 酵の終りにまだ！＃１墨で春雪結晶を含有する突２２異株を選定することによっ て確認できる。

溶菌マイナス菌株は、保護されカブ七ル封入された毒素タンパクを生ずる細胞固 定１ヒ法に適している。

上記の胞子非形成突然変異体のファージ耐性変異菌をつくるには、ファージ溶菌 液のアリコートを栄養寒天上に広げ、乾燥させる０次に、ファーソ感受注菌株の アリコートを乾燥した溶菌上に直接プレートし、乾燥させる。

プレートを３０℃で培養する。プレートを２日間培養し、この時点で多数の集落 が寒天上に生育しているのを観察できる。これらの集落の幾つかを取り上げ、栄 養寒天プレート上で二次ｚｇ　ｍ基にする。これらの明白な耐性ｋｇ　ＩＩ基を ファージ溶菌２αとの交差線条接種（クロスストリーキング）によって耐性につ いて試験する。ファージ溶菌１αの１ラインをプレート上に線条接種し、乾燥さ せる。

次に、推定上の耐性培養基をファージラインに交差するように線条接種する。耐 性細菌の培養基は、３０℃で一夜培養後、ファージ線に交差する線条のどこでも 溶菌を示さない０次に、ファージ耐性は、栄養寒天プレート上に耐性培養基コロ ニーをプレートすることによって再確認される。陽性対照として役立たせるため 、感受性菌株も同様にプレートする。乾燥後、ファージ溶菌液の一滴をプレート 中心部に撒き、乾燥させる。耐性培養基は、（資）℃て２４時閏培ｌＩ後、ファ ージ溶菌液を置いた場所でｆｓＭを示さなかフた。

変異体はこの分野でよくしられた手順によって紫外線光及びニトロソグアニジン を用いて造ることも出来る。

本発明の殺アリマキ毒素は特定して８６＾ｌと命名される毒素によって本明細書 では例示される０本発明は更に郭Ａ１と同し又は同様な生物活性を有している均 等な毒素（及び均等な毒素に対しコードしているヌクレオチド配列）を含んでい る。これらの均等な毒素は本明細書に開示され特許請求されｋＩ素とアミノ酸相 同性を有し得る。

このアミノ酸相同性は典型的には５０％より大きく、好ましくは７５％より大き く、最も好ましくは９０％よりも大きい、アミノ酸相同性は生物活性の原因とな っている毒素のある臨界領域、又は生物活性に対し究極的に責任のある３次元立 体配置の決定に閏与する毒素のある臨界Ｉ［域に於て最も高いてあろう。この点 に間しである種のアミノ１１１置換は、これらの置換が活性に対し臨界でない領 域に於けるもの、又は分子の：３３次元立配置に影響を与えないコンザーパテイ ブなアミノ１１１置換であるならば、受は入れられ、そして朋待される０例えば アミノ酸は次のクラスに分類される。非梯性、電荷のない極性、塩基性及び酸性 アミノ酸、置換が化合物の生物活性を実質的に変更しない限り、一つの類のアミ ノ酸が同しタイプの別の７ミノ駿と置き換えられろコンザーバテイブな置換は本 発明の範囲内に入る０表２は各クラスに属するアミノ酸の例を挙げている。

ある場合には、非コンザーバテイブ５１換もなされ得る。

臨界的な要因はこれらの置換が毒素の生物活性を有意義に減少してはならないと いうことである。同定された構造とｌｌ能を持つ蛋白質は、変更が蛋白質の二次 構造を変えないならば、アミノ酸配列を変えることによって構築され得ることが 示されている（カイザー、イー、ティー、及びケズデイ、エフ、ジエイ−［１９ Ｂ４］５ｃｉｅｎｃｅ　２２３：２４９−２５５ン。

従って本発明は蛋白質の二次構造を変えない、又は構造が変ったとし・でも生物 活性が実質的に闇持されている、ここに描かれるアミンｒ１１ｉ！ｉ！列の突然 変異体を含んでいる。

本発明に従う遺伝子と毒素は、ここに開示される完全な長さの配列のみならず、 本明細書に特定して例示される毒素の特徴的な段アリマキ活性を尿持し・ている これらの配列の断片又は融合蛋白質も含んでいる。

本発明の一つの面は、アリマキに対し活性を有しているｓＷ：を同定する為に使 用することが出来る。以後一般式と呼ぶ一般化学式の発見に間する。この一般式 は約４５ｋＤａ〜約０５ｋＤａの分子量を有する毒素蛋白質を記載している。そ れらの−次アミノ酸構造は実質的に以下に示されるモチーフに従っている。

１０１　ＸＷｌ＝’１ｊＸＸｌ、ＶＬＢＢＫＸＩＸＩＪＩ、ＸＸ　ＹＸＢＫＸＯ ＺＪＸＸ　Ｘｇ、ｖｘＺＸＸＪＸＥＩ　Ｕ、ＩＪＢＪｌルＸiＩＪ ＸＸ、ＩＪＯＸＸＸ、ＫＯＸ１ｆＪＢＸＯＲＣＸＬ　ＬＬＪｉＥＯＪＬＡ’ＪＸ 　ｆ）ＱＪＸＢＸＸＸｊｐ　ＸＢＬＸＺＸＵｘｘｘ２０１　尽）巳Ｉワ冶獄殻品 覗ボ１１聡鋤３０１　ｕｘＪＬＪＫ、Ｉ［ｌＫＬ　ＬＺＢＢｌ、１ｚＬＸＯＪ　 ＬＪＸＢＸＸＬＩＺＸＸ　０１．ＸＢＢＸＫＬＸＺ　ＩＷＸＸＩ、ＸＸＵhＸ ＵＩＪＸＯＺＸＸＥＢ　Ｘ、ｌＸＸ、ＩＸ、ＩＸＬＸ　ｌ、ＥＬＸＪＯＸＸＸＷ 　ＸＸＢＯＸＥＯＸＸＢ　Ｘ牌ＹＸＸｘｘｘ４０１　（λ）ｎｓ ―ここでｎ＝ｏ〜＋００ 数は便宜のため、そしておよその位置を示す為のみに用いられている。

Ａ　＝　ａｌａ　Ｇ　＝　ｇｌｙ　き１　＝　ｍｅｔ　Ｓ　＝　ｓｅｒ　Ｃ＝　 ｃｙｓＨ＝ｈｉｓ　Ｎ＝ａｓｎ　Ｔ＝ｔｈｒ　Ｄ＝ａｓｐ　Ｉ　＝ｉｌｅＰ　＝ 　ｐｒｏ　Ｖ　＝　ｖａｔ　Ｅ　＝山ｈ　Ｋ　＝　ｌｙｓ　Ｑ　＝　ｇｌｎ〜− ；＝ｔｒｐＦ＝ｐｈｅＬ＝ＩｅｕＲ＝ａｒｇＹ＝ｔｙｒＢ　＝　Ｍ、し、１．Ｖ 又はＦ Ｊ　＝　Ｉ＜、Ｒ，Ｅ又はＤ Ｏ＝Ａ又はＴ Ｌｌ　＝　Ｎ又はＱ ノ酸の完全な取除き） ひと続きのワイルドカートのアミノ酸に遭遇し・たときは（Ｘ（ｎ）又は＼（１ １）であってｎ＞２）　、与えられたアミノ酸の繰返しをさけるへきである。同 様にＰ、Ｃ，Ｅ、Ｄ。

１＜　、又はＲの利用は最小にされるへきである。

この式は、本出願では特定！ｌ　＊　８ＧＡｌで例示される。

当業者には殺アリマキ毒素をコートする遺伝子は幾つかの手段を通じて同定、人 手できることが明らかである。

特定の遺伝子は明細書に記載される培養基寄託所から得ることができる。又はこ れらの遺伝子又はその一部分は例えば遺伝子マシンの使用によって合成的に造る ことができる。こらの遺伝子の変異体は、点突然変異体を造ることによって標準 の技術を使用して容易に構築できる。

又これらの遺伝子の断片は標準の手順に従って市販されたエクソヌクしアーゼ又 はエントヌクレアーゼを使用して造ることができる０例えばＢａ１３１等の酵素 又は部位特異的突然変異誘発を、これらの遺伝子の末端からヌクレオチドを系統 的に切り取る為に使用することが出来る。

また活性断片をコートする遺伝子は種々の他の制限酵素を使用して得ることがで きる。これらの毒素の活性断片を直接得る為に蛋白質分解酵′Ｉｇを使用できる 。

均等な毒素及び／又はこれらの均等な毒素をコードする遺伝子も本明細書に提供 される技術を使用してｅ、ｔ、単離体及び／又はＤＮＡライブラリーから見つけ ることができる。天然に存在する本発明の段アリマキ毒素を得る為の幾つかの方 法がある０例えば本明細書に開示され、特許請求される段アリマキ毒素の抗体は 蛋白質の混合物から曲の毒素を同定及び単離するために使用できる。これらの抗 体を次にイムノブレシビテーション、エンザイムリンクトイムノアッセイ（エリ ザ：　ＥＬＩＳＡ）又はウエスタンブロリティックによって特徴的な殺アリマキ 活性を有する均等な毒素を特定的に同定するために使用できる。

本明細書に開示される毒素又は均等な毒素、又はこれらの毒素の断片に対する抗 体はこの分野の標準手順を使用して容易に製造できる。

本発明の毒素及び遺伝子を同定する別の方法は、オリゴヌクレオチドプローブを 使用することを通じて行なう事である。これらのプローブは検出てきる標識を有 する又クレオチド配列である。この分野で良く知られるようにもしプローブ分子 と咳ｉＭ試料とが２つの分子の間で強い結合を形成することによってハイブリダ イズするならば、ブロー７と試料は本質的に同しであると１定する十分な理由が 有り得る。プローブの検出可能なラヘルはノーイブリダイゼーションが生し・た かどうかを既知の方法で決めろための手段を１１洪する。そのようなプローブ分 析は本発明の段アリマキエントトキンン遺伝子を同定するための迅速な方法を提 供する。

本発明に従ってプローブとして使用されるヌクレオチドセグメントは、標準手順 を使用してＤＮＡシンセサイザーの使用により合成できろ、ブロー７としてのヌ クレオチドセグメントを使用するにあたって、特定のプローブは放射性及び非故 躬性！識を含めた当業者に知られた適当な任曾の標識で標識でされる。典型的な 放射性標識は３２ｐ、１２５１　、３５５等を含む、放射性同位元素で標識され たプローブは、デオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）及びＤＮＡポリメラー ゼを使用し・て慣用のニックトランスレーション反応によってＤＮＡ試料に対し 相補的なヌクレオチド配列から＊Ｗｉてきる。そのプローブと試料は次にハイブ リダイゼーション緩衝溶液中で一緒にされ、適当な温度にアニーリングが起きる まて筺たれる。その後、膜が外部的物質がないように洗浄され、試料と結合した プローブ分子を残し、典型的にはオートラジオクラフイ及び／又は潰体シンチシ ーノヨン（螢光）計数によって検出され定量される。

非放射性標識には例えばビオチン又はチロキシン等のリガント（配位子）並びに ヒトロラー七又はベルイクソダーセ（ｐｅｒｉｘｏｄａｓｅ）等の酵素又は種々 の化学発光剤、例えばルシフェリン、又は螢光化合物、例えばフルオレス七イン 及びその誘導体類が含まれる。プローブはまた上に述べた末端に於いて同位体標 識を使用することにより、そして池の末端でビオチン標識によって行なう等、分 Ｍの容易さの為に異なる種類の標識で両端を標識することもてきる。

