JPH0644878B2 - 胆汁酸測定用試薬 - Google Patents
胆汁酸測定用試薬Info
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- JPH0644878B2 JPH0644878B2 JP60290098A JP29009885A JPH0644878B2 JP H0644878 B2 JPH0644878 B2 JP H0644878B2 JP 60290098 A JP60290098 A JP 60290098A JP 29009885 A JP29009885 A JP 29009885A JP H0644878 B2 JPH0644878 B2 JP H0644878B2
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- acid
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Description
【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は胆汁酸測定用試薬に関する。更に詳細には、至
適pHが8.0 〜9.0 にあり且つ、３α−ヒドロキシステロ
イドに対し基質特異性を有する３α−ヒドロキシステロ
イドデヒドロゲナーゼ（以下、３α−ＨＳＤＨと略す）
を含有する系からなる胆汁酸測定用試薬に関する。
適pHが8.0 〜9.0 にあり且つ、３α−ヒドロキシステロ
イドに対し基質特異性を有する３α−ヒドロキシステロ
イドデヒドロゲナーゼ（以下、３α−ＨＳＤＨと略す）
を含有する系からなる胆汁酸測定用試薬に関する。
本胆汁酸測定用試薬は、臨床検査分野で肝胆道系疾患の
検査法として血中の胆汁酸濃度を測定する際に用いられ
うる。
検査法として血中の胆汁酸濃度を測定する際に用いられ
うる。
従来の技術 従来より胆汁酸の測定には、イムノアッセイ法，ガスク
ロマトグラフイー法，薄層クロマトグラフイー法，高速
液体クロマトグラフイー法等があるが、方法によっては
特定の胆汁酸しか測定できなかったり、前処理が煩雑で
分離が不充分なこと、さらには血中濃度を測定するには
感度が低い等の問題点がある。これらを解決する為、総
胆汁酸の測定には３α−ＨＳＤＨを用いる簡便で特異性
が高く、感度の良い方法が採用されている。その酵素法
による胆汁酸定量は、日常のルーチン検査法，マススク
リーニング法として優れている。
ロマトグラフイー法，薄層クロマトグラフイー法，高速
液体クロマトグラフイー法等があるが、方法によっては
特定の胆汁酸しか測定できなかったり、前処理が煩雑で
分離が不充分なこと、さらには血中濃度を測定するには
感度が低い等の問題点がある。これらを解決する為、総
胆汁酸の測定には３α−ＨＳＤＨを用いる簡便で特異性
が高く、感度の良い方法が採用されている。その酵素法
による胆汁酸定量は、日常のルーチン検査法，マススク
リーニング法として優れている。
３α−ＨＳＤＨは、従来より数多くの報文に記載されて
いる。
いる。
動物起源のものとしてはラットの肝，腎臓，睾丸，前立
腺，ウサギの肝、ヒトの前立腺にその存在が証明されて
いるが、工業適な実用性に乏しい。
腺，ウサギの肝、ヒトの前立腺にその存在が証明されて
いるが、工業適な実用性に乏しい。
一方、微生物起源のものとしては例えば、Talalay,P ら
が報告したシュードモナス・テストステロニー（Pseudo
monas testosteroni）由来の３α−ＨＳＤＨ（Nature,1
73巻,1189 頁,1954 年、Journal Biological Chemistr
y,218巻,675頁,1956年、Methods in Enzymology ，５
巻,512頁,1962 年、Biochemistry,４巻,1825頁,1965
年）、上島らが報告したシュードモナス・プチダ（Pseu
domonas putida）及びバチルス・スフエリカス（Bacill
us sphaericus）由来の３α−ＨＳＤＨ（Agricultural
Biological Chemistry ,42 巻,1577 頁,1978 年、43巻,
1521 頁,1979 年、特公昭60-22914）、同じくバチルス
・スフエリカス由来の３α−ＨＳＤＨ（特開昭54-1789
4）等が挙げられる。
が報告したシュードモナス・テストステロニー（Pseudo
monas testosteroni）由来の３α−ＨＳＤＨ（Nature,1
73巻,1189 頁,1954 年、Journal Biological Chemistr
y,218巻,675頁,1956年、Methods in Enzymology ，５
巻,512頁,1962 年、Biochemistry,４巻,1825頁,1965
年）、上島らが報告したシュードモナス・プチダ（Pseu
domonas putida）及びバチルス・スフエリカス（Bacill
us sphaericus）由来の３α−ＨＳＤＨ（Agricultural
Biological Chemistry ,42 巻,1577 頁,1978 年、43巻,
1521 頁,1979 年、特公昭60-22914）、同じくバチルス
・スフエリカス由来の３α−ＨＳＤＨ（特開昭54-1789
4）等が挙げられる。
しかしながら、Talalay,Pらが報告した３α−ＨＳＤＨ
は至適pHが9.1 であり、金属イオン，ｐ−クロロマーキ
ュリベンゾエートにより活性が著しく阻害されること等
により本酵素とは性質を異にする。又、上島らのシュー
ドモナス・プチダ由来の３α−ＨＳＤＨは至適pHが11.
