JPH03219900A

JPH03219900A - 魚介類の鮮度測定法

Info

Publication number: JPH03219900A
Application number: JP1566990A
Authority: JP
Inventors: Yoshikazu Isono; 義員磯野
Original assignee: Otsuka Foods Co Ltd
Current assignee: Otsuka Foods Co Ltd
Priority date: 1990-01-24
Filing date: 1990-01-24
Publication date: 1991-09-27
Anticipated expiration: 2014-04-05
Also published as: JP2879351B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】産業上の利用分野本発明は魚介類の鮮度測定方法、より詳しくは各種酵素
反応を組み合わせ利用して、魚介類の鮮度をより容易且
つ迅速に測定する新しい方法に関する。

従来より魚介類の鮮度（生きのよさ）は官能的に判断さ
れてきたが、近年の冷凍技術の進歩や包装形態、流通機
構の変化等に伴って、上記魚介類の外観による鮮度判断
は次第に困難になりつつあり、これに代わって科学的且
つ客観的な鮮度測定技術及びそのための指標が要望され
てきている。

現在、上記要望に合致する最も信頼できる鮮度指標とし
ては、下式（１）で算出されるに値が知られている。

（１）（式中ＡＴＰはアデノシン３リン酸を、ＡＤＰはアデノ
シン２リン酸を、ＡＭＰはアデニル酸を、ＩＭＰはイノ
シン酸を、ＨｘＲはイノシンを、Ｈｘはヒポキサンチン
をそれぞれ示し、以下同様とする。）また上記ＡＴＰ　
ＸＡＤＰ及びＡＭＰは魚肉中で速やかに分解されるので
、上式（１）より之等を省略した下式（２）で算出され
るＫｌ値でも、実用上充分な精度で鮮度を表わし得るこ
とが明らかにされている（例えば特開昭５９−１０７２
５６号公報、１、　Ａｇｒｉｃ、　　Ｆｏｏｄ　Ｃｈｅ
ｍ、、　　ｖｏｌ、３２．　　ｐｐ１８−２２　（１９
８４）等参照）。

しかして、上記鮮度指標に値やＫｌ値は、従来下記（１
）〜（４）の如き各種の方法により求められているが、
２等各法は以下に述べるようにそれらに特有の問題点が
あり、いずれも充分なものとは言えない現状にある。

即ち、（１）イオン交換樹脂を用いて各成分を分画し、
之等をそれぞれ測定してに値を算出する方法（簡易クロ
マトグラフィー法）は、熟練者でも上記指標の算出まで
に２〜３時間もの操作時間を要し、その操作が繁雑にす
ぎることは勿論のこと、用いられるイオン交換樹脂の再
生、平衡化等も必要となる不利がある。

（２）逆相系カラム、ゲル浸透クロマトグラフィー用カ
ラム等を用いて各成分を分画し、之等を定量してに値を
求める方法（ＨＰ　Ｌ　Ｃ法）は、高価なＨＰＬＣ装置
やクロマトパック等の各成分のピーク面積を求めるため
の付属品が必要で、また測定に熟練した技術を要し、更
に各成分の標準溶液を用意せねばならず、加えて分析の
ためにカラムの平衡化や洗浄も必要な難点がある。

（３）キサンチンオキシダーゼ及びヌクレオシドフォス
フォリラーゼを用いたＵＶ法は、まず劇薬である過塩素
酸を用いて魚肉から核酸成分を抽出し、抽出液の２５０
ｎｍの吸収を測定して核酸関連化合物の総量（Ａ）を求
め、次に上記抽出液にキサンチンオキシダーゼ及びヌク
レオシドフォスフォリラーゼを作用させてＨｘＲ及びＨ
ｘを尿酸に変化させ、生成した尿酸の量を２９３ｎｍの
吸収から求め、更にこれに魚種によって異なる換算係数
を掛けて（Ｂ）を算出し、上記各値よりＡ／Ｂ　Ｘ１０
０を算出してに値を求める方法である。しかるに、この
方法は上記の通り魚肉からの核酸関連物質抽出の際に、
ＵＶ吸収を妨害しない点から劇薬である過塩素酸を用い
る必要があり危険であると共に、操作が繁雑で、ＵＶ分
光光度計が必要である不利がある。更に、この方法はＵ
Ｖ吸収により核酸関連物質の量を求めるものであるが、
魚肉試料中には上記核酸関連物質以外にもＵＶ吸収をも
つ物質が存在する可能性があり、この点を考慮すれば、
精度上問題がある。

また（４）酵素反応で消費される酸素量を酸素電極を用
いて測定し、間接的にＡＴＰ関連化合物を定量する方法
は、まず魚肉試料を２つに分け、方にキサンチンオキシ
ダーゼ及びヌクレオシドフォスフォリラーゼを作用させ
てＨＸＲ及びＨＸを尿酸にまで酸化させ、この時消費さ
れる溶液中の酵素量を酸素電極で測定してＨＫＲ及びＨ
ｒ量を求める一方、他方の試料に粗アルカリフォスファ
ターゼを作用させて予備反応を行ない、ＡＴＰ　、　Ａ
ＤＰ　ＸＡＭＰ及びＩＭＰをＨＸＲに変換し、これにキ
サンチンオキシダーゼ及びヌクレオシドフォスフォリラ
ーゼを作用させ、この時消費される酵素量を同様に酸素
電極で測定してＡＴＰ関連化合物の総量を求め、得られ
た両者の測定値の比によりに値を算出する方法である。

この方法は、高価な測定器が必要である欠点と共に、試
料を２つに分け、之等のそれぞれについて酸素電極を用
いて酸素消費量を別途に求めねばならない不利があり、
更にアルカリフォスファターゼによる予備反応も必要で
、時間がかかるし、各酵素反応は使用される酵素標品中
に通常混入するカタラーゼによって影響を受け、これが
精度を低下させる不利もある。

以上のように、従来よりに値及びに１値を指標とする魚
介類の鮮度測定技術は、その指標自体は信頼できるとさ
れているにも係わらず、測定技術自体が繁雑であったり
、精度が悪く、より迅速且つ簡便にしかも正確に上記指
標を求め得る新しい鮮度測定技術の開発が、この業界で
要望されている現状にある。

発明が解決しようとする課題本発明の目的は、上記業界の要望に合致し、迅速、簡便
で且つ正確な鮮度測定法を提供することにあり、また従
来法にみられるＨＰＬＣ装置、酸素電極による測定装置
、紫外分光光度計等の高価な装置必要とせず、安価な分
析器で実施できる上記方法を提供することにある。