デュプレックス形成及び安定性はハイブリッドの２つのストランドの間の実質的 な相補性に依存し、そして上に述べたようにある程度のミスマンチが許され得る 。従って本発明のプローブは突然変異（単数及び複数の両方）、欠失、記載され た配列の挿入、及びこれらの絹合せを含み、ここでその突然変異、挿入及び欠失 は問題の標的ポリヌクレオチドと安定なハイブリッドを形成することを許すもの である。突然変異、挿入及び欠失は多くの方法で与えられたポリヌクレオチド配 列中に生じることができ、そしてこれらの方法は当業者に知られている。他の方 法も将来用られるかも知れない。

知られた方法には限定されるものではないが、次のものが含まれる。

（１）既知の配列の突然変異、挿入又は欠失である人工的な配列を化学的又はそ の他の方法で合成する。

（２）本発明のプローブを使用してハイブリダイゼーシヨンを経て新規な配列、 又はそのプローブ配列の突然変異、挿入又は欠失を得ること、及び （３）インビトロ又は生体内で試験配列を突然変異させ、挿入し又は欠失さする こと。

与えられたプローブから生じる突然変異、挿入及び欠失による変異体はもとのプ ローブよりも多かれ少なかれ効率的であり得ろことに４奮することが重要である 。効率におけるそのような差にもかがＪ）らず、これらの変異体は本発明の範囲 内にある。

従って開示された配列の突然変異、挿入及び欠失変異体は当業者に良く知られた 方法で容易に製造できる。これらのｆ異体は、プローブと実質的な配列相同性を その変異体が有する限り、この本発明のブロー７と同じ方法で使用できる０本明 細書て使用される実質的な配列相同性とはもとのプローブと同し能力で変異体が 機能できるようにするに十分な相同性を指している。好ましくはこの相同性は５ ０％よりも大きく、より好ましくは相同性は７５％よりも大きく、最も好ましく はこの相同性は９０％を越える。その意図された能力に於いて変異体が機能する のに必要とされる相同性の程度は、配列の意図される用途に依存する。配列の機 能を改良する為、又はその他の方法で方法論的な利点を提供するために設計され る突然変異的、挿入的、及び欠失的な変異を造ることは当業者の行ない得ること である。

本発明に従い、殺アリマキ遺伝子の迅速な同定に青用な特定のヌクレオチドフロ ーアは、次のアミノ酸配列に対しコーＦするヌクレオチド配列である。

”（Ｄ、５）ＤＦ（Ｎ、５）ＱＬＹ（１：、［ｌ）νＹ′″（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎ Ｑ、３　）；”　（Ｅ　、に）εＬＬ（Ｅ、に）Ｋν”（ＳＥｏ　１０　Ｎ＋） 、４　）；ＬＰＧＬＬＧＦＶＶＹＥＩ”（ＳＥＱ　１０　Ｎ１１．５　）；”Ｄ ＲＤＶＫＩ（Ｌ、Ｉ）ＧＭ”（ＳＥｏ　１０　Ｎ＋）、６　）；及び°（〜’、 　Ｉ）（Ｌ、Ｉ）ｋ（Ｔ、５）ＡＮＤＩ”（ＳＥＱ　１ＯＮｏ、７　）。

遺伝子コートの縮重の為に、即ち一つを越えるコード化ヌクレオチドトリブレッ ト（コドン）が蛋白質を造る為に使用されるアミノ酸の多くに対し・使用できる ので、特定のアミノ酸に対し・興なるヌクレオチド配列がコードし得る６従って 、ｅ、ｔ、ｉ素及びペプチドのアミノ酸配列は、蛋白質又はペプチドの同し・ア ミノ酸配列をコートしている均等なヌクレオチド配列によって製造できる。従っ て本発明はそのような均等なヌクレオチド配列を含む、又、逆又は相捕的な配列 は本発明の一面であり、当業者に容易に使用できる。

本明細書の配列リスト中に示される三文字アミノ酸コートは、ある与えられた位 置に於て二つのアミノ酸の間から選択される必要が存在する場合の上記の単一文 字の７ミノ放置列の反映に刻Ｌ・て、なんら規定を有しない。

従って配列リスト内て°’Ｘａａ”は配列内の変化の位置を示すのに使用される が、上記の単一文字のコートは配列内の与えられた位置に於て特定のアミノ酸を さすべきである。

本発明の殺虫処方は標的害虫の環境、例えばｔＩｆ物、土壌、水に対して、スフ レ−１噴霧６散布などによって適用できる６本発明のＢ、ｔ、細胞は標準の知ら れた培地及び醗酵技術を使用して培養できる。１１８酵サイクルが完了したら細 菌はまずこの分野で良く知られた手段によって発酵アａスからｅ、ｔ、ａ子と結 晶をまず分離することによって収ｆｌてきる５回収されたＢ　、　ｔ　、　Ｐｉ 子及び結晶は表面活性剤、分散剤、不活性担体及び特定の標的害虫に対する取り 扱い及びａ用を容易にされるための池の成分子ｔ添加することによって水和剤、 液体濃縮物、顆粒、又は他の処方に処方できろ。これらの処方及び適用手順はす べてこの分野で良く知られているものである。

殺アリマキ有効量の本明細書で開示される微生物、又は毒素を、適当な殺アリマ キ処方中で標的害虫の環境に適用すると、それらの害虫の有効な抑制が得られる 。

殺アリマキ有効量は抑制されるへき害虫の性質と量、年の時期、温度、ｌ２度、 及び生物の主剤に影°響し得る他の知られた要因に依存してヘクタール当り約１ 〜約１２リツトルで変化し・得る。標的害虫の有効な抑制を得る為に適用される べき生物殺虫剤の量を決めることは当業者がなし・得ることである。

細胞内δ−エンドトキシン蛋白質は池のａ虫蛋白質と組合せて（ハシラス・チュ ーリンゲンシス以外の源から得られるものを含む）活性スペクトラムを増加し、 そして標的害虫の完全な抑制を与えることがてきる。

Ｂ、Ｌ、菌体は種々の方法で処方できろ、これらは無機鉱物（フィロソリケート 類、炭酸塩類、硫酸塩類、燐酸塩類等）又は植物を１料（粉末化とうもろこしの 穂軸、米の籾殻、胡桃の殻なと）等の不活性物質と混合することによって水和粉 末、顆粒、又は散布剤として用いることができる。処方剤はスブレツダー−ステ イ・ツカ−助剤、安定化剤、他の殺虫添加剤又は表面活性剤を含み得ろ、液体配 合物は水性基盤又は非水性であり得、フオーム、ゲル、懸濁液、乳１ヒ可能なＪ 縮重なととし・て用ｔ）ろことカイてきる。成分はレオロジー剤、表面活性剤、 乳１ヒ剤、分散剤、又は重合体を含み得る。

殺虫濃度は特定の処方の性質、特にこれが１縮物か直接使用されるかに依存して 広く変り得る。殺虫剤は少なくとも１重量％て存在し、そしてｔｏｏｔ　ｔ％で あり得る。

乾燥処方剤は殺虫剤の約１〜９５重量％を有するが、一方液体処方剤は一般に液 相中の約１〜６０ｉ量％の固体である。処方剤は一般に麟ｇ当り約１０２〜ｔｏ ’＊胞を有する。これらの処方剤はへクタール当り約５０ｍｇ　（４１体又は乾 燥）〜Ｉｋｇ又はそれ以上で投与される。

本発明のｆＪｉ現な！１離１本が宿す毒素遺に子は広範囲な微生物宿主中に導入 できる。！ｌ素遺伝子の発現は、直接又は間接に、殺虫剤の細胞内生産及び維持 を生しる。適当な宿主、例えばシュードモナスでは微生物はアリマキが増殖する 場所に適用できる。その結果アリマキが抑制される。

薄紫遺伝子を宿している微生物は細胞内で造られる毒素の活性を長引かせる条件 下で処理できる。微生物細胞、例えばｅ、ｔ、毒素遺伝子を含有する微生物の処 理は、技術が酵素の性質に悪影響をしない限り、また毒素を保護する細胞の能力 を減少させない限り化学的又は物理的手段、又は化学的及び／又は物理的手段の 組合せによるものであり得ろ、化学剤の例はハロゲン化剤、特に原子番号１７〜 ８０のハロゲンによるものである。より詳し・くは温和な条件下でヨウ禦か使用 でき、そして所望の結果を達成するために十分な時間行なわれる。　Ｉｔ！！の 適当な技術にはアルデヒド、例えばホルムアルデヒド及びグルタルアルデヒドて の処理、抗感染剤例えばセフイランクロライド及びセチルピリジニウムクロライ ドでの処理、アルコール類例えばイソプロピルアルコール及びエタノール；　種 々の組織学的固定剤例えばルゴールヨウ素、ボウイン（Ｂｏｕｌｎ）［ｉ！ｉｌ 定剤及びヘリ−（Ｈｅｌｌｙ）固定剤（ヒューマソン。

グレッチェン　し１、　アニマルＭｉ縁技術（Ａｎｉｍａｌ　Ｔｉ５ｓｕｅＴｅ ｃｈｎｏｌｕ３ｙ）　、讐、Ｈ，フリーマン　アンド　カンパニー　１９６７参 照）又は！Ｉ胞が宿主動物に投与された時に細胞中に造られる毒素の活性を８存 し、長引かせる物理（熱〉及び化学剤の組合せが含まれる。物理的手段の例はガ ンマ−＆Ｉ照射及びＸ線照射なとの短波長照射、Ｊ結、紫外線照射、凍結乾燥等 である。処理された細胞は次に標的害虫の環境に適用できる。生じる生成物はＢ 、ｔ、毒素の毒性を保持している。

遺伝子の安定な維持と発現を可能とする条件下で、微生物宿主中に毒素を発現す るＢ、ｔ、遺伝子を導入するために種々の方法が利用できる。これらの方法は当 業者に良く知られている。

以下は最良の態様を含めた本発明を実施する手順を説明する実施例である。これ らの実施例は制限するものと解釈されるへきてはない。別途記載されない限り全 ての％は重量により、全ての溶媒混合物割合は容量による。

実施例Ｉ　Ｂ、Ｌ、単離体の培養 本発明のＢ、ｔ、単離体又はその突然変異体を次の培地、ペプトン・ブドウ糖・ 塩培地に接種するのに使用できる。

バクト・ペプトン　７．５　ｇｌ＋ ブドウＩ！１１．０　ｇ／ｌ に８２ＰＯａ　３．４　ｇ／ｌ に２）ＩＰＱ、　４．３５　ｇ／ｌ 塩溶液　５．０　ｍｌ／１ ＣａＣＩ２溶Ｋｌ　５．Ｏｍｌ／１ ｐＨ７，２ 塩溶ｌα（１００ｍｌ） Ｍｇｓｏ、・７Ｈ２ｎ　２．４６　ｚ ＭｎＳθ４’Ｈ２１）　０．０４　： ＺｎＳＯ４・７＋Ｉ２０　０．２Ｂ　５ＦｅＳＩ：１４’７１１２０　０．４０ 　ｇＣａＣ１２ｉ　潰（１００ｍｌ） ＣａＣ１２ｅ２＋Ｉ２１）　３．６６　ｇ塩溶液とＣａＣｌ２溶潅を濾過滅菌し 、オートクレーブ処理し調理したフロスに、接種時に添加する。２００　ｒｐ− で操作される回転系とう機で、フラスコを３０℃、６４時間培養する。バラ胞子 封入体、胞子及び細胞の破片は遠心分離て累めた（　７．１４に＊ｇ＊２０分） 。