0、金属イオン，ｐ−クロロマーキュリベンゾエートに
より活性阻害がみられる。更に、バチルス・スフエリカ
ス由来の３α−ＨＳＤＨは至適pHが10.0〜10.5、安定化
に金属イオンを要求する。
は至適pHが9.1 であり、金属イオン，ｐ−クロロマーキ
ュリベンゾエートにより活性が著しく阻害されること等
により本酵素とは性質を異にする。又、上島らのシュー
ドモナス・プチダ由来の３α−ＨＳＤＨは至適pHが11.
0、金属イオン，ｐ−クロロマーキュリベンゾエートに
より活性阻害がみられる。更に、バチルス・スフエリカ
ス由来の３α−ＨＳＤＨは至適pHが10.0〜10.5、安定化
に金属イオンを要求する。
このように、従来報告された３α−ＨＳＤＨは実用性，
至適pH，阻害剤，安定性等の面で問題点が多々存在し
た。特に、従来の酵素は至適pHが高い為、生体体液中の
胆汁酸測定には不利である。
至適pH，阻害剤，安定性等の面で問題点が多々存在し
た。特に、従来の酵素は至適pHが高い為、生体体液中の
胆汁酸測定には不利である。
発明が解決しようとする問題点 前述したように、従来より胆汁酸測定用として実用に供
されている酵素、例えばシュードモナス・テストステロ
ニー由来の３α−ＨＳＤＨは至適pHが９．０以上のとこ
ろにあり、臨床検査試薬としては不利な面が多い。即
ち、この酵素を用いる胆汁酸測定キットにおいては、通
常ｐＨ7.0 〜8.0 前後で酵素反応が行われる為、このｐ
Ｈ8.0 よりも掛け離れた至適pHを持つ酵素程、測定に充
分な量を使用しなければならないことを意味する。故
に、酵素使用量の増加はコストの面のみならず、多量に
使用することによる、往々にして夾雑する酵素及び添加
剤の悪影響を免れ得ないのである。なお且つ、試薬組成
中にはβ-ＮＡＤが含まれており、この物質は溶液のｐ
Ｈがアルカリ側に傾く程不安定で分解し、測定には支障
をきたすことになる。これらの問題は、検査データが正
しく反映されないことでもある。
されている酵素、例えばシュードモナス・テストステロ
ニー由来の３α−ＨＳＤＨは至適pHが９．０以上のとこ
ろにあり、臨床検査試薬としては不利な面が多い。即
ち、この酵素を用いる胆汁酸測定キットにおいては、通
常ｐＨ7.0 〜8.0 前後で酵素反応が行われる為、このｐ
Ｈ8.0 よりも掛け離れた至適pHを持つ酵素程、測定に充
分な量を使用しなければならないことを意味する。故
に、酵素使用量の増加はコストの面のみならず、多量に
使用することによる、往々にして夾雑する酵素及び添加
剤の悪影響を免れ得ないのである。なお且つ、試薬組成
中にはβ-ＮＡＤが含まれており、この物質は溶液のｐ
Ｈがアルカリ側に傾く程不安定で分解し、測定には支障
をきたすことになる。これらの問題は、検査データが正
しく反映されないことでもある。
そこで本発明の目的は、生体体液中の胆汁酸の定量に有
利な胆汁酸測定用試薬を提供することにある。
利な胆汁酸測定用試薬を提供することにある。
問題点を解決する為の手段 上記の実情により、至適pHが従来のものよりも低い３α
−ＨＳＤＨの開発が強く望まれている現像をふまえ、本
発明者らはかかる欠点を補うべく生体体液中の胆汁酸測
定用に適した３α−ＨＳＤＨの開発を目的として鋭意検
討した。その結果、研究の過程で意外にもノカルジア属
（Nocardia sp.No.Ch2- 1,FERM- P No.6217）に属する
微生物が上記目的に合致した酵素を産生することを見い
出し、本発明を完成するに至った。
−ＨＳＤＨの開発が強く望まれている現像をふまえ、本
発明者らはかかる欠点を補うべく生体体液中の胆汁酸測
定用に適した３α−ＨＳＤＨの開発を目的として鋭意検
討した。その結果、研究の過程で意外にもノカルジア属
（Nocardia sp.No.Ch2- 1,FERM- P No.6217）に属する
微生物が上記目的に合致した酵素を産生することを見い
出し、本発明を完成するに至った。
ここで発見された新規な３α−ＨＳＤＨは、至適pHが8.