課題を解決するための手段上記目的は、以下の方法により達成される。

即ち、本発明によれば、鮮度測定用試料液、リン酸塩を
含まない緩衝液及び酸化により発色する発色試薬を含む
系に、（１）リボース−１−リン酸の存在下にヌクレオ
シドホスホリラーゼ作用させてヒポキサンチンをヌクレ
オシドに変換させる工程、（２）ヌクレオシドオキシダ
ーゼを作用させてヌクレオシドを酸化させると共に該ヌ
クレオシド量に対応して発現する上記ヌクレオシドオキ
シダーゼのラッカーゼ様活性により発色試薬を発色させ
る工程、（３）アデノシン３リン酸、アデノシン２リン
酸、アデニル酸及びイノシン酸をヌクレオシドに変換さ
せる酵素類を作用させる工程及び（４）上記各工程後の
反応液の発色度合を測定する工程を包含することを特徴
とする魚介類の鮮度測定法が提供される。

本発明方法は、より詳細には（１）上記において、工程（１）〜工程（３）をこの順
序で実施し且つ工程（３）において粗アルカリホスファ
ターゼ、粗酸性ホスファターゼ及び粗アピラーゼから選
ばれる酵素類を用い、工程（２）後の測定値を工程（３
）後の測定値で除してに値を求め、これを魚介類鮮度指
標とする方法、（２）上記において、工程（１）〜工程（３）をこの順
序で実施し且つ工程（３）において精製アルカリホスフ
ァターゼ及び／又は５′−ヌクレオチダーゼを用い、工
程（２）後の測定値を工程（３）後の測定値で除してＫ
ｌ値を求め、これを魚介類鮮度指標とする方法、及び（３）上記において、工程（１）〜工程（３）を工程（
２）、（１）及び（３）の順序で実施し且つ工程（３）
において精製アルカリホスファターゼ及び／又は５′−
ヌクレオチダーゼを用い、（ａ）工程（１）後の測定値
から工程（２）後の測定値を差し引いた値を、工程（３
）後の測定値で除してＨｘ比を求め、（ｂ）工程（２）
後の測定値を工程（３）後の測定値で除してＨｘＲ比を
求め、また（ｃ）工程（３）後の測定値から工程（１）
後の測定値を差し引いた値を、工程（３）後の測定値で
除してＩＭＰ比を求め、得られた各値のいずれかを魚介
類鮮度指標とする方法を包含している。

上記（１）〜（３）のいずれの本発明方法も、迅速、簡
便で且つ正確に魚介類の鮮度測定を可能とするものであ
り、従来法のごと（ＨＰＬＣ装置、酸素電極による測定
装置、紫外分光光度計等の高価な装置必要とせず、安価
な分析器で実施できる利点を有している。

本発明方法に利用されるヌクレオシドオキシダーゼにつ
き詳述すれば、この酵素は本発明者らが先に開発（特願
昭６３−１９６６３２号）し、［ヌクレオシドオキシダ
ーゼＹＴ−ＩＪと命名したヌクレオシドの酸化反応を触
媒する酵素であり、該ヌクレオシドと分子状酸素との反
応によってヌレオシド−５′　−アルデヒドを経てヌク
レオシド５′−カルボン酸を生成するが、過酸化水素は
副生しない特徴を有している。本酵素の触媒する上記ヌ
クレオシドの酸化反応は、次式（１）及び（２）で示さ
れ、公知の他のヌクレオシドオキシダーゼの酸化反応と
は明確に区別される。

ＨＯＨ２ＣＢａ５ｅ　　　　　　　　ＯＨＣＢａ５ｅＨ
ＯＨＯＨＯＨ（１）ＯＨＯＨ０１（ＯＨ（２）また本酵素は、上記式で示される該ヌクレオシドの酸化
反応と同時に、該ヌクレオシド量に応じてラッカーゼ様
活性を示すという該酵素に特有の性質をも有しており、
本発明方法は本酵素に特有の上記ラッカーゼ様活性を利
用する点に特徴を有している。

本酵素ＹＴ−１は、シュードモナス属に属する該酵素生
産菌を用いて製造される。ここで用いられる上記酵素の
生産菌としては、例えば本発明者らが新たに単離した以
下の性質を有する菌株を例示できる。

■、菌学的性質（Ａ）形態学的性質 ■　細胞は桿菌であり、大きさは０．５Ｘ１．５〜１．
７μｍである。

■　運動性を有し、べん毛は極べん毛である。

■　胞子は形成されない。

■　ダラム染色においては陰性である。

（Ｂ）培養所見 ■　肉汁寒天平板培養生育は中庸であり、集落は円形で、表面は滑かで黄色で
ある。

■　肉汁寒天斜面培養生育は中庸であり、表面は滑かで黄色である。

■　肉汁液体培養表面に生育し、生育は中庸である。

肉汁ゼラチン穿刺培養表面部分に生育し、ゼラチンを液化する（Ｓｆｒａｔｉ
ｆｏｒｍ）。

（ｃ）生理的性質 ■ 硝酸塩の還元　　　　　陰性脱窒反応　　　　　　　陰性インドールの生成　　　陰性硫化水素の生成　　　　陰性澱粉の加水分解　　　　陰性硝酸塩の利用　　　　　陰性アンモニウム塩の利用　陽性色素の生成蛍光色素、ビオシアニン、キサントモナジンはいずれも
生成しない。肉汁寒天培地では褐色の拡散性、色素を生
産することがある。

ウレアーゼ　　　　　　陰性オキーシダーゼ　　　　　陰性〜弱陽性カタラーゼ　　
　　　　陽性生育の範囲ｐＨ４，５で生育しない。４℃及び４１℃で生育しない
。生育ｐＨは５〜８の範囲が適当であり、温度は３５℃
が最適である。

酸素に対する態度０−Ｆテスト（Ｈｕｇｈ糖類からの酸の生成り−グルコース　　　陽性Ｄ−フルクトース　　陽性Ｄ−マルトース　　　陽性Ｄ−ガラクトース　　陽性Ｄ−キシロース　　　陽性Ｄ−マンニトール　　陰性ショ糖　　　　　　　陰性乳　糖　　　　　　　陽性エスクリンの分解アルギニンジヒドラーゼリジンデカルボキシラーゼオルニチンデカルボキシラーゼフェニルアラニンデアミナーゼ卵黄反応ツイーン２０の分解好気性であるＬｅｉｆｓｏｎ法）　酸化的陽性陰性陽性陰性陰性陰性陽性 ■　ツイーン８０の分解　　　　　　陽性［相］　ポリ
ベーターヒドロキシ酪酸の蓄積　陰性■　栄養要求性メチオニン或いはシスチンを要求する。