上の手順は、この技術て周知の手順により、大ＩＩ８酵装置まて容易：こ規模拡 大できる。

上の醗酵て弓りれるＢ、１．胞子及び結晶は、この技術で周知の手順により単離 てきる。しばし・ば用いられる手順は、取り入れた醗酵１夜を分離技術、例えば 遠心分離にかけることである。

実施例２−Ｎ末端配列決定 バラ胞子封入体を臭化ナトリウム（２８−３８％）ｖＥ度勾配平街遠心分Ｍ［エ ム・エイ・ファンネンスチール（Ｍ。

Ａ、　Ｐｆａｎｎｅｎｓｔｉｅｌ）　ら、［１９８４年］　ＦＥＭＳ　Ｍｉｃｒ ｏｂｉｏｌ、　Ｌｅｔｔ。

２１巻３９頁］によって部分的に精製した。この部分的に精製した蛋白質を、ウ ェスタン・プロット法［エッチ・トービン（Ｈ，Ｔｏｗｂｉｎ）ら、［１９７９ 年］　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ　、　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、　ＬＩＳＡ　７６巻４３５０頁コによって、インモビロン（ｌｓｏｂｉ ｌ　ｏ　ｎ　）　−Ｐ　、　Ｐ　’ｖ’　Ｄ　Ｆ　ｉｉ　（ミリポア社、マサチ ューセッツ州へドフオート）に結合した。Ｎ末端アミノ酸配列を、自動１ヒ気泪 セクエシサーでの標準的なエドマン反応［エム・ダブリュー・バンカピラー（＞ １．ｉ　Ｈｕｎｋａｐｉｌｌｅｒ）ら、［１９８３年コト１ｅ目１．　Ｅｎｚｙ ｍｏｌ　、　９１巻３！］９頁］によって決定した。

得られた配列ζま以下のとおりである。

ＮＨ２−ＭｌｌＤＳＫＴＴＬＰＲ）ｌｓＬＩＨＴｌｋＬ−Ｃ１：１２Ｈ（ＳＥＱ 　ｌ［ｌ　Ｎｏ、８）二の配列から１次のオリブヌクレオチドブロ−７が命名さ れる。

５°ＡＴＩ−ＡＴＴＧＡＴＴＣＴＡＡＡＡＣＡＡＣＡＴＴＡｌ二ＣＡＡＧＡ（八 ＴＴＣＴ／Ａ　ＴＴＡ　ＡＴＴ／Ａ　ＣＡＴ　ＡＣＴ／Ａ　ＡＴＴ／Ａ　ＡＡ　 ３’　（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、９）このプローブを８６ＡＩＡと命名した。

実施例３　バシルス・チューリンゲンシス菌株Ｐ５８６ＡＩ？ｌｌらの新規な毒 素をコートした遺伝子の分子クローニング６００　ｎ＊で１．０の光学Ｅ度に生 育させたＰＳ８６Ａ１８！ａ胞から全細胞ＤＮＡを調製した。細胞を遠心分離に よってベレント化し、原形質緩衝ｔα（０，３Ｍ庶糖中２０　Ｂ／ｍ１ｌＪゾチ ーム、２５ａ＋Ｍ）リス−Ｃ１、ｐＨ８，０，２５ｍＭ　ＥＤＴＡ）中に再懸濁 させた。３７℃で１時間培養後、２周期の冷凍−解凍によってプロトプラスト（ 原形質体）を溶菌化した。０．１ＭＮａｃＩ、０．１％５０５．０．１Ｍ）リス −ＣＩの溶液９＠量を加えて溶菌化を完了させた。透明化ｔｉｉ液をフェノール ：クロロホルム（Ｉｌ）で２回抽出した。核酸を２倍容量のエタノールで沈殿さ せ、遠心分離によフてペレフト化した。

ベレットをｌｏｗＭ）リス−（７１，１■ＨεＤＴＡ（ＴＥ）　（ｐＨ８，０） 中に再懸濁し、ＲＮＡ５ｅを５０μｚ／ｍｌの最終濃度に添加した。

３７℃で１時間ｔＦ！　％　役、溶液をフェノール：クロロホルム（１：Ｉ）及 びＴＥＩＪ９和クロロホルムでそれぞれ１回抽出した。　ｌ／１０容量の３Ｍ　 ＮａＱＡｃ及Ｕ２倍量のエタノールを添加して、ＤＮＡを水相から沈殿させた。

ＤＮＡを遠心分離によってベレット化し、７０％エタノールで洗い、乾燥し、Ｔ Ｅに再懸濁した。

ＰＳ８６ＡＩＤ　Ｎ　Ａのサザーンプロットと、８ＳＡＩＡと命名される３２ｐ −標識つきオリゴヌクレオチドプローブとの標準ハイブリダイゼーションによっ て、制限断片長の吊型現象（ＲＦＬＰ）分析を１テなった。

示すように、プローブを４位置で混合した。ハイブリッド形成バンドは、約３． ＋３　ｋｂｐ　）ｌｉｎｄｌｌｌ断片と約９．３　ｋｂｐＥｃｏＲＶ断片を包含 した。

５ａｕ３Ａで部分消化させたＰＳ８６ＡＩ　Ｄ　Ｎ　Ａから遺伝子ライブラリー を構築した０部分的制限消化物をアガロースゲル電気泳動によって分画した。６ ．６−２３　ｋｂｐの大きさのＤＮＡ断片をゲルから切出し、ゲルスライスから 電気溶離し、エルチップ−Ｄイオン交換カラムでの精Ｕ後、エタノール沈殿によ ７て回収した。５ａｕ３Ａ挿入物をＢ騙Ｈ１で消化させたラムダ（Ｌａｍｂｄａ ）Ｇ　ｅｍ−１１（プロメガ社、ライスコンシン州マジソン）へ連結させた０組 替えファージをパッケージし、大Ｉｌｌ菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ）Ｉ＜　Ｗ　２５１ 細胞（プロメガ社）上ヘブレートした。放射性標識つき８６ＡｉＡオリゴヌクレ オチドプローブとのハイブリダイゼーションによって、プラークを選別した。ハ イブリッド形成ファージをプラーク精製し、これを用いて標準手順によってファ ージＤＮＡの単離のため大１１　Ｍ　Ｋ　Ｗ　２５１纏胞の液体培養基ニ’５５ 染させた［マニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら［１９８２年］　「分子クローニ ング：実験マニュアル（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏｒ ａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ）」コールドスプリングハーバ−研究所、ニューヨー ク州コールドスプリングハーバーコ、二次クローニングには、ＤＮＡのｖ４ｉｌ 量をＥｃｏＲＩとＳ　ａｌ　Ｉて消化させ、アガロースゲル上の電気泳動にかけ た。青票遺伝子を含有する約２．９　ｋｂｐのバンドをゲルから切出し、ゲルス ライスから電気ｍ　Ｍし、上のようにイオン交換クロマトグラフィによって精製 した。

精製されたＤＮＡ挿入体を、ＥｃｏＲＩ　＋　５ａｌｌで消化させたｐＨＴＢ　 ｆｕｅｌｌ　（すなわちｐＢＩｕｅｓｃｒｉｐｔ　Ｓ／に（カリフォルニア州す ンディエゴ、ストラタジーン社ｉ１＞とし・ジデントＢ、ｔ、プラスミドからの 濱製閏始点Ｃディー・レレクラス（Ｑ、　ｃ、ｅｒｅｃｌｕｓ）ら、［１９８９ 年］　ＦＥＭＳ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　ＬｅＬＬ、　６０巻２＋１−２１８頁 コとからなる大腸菌／　Ｂ、ｔ、シャトルヘクター）へ連結さけた。この連結混 合物を使用して、冷凍されたコンピテント大腸菌ＮＭ５２２纏胞（ＡＴＣＣ４７ ０００）を形質転換させた。石質転換体を、アンピシリン、イソプロピル・（β ）−〇−チオガラクトシド（＋ＰＴＧ）及び５−ブロモ−４−クロロ−３−イン ドリル−（β）−［＋−ガラクトシド（ＸＧＡＬ）を含有するし８寒天（前掲マ ニアチスら）玉にプレートした。

アルカリ溶菌（前掲マニアチス）によって推定上の絹替え型からプラスミドを精 製し、アガロースゲル上てＥ　ｃ。

Ｒ１及びＳ　ａｌ　ｌ消化物の１ｉ気泳動によって分析した。所望のプラスミド 構造体ｐＭ〜′Ｃ２３２０は、本発明の新規な毒素遺伝子を含有している。図２ を参ド、この遺伝子のＤＮＡ配列をＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯＩに示す。この遺伝子て 発現される毒素を、ＳＥｏ　１０　Ｎｏ　２に示す。

プラスミドｐＭｖｌＴ２３２０８．ｔ、エレクトロポレーションζこまって結晶 非杉成（Ｃｒｙ−）　Ｂ、ｔ、ホスト（Ｂ、ｔ、ＨＤ−Ｉ　ｃｒｙ　Ｂ、エイ・ アイ・アロンソン、バーデユー大学、インディアナ州ウエストラフフイアノト） に導入された。キ勺５８ｋＤａタンパクの発現は、５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析によフ て立証される。

本明細書で明らかにされた制限酵素は、インジアナ州インジアナポリスのボエリ ンカーマンノ１イム又乞よマサチューセッツ州ビバリーのニューイングランド・ １＜イオラブから購入できる。酵素は、供給者から提供された指示に従って使用 される。

Ｂ、ｔ、毒素遺伝子を含有するブラスミＦ’　ｐＭＹｃ２３２０は、周知標準的 手順を用い、形質転換宿主微生物から除去できる１例えば、大腸菌ＮＭ５２２　 （Ｉ］ＭＹＣ２３２０）を透明溶菌液の密度勾配平衡手順等にかけると、ｐＭＹ ｃ２３２０が回収される。

実施例４　ゼネリックなオリゴヌクレオチドブライマーを使用する新規なアリマ キに活性の遺伝子の別のクローニング 新規な殺アリマキＳ、ｔ、単離体からの殺アリマキ毒素をコートする遺伝子は、 以下の通りのオリゴヌクレオチドを使用して標準のポリメラーゼ鎖反応手順を実 施することによって、その菌株のＤ　Ｎ　Ａ　ｈ）ら得ることができる。