0 〜9.0 であり前記の胆汁酸測定に伴うpHの問題点を解
決したのみならず、ｐ−クロロマーキュリベンゾエート
等のＳＨ試薬，金属イオンによって影響を受けず、安定
剤も特に必要としないという実用上すこぶる優れた性質
を有していたのである。
0 〜9.0 であり前記の胆汁酸測定に伴うpHの問題点を解
決したのみならず、ｐ−クロロマーキュリベンゾエート
等のＳＨ試薬，金属イオンによって影響を受けず、安定
剤も特に必要としないという実用上すこぶる優れた性質
を有していたのである。
本発明の酵素を製造する際に用いられる優れた菌株は、
ノカルジア・エスピー No.Ｃｈ２−１，ＦＥＲＭ No.
6217であり、その菌学的性質は下記の如くである。
ノカルジア・エスピー No.Ｃｈ２−１，ＦＥＲＭ No.
6217であり、その菌学的性質は下記の如くである。
（Ａ）形態的性質 １）細胞の形及び大きさ：培養初期菌糸状に生育し分岐
を生じる。その後、不規則な分断が生じ細胞は桿菌状と
なる。大きさは0.8 〜1.0 μ×1.5 〜4.0 μ位である。
気菌糸を形成せず胞子のう胞子も形成しない。
を生じる。その後、不規則な分断が生じ細胞は桿菌状と
なる。大きさは0.8 〜1.0 μ×1.5 〜4.0 μ位である。
気菌糸を形成せず胞子のう胞子も形成しない。
２）グラム染色性：陽性 ３）抗酸性：陽性 ４）運動性：無 （Ｂ）化学的組成分析 細胞壁中にmeso−ジアミノピメリン酸、アラビノース、
ガラクトースが含まれL,L −ジアミノピメリン酸、グリ
シンは含まない。
ガラクトースが含まれL,L −ジアミノピメリン酸、グリ
シンは含まない。
（Ｃ）各培地における生育状態 １）肉汁寒天平板培地：30℃で４日培養後、直径0.5 〜
1.0 mmの円形のコロニーを形成する。周辺は全縁もしく
は波状である。表面は平滑で半球状であり、中心部が凸
状に隆起する場合もある。色調は薄いクリーム色で不透
明である。培地中に色素は出さない。
1.0 mmの円形のコロニーを形成する。周辺は全縁もしく
は波状である。表面は平滑で半球状であり、中心部が凸
状に隆起する場合もある。色調は薄いクリーム色で不透
明である。培地中に色素は出さない。
２）シュークロース硝酸塩寒天培地：生育中程度で集落
の色は白色ないし薄クリーム色である。水溶性色素は出
さない。
の色は白色ないし薄クリーム色である。水溶性色素は出
さない。
３）グルコース、アスパラギン寒天培地：生育中程度で
集落の色はクリーム色である。水溶性色素は出さない。
集落の色はクリーム色である。水溶性色素は出さない。
４）グリセリン、アスパラギン寒天培地：生育中程度で
集落の色は白色ないし薄クリーム色である。水溶性色素
は出さない。
集落の色は白色ないし薄クリーム色である。水溶性色素
は出さない。
５）スターチ無機塩寒天培地：生育中程度で集落の色は
白色ないし薄クリーム色である。水溶性色素は出さな
い。
白色ないし薄クリーム色である。水溶性色素は出さな
い。
６）チロシン寒天培地：生育中程度で集落の色は白色な
いし薄クリーム色である。水溶性色素は出さない。
いし薄クリーム色である。水溶性色素は出さない。
７）栄養寒天培地：生育良好で集落の色はクリーム色で
ある。水溶性色素は出さない。
ある。水溶性色素は出さない。
８）イースト麦芽寒天培地：生育良好で集落の色はクリ
ーム色である。水溶性色素は出さない。
ーム色である。水溶性色素は出さない。
９）オートミール寒天培地：生育中程度で集落の色は白
色ないし薄クリーム色である。水溶性色素は出さない。
色ないし薄クリーム色である。水溶性色素は出さない。
（Ｄ）生理的性質 １）生育温度：15〜43℃で生育する。10℃,45℃で生育
しない。最適温度は30〜35℃である。
しない。最適温度は30〜35℃である。