以上の各性質をもとに、本菌株の検索をバージ［Ｂｅｒ
ｇｅ７’ｓ　Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　Ｓｙｓｔｅｍａｔｉ
ｃ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ（１９８４））に従って
行なうと、本菌株は■グラム陰性の桿菌であり、胞子を
形成しないこと、■カタラーゼ陽性であること、■極べ
ん毛で運動すること、■グルコースを酸化的に分解する
こと、■ｐＨ７，０の普通寒天培地によく生育すること
等の特徴を有していることより、シュードモナス属（Ｐ
ｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属）に属すると認められた。更に
■シスチン或いはメチオニンを生育に要求すること、■
アルギニンジヒドロラーゼ陰性であること、■ポリベー
ターヒドロキシ酪酸を蓄積しないこと、■コロニーが黄
色であること、■キサントモナジンを産生じないこと、
■オキシダーゼ反応が微弱であること等、シュードモナ
ス　マルトフィリア（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｍａｌ
ｔｏｐｈｉｌｉａ　）の特徴とよく一致した。

以上の結果より、本発明者らは本菌株をシュードモナス
　マルトフィリアの一菌株と同定し、これをシュードモ
ナス　マルトフィリアＬＢ−８６（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎ
ａｓ　ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ　ＬＢ−ｇ５　）と命名
した。

該菌株は、通産省工業技術院微生物工業技術研究所に上
記表示にて、微工研菌寄第９８１３号（ＦＥＲＭ　　Ｐ
−９８１３）として寄託された。

本酵素ヌクレオシドオキシダーゼＹＴ−１は、上記ＬＢ
−８６株、その変異株等を含むシュードモナス属に属し
、上記ヌクレオシドオキシダーゼＹＴ−１の産生能を有
する微生物を培養することにより製造でき、この培養は
、適当な栄養含有培地中で実施できる。培地としては、
シュードモナス属に属する微生物の培養に通常使用され
る各種の炭素源、窒素源、無機物等を含有する合成培地
、半合成培地及び天然培地のいずれをも使用できる。

上記炭素源としては具体的には例えば高級脂肪酸、スタ
ーチ分解物（デキストリン）、マルトース、乳糖、ブド
ウ糖、糖蜜、果糖等の微生物が同化可能な各種炭素化合
物が単独で又は２種以上組合せて用いられる。窒素源と
しては例えばペプトン、肉エキス、酵母エキス、大豆粉
、綿実粉、コンスティープリカー等を例示できる。無機
物としては例えば食塩の他、カリウム、ナトリウム、マ
グネシウム、カルシウム、亜鉛、鉄等の無機金属のリン
酸塩類や硫酸塩類等の無機塩類が必要に応じて適宜利用
され得る。

上記微生物の培養は、液体培養でも固体培養でも実施で
き、通常通気撹拌条件下、好気的に行なわれるのが望ま
しい。培地のｐＨ１培養温度、培養時間等の培養条件は
、培養する微生物の発育に適しており、しかも目的とす
る酵素の生産量をできるだけ多くする条件から選択され
るのがよい。

例えば培地ｐＨは約６〜８の範囲、培養温度は約２０〜
３５℃の範囲から選択されるのが好適である。培養時間
は目的とする酵素の生産蓄積量が最高に達する時間を選
べばよく、通常約１２〜４８時間の範囲から選択される
。勿論、上記培養の各条件や培養方法等は、用いる微生
物の種類や培養のための外的条件等に応じて適宜変化さ
せ得る。

かくして得られる培養物中には、通常その菌体区分に目
的とする酵素が蓄積される。この酵素の採取及びその精
製は、従来より微生物を利用して酵素等を製造する方法
に採用されている通常の各種方法に従うことができる。

上記精製手段としては例えば溶媒に対する溶解性を利用
する手段、イオン結合力の差を利用する手段、分子量の
差を利用する手段、等電点の差を利用する手段、疎水性
の差を利用する手段等をそれぞれ単独で又は適宜組合せ
て採用することができる。

上記菌体区分からの目的酵素の採取はより詳細には、例
えば遠心分離等の常法に従い集めて得られる湿潤菌体を
リン酸緩衝液やトリス緩衝液等に懸濁させ、超音波処理
、フレンチプレス、リゾチーム処理等の種々の菌体処理
手段を適宜組合せ採用して行なわれ、かくして粗製酵素
含有液が得られる。上記粗製酵素含有液は、これを更に
通常の方法により精製して精製酵素標品とすることがで
きる。この精製手段としては例えばエタノール、アセト
ン等の有機溶媒による分別沈澱法、硫安、硫酸アルミニ
ウム等を用いた塩析法等により、まず上記粗製酵素含有
液から沈澱を回収し、次いで該沈澱をジエチルアミノエ
チルデキストラン等のイオン交換体、ポリアクリルアミ
ドゲル等のゲル濾過剤によるクロマトグラフィー操作に
付すことにより実施でき、またかくして得られる精製酵
素標品は更に凍結乾燥等の操作によって精製粉末標品と
することもできる。

以上のようにして得られる本酵素は、前記した式（１）
及び（２）で示される酸化反応を触媒する酵素作用を有
する点において特徴づけられる他、以下に示す物理化学
的性質等を有する点においてもまた特徴付けられる。

（１）基質特異性・イノシン等の各種ヌクレオシドに作用する。ヒポキサン
チン等の塩基、イノシン酸等のヌクレオチド、リボース
等には作用しない。

（２）温度及びｐＨ安定性：ｐＨ６，０，６０’Ｃ，１５分で９５％以上残存し、７
０°Ｃ１１５分では失活する。

また、３７°Ｃ１６０分の処理ではｐＨ５，０〜６．０
で９５％以上残存する。

（３）至適ｐＨ：　　ｐＨ５，０〜６．　０である。

（４）分子量：約１３００００である。

（ゲル濾過法による）（５）等電点：ｐＨ５，３である。

（６）阻害剤の影響ニジアン酸カリウム、アジ化ナトリ
ウムによって阻害される。

（７）可視部吸収ニリン酸緩衝液等の中性緩衝液中にお
いては４５０ｎｍ以上に吸収極大がない。基質、亜ニチ
オン（ハイドロサルファイドナトリウム）等によって還
元されていない酸化型酵素は４５０ｎｍ以上に吸収極大
がない。

（８）金属含量：鉄を含む。

本発明方法においては、以上の性質を有する本酵素ヌク
レオシドオキシダーゼＹＴ−１を利用して、イノシン、
アデニン等の各種のヌクレオシドを分子状酸素を電子受
容体として酸化させると同時に、該ヌクレオシド存在下
にヌクレオシド量に応じたラッカーゼ反応を示すという
該酵素に特有のラッカーゼ様活性を利用して、例えばハ
イドロキノンのような代表的ラッカーゼ基質を酸化させ
、また４−アミノアンチピリンとフェノールとやアニリ
ン系の物質等を酸化的にカップリングさせてキノンイミ
ン等の色素を上記ヌクレオシド量に比例して生成させ得
、かくしてこの色素生成量の測定によってヌクレオシド
量を定量できる。