１、フォーワードプライマーｒ　ＴＧＡＴＴＴＴ（Ｔ又はＡ）（Ｃ又はＡ）ＴＣ ＡＡＴＴＡＴＡＴ（Ａ又はＧ　）　、Ａ　（Ｇ又はＴ）ＧＴＴＴＡＴＪ（ＳＥＱ 　ＩＱ　Ｎｏ、１０）は、プローブｒ　ＡＡＧ４ＧＴＴＡ（Ｃ又はＴ）ＴＡ（Ａ 又はＧ）Ａ（Ｇ又はＡ）ＡＡＡＧＴＡＪ　（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、Ｉｌ）　、プ ローブｒ　ＴＴＡＧＧＡＣＣＡＴＴ（Ａ又はＧ）（Ｃ又はＴ）Ｔ（Ｔ又はＡ）Ｇ ＧＡＴＴＴＧＴＴＧＴ（Ａ又はＴ　）　Ｔ　Ａ　Ｔ　Ｇ　Ａ　Ａ　ＡＴＪ（ＳＥ Ｑ　ＩＤ　Ｎｏ、Ｉ２）、及びプローブｒ　ＧＡ（Ｃ又はＴ）ＡＧＡｆｌ：ＡＴ ＧＴ（Ａ又はＴ）ＡＡＡＡＴ（Ｃ又はＴ）（Ｔ又はＡ）ＴＡＧＧＡＡＴＧＪ　（ ＳＥ（１１０Ｎｏ、　１３＞に対し相補的なプライマーと共に使用でき、それぞ れおよそ４４０．５４０、及びＧ５０ｂｐの増幅された断片を生じる。

２、フォーワードプライマーｒ　ＴＴ（Ａ又はＣ）ＴＴＡＡＡ（Ａ又はＴ）Ｃ（ Ａ又はＴ）ｔ；ＣＴＡＡＴＧＡＴＡＴＴＪ　（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、　１４）は 、ｓＥａ　＋ＤＮｏ、目、ＳＥＱ　Ｉｎ　Ｎｏ、Ｉ２及びＳＥＱ　Ｉｎ　Ｎｏ、 ＋３に対し相補的なプライマーと共に使用することができ、それぞれおよそ３６ ０．４６０及び５７０ｂｐの増幅された断片を生じる。

３．フォーワードプライマーＳＥＱ　１０　Ｎｏ、ｌｌは、ＳＥＱ　１ＯＮｏ、 Ｉ２及びＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、１３に対し相補的なプライマーと共に使用してそ れぞれおよそ＋００及び２＋５ｂｐの増幅された断片を生じることができる。

示された大きさの増幅されたＤＮＡ断片は放射能標識され、そして実施例３の様 に全遺伝子をクローニングするためにプローブとして使用できる。

上に挙げたプライマーの各々Ｃ３ＥＱ　ｌ［１Ｎｏ、　１０〜＋４）は上記の擾 に段アリマキ毒素をコードする遺伝子のプローブとしても使用出来る。

本発明のＢ、チューリンゲンシス単離体を遠心分離で濃縮されたＩ１９酵７０ス のｌｌ　ｉ乾燥粉末として試験した。水とバイオマス（胞子、結晶デルタエンド ；・キシン、細胞破片、及び生育培地）からなるペレットを標準の担体、防腐剤 、及び表面活性剤と混合した。２５％のバイオマスからなる粉末をヤマト噴霧乾 燥機（日本国東京のヤマト科学株式会社（Ｙａｍａｔｏ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ 　−二ｏ、　Ｌｔｄ、）により販売）を使用し・て造った。

すべてのブロスは、家バエの幼虫のバイオアッセイによってβ−エキソトキシン の存在につき試験された（キャンヘルＤ、Ｐ、ディエボールＤ、Ｅ、及びブラッ ケッ）　Ｊ　、　Ｍ、　＋０８７バシラス争チユーリンゲンシスβ−エキソトキ シン用迅速ＨＰＬＣ検定、Ｊ、　Ａｇｒｉｃ、　Ｆｏｏｄ　Ｃｈｅｓ、　３５二 １５６−１５８）。β−エキソトキシンがないことが試験でわかった単離体のみ アリマキに対する検定で使用された。

噴霧乾燥粉末の懸Ｊ液を５１の１０％蔗糖溶液中に２５−ｇの粉末を混合するこ とによって試験用につくった。この混合物を懸１ｗ１αを造る為に８分閏超音波 処理した。

２１の懸ｉ１　ｍをバラフィルム（Ｐａｒａｆｉ１ｗ＋）ＲＭフィルムボトムを 有する金属リンクからなるレザボア中に置いた。

およそ３０匹の雌のエントウアリマキ（Ａｃｙｒｔｈｏｓｉｐｈｏｎ　ｐｉｓｕ ｍ）を含有し・てるベトリ皿をフィルムの下側に置いた。

アリマキを２４時間緘糖溶１α上で飼育し、次にエントウの苗に移した。４８後 致死率を測定したく表３）、各検定を三重に行なった０表３は５０００ｐｐｍ＋ こ於て、エントウアリマキ、即ちＡｃｙｒｔｈｏｓｉｐｈｏｎ　ｐｉｓｕ＋＊に 対するバララス・チューリンゲンシス単離体の毒性を示している。

施例６　毒素遺伝子の植物への挿 本発明の１つの面は段アリマキ毒素をコードする遺伝子で植物を形質転換するこ とである。形質転換された植物はアリマキによる攻撃に対し、抵抗性である。

段アリマキ毒素に対し・コートする本明細書に開示される遺伝子は、この分野で 良く知られた種々の技術を使用して植物細胞中に挿入できろ０例えば大腸菌中０ １１製系及び形質転換細胞の選択を可能にするマーカーを含んでいる多数のクロ ーニングベクターを、外来遺伝子を高等植物中へ挿入する調製剤用に利用できる 。そのベクターは例えばｐ８Ｒ３２２、ｐｔｌｃ系、旧３ａｌｐ系、ｐＡｃＹｃ １８４などを含んでいる。従って８．（、毒素をコートする配列は適当な制限位 置において・ベクター中に挿入できる。生じるプラスミドは大腸菌中への形質転 １９のために使用される。大腸菌細胞は適当な栄養培地中で培養され、次に収穫 されて溶菌される。プラスミドは回収される。１２列分析、制限分析、ミス泳動 及び曲の生１ヒ学−分子生物学的方法は一般に分析の為の方法として実施される 。各操作の後、使用された［１ＮＡ１９列は開裂され、そして次のＤＮＡ配列に 結合される。各プラスミド配列は同しか又は池のプラスミドにクローニングでき る。植物中に所望の遺伝子を挿入する方法に依存し・て池のＤＮＡ配列が必要か もしれない。例えばもしＴ１又はＲ１プラスミドが植物細胞の形質転換に使用さ れる時は、Ｔ１又はＲ１プラスミドＴ−ＤＮＡの少なくとも右のボーダー、しか ししばしば右及び左のボーダーが、挿入されるへき遺１！ｌ：子のフランキング 領域として結合されなければならない。

植物細胞の形質転！灸のためのＴ−ＤＮＡの使用は広く研究されており、そして ＥＰ１２０５１６　：ホエケマ（１９８５）のザバイナリー　プラント　ベクタ ー　システム（Ｔｈｅ　Ｂｉｎａｒｙ　ＰＩａｎｔ〜ｅｃｔｏｒ　Ｓｙｓｔｅｍ ）　、オフセットドウルクケルジ　カンタース（Ｏｆｆｓｅｔ−ｄｕｒｋｋｅｒ ｉ　ｊ　Ｋａｎｔｅｒｓ）　Ｂ、Ｖ、、Ａｌｂｌａｓｓｅｒｄａ信（アルブラッ サーダム）、チャプター５；フラーシー等Ｃｒ１ｔ、　Ｒｅｖ、　Ｐｌａｔ、　 Ｓｃｉ、　４：ｌ−４１３：及びアン等（＋９８５）　ＥＭ＆０．１．４：２７ ７−２８７に十分に記載されている。

挿入されたＤＮＡがゲノムに一旦組込まれれば挿入されたＤＮＡは比較的そこで 安定であり、通常ふたたび出てほこない、これは、なかでもカナマイシン、Ｇ４ １８、プレオマイシン、ハイグロマイシン又はクロラムフェニコール等の殺生物 剤又は抗生物質に対する抵抗性を、形質転換された植物＊＋ｍに与える、選択マ ーカーを萱通含有している。従って個々に使用されたマーカーは、挿入されたＤ ＮＡを含有し・ない細胞ではなくて、形質転換された細胞の選択を可能とする。

ＤＮＡを植物宿主細胞に挿入するために数多くの技術が利用できる。これらの技 術には、形質転換剤としてアグロバクテリウムツメファシェンス又はアグロバク テリウムリゾゲネスを使用するＴ−ＤＮＡでの形質転換、融合、注入又はエレク トロポレーションならびに他の可能な方法が含まれる。形質転換のためにアゲロ バクチリアが使用される時は、挿入されるべきＤＮＡは特別なプラスミド。

即ち中間体ベクター又はバイナリ−ベクタ〜のいずれかにクローン化されなけれ ばならない、この中間体ベクターはＴ−ＤＮＡの配列に対し相同性である配列の ために、相同組替えによってＴｉ又はＲ１プラスミドに鞘込みできる。

Ｔ１又はＲ１プラスミドはまたＴ−ＤＮＡを移すのに必要なりｉｒ領領域含んで いろ、中間体ベクターはそれら自体でアゲロバクチリア中で複製できない、中間 体ベクターはヘルパープラスミドによってアグロバクテリウムツメファシェンス 中に移されることができる（コンジュゲーション）。

ハイナリーヘクターは大腸菌中でもアゲロバクチリア中でもそれら自体で複製で きる。これらは選択マーカー遺伝子とリンカ−又はポリリンカーを含んでおり、 これらは右及び左Ｔ−ＤＮＡボーダー領域によりフレームされる。

これらはアゲロバクチリア中に直接形質転換できる（ホルスタ−等［１９７８］ 　Ｍｏ１．　Ｇｅｎ、　Ｇｅｎｅｔ、　１６３：１８１１８７）　＊宿主細胞と して使用するアグロバクテリウムはＶげ領域を持つプラスミドを含Ｃへきである 。　ｖｉｒ領域はＴ−ＤＮＡを植物細胞に移すのに必要である。追加のＴ−ＤＮ Ａが含まれ得る。そのようにバち質転換された細菌は植物細胞の形質転換に使用 される。そのＤＮＡを植物細胞に移す為にアグロバクテリウムツメファシェンス 又は７グロバクテリウムリゾゲネスと植物外植体（ｅｘｒ＋１ａｎＬ）が培養さ れるのが有利であり得る。次に、選択のために抗生物質又は殺生物剤を含み得る 適当な培地中で感染した植物物質（例えば葉の切れ端、茎のセグメント、根のみ ならずプロトプラスト（原形質体）又は＃Ａ濁培！Ｉｌｌ胞も）から、全体の植 物が再生できる。そのようにして得られたこの植物は次に挿入されたＤＮＡの存 在について試験される。注入及びエレクトロポレーションの場合にはプラスミド に特別な要求がなされない、例えばｐＵｃ誘導体などの通常のプラスミドの使用 が可能である。

形質転換された細胞は通常の方法で植物内で成長する。

これらは性Ｍｉｌ胞を形成でき、そして子孫植物に対し形質転換された性質（群 ）を伝達する。そのような植物は通常の方法で成育てき、そして同じ形質転換さ れた遺伝因子又は池の遺伝因子を有する植物と交配できる。生じる雑種個体は対 応する表Ｅｌｌ型性質を有する。