本発明方法において用いられる酸化により発色する発色
試薬としては、上記ヌクレオシドオキシダーゼのラッカ
ーゼ様活性により酸化されて発色する物質をいずれも使
用できる。該物質には単独の化合物で酸化されて可視部
に吸収を示す試薬及び２種以上の化合物の組合せで酸化
されて縮合して可視部に吸収を示す試薬が包含される。

上記単独化合物の例としては、各種のラッカーゼ基質、
例えばｏ−トリジン、ｏ−トルイジン、０−ジアニシジ
ン、１Ｏ−Ｎ−メチルカルバモイル−３゜７−シメチル
アミノー１Ｏ−Ｈ−フェノチアジン、ビス〔３−ビス（
４−クロロフェニル）−メチル−４−ジメチルアミノフ
ェニル〕アミン等のアニリン系物質等を例示できる。ま
た、上記２種以上の化合物の組合せとしては、従来より
臨床診断薬として汎用されている４−アミノアンチピリ
ン及びフェノールで代表されるように、所謂カップラー
とトリンダー試薬（水素供与体）との組合せを例示でき
る。上記カップラーの具体例としては、４−アミノアン
チピリン（４−ＡＡ）の他、２゜６−ジブロモアミノフ
ェノール、３−メチル−ベンゾチアゾリノンヒドラゾン
等を、またトリンダ試薬（水素供与体）の具体例として
は、フェノールの他、β−クロロフェノール、２．４−
ジクロロフェノール、２，６−ジクロロフェノール、Ｎ
、　　Ｎ−ジメチルアニリン（ＤＭＡ）　、Ｎ−エチル
−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルフオプロピル）−ｍ
−アニシジン（ＡＤＯ８）、Ｎ−エチルＮ−（２−ヒド
ロキシ−３−スルフォプロピル）アニリン（ＡＬＯ３）
　、Ｎ−エチル−Ｎ−（２ヒドロキシ−３−スルフォプ
ロピル）−ｍ−トルイジン（ＴＯＯ８）　、Ｎ−エチル
−Ｎ−スルフォプロピル）−ｍ−アニシジン（ＡＤＰＳ
）　、Ｎエチル−Ｎ−スルフオプロピルアニリン（ＡＬ
ＰＳ）　、Ｎ−エチル−Ｎ−スルフォプロピルー３．５
−ジメトキシアニリン・ナトリウム塩（ＤＡＰＳ）　、
Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルフォプロ
ピル）−３，５−ジメトキシアニリン・ナトリウム塩（
ＤＡＯ８）　、Ｎ−スルフォプロピルー３．５−ジメト
キシアニリン（ＨＤＡＰＳ）　、Ｎ−（２−ヒドロキシ
−３−スルフォプロピル）−３，５−ジメトキシアニリ
ン（ＨＤＡＯ８）　、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキ
シ−３−スルフォプロピル）−３，５−ジメチルアニリ
ン（ＭＡＯ３）　、Ｎ−エチル−Ｎ−スルフオプロピル
ー３，５−ジメチルアニリン（ＭＡＰＳ）　、Ｎ−エチ
ル−Ｎ−スルフォプロピルーｍ−トルイジ、ン（ＴＯＰ
Ｓ）、Ｎ２−エチルＮ２−　（３−メチルフェニル）−
Ｎ′−アセチルエチレンジアミン（ＥＭＡＥ）等を例示
できる。

また本発明方法において、上記ヌクレオシドオキシダー
ゼ及び発色試薬以外の他の試薬、即ち鮮度測定用試料液
、リン酸塩を含まない緩衝液、リボース−１−リン酸、
ヌクレオシドホスホリラーゼ並びにＡＴＰ　、　ＡＤＴ
　、　ＡＭＰ及びＩＭＰをヌクレオシド（）ｌｘＲ）に
変換させる酵素類（例えば代表的にはアルカリホスファ
ターゼ等）としては、従来のこの種鮮度測定技術に用い
られているものと同様のものをいずれも利用することが
でき、またそれらと同様にして調製することができる。

例えば鮮度測定用試料液は、通常の方法に従い得られる
魚介類の抽出物、例えば１０％ＴＣＡ溶液を加えてホモ
ジナイズ後、遠心分離して得られる上清のアルカリ中和
物を使用できる。

リン酸塩を含まない緩衝液としては、トリス塩酸緩衝液
やＨＥＰＥＳ緩衝液等を使用できる。

リボース−１−リン酸、ヌクレオシドホスホリラーゼ並
びにアルカリホスファターゼ等のＡＴＰ　。

ＡＤＴ　、　ＡＭＰ、及びＩＭＰをヌクレオシド（Ｈｘ
Ｒ）に変換させる酵素類としては、各種市販品をいずれ
も使用できる。特に上記ＡＴＰ　、　ＡＤＴ　、　ＡＭ
Ｐ及びＩＭＰをヌクレオシド（ＨＸＲ）に変換させる酵
素類は、前記した（１）〜（３）の本発明方法に応じて
、粗アルカリホスファターゼ、粗酸性アルカリホスファ
ターゼ及び粗アピラーゼから選ばれるものと、精製アル
カリホスファターゼ及び／又は５′−ヌクレオチダーゼ
とを使い分ける必要がある。

以下、本発明方法に従う測定法につき詳述する。

本発明の第１の方法によれば、Ｋ値を指標として魚介類
の鮮度を測定できる。

この方法において、Ｋ値算出に必要な測定項目としては
ＡＴＰ　　（アデノシン３リン酸）、Ａｔ）Ｐ（アデノ
シン２リン酸）、ＡＭＰ（アデニル酸）　、ＩＭＰ（イ
ノシン酸）、）ＩＸＲ（イノシン）及びＨＩ　（ヒポキ
サンチン）があり、之等はそれぞれ本発明に従い、以下
の通り測定される。

即ち、（１）Ｈｘはリボース−１−リン酸の存在下にヌ
クレオシドホスホリラーゼを作用させる工程（１）によ
りＨｘＲに変換される。しかして上記ヌクレオシドホス
ホリラーゼは、本来ＨＩＲ等のヌクレオシドを加リン酸
分解して、ｌ（ｘ等の塩基とリボース−１−リン酸を生
成させる酵素であるが、この（１）工程の採用により上
記反応の逆反応が起こり、かくして）Ｉ！よりＨｘＲが
生成する。しかして、この逆反応は引き続く工程（２）
に従い、生成したＨＸＨにヌクレオシドオキシダーゼを
作用させて酸化して反応計より除去することにより、実
質的に１００％進行することが本発明者により確認され
ている。