施例７　新規なり、チューリンゲンシス遺伝子の昆虫ウィルスへのクローニング 多くのウィルスが昆虫に感染することが知られている。

これらのウィルスには例えばバクロウィルス及びエントモポックスウィルスが含 まれる。本発明の一具体例中では本明細書に記載されるアリマキ活性遺伝子を昆 虫ウィルスのゲノムと共にいれることがてき、従ってウィルスの病原性を強化で きる。　Ｂ、ｔ、毒素遺伝子を含む昆虫ウィルスを構築する方法はよく知られ、 当業者に容易に実施される。これらの手順は例えはメリーウェザ−等（メリーウ ェザ〜、Ａ、Ｔ、、Ｕ、ウニイヤー、門、Ｐ、Ｇ、ハリス、閂、ヒルスト、■、 ブース、Ｒ，Ｄ、ポジー（１９９０）　Ｊ、　Ｇｅｎ、　Ｖｉｒｏｌ。

７１　：１５３５−１５４４）及びマルテンス等（マルテンス、Ｊ、Ｗ、Ｍ、、 Ｇ、ホーニー、０．ズイデマ、Ｊ、讐９Ｍ、バンレント、Ｂ、ビサー１．１　、 　Ｍ　、ブラック（１０９０）　Ａｐｐｌ、　ＥｎｖｉｒｏｎＩｌ＋ｅｎ１．ａ ｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ。

５６（９）：２７６４−２７７０）に記載されている。

木切ｗ１書に記載された実施例と具体例ｃｉ説明目的のみの為であり、それをみ て種々の変更又は１１χ飾が当業者に示唆でき、そして添１寸の特許請求の範囲 及び本願の精神とｉｉ’１ｆｆｉの中に含まれるものである。

配列リスト 配列リスト （＋）一般情報 （１）出願人：ペイン、ツユウェル　Ｍ。

（１、発明の名ａ：バシラス・チューリンゲンシス単離体及びそれからのアフィ ディダエ科の害虫を抑制する為の毒素 （ｉｉｉン配列数：］４ （Ｉν）通信住所 （Ａ）宛先：デビット　Ｒ２サリワンチック（Ｂ）　街路：　２４２Ｉ　Ｎ、Ｗ 、４１ｓｔ　ストリート、スウィ−）Ａ−１ ＜Ｃ＞シティ−名二ケインスピル （Ｄ）州名：フロリダ州 （Ｅ）国名：アメリカ合衆国 （Ｆ）郵便番号：　３２６０６ （Ｖ）次のコンピューターから読取り可能（Ａ）媒体タイプ：フロッピーディス ク（Ｂ）コンピューター：　ＩＢＮ　ＰＣとコンパチブル（Ｃ）　＃へ０し−ｉ イＪクーシステム：　ＰＣ−ＤＯ５／ＭＳ−ＤＯ５（０）　ソフトウ１７　：　 Ｐａｔｅｎｔｌｎ　レリーｌ″１１．０．　ハ゛−ジ３ンＨ，２５（ｖｉ）Ｉ、 ｉ時点の出願データ （Ａ）出ｌＩ′＃号：　０７／９３５．３１０（Ｂ）　出願日　：　１９９２年 ８月２４日（Ｃ）分類： （ｖｉ口）弁理士／代理人情摺 （＾）氏名：サラワンチク。デビット　Ｒ１（Ｂ）登０１番号：　３１，７９４ （Ｃ）！’！ｌｆ！／ドケット番号ＩＮ／Ｓ　２０５（１ｘ）テレコミュニケー ション情報 （Ａ）電話：　９０４−３７５−８１００（Ｂ）　：１７９２：　９０４−３７ ２−５８００（２）　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：Ｉ：に間する情報（電）配列の特徴 ： （Ａ）長さ：１４２５塩基対 （Ｂ）ｆＩ類：核酸 （Ｃ）鎖の数：二本鎖 （０）トポロジー二値鎖状 （ｉｉ）　１１２列の’ｆ＊　Ｈ（ＭＱＬＥＣＵＬＥ　ＴＹＰＥ）　：　Ｇｅｎ ｏｓ＋ｉｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ（ｉｉｉ）ハイボセティカル配列：Ｎ。

（１ν）アンチセンス：Ｎ。

（ｖＩ）起Ｒ（ＯＲＩＧＩＮＡＬ　５ＯＵＲＣＥ）　：（Ａン生物（ＯＲＧＡＮ ＩＳＭ）　：バララス・チューリンゲンシス （Ｃ）　個体・単Ｈ’）ローン名（ＩＮＤＩＶＩＤＵＡＬ　ｌ５ＯＬＡＴＥ）： ＰＳ８６Ａ１ （ｖｉｉンａ接の起源（ＩＭＭＥＤＩＡＴＥ　ＳＯＵ［Ｅ）：（Ａ）−ｙ　イブ ラリ名二大Ｈ［（ε、ｃｏｌｉ）　８Ｍ５２２［１１ＭＶＣ２３２０］（ｉｖ） 配列の特徴（ＦＥＡＴＵＲＥ）　：（Ａ）名称／キー：　ｍａｔ　ｐｅｐｔｌｄ ｅ（Ｂ）存在位置：　１．、＋４２５ （ｘｉ）配列（ＳＥＱＵＥＮＣＥ　ＤＥＳＣＲＩＰＴＩＯＮ）：　ＳＥＱ　ＩＤ 　ＮＯ：ｌ：（２）　ＳＥＱ　ＩＱ　ＨＯ：２：Ｉニー間する情報（１）配列の 特徴： （Ａ）長さ：４７５アミノ酸 ＜Ｂ）Ｎ類二アミノ酸 ＜Ｃ＞鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 ＜ｉｉ）配列の橿ＫＲ（ＭＯＬＥＣＬＩＬＥ　ＴＹＰＥ）　：　９　ンハ’）　 １１（ｉｉ＋）ハイボセティカル配列：　Ｙ　ｅ　５（１ｖ）アンチセンス：Ｎ 。

（ｖｉ）　起　源　（ＯＲＩＧＩＮＡＬ　５ＯＵＲＣε）　：（Ａ）生物名：バ シラス・チューリンゲンシス（Ｃ）個体・単離クローン名：ＰＳ８６Ａ１（昌） 配列の特徴（ＦＥＡＴＵＲＥ）　：（Ａ）名称／キー：タンパク質 （Ｂ）存在位置：　１１．１４７５ （ｘｌ）配列（ＳＥＱＵＥＮＣＥ　ＤＥＳＣＲＩＰＴＩＯＮ）：　ＳＥＱ　１０ 　ＮＯ：２：Ｍｅｔ　工１・　工１＠　Ａａｐ　：＠ｒ　Ｌｙｌｌ　Ｔｈｒ　Ｔ ｈｒ　Ｌｌｌｕ　Ｐｇｏ　＾ｘｑ　ＨＬｍ　Ｓａｒ　Ｌｅｕ　ｉｊａ　Ｒ撃■ Ｔｈｒ　ＩＩｓ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ａｓｎ　！Ｅａｔ　Ａｓｎ　Ｌｙｓ　Ｌｇｓ 　Ｔｙｒ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　党ｐ　Ｍ−セ翫Ａｓｎ　（：Ｌｙ　Ａｓｒ ＋　Ｇｉｎ　Ｐｒｙｓ　Ｘｉ＠工１＊　２３ｒ　Ｌｙｅ　ａｌａ　Ｇｌｕ　Ｔｒ ｐ　ＡＰ　Ｔｈｒ　Ｉｌａ　Ｇｌ■ Ａｌａ　Ｏｒ　Ｘ１ｔａ　Ｇｉｎ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　”ｒ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｐ ｒｏ　Ｖａｌ　Ａｇｎ　ＧＬｕ　Ｇｉｎ　Ｇｉｎ　ＬｓｕＡｒｇ　Ｔｈｒ　Ｈｌ ｓ　ＶａｌＡｇｎ　Ｌａｕ　Ｓａｒ　Ｇｉｎ　Ａｍｐ　Ｉｌａ　Ｂａｒ　ＩＩｓ 　Ｐｒｏ　Ｅａｒ　Ａｓｐ　ＰｈｅＳｉｒ　Ｇｉｎ　Ｌａｕ　Ｔｙｒ　Ａｓｐ　 Ｖａｌ　Ｔｙｒ　Ｃｙｍ　Ｓｅｒ　Ａｇｐ　Ｌｙｅ　Ｔｈｒ　５＊ｒ　Ａｌａ　 Ｇｌｕ　Ｔｒｐ丁ｒｐ　Ａｍｎ　Ｌｙｓ　Ａｓｎ　Ｌ＠ｕ　Ｔｙｒ　Ｐｒｏ　Ｌ ｅｕ　工１＠　工１ｍ　Ｌｙ＠　Ｂａｒ　Ａｌａ　Ａｇｎ　Ａａｐ　ＨｌｓＺｏ ｏ　１０５　ユニ０ Ａｉａ　５＠ｒ　、ｌＥ　ＧＬｙ　Ｐｈｅ　Ｌｙｅ　Ｖａｌ　Ａｊｇ　Ｇｌｙ　 Ａｓｐ　Ｐｒｏ　５ｓｒ　９２　Ｌｙｓ　ＬＹＩＩ　Ａｓｐｃｌｙ　Ｔｙｒ　Ｐ ｈｓ　ＬＹ＃　Ｌｙａ　Ｌｅｕ　ｃｌｒ＋　Ａｓｐ　Ｃ１ｕ　Ｌｓｕ　Ａｓｐ　 Ａｓｎ　Ｉｌ自Ｖａｌ　Ａｓｐ　Ａｇｎ１３０　１５５　１　Ｌ＋〇 Ａｓｎ　Ｂａｒ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ａｌａ　工１＠λ↓ａ　Ｌｙｅ　Ａ ｌａ　工１ｅ　Ｌｙ＋　入ｓｐ　Ｐｈ・　ＬＹＩＩ　ＡｌａＡｒｇ　ＣＹＩ　Ｇ ｕｙ　１１ｅ　Ｌｅｕ　Ｉｌａ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　Ｌｙ、ｇ　Ｇｉｎ　 Ｔｙｒ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　ＡＳＨＡｌａＬＹ８　Ａｓｎ　ＸＬ＠￥ＨＡ　Ｔｈｒ 　Ｓｅｇ　Ｌａｕ　Ａｓｐ　Ｇｉｎ　Ｐｈ＠′ｕ　ＨＬｔｒ、Ｇｕｙ　”ｇ　に Ｉｎ　ＬＦ＃Ｌｙ′ｓ　Ｌｅｕ　Ｇｊｕ　ＧＬｙ　Ｖａｌ　ＩＩｓ　Ａｗｎ　ｊ Ａａｏｉｎ　Ｌｙｓ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　￥に：　ＧＬｕ　Ｖａｌ　ＧｉｎＴｈｒ 　Ａｌａ　Ｌａｕ　Ａｓｎ　Ｇｉｎ　Ａｉｍ　Ｈｉａ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ 　Ｓａｒ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ｈｌｓ　Ｌｙｅ　ＧｌｕＬｆｆｕ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ 　Ｌｙｓ　Ｖａｌ　Ｍｇ　Ａｓｎ　Ｌｅｕ　Ｌｙｅ　Ｔｈｒ　璃Ｌｅｕ　Ｇｌｕ 　Ａｒｇτ１１８Ｌｙｅ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ｇｉｎ　ＡＳＷ　Ｌａｕ　Ｇｌｕ　 Ｉ、ｙｓ　Ｌｙｓ　ＭＨＡ　Ｇｌｕ　Ｔｙｒ　Ｓｏｒ　Ｐｈｓ　Ｌａｕ　論Ｇｌ ｙ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　Ｌ：ｕ　Ｇｌｙ　Ｐｈ＠Ｖａ１ＶａＬ　ｎＥ　ＧＬｕ　Ｘ Ｌａ　ｒ、ｓｕ　Ｇｌｕ　Ａｇ８　Ｔｌｔｒ　ｊｕａＶａｌ　Ｇｉｎ　１１．Ｈ 工１＊　Ｌｙｓ　Ａｓｎ　Ｇｉｎ　ＭＡｅ　Ａｓｐ　Ｇｌｕ工１＠　Ｌｙｓ　” ｘｇ　Ｇｉｎ　Ｌ＊ｕ＾−ｐｌ；＠ｔ　Ａ１３　Ｇｉｎ　ＨＬｍ　Ａｓｐ　Ｌｓ ｕ　朔Ａｒｇ　Ａｍｐ　Ｍａｌ　Ｌｙｓ　ｊｌｅ　１１ｍ　Ｇｌｙ　隊Ｌ＠ｕＡ ｇｎ　Ｂａｒ　ｚＬｍ　Ｍｎ　Ｔｈｒ　Ｇｆｆｉｇ　ＩｌａＡｓｐ　Ａａｎ　Ｌ ａｕ　ＴＩＥ　５ｅｒ　Ｇｉｎ　Ｇｌｙ　Ｇｌｎ　（５１■ Ａｌａ　ＸＬａ　Ｌｙｅｓ　Ｖａｌ　Ｐｌｊａ　Ｇｉｎ　Ｌｙｓ　Ｌａｕ　Ｇｉ ｎ　（５３，Ｋ　Ｈｌｓ　”ｒｔｐ＾ＩＪＬ　Ｔｈｒ　ｊｉａ@Ｇｌｙ Ａｌａ　Ｇｉｎ　Ｉｔｓ　（Ｊｕ　Ａａｎ　Ｌａｕ　Ａｒｇ　Ｔｈｒτｈｒ　５ ｓｉｒ　Ｌｍｕ　Ｇｉｎ　Ｇｌｕ　Ｖａｌ　Ｇｉｎ　ＡｓｐＳ＠ｘ　Ａｓｐ　＝ ｇ　Ａｌａ　Ａａｐ　ＧＬｕエエ＠Ｉ　ＧＡ８１１ａ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　ｃｌｕ 　ＡＳＷ　Ａｌａ　Ｓｓｒ　ＡｓｐＡｌａ　”５５Ｆ、　Ｌａｕ　Ｖａｔ　Ｖａ ｌ　Ａｌａ　Ｇｉｎ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　Ａｒｇ　Ａｓｐ　Ｐｈｓ　Ｔｈｒ　Ｌａ ｕ　Ａｓｎ　Ａ撃■ ｌｒ　５＠ｒ　Ｔｈｒ　Ｍｎ　５ｅｒ　％ｇ　Ｇｉｎ　Ａｓｎ　ｔａｕ　Ｐｒｏ 　Ｘ、９　Ａｓｎ　Ｍａｌ　ｌｉｅ釦曇３６ｓａｒ　Ｃｙｓ　＾ｌｌｎ　Ｃｙｍ 　Ｓｅｅ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ａ１１ｎ　Ｍｅｔ　Ｔｈｒ　Ｂａｒ　入ａｎ　Ｇｉ ｎ　丁ｙｒ　ｓｅｒ　入|ｎ Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ｔｈｘ　Ａｓｎ　Ｍａｔ　τ’ｈｒ　Ｓａｔ　Ａｓｎ　Ｇｌｎ 　Ｔｙｒ　Ｍａｔ　Ｘｌ自１３ａｔ　）ｆｌｓ　Ｇｌｕ　Ｔ凾■ ４２０　、　４２５　４３０ Ｔｈｒ　Ｂａｒ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ａｓｎ　Ａｓｎ　Ｐｈｓ　Ｍａｔ　Ｌａｕ　 ｇｅｒ　Ａｒｇ　Ａｓｎ　！ｉａｒ　Ａｓｎ　Ｌａｕ　Ｇｌ■ Ｔｙｒ　龍ｇ　Ｃｙｌ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ａｓｎ　Ａｓｎ　Ｐｈｅ　Ｍｅｔ　Ｘ ｉｓ　Ｔｙｒ　Ｔ２　Ｔｙｒ　Ａｇｎ　Ａａｎ　５ｓｉｒ北ｇ　Ｔｒｐ　Ｔｙｒ 　Ａｇｎ　Ａｓｎ　ＲｅｊＳ　Ａｓｐ　Ｔｒｐ　Ｔｙｒ　Ａｍｎ　Ａ９ｎ（２） 　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３：に関する情報（１）配列の特徴： （Ａ）長さ：１０アミノ酸 （Ｂ）１順二アミノ酸 ＜Ｃ＞鎖の数ニー末鎖 （０）トポロジー：直鎖状 （１１）配列のＩＩ類（ＭｎＬＥＣＵＬＥ　ＴＹＰＥ）　：タンパク質（Ｘｌ） 配列（ＳＥＧすＥＮＣＥ　ＩＩＥＳＣＲＩＦ’Ｔｌ０ＩＩ）　：　ＳＥＱ　ＩＤ Ｎ０：３：（２）　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４：に間する情報（１）配列の特徴： （Ａ）長さニアアミノ酸 （Ｂ）種類二アミノ酸 （Ｃ）鎖の数ニー末鎖 ＜０）トポロジー二値鎖状 （ｉｉ）配列の橿１３１（ＭθＬＥＣｔｌＬＥ　ＴＶＰＥ）　：タンパク質（ｘ ｌ）配列（ＳＥＱＵＥＮＣＥ　ＤＥＳＩＩＰＴＩＩ）Ｎ）：　ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎ Ｏ：４：Ｘａａ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｘａａ　Ｌｙｓ　Ｖａ１（２）　Ｓ ＥＯＩＤ　ＮＯ：５：に関する情報（１）配列の特徴： （Ａ）長さ＝１２アミノ酸 （１３）種類二アミノ酸 （Ｃ）鎖の数ニー末鎖 （Ｄ）トポロジー二値鎮状 （１１）配列のｆｉ　Ｏ（ＭＯＬＥＣＵＬＥ　ＴＶＰＥ）：タンパク賀（ｘｌ） 配列（ＳＥＱＵＥＮＣＥ　ＤＥＳＣＲＩＰＴＩＯＮ）：ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ＋５ ：（２）　ＳＥＱ　１０　ＮＯ＋１３：に関する情報（ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ＝９アミノ酸 （Ｂ）ｆ！