（２）　）（Ｉ　Ｒは、ヌクレオシドオキシダーゼを作
用させる工程（２）により直接酸化される。またこの工
程（２）では上記ＨｘＲの酸化反応と同時にラッカーゼ
様反応により発色試薬も酸化されて有色物質を生成し発
色が認められる。

（３）ＡＴＰ　＋ＡＤＰ　＋ＡＭＰ　＋ＩＭＰは粗アル
カリホスファターゼ、粗酸性アルカリホスファターゼ及
び粗アピラーゼから選ばれるアルカリホスファターゼを
作用させる工程（３）により脱リン酸され、ＡＴＰ　。

ＡＤＰ及びＡＭＰがＡｄＲ（アデノシン）に、またＩＭ
Ｐがｔ（ｘＲにそれぞれ変換され、之等は上記（２）工
程と同様にヌクレオシドオキシダーゼを作用させる工程
により酸化される。

従って、本発明の第１方法は、工程（１）〜工程（３）
をこの順序で実施し、工程（２）後の測定値（Ｅ＋　と
する）から工程（２）前の測定値（Ｅｏとする）を差し
引いた値（ＥＩ　Ｅｏ）を、工程（３）後の測定値（Ｅ
２とする）から工程（２）前の測定値（Ｅｏ　）を差し
引いた値（Ｅ２　　ＥＯ）で除すことにより、下式によ
りに値を求めることができる。

Ｋ値−（Ｅ＋　　Ｅｏ　）　／　（Ｅ２−Ｅｏ　）　Ｘ
１００（１′　）殊にこの第１の方法は、その（３）工程をリン酸を含ま
ない緩衝液中で実施し、ｐＨ約７．５付近で作用させる
ことによって、ＡＴＰ　、　ＡＤＰ　、　ＡＭＰ及びＩ
ＭＰから１ｍ？への変換、ＨＸから）ＩｘＲへの変換並
びにＨｘＲの酸化を同−ｐＨで行なうことができ、かく
して単一試料を用いてに値測定に必要な全ての項目を同
一系で実施できる利点がある。

上記本発明第１方法の実施につき各工程での操作を詳述
すれば、この方法ではまずリン酸を含まない緩衝液にリ
ボース−１−リン酸及び発色試薬を溶解させた溶液に、
ヌクレオシドホスホリラーゼと鮮度測定用試料（例えば
魚肉抽出液）を添加して反応させて（工程（１））吸光
度Ｅｏを測定する。

尚、これは吸光度測定器のＯ調整を行なうことに代替で
きる。次に、上記反応液にヌクレオシドオキシダーゼを
添加して反応させて（工程（２））吸光度Ｅ１を測定す
る。上記操作により、工程（１）と工程（２）との各酵
素による反応が同時に進行し、かくして得られるＥ、−
Ｅ、値（又はＯ調整を行なった場合はＥｌ値）が試料中
のＨｘ及びＨＸＨの総量を示すものである。

次に、粗アルカリホスファターゼ等を反応系内に添加し
て脱リン酸反応を行ない（工程（３））　、吸光度Ｅ２
を測定することにより、Ｅ２−ＥＯ（又はＯ調整を行な
った場合Ｅ２）として、ＡＴＰ　。

ＡＤＰ　、　ＡＭＰ　、ＩＭＰ　、　ＨｘＲ及びＦＩＺ
の総量を求め得る。

上記においてアルカリホスファターゼ利用の場合は、系
内のｐＨは各酵素の作用ｐＨから約６．５〜８．０、好
ましくは約７．０前後とするのがよく、酸性ホスファタ
ーゼ及びアピラーゼ利用の場合は、ｐＴ（約５．０〜７
．０、特に約６．０前後とするのが望ましい。リン酸を
含まない緩衝液としては上記ｐＨ条件に応じて、例えば
ｐＨ７，５程度の場合はＨＥＰＥＳ緩衝液やトリス緩衝
液を、ｐＨ６，０程度の場合はＭＥＳ緩衝液等をそれぞ
れ利用することができる。２等緩衝液の濃度は充分な緩
衝作用を示すことを前提として特に限定はないが、通常
約１０〜１００ｍＭ程度とされるのがよい。

上記各反応に用いられる酵素量は、その種類により適宜
決定すればよく、ヌクレオシドオキシダーゼでは約０．
１単位以上、好ましくは０．３〜５単位程度、ヌクレオ
シドホスホリラーゼでは０．０４単位以上、好ましくは
０．２〜０．４単位程度、アルカリホスファターゼでは
２０単位以上、好ましくは７０〜１４０単位程度、酸性
ホスファターゼでは２０単位以上、好ましくは１００単
位前後、アピラーゼ（シグマ社製）では２０ｇ単位以上
、好ましくは６０〜１００単位程度の範囲とするのが適
当である。

また上記各酵素反応の反応時間は、用いる酵素の種類や
酵素量に応じて適宜決定され、特に制限されるものでは
ないが、通常的３〜１５分程度の範囲とすればよく、反
応温度は一般に約２０〜５０℃程度、好ましくは約２５
〜４０℃程度とすればよい。

更に吸光度測定のための測定波長は、利用する発色試薬
の種類に従い適宜決定される。例えば４−アミノアンチ
ピリンとフェノールとを発色試薬とする場合は５００ｎ
ｍを、ＴＯＯ８の場合は５５５ｎｍを、ＭＡＯ３では６
３０ｎｍを、ＤＡＯ８では５９３ｎｍをそれぞれ採用で
きる。

本発明の第２の方法によれば、Ｋｉ値を指標として魚介
類の鮮度を測定できる。

この方法によれば、工程（１）〜工程（３）をこの順序
で実施し且つ工程（３）において精製アルカリホスファ
ターゼ及び５′−ヌクレオチダーゼを用い、工程（２）
後の測定値（、Ｅ＋）から工程（２）前の測定値（Ｅｏ
　）を差し引いた値（Ｅ＋　　Ｅｏ）を、工程（３）後
の測定値（Ｅ３とする）から工程（２）前の測定値（Ｅ
ｏ　）を差し引いた値（Ｅ３　　ＥＯ）で除すことによ
り下式に従いＫｌ値を求め得る。

Ｋｌ値＝　（Ｅ＋　−Ｅｏ　）　／　（Ｅ３−Ｅｏ　）
　Ｘ１００（２′）即ち、上記精製アルカリホスファターゼ及び５′−ヌク
レオチダーゼの利用によれば、ＩＭＦのみがＨＸＲに変
換され、これにより前記第１の方法と同様にしてに、値
を求め得る。

また本発明の第３の方法によれば、上記第２の方法と同
様の原理により、工程（１）〜工程（３）を工程（２）
、（１）及び（３）の順序で実施し且つ工程（３）にお
いて精製アルカリホスファターゼ及び５′　−ヌクレオ
チダーゼを用い、（ａ）工程（１）後の測定値（Ａｔと
する）から工程（２）後の測定値（Ａ２とする）を差し
引いた値（Ａｔ　　Ａ２）を、工程（３）後の測定値（
Ａ３とする）で除してＨｘ比を求め、（ｂ）工程（２）
後の測定値（Ａ２）を工程（３）後の測定値（Ａ３）で
除してＨＸＲ比を求め、また（ｃ）工程（３）後の測定
値（Ａ３）から工程（１）後の測定値（Ａ１）を差し引
いた値（Ａ３−Ａｔ　）を、工程（３）後の測定値（Ａ
３）で除してＩＭＰ比を求め、之等各値のいずれか少な
くともひとつを魚介類鮮度指標として魚介類の鮮度測定
を行なうことができる。２等各指標は、下記式（３）〜
（５）で示される。

ｔ（ｘ比　＝　（Ａｔ　−Ａ２　）／Ａ３　　　　　　
（３）ｔｌｘＲ比−Ａ２／Ａ３　　　　　　　　　（４
）ＩＭＰ比−（Ａ３−Ａｔ　）　／Ａ３　　　　　（５
）この第３の方法の操作の詳細は、例えばまず鮮度測定
用試料にヌクレオシドオキシダーゼを作用させ、その時
の吸光度Ａ２　　（ＨＩ’Ｒ量に対応する）を測定する
。次に、反応系内にヌクレオシドホスホリラーゼを加え
て反応させて吸光度Ａ１を測定する。このＡ２は１（Ｘ
Ｒ及びＨｘの総量に対応する。

更に上記反応系内に精製アルカリホスファターゼ又は５
′　−ヌクレオチダーゼを作用させて吸光度Ａ３を測定
する。このＡ３は［Ｍ［’　、　ＨＸＲ及びＨＫの総量
に対応する。上記で求めた各吸光度より、それぞれ前記
式（３）　〜（５）に従い、ｆＩＸ比、ＨＸＲ比及びＩ
ＭＰ比を算出できる。

かくして本発明方法によれば、非常に簡単な操作で、正
確に魚介類の鮮度を測定することができる。

実　　　施　　　例以下、本発明を更に詳細に説明するため、参考例、試験
例及び実施例を挙げる。

尚、ヌクレオシドオキシダーゼ活性は、以下の方法によ
り測定した。

〈ヌクレオシドオキシダーゼ活性測定法〉７ｍＭイノシ
ンを含む１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐ　Ｈ６、０）　１
７Ａ’を酵素電極のセルに入れ、酵素標品５μｌを添加
し、２５℃において酵素消費の初速度を測定する。即ち
、２５℃における飽和溶存酸素量的２５０μＭからの溶
存酸素量の減少を酸素電極により経時的に測定し、１分
間当たり１μモルの酸素を消費させた場合を１ユニツト
（Ｕ）とする。

参考例　１シュードモナス　マルトフィリアＬＢ−８６（Ｐｓｅｕ
＋ｌｏｍｏｎａｓ　ｍａＮｏｐｈｉｌｉａ　ＬＢ−８６
、微工研菌寄第９８１３号）を、ブイヨン培地　１００
ｙｌを５００ｚＩ！容の坂ロフラスコに入れたものに接
種し、２５℃で１２時間振盪培養（１１０ｒｐｍ　）　
して種培養物を得る。

得られた種培養物を、予め５００ｚｌ容量の坂ロフラス
コに殺菌した１００ｙｌの酵母エキス・グルコース培地
（酵母エキス２．５％、グルコース３％、ＫＣＡ’０．
１％、ＫＨ２ＰＯ４０，１％、Ｍ　ｇ　Ｓ　Ｏａ　・７
Ｈ２００，０５％、ｐＨ７，２）を入れたものの中に接
種（接種量＝２％）する。

培養温度２５°Ｃ１撹拌１１０　ｒｐｍの条件で２４時
間培養し、培養終了後、集菌し、フラスコ１本当たり３
０１１のリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）に菌体を懸濁させ
、２０ＫＨｚ、２００Ｗの条件で１５分間超音波処理を
行なう。かくして菌体抽出液を得る。

このもののヌクレオシドオキシダーゼ活性は、７、ＯＵ
／ｚＡ’であった。

上記で得られた菌体抽出液２７２ｙＡ’に、２０％スト
レプトマイシン硫酸塩６０１１を添加して生じた沈澱を
遠心除去した後、硫安を３５％飽和になるように添加す
る。生じた沈澱を除去した後、更に硫安を６０％飽和に
なるまで添加する。冷所に一夜放置して沈澱を生成させ
た後、これを集め、２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６，０
）に溶解させる。これを透析チューブに入れ、−日透析
した後、予め２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６，０）で平
衡化したＤＥＡＥ−トヨパール６５０Ｍカラム（トーソ
ー社製）にかけ、同緩衝液で充分洗浄後、食塩０〜０．
５Ｍのリニアグラジェントにて溶出させる。

活性画分を分画分子量２００００のアミコン膜（アミコ
ン社製）を用いて濃縮し、更に２０ｍＭリン酸緩衝液（
ｐ　Ｈ６，０）で平衡化したセファクリールＳ−２００
カラム（ファルマシア社製）にチャージしてゲルが過を
行なう。溶出してくる活性画分を集め、再び分画分子量
２００００のアミコン膜で濃縮し、セファクリールＳ−
２００によるゲルが過を繰返す。

上記で溶出してくる活性画分を集め、凍結乾燥を行なう
ことにより、精製ヌクレオシドオキシダーゼＹＴ−１を
得る。

この精製品は、ディスク電気泳動的に単一であり、前記
した性質を有するものであった。

上記、精製結果をまとめて下記第１表に示す。

試験例　１本発明の測定法に従いＡＴＰ　、　ＡＤＰ　、　ＡＭＰ
　、　ＩＭＰ　。

１（ＸＲびＨＸか定量できることを確認するため、各物
質ごとに種々の濃度の標準液を調製し、濃度と吸光度の
関係を調べた。

■測定方法（１）測定試薬（ａ）発色液４−アミノアンチピリン２３．４ｍｇ、５％フェノール
溶液２．Ｏｙｌ、Ｄ−リボース−１−リン酸（ベーリン
ガーマンハイム社製、製品番号＋０９２４０）１１．６
ｍｇを５０ｍＭ　　ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７，５）に
溶解して、全量を１００ｚｌとした。