１１１二アミノ酸 （Ｃ）ＩＩの数ニー末鎖 （０）トポロジー：直鎖状 （１）配列のｆｉ類（ＭＯＬＥＣＵＬＥ　ＴＹＰＥ）：タンパク質（ｘｉ）配列 （ＳＥ（ＩＵＥＮＣＥ　ＤＥＳＣＲＩＰＴＩＯＮ）：　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：Ｇ ：（２）　ＳＥＱ　１０　ＮＯニア：に関する情報（１）配列の特ｗｌ： （Ａ）長さ二８アミノ酸 （Ｂ）種Ｘｉ二アミノ酸 （Ｃ）鎖の数ニー末鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （目）配列の１１類（ＭＯＬＥＣＵＬＥ　ＴＶＰＥ）：タンパク賀（ｘｉ）配列 （ＳＥＱＵＥＮＣＥ　ＤＥＳＣＲＩＰＴＩＯＮＣＳＥＱ　１０　ＮＯニア”？（ ２）　ＳＥＱ　１０　ＮＯ：８：に関する情報（ｉ）　ｆｉ２列の特徴： （Ａ）長さ：２０アミノ酸 （Ｂ）種ｇｌ二アミノ酸 （Ｃ）鎖の数ニー末鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列のｌ頚（ＭＯＬＥＣｔ・ＬＥ　ＴＹＰＥ）　：ペプチド（日〉　起 ｉｔ！Ｘ　（ＯＲＩＧＩＮＡＬ　５ＯＩＪＲＣＥ）：（Ａ）生物名：ハンラス・ チューリンゲンシス（Ｂ）法名：ＰＳ８（３ＡＩ （＼Ｉ）配列（ＳＥＩ）ＬＩＥＮＣＥ　１）Ｅ５ＣＲＩＰＴＩＯＮ）：　ＳＥＱ 　ＩＤ　ＮＯ：８：（２）　ＳＥＱ　ＩＱ　ＮＯ：９：に関する情報（１）配列 の特徴： （Ａ）長さ：５３塩基対 （Ｂ）ｆｉＸｌｌ：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー末鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖４大 （ｉｉ）配列の種類（Ｍ　ＯＬ　Ｅ　ＣＬＩ　Ｌ　Ｅ　Ｔ　Ｓ’　Ｐ　Ｅ　）二 Ｇｅｎｏａ＋ｉｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ（ｖｌ）起Ｒ（ＯＲＩＧＩＮＡＬ　ＳｏすＲＣε ）二（Ａ）生物名（ＯＲＧＡＮＩＳＭ）　：バララス・チューリンゲンシス（８ ）法名（ＳＴＲＡＩＮ）　：　Ｐ　Ｓ　８６　Ａ　１（Ｘｉ　）配列（ＳＥＱＵ ＥＮＣＥ　ＤＥＳＣＲＩＰＴＩＯＮ）：　ＳＥＱ　１０　ＮＯ：９：ＡＴＧＡＴ ＴＧＡＴＴ　ＣＴＡＡＡＣＡＡＣＡＴＴＡＣＣ，ＡＡＧＡ　ＣＡＴＴＣ讐ＴＴＡ ＡＴＷＣＡＴＡＣＩＩＩＡＴ　ＷＡＡ （２）　ＳＥｏ　１０　ＮＩＣｌ０：に関する情報（１）配列の特ｍ： （Ａ）長さ：２８塩基対 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖の１′１ニ一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （１１）配列の種類（ＭｔｌＬＥＣυｔ、Ｅ　ＴＶＰＥ）　：　Ｄ）ｉＡ　（５ ｙｎｔｈｅｔｉｃ）（＼１）配列（ＳＥＱＬＩＥＮＣＥ　ＤＥＳＣＲＩＰＴＩ（ ＩＮ）：　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：ＩＯ：Ｔ　Ｇ　Ａ　Ｔ　Ｔ　Ｔ　Ｔ讐ＭＴ　Ｃ ＡＡＴＴＡＴＡＴＲＡｋＧＴＴＴＡＴ（２）　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１１：に関 する情報（ｉ）配列の特徴： （，４）長ざ；２０塩基対 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー末鎖 （０）トポロジー：直鎖状 （肖）配列の種ｎ　ＣＭＯＬＥＣＵＬＥ　ＴＹＰＥ）　：　Ｄ）ｉＡ　（５ｙｎ ｔｈｅｔｉｃ）（ｘｉ）配列（ＳＥＱＵＥＮＣＥ　ＩＩＥｓｃＲＩＰＴＩＩＩＮ ）：　ＳＥＱ　１０　ＮＯ：ｌｌ：ＡＡＧＡＧＴＴＡＹＴ　ＡＲＡＲＡＡＡＧＴ Ａ（２）　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１２：に関する情報（ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：３５塩基対 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖の数ニ一本望 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （目）配列の橿ｎ　（ＭＩＩＬＥＣＵＬＥ　ＴＹＰＥ）　：　ＤＮＡ　（５ｙｎ ｔｈｅｔｉｃ）（ｘｌ）配列（ＳＥＱＵＥＮＣＥ　ＤＥＳＣＲＩＰＴＩＯＮ）： 　ＳＥＱ　１０　ＮＯ：１２：ＴＴＡＧＧＡＣＣＡＴ　ＴＲＹＴＷＧＧＡＴＴ　 ＴＧＴＴＧＴＷＴＡＴ　ＧＡｉＴ（２）　ＳＥＱ　１０　ＮＯ：１３：に間する 情報（１）配列の特徴： （Ａ）長さ：２７塩基刻 （Ｂ）ｆｌ類：核酸 （Ｃ）鎖の数ニ一本望 （０）トボロノー：直鎮状 （ｉｉ）　Ｑ列の［Ｈ（ＭＯＬＥＣＬＩＬＥ　ＴｖＰＥ）　：　ＤＮＡ　（５ｙ ｎｔ、ｌ＋ｅｔｉｃ）（＼１）　配列　（ＳＥＧＵＥＮＣＥ　ＤＥＳｆ：ＲＩＰ ＴＩＯＮ）：　ＳＥＱ　１０　ＮｉＣｌ２：ＧＡｖＡＧＡＧＡＴＧ　ＴＷＡＡＡ ＡＴＹ讐Ｔ　Ａ　Ｇ　Ｇ　、Ａ　Ａ　Ｔ　Ｇ（２）　ＳＥＱ　１０　ＮＯ：１４ ：に関する情報（１）配列の特徴： （Ａ）長さ：２３塩基対 （Ｂ）橿頚：咳酸 （Ｃ）鎖の数ニ一本望 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （１１）配列の種類（門０ＬＥＣＩＪＬＥ　ＴＹＰＥ）：　ＤＮＡ　（５ｙｎｔ ｈｅｔｉｃ）（ｘｉ）配列（ＳＥＱＵＥＮＣＥ　ＤＥＳＣＲＩＰＴＩＯＮ）：　 ＳＥＱ　ＩＱ　ＮＯ：１４：ＴＴＭＴＴＡＡＡ讐ＣＷＧＣＴＡＡＴＧＡＴ　ＡＴ ＴＡ、バラルスチューリンゲンシス　ＰＳ７５Ｊ　］Ｂ、バシルバラューリンゲ ンシス　ＰＳ８６Ａ］Ｃ，バラルスチューリンゲンシス　ＰＳ１５７　Ｃ１図１ 図　２ フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，６識別記号　庁内整理番号Ｃ１２Ｎ　Ｓ／１０ Ｃ１２Ｐ　１１０４　Ｚ　７４１７−４Ｂ／／（Ｃ１２Ｎ　１５１０９　ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ１：０７） （Ｃ１２Ｎ　５／１０ Ｃ１２Ｒ１：９２） （７２）発明者　シュネフ、エイチ、アーネストアメリカ合衆国　９２１２６　 カリフォルニア州　サンジエゴ　ハンデルコート７９５４Ｉ （Ｃ１２Ｎ　１５１００　ＺＮＡ　Ａ Ｃ１２Ｒ１：０７） （Ｃ１２Ｎ　５１００　Ａ Ｃ１２Ｒ１：９２） （７２）発明者　シュワブ、ジョージ　イー。

アメリカ合衆国　９２０２４　カリフォルニア州　エンシニタス　ウオルナット ビュー

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．Ｂ．ｔ．ＰＳ１５７Ｃ１、Ｂ．ｔ．ＰＳ８６Ａ１、Ｂ．ｔ．ＰＳ７５Ｊ１か 、らなる群から選択されるバシラス・チューリンゲンシス単離体及びモの変異体 、又は該単離体の毒素結晶又は胞子のアリマキ抑制有効量にアフィディダエ（Ａ ｐｈｉｄｉｄａａｅ）科からの害虫を接触させることからなる、該害虫を抑制す る方法。 ２．微生物がバシラス・チューリンゲンシスＰＳ１５７Ｃ１である請求項１に記 載の方法。 ３．微生物がバシラス・チューリンゲンシスＰＳ８６Ａ１である請求項１に記載 の方法。 ４．微生物がバシラス・チューリンゲンシスＰＳ７５Ｊ１である請求項１に記載 の方法。 ５．害虫がエンドウアリマキ（Ａｃｙｒｔｈｏｓｉｐｈｏｎｐｉｓｕｍ）である 請求項１に記載の方法。 ６．Ｂ．ｔ．ＰＳ１５７Ｃ１、Ｂ．ｔ．ＰＳ８６Ａ１、Ｂ．ｔ．ＰＳ７５Ｊ１か らなる詳から選択されるバシラス・チューリンゲンシス単離体及びその変異体か ら得ることが出来、アリマキに対し活性な毒素をコードしているヌクレオチド配 列。 ７．アリマキに対し毒性であるが線虫は抑制しない毒素蛋白質をコードしている ヌクレオチド配列であって、該毒素が、 （ａ）該毒素のアミノ酸配列が一般式（明細書１２〜１３頁のもの）に適合する こと、 （ｂ）該毒素のアミノ酸配列が蛋白質８６Ａ１のアミノ酸配列と少なくとも５０ ％相同であること、（ｃ）該毒素をコードするＤＮＡが蛋白質８６Ａ１の全て又 は一部に対しコードするＤＮＡとハイブリダイズすること、 （ｄ）該毒素に対しコードするＤＮＡがＳＥＱＩＤＮＯ．１０〜１４からなる群 から選択されるプローブ、及びＳＥＱＩＤＮＯ．３〜７に対しコードするＤＮＡ とハイブリダイズすること、（ｅ）該毒素に対しコードするヌクレオチド配列の 一部が、 （ｉ）ＳＥＱＩＤＮＯ．１０又はＳＥＱＩＤＮＯ．１４のいずれかであるブォー ワードブテイマー、及びＳＥＱＩＤＮＯ．１１、ＳＥＱＩＤＮＯ．１２又はＳＥ ＱＩＤＮＯ．１３のいずれかに対し相補的であるリバースプライマー、 （ｉｉ）ＳＥＱＩＤＮＯ．１１であるフォーワードプライマー、及びＳＥＱＩＤ ＮＯ．１２又はＳＥＱＩＤＮＯ．１３のいずれかに対し相補的であるリバースプ ライマー、 とのポリメラーゼ鎖反応を使用してバシラス・チューリンゲンシス菌株から増幅 できること、 （ｆ）毒素１５７Ｃ１、７５．１１及び８６Ａ１からなる群から選択される蛋白 質と免疫反応する抗体と該毒素が免疫反応性であること、 からなる群から選択される特徴の少なくとも一つを有し８．該毒素が核一般式に 適合する請求項７に記載のヌクレオチド配列。 ９．該毒素に対しコードするＤＮＡが蛋白質８６Ａ１の全部又は一部に対しコー ドするＤＮＡとハイブリダイズする請求項７に記載のヌクレオチド配列。 １０．該毒素に対しコードするＤＮＡがＳＥＱＩＤＮＯ．１０〜１４からなる群 から選択されるプローブ、及びＳＥＱＩＤＮＯ．３〜７に対しコードするＤＮＡ とハイブリダイズする、請求項７に記載のヌクレオチド配列。 １１．該毒素をコードするヌクレオチド配列の一部が、（ａ）ＳＥＱＩＤＮＯ． １０又はＳＥＱＩＤＮＯ．１４のいずれかであるフォーワードプライマー、及び ＳＥＱＩＤＮＯ．１１、ＳＥＱＩＤＮＯ．１２又はＳＥＱＩＤＮＯ．１３のいず れかに対し相補的であるリバースプライマー、又は （ｂ）ＳＥＱＩＤＮＯ．１１てあるフォーワードプライマー、及びＳＥＱＩＤＮ Ｏ．１２又はＳＥＱＩＤＮＯ．１３のいずれかに対し相補的であるリバースプラ イマー、 とのポリメラーゼ鎖反応を使用してバシラス・チューリンゲンシス菌株がら増幅 できる請求項７に記載のヌクレオチド配列。 １２．該フォーワードプライマーがＳＥＱＩＤＮＯ．１０であり、そして （２）該リバースプライマーがＳＥＱＩＤＮＯ．１１に対し相補的であって約４ ４０ｂｐのポリメラーゼ鎖反応断片を生じるか、 （ｂ）該リバースプライマーがＳＥＱＩＤＮＯ．１２に対し相補的であって約５ ４０ｂｐのポリメラーゼ鎖反応断片を生じるか、 （ｃ）該リバースプライマーがＳＥＱＩＤＮＯ．１３に対し相補的であって約６ ５０ｂｐのポリメラーゼ鎖反応断片を生じる、請求項１１に記載のヌクレオチド 配列。 １３．該フォーワードプライマーがＳＥＱＩＤＮＯ．１４であり、ＳＥＱＩＤＮ Ｏ．１４がＳＥＱＩＤＮＯ．１１、ｌ２又は１３に対し相補的であるリバースプ ライマーと共に使用されたときに、それぞれ約３６０、４６０及び５７０ｂｐの ポリメラーゼ鎖反応断片を生じる請求項１１に記載のヌクレオチド配列。 １４．該フォーワードプライマーがＳＥＱＩＤＮＯ．１１であり、ＳＥＱＩＤＮ Ｏ．１１がＳＥＱＩＤＮＯ．１２又は１３に対し相補的であるリバースプライマ ーと共に使用されたときに、それぞれ約１００及び２１５ｂｐのポリメラーゼ鎖 反応断片を生じる請求項１１に記載のヌクレオチド配列。 １５．該毒素が毒素１５７Ｃ１、７５Ｊ１及び８６Ａ１からなる群から選択され る蛋白質と免疫反応する抗体と免疫反応性である請求項７に記載のヌクレオチド 。 １６．Ｂ．ｔ．ＰＳ１５７Ｃ１、Ｂ．ｔ．ＰＳ８６Ａ１、Ｂ．ｔ．ＰＳ７５Ｊ１ からなる群から選択されるバシラス・チューリンゲンシス単離体及びその変異体 から得ることが出来るヌクレオチド配列によってコードされ、アリマキ害虫に対 し活性な毒素。 １７．アリマキに対し毒性であるが線虫は抑制しない実貧的に純粋な毒素蛋白質 であって、 （ａ）該毒素のアミノ酸配列が一般式（明細書１２〜１３頁のもの）に連合する こと、 （ｂ）該毒素のアミノ酸配列が蛋白質８６Ａ１のアミノ酸配列と少なくとも５０ ％相同であること、（ｃ）該毒素をコードするＤＮＡが蛋白質８６Ａ１の全て又 は一部に対しコードするＤＮＡとハイブリダイズすること、 （ｄ）該毒素に対しコードするＤＮＡがＳＥＱＩＤＮＯ．１０〜１４からなる群 から選択されるプローブ、及びＳＥＱＩＤＮＯ．３〜７に対しコードするＤＮＡ とハイブリダイズすること、（ｅ）該毒素に対しコードするヌクレオチド配列の 一部が、 （ｉ）ＳＥＱＩＤＮＯ．１０又はＳＥＱＩＤＮＯ．１４のいずれかであるフォー ワードプライマー、及びＳＥＱＩＤＮＯ．１１、ＳＥＱＩＤＮＯ．１２又はＳＳ ＥＱＩＤＮＯ．１３のいずれかに対し相補的であるリバースプライマー、又は （ｉｉ）ＳＥＱＩＤＮＯ．１１であるフォーワードプライマー、及びＳＥＱＩＤ ＮＯ．１２又はＳＥＱＩＤＮＯ．１３のいずれかに対し相補的であるリバースプ ライマー、 とのポリメラーゼ鎖反応を使用してバシラス・チューリンゲンシス菌株から増幅 できること、 （ｆ）毒素１５７Ｃ１、７５Ｊ１及び８６Ａ１がらなる群から選択される蛋白貧 と免疫反応する抗体と該毒素が免疫反応性であること、 からなる群から選択される特徴の少なくとも一つを有している、実質的に純粋な 毒素蛋白質。 １８．該毒素が該一般式に適合する請求項１７に記載の毒素。 １９．該毒素に対しコードするＤＮＡが蛋白質８６Ａ１の全部又は一部に対しコ ードするＤＮＡとハイブリダイズする請求項１７に記載の毒素。 ２０．該毒素に対しコードするＤＮＡがＳＥＱＩＤＮＯ．１０〜１４からなる群 から選択されるプローブ、及びＳＥＱＩＤＮＯ．３〜７に対しコードするＤＮＡ とハイブリダイズする、請求項１７に記載の毒素。 ２１．該毒素をコードするヌクレオチド配列の一部が、（ａ）ＳＥＱＩＤＮＯ． １０又はＳＥＱＩＤＮＯ．１４のいずれかであるフォーワードプライマー、及び ＳＥＱＩＤＮＯ．１１、ＳＥＱＩＤＮＯ．１２又はＳＥＱＩＤＮＯ．１３のいず れかに対し相補的であるリバースプライマー、又は （ｂ）ＳＥＱＩＤＮＯ．１１であるフォーワードプライマー、及びＳＥＱＩＤＮ Ｏ．１２又はＳＥＱＩＤＮＯ．１３のいずれかに対し相補的であるリバースプラ イマー、 とのポリメラーゼ鎖反応を使用してバシラス・チューリンデンシス菌株から増幅 できる請求項１７に記載の毒素。 ２２．該フォーワードプライマーがＳＥＱＩＤＮＯ．１０であり、そして （ａ）該リバースプライマーがＳＥＱＩＤＮＯ．１１に対し相補的であって約４ ４０ｂｐのポリメラーゼ鎖反応断片を生じるか、 （ｂ）該リバースプライマーがＳＥＱＩＤＮＯ．１２に対し相補的であって約５ ４０ｂｐのポリメラーゼ鎖反応断片を生じるか、又は （ｃ）該リバースプライマーがＳＥＱＩＤＮＯ．１３に対し相補的であって約６ ５０ｂｐのポリメラーゼ鎖反応断片を生じる、請求項２１に記載の毒素。 ２３．該フォーワードプライマーがＳＥＱＩＤＮＯ．１４であり、ＳＥＱＩＤＮ Ｏ．１４がＳＥＱＩＤＮＯ．１１、１２又は１３に対し相補的であるリバースプ ライマーと共に使用されたときに、それぞれ約３６０、４６０及び５７０ｂｐの ポリメラーゼ鎖反応断片を生じる請求項２１に記載の毒素。 ２４．該フォーワードプライマーがＳＥＱＩＤＮＯ．１１であり、ＳＥＱＩＤＮ Ｏ．１１がＳＥＱＩＤＮＯ．１２又は１３に対し相補的であるリバースプライマ ーと共に使用されたときに、それぞれ約１００及び２１５ｂｐのポリメラーゼ鎖 反応断片を生じる請求項２１に記載の毒素。 ２５．該毒素が、毒素１５７Ｃ１、７５Ｊ１及び８６Ａ１からなる群から選択さ れる蛋白質と免疫反応する抗体と免疫反応性である請求項１７に記載の毒素。 ２６．アリマキに対し毒性である実質的に純粋な毒素蛋白質を含み、 （ａ）該毒素のアミノ酸配列が一般式（明細書１２〜１３頁）に適合すること、 （ｂ）該毒素のアミノ酸配列が蛋白質８６Ａ１のアミノ酸配列と少なくとも５０ ％相同であること、（ｃ）該毒素をコードするＤＮＡが蛋白質８６Ａ１の全て又 は一部に対しコードするＤＮＡとハイブリダイズすること、 （ｄ）該毒素に対しコードするＤＮＡがＳＥＱＩＤＮＯ．１０〜１４からなる群 から選択されるプローブ、及びＳＥＱＩＤＮＯ．３〜７に対しコードするＤＮＡ とハイブリダイズすること、（ｅ）該毒素に対しコードするヌクレオチド配列の 一部が、 （ｉ）ＳＥＱＩＤＮＯ．１０又はＳＥＱＩＤＮＯ．１４のいずれかであるフォー ワードプライマー、及びＳＥＱＩＤＮＯ．１１、ＳＥＱＩＤＮＯ．１２又はＳＥ ＱＩＤＮＯ．１３のいずれかに対し相構的であるリバースプライマー、 （ｉｉ）ＳＥＱＩＤＮＯ．１１であるフォーワードプライマー、及びＳＥＱＩＤ ＮＯ．１２又はＳＥＱＩＤＮＯ．１３のいずれかに対し相補的であるリバースプ ライマー、 とのポリメラーゼ鎖反応を使用してバシラス・チューリンゲンシス菌株から増幅 できること、 （ｆ）毒素１５７Ｃ１、７５Ｊ１及び８６Ａ１からなる群から選択される蛋白質 と免疫反応する抗体と該毒素が免疫反応性であること、 からなる群から選択される特徴の少なくとも一つを該毒素が有している組成物と 、アフィディダエ（Ａｐｈｌｄｉｄａｅ）科の害虫を接触させることからなるア フィディダエ科の害虫を抑制する方法。 ２７．該毒素が該一般式に適合する請求項２６に記載の方法。 ２８．該毒素に対しコードするＤＮＡが蛋白質８６Ａ１の全部又は一部に対しコ ードするＤＮＡとハイブリダイズする請求項２６に記載の方法。 ２９．該毒素に対しコードするＤＮＡがＳＥＱＩＤＮＯ．１０〜１４からなる群 から選択されるプローブ、及びＳＥＱＩＤＮＯ．３〜７に対しコードするＤＮＡ とハイブリダイズする、請求項２６に記載の方法。 ３０．該毒素をコードするヌクレオチド配列の一部が、（ａ）ＳＥＱＩＤＮＯ． １０又はＳＥＱＩＤＮＯ．１４のいずれかであるフォーワードプライマー．及び ＳＥＱＩＤＯＮ．１１、ＳＥＱＩＤＮＯ．１２又はＳＥＱＩＤＮＯ．１３のいず れかに対し相補的であるリバースプライマー、又は （ｂ）ＳＥＱＩＤＮＯ．１１てあるフォーワードプライマー、及びＳＥＱＩＤＮ Ｏ．１２又はＳＥＱＩＤＮＯ．１３のいずれかに対し相補的であるリバースブテ イマー、 とのポリメラーゼ鎖反応を使用してバシラス・チューリンゲンシス菌株から増幅 できる請求項２６に記載の方法。 ３１．該フォーワードプライマーがＳＥＱＩＤＮＯ．１０であり、そして （ａ）該リバースプライマーがＳＥＱＩＤＮＯ．１１に対し相補的であって約４ ４０ｂｐのポリメラーゼ鎖反応断片を生じるか、 （ｂ）該リバースプライマーがＳＥＯＩＤＮＯ．１２に対し相補的であって約５ ４０ｂｐのポリメラーゼ鎖反応断片を生じるか、又は （ｃ）該リバースプライマーがＳＥＯＩＤＮＯ．１３に対し相補的であって約６ ５０ｂｐのポリメラーゼ鎖反応断片を生じる、請求項３０に記載の方法。 ３２．該フォーワードプライマーがＳＥＱＩＤＮＯ．１４であり、ＳＥＱＩＤＮ Ｏ．１４がＳＥＱＩＤＮＯ．１１、１２又は１３に対し相補的であるリバースプ ライマーと共に使用されたときに、それぞれ約３６０、４６０及び５７０ｂｐの ポリメラーゼ鎖反応断片を生じる請求項３０に記載の方法。 ３３．該フォーワードプライマーがＳＥＱＩＤＮＯ．１１であり、ＳＥＱＩＤＮ Ｏ．１１がＳＥＱＩＤＮＯ．１２又は１３に対し相補的であるリバースプライマ ーと共に使用されたときに、それぞれ約１００及び２１５ｂｐのポリメラーゼ鎖 反応断片を生じる請求項３０に記載の方法。 ３４．該毒素が、毒素１５７Ｃ１、７５Ｊ１及び８６Ａ１からなる群から過択さ れる蛋白質と免疫反応する抗体と免疫反応性である請求項２６に記載の方法。 ３５．Ｂ．ｔ．ＰＳ１５７Ｃ１．Ｂ．ｔ．ＰＳ８６Ａ１、Ｂ．ｔ．ＰＳ７５Ｊ１ からなる群から選択されるバシラス・チューリンゲンシス単離体、及びその変異 体から得ることが出来るヌクレオチド配列であって、アリマキに対し毒性である が線虫は抑制しない蛋白質をコードしているヌクレオチド配列によって形質転換 された、植物、微生物、バクロウィルス、及びエントモポックスウィルスからな る群から選択される形質転換宿主。 ３６．アリマキに対し毒性であるが線虫は抑制しない毒素蛋白質であって、 （ａ）該毒素のアミノ酸配列が一般式（明細書１２〜１３頁）に適合すること、 （ｂ）該毒素のアミノ酸配列が蛋白質８６Ａ１のアミノ酸配列と少なくとも５０ ％相同であること、（ｃ）該毒素をコードするＤＮＡが蛋白質８６Ａ１の全て又 は一部に対しコードするＤＮＡとハイブリダイズすること、 （ｄ）該毒素に対しコードするＤＮＡがＳＥＱＩＤＮＯ．１０〜１４からなる群 から選択されるプローブ、及びＳＥＱＩＤＮＯ．３〜７に対しコードするＤＮＡ とハイブリダイズすること、（ｅ）該毒素に対しコードするヌクレオチド配列の 一部が、 （ｉ）ＳＥＱＩＤＮＯ．１０又はＳＥＱＩＤＮＯ．１４のいずれかであるフォー ワードプライマー、及びＳＥＱＩＤＮＯ．１１、ＳＥＱＩＤＮＯ．１２又はＳＥ ＱＩＤＮＯ．１３のいずれかに対し相補的であるリバースプライマー、 （ｉｉ）ＳＥＱＩＤＮＯ．１１であるフォーワードプライマー、及びＳＥＱＩＤ ＮＯ．１２又はＳＥＱＩＤＮＯ．１３のいずれかに対し相補的であるリバースプ ライマー、 とのポリメラーゼ鎖反応を使用してバシラス・チューリンゲンシス菌株から増幅 できること、 （ｆ）毒素１５７Ｃ１、７５Ｊ１及び８６Ａ１からなろ群から選択される蛋白質 と免疫反応する抗体と該毒素が免疫反応性であること、 からなる群から選択される特徴の少なくとも一つを有している毒素をコードして いるヌクレオチド配列によって形質転換されている、植物、微生物、バクロウィ ルス、及びエントモポックスウィルスからなる群から選択される形質転換宿主。