（ｂ）ヌクレオシドホスフオリラーゼベーリンガーマンハイム社製　製品番号１０７９５６（
約２０単位／１１）を用いた。

（ｃ）ヌクレオシドオキシダーゼ参考例１で得たＰｓｅ＋＋＋Ｉｏｍｏｎａｓ　ｍａｌｔ
ｏｐｈｉｌｉａ　ＬＢ−８６株より抽出し、精製（ＤＥ
ＡＥ−）ヨパール溶出液）したものを用いた（３５単位
／１ｌｌ）。

（ｄ）粗アルカリホスファターゼベーリンガーマンハイム社製グレード■（Ｇｒａｄｅ　
ＩＩ）　、製品番号＋０１１１５４　（約１４００単位
／１１）を用いた。

（２）測定操作分光光度系セルに発色液２．８１１１ヌクレオシドホス
フオルラーゼ１０μｌ、種々の濃度の標準溶液１００μ
ｌを添加し、分光光度系にセットし０合わせを行なった
。次に、ヌクレオシドオキシダーゼ１０μｌを添加し、
５分間放置後、５００ｎｍの吸光度Ｅ１を測定した。次
にこれに粗アルカリホスファターゼ５０μｌを添加し、
５分間放置後５００ｎｍの吸光度Ｅ２を測定した。ＨＸ
Ｒ及びｔｂはＥｌの値を、他はＥ２の値を用いた。また
測定は室温で行なった。

（３）測定結果ＨＸＲ及びＨＸについての測定結果を第１図に示す。

第１図において横軸は、反応系に添加されたイノシン（
ＨＸＲ）及びヒポキサンチン（Ｆｌｘ）の添加量（ｎ　
ｍｏｌ　）を、縦軸は吸光度（５００ｎｍ）を示し、図
中（１）はＨＸＲを、（２）はＨＸを示す。

第１図より、１（ＸＲ及びＨＸとも、濃度と吸光度との
間に良好な直線関係が得られ且つＨｘＲとＨＸは同一直
線上にプロットされた。このことから同濃度のＨＸＲと
ＨＸは同一の発色率を示し、本発明測定法においては、
ｌ（Ｘが完全にＨＩＨに変換されいていることが確認で
きた。

また、ＡＴＰ　、　ＡＤＰ　、　ＡＭＰ及びＩＭＰにつ
いての測定結果を第２図に示す。

該図において横軸は、反応系に添加されたＨＸＲ。

ＡＴＰ　、　ＡＤＰ　ＸＡＭＰ及びＩＭＰのそれぞれの
添加量（ｎ　ｍｏｌ　）を、縦軸は吸光度（５００ｎｍ
）を示し、図中（１）はＨＸＲを、（２）はＡＴＰを、
（３）はＡＤＰを、（４）はＡＭＰを、また（５）はＩ
ＭＦをそれぞれ示す。

第２図より、ＡＴＰ　ＸＡＤＰ　、、ＡＭＰ及びＩＭＰ
についてもまた良好な直線関係が得られ、之等も同一直
線上にプロットされることが判る。

上記第１図及び第２図より、Ｋ値測定に必要なすべての
成分が本発明測定法によって良好に測定できることが確
認できる。

試験例　２試験例１において粗アルカリホスファターゼに替えて、
粗酸性ホスファターゼ（ベーリンガーマンハイム社製、
グレード■）及び粗アピラーゼ（シグマ社製、Ｎｏ、　
Ａ６１３２　）をそれぞれ用い且っＨＥＰＥＳ緩衝液（
ｐＨ７，５）に替えてＭＥＳ緩衝液（ｐ　Ｈ６，０）を
用いて、同一試験を繰り返した。得られた結果を下記第
２表に示す。

第　　　２　　　表第２表より、粗アルカリホスファターゼに替えて、粗酸
性ホスファターゼ及び粗アピラーゼ（シグマ社製、Ｎｏ
、　Ａ６１３２　）のそれぞれを用いた場合にも、同様
に同程度の発色が得られ、本発明において之等の酵素標
品の使用も可能であることが確認された。

試験例　３この試験においては実際に魚肉抽出液を用いて、本発明
方法を実施し、その再現性及び精度を検討した。

■試料の調製大津市内の鮮魚店で購入したブリを用い、その背向４ｇ
に１０％ＴＣＡ溶液８２Ａ’を加えてホモゲナイズした
。次に、この遠心分離上澄にｌ０ＮＫＯＨ溶液を添加し
て中和後、１０１１にメスアップしたものを魚肉抽出液
として、鮮度の測定に供した。

■鮮度測定方法（１）測定試薬（ａ）発色液４−アミノアンチピリン２３．４ｎ＋ｇ、ＤＡＯ８（同
仁化学社製）３４．１ｍｇ及びＤ−リボース１−リン酸
（ベーリンガーマンハイム社製、製品番号１０９２４０
）　１１．　６ｍｇを５０ｍＭ　　ＨＥＰＥＳ緩衝液（
ｐＨ７，５）に溶解して、全量を１００１１とした。

（ｂ）ヌクレオシドホスフォリラーゼベーリンガーマンハイム社製　製品番号１０７９５６（
約２０単位／１１）を用いた。

（ｃ）ヌクレオシドオキシダーゼ参考例１で得たＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｍａｌｔｏｐ
ｈｉｌｉａ　Ｌ８８６株より抽出し、精製（ＤＥＡＥ−
１ヨパール溶出液）したものを用いた（３５単位／１１
）。

（ｄ）粗アルカリホスファターゼベーリンガーマンハイム社製グレード■（Ｇｒａｄｅ　
ＩＩ）　、製品番号１０８１５４　（約１４００単位／
１１）を用いた。

（２）測定操作分光光度系セルに発色液２．８ｚＡ’、ヌクレオシドホ
スフォルラーゼ１０μ！及び魚肉抽出液１００μｌを添
加し、分光光度系にセットし０合わせを行なった。次に
、ヌクレオシドオキシダーゼ１０μｌを添加し、５分間
放置後、５９３ｎｍの吸光度Ｅ、を測定した。次にこれ
に粗アルカリホスファターゼ５０μｌを添加し、５分間
放置後、５９３ｎｍの吸光度Ｅ２を測定した。Ｋ値はＥ
＋／Ｅ２Ｘ１００の式より求めた。

尚、測定操作は全て３０℃で行なった。

（３）測定結果同一試料につき、１０回の測定を行ない、翌日更に１０
回の測定を行なった。

得られた値の平均値、標準偏差及び変異係数を算出した
。

その結果を下記第３表に示す。

第　　　３　　　表上記表より、本発明方法は実用上充分な精度と再現性と
を有していることが判る。

実施例　１鮮魚店で購入したイガを３群に分け、購入直後、冷蔵庫
内で１日放置後、及び冷蔵庫内で２日放置後にそれぞれ
試料としてに値の測定を行なった。

試料の調製方法及びに値測定項目のそれぞれの測定方法
は試験例３と同様にした。

得られた結果を下記第４表に示す。

第　　　４　　　表上記第４表より、本発明測定法によって、供試試料であ
るイカは購入後の時間経過と共に、そのに値が上昇して
くることが判り、このことから、本発明方法によって充
分に鮮度測定が行ない得ることが明らかである。

実施例　２鮮魚店で購入したキハダマグロ、ハマチ、アジ、イワシ
、ワカサギ、トリササミ及びブリのそれぞれを各々３群
に分け、購入直後、室温放置後及び３０℃放置後にそれ
ぞれ試料として、前記試験例３と同様にして本発明方法
を実施し、Ｋ値を求めた。

また、上記と同一の試料につき、従来の鮮度測定法に従
い、下記条件下でのＨＰＬＣ法によってに値の測定を行
なった。＜ＨＰＬＣ法〉カラム：コスモシール５Ｃ１８（ナカライテスク社製）溶出液：　１０ｍＭ　　ＫＨ２Ｐ　０４　／メタノール
−８８／３検　出：ＵＶ２５４ｎｍ流速：１．Ｏｒ／／分各試料につき求められたに値の結果を第３図に示す。

図において、横軸は従来のＨＰＬＣ法により測定された
各試料のに値（％）を、縦軸は本発明方法に従い求めら
れた各試料のに値をそれぞれ示す。

上記第３図より、本発明方法によるに値と従来のＨＰ　
Ｌ　Ｃ法によるに値との間には、高い相関が認められ、
その相関係数は次の通りであった。

γ＝０．９９６回帰式ｙ＝１．．０４ｘ＋０．９８実施例　３鮮魚店で購入したキハダマグロ及びブリを用いて、前記
試験例３と同様にして試料を調製し、之等のそれぞれに
つき、以下の通りＩｔ　ｘ　Ｒ比、ＨＸ比及びＩＭＰ比
を求めた。

即ち、試験例３と同様の発色試薬２．８ｚ／及び試料４
０μｌを分光光度計のセルにいれ、０合わせを行なった
後、この液中にヌクレオシドオキシダーゼ１０μ１（３
５単位／１１）を添加し、５分後に吸光度Ａ１を測定し
た。

次に上記反応液中にヌクレオシドホスフォリラーゼ１０
μｌを加えて５分放置し、その後吸光度Ａ２を測定した
。

更に上記反応液中に精製アルカリホスファターゼ（ベー
リンガーマンハイム社製、グレード■、製品番号４０５
６１２）　５０μｌを添加し、５分間反応させて吸光度
Ａ３を測定した。

測定結果を下記第５表に示す。

また、上記Ａ１はＨＸＨの濃度に、Ａ２はＨｌとＨＸＲ
との総計濃度に、またＡ３はＩＭＰ　ＸＨｘＲ及びＨＸ
の総量にそれぞれ対応する値であり、之等よりｌｘ比［
ＡＩ　／Ａ３　Ｘ　１００］　、ＨＸＲ比［（Ａ２ＡＩ
　）／Ａ３　Ｘ１００］及びＩＭＰ比［（Ａ３Ａ２　）
　／Ａ３　Ｘ　１００］をそれぞれ算出した結果と共に
、Ｋ１値を同様にして求めた結果を、第５表に併記する
。

第　　　５　　　表度との関係を示すグラフであり、第３図は本発明実施例
２に従って実施された本発明方法により求められたに値
と従来のＨＰＬＣ法に従い求められたに値との相関を示
すグラフである。

（以　上）上記第５表より、本発明方法によれば魚介類の鮮度指標
としてのＨＸ比、ＨＸＲ比、ＩＭＰ比及びに値をも、非
常に容易に算出でき、しかも之等の指標が魚介類の鮮度
の測定に充分に利用できる高精度のものであることか判
る。

【図面の簡単な説明】

第１図及び第２図は、本発明試験例１に従い、本発明方
法により測定された各物質の濃度と吸光第１図試料名１カ０量（ｎｍｏり第図（１）０ｇ式Ｊ奉斗己蒼乃口里（ｎｍｏｌ）００

Claims

【特許請求の範囲】［１］鮮度測定用試料液、リン酸塩を含まない緩衝液及
び酸化により発色する発色試薬を含む系に、（１）リボース−１−リン酸の存在下にヌクレオシドホ
スホリラーゼ作用させてヒポキサンチンをヌクレオシド
に変換させる工程、（２）ヌクレオシドオキシダーゼを作用させてヌクレオ
シドを酸化させると共に該ヌクレオシド量に対応して発
現する上記ヌクレオシドオキシダーゼのラッカーゼ様活
性により発色試薬を発色させる工程、（３）アデノシン３リン酸、アデノシン２リン酸、アデ
ニル酸及びイノシン酸をヌクレオシドに変換させる酵素
類を作用させる工程、及び（４）上記各工程後の反応液の発色度合を測定する工程を包含することを特徴とする魚介類の鮮度測定法。［２］請求項［１］において、工程（１）〜工程（３）
をこの順序で実施し且つ工程（３）において粗アルカリ
ホスファターゼ、粗酸性ホスファターゼ及び粗アピラー
ゼから選ばれる酵素類を用い、工程（２）後の測定値を
工程（３）後の測定値で除してＫ値を求め、これを魚介
類鮮度指標とする魚介類の鮮度測定法。［３］請求項［１］において、工程（１）〜工程（３）
をこの順序で実施し且つ工程（３）において精製アルカ
リホスファターゼ及び／又は５′−ヌクレオチダーゼを
用い、工程（２）後の測定値を工程（３）後の測定値で
除してＫ＿１値を求め、これを魚介類鮮度指標とする魚
介類の鮮度測定法。［４］請求項［１］において、工程（１）〜工程（３）
を工程（２）、（１）及び（３）の順序で実施し且つ工
程（３）において精製アルカリホスファターゼ及び／又
は５′−ヌクレオチダーゼを用い、（ａ）工程（１）後の測定値から工程（２）後の測定値
を差し引いた値を、工程（３）後の測定値で除してＨｘ
比を求め、（ｂ）工程（２）後の測定値を工程（３）後の測定値で
除してＨｘＲ比を求め、また（ｃ）工程（３）後の測定値から工程（１）後の測定値
を差し引いた値を、工程（３）後の測定値で除してＩＭ
Ｐ比を求め、得られた各値のいずれか少なくともひとつを魚介類鮮度
指標とする魚介類の鮮度測定法。