２）硝酸塩還元性：陽性 ３）カタラーゼ：陽性 ４）オキシダーゼ：陰性 ５）ウレアーゼ：陽性 ６）デンプン加水分解：陰性 ７）ゼラチン液化：陰性 ８）チロシン加水分解：陰性 ９）カゼイン加水分解：陰性 10）キサンチン加水分解：陰性 11）ＤＮＡの分解：陰性 12）リトマスミルク：アルカリ性、ペプトン化、凝固共
にしない。
にしない。
13）メラニン様色素の生成：無 14）エスクリン加水分解：陽性 15）Tween20,40,60,80加水分解：全て陽性 16）ペニシリン耐性試験：耐性 17）酸素に対する態度：好気性 18）無機窒素源の利用：アンモニウム塩、硝酸塩共に利
用する。
用する。
19）NaCl生育範囲：０〜６％で生育する。７％で生育し
ない。
ない。
20）各種炭素源の同化性（プリドハム、ゴドリーブ寒天
培地）：Ｄ−グルコース、Ｄ−フラクトース、マンノー
ス、グリセリン、トレハロースを同化する。Ｌ−アラビ
ノース、Ｄ−キシロース、サッカロース、イノシット、
Ｌ−ラムノース、ラフイノース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ
−マンニット、マルトース、ソルビットを同化しない。
培地）：Ｄ−グルコース、Ｄ−フラクトース、マンノー
ス、グリセリン、トレハロースを同化する。Ｌ−アラビ
ノース、Ｄ−キシロース、サッカロース、イノシット、
Ｌ−ラムノース、ラフイノース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ
−マンニット、マルトース、ソルビットを同化しない。
21）各種糖から酸の生成：Ｄ−グルコース、マンノー
ス、Ｄ−フラクトース、トレハロース、グリセリンから
酸を生成する。Ｌ−アラビノース、Ｄ−キシロース、Ｄ
−ガラクトース、マルトース、サッカロース、ラクトー
ス、Ｄ−ソルビット、Ｄ−マンニット、イノシット、デ
ンプンから酸を生成しない。
ス、Ｄ−フラクトース、トレハロース、グリセリンから
酸を生成する。Ｌ−アラビノース、Ｄ−キシロース、Ｄ
−ガラクトース、マルトース、サッカロース、ラクトー
ス、Ｄ−ソルビット、Ｄ−マンニット、イノシット、デ
ンプンから酸を生成しない。
以上の菌学的性質をBergey′s Manual of Determinativ
e Bacteriology 第８版を参考に検討した結果、細胞壁
中にmeso- ジアミノピメリン酸、アラビノース、ガラク
トースを含み、L,L -ジアミノピメリン酸、グリシンが
含まれないこと、好気性で菌糸状によく生育し、後に分
断して桿菌状となること、抗酸性であること、胞子のう
胞子及び気菌糸を着生しないこと等から本菌はNocardia
に属する菌である。本菌は、本発明者らがノカルジア・
エスピー No.Ch 2-1(Nocardia sp.No.Ch 2-1)と命名
し、工業技術院微生物工業技術研究所に菌奇第6217号
（FERM -P No.6217）として既に寄託されている。
e Bacteriology 第８版を参考に検討した結果、細胞壁
中にmeso- ジアミノピメリン酸、アラビノース、ガラク
トースを含み、L,L -ジアミノピメリン酸、グリシンが
含まれないこと、好気性で菌糸状によく生育し、後に分
断して桿菌状となること、抗酸性であること、胞子のう
胞子及び気菌糸を着生しないこと等から本菌はNocardia
に属する菌である。本菌は、本発明者らがノカルジア・
エスピー No.Ch 2-1(Nocardia sp.No.Ch 2-1)と命名
し、工業技術院微生物工業技術研究所に菌奇第6217号
（FERM -P No.6217）として既に寄託されている。
本酵素を培養液中に生成蓄積せしめるには、栄養培地に
炭素源としてグルコース、トレハロース等の糖類を、窒
素源としては肉エキス、ペプトン、酵母エキス等の有機
物を用いることができる。尚、３α−ＨＳＤＨの生産に
はステロイド類の添加が必要であり、コレステロール，
β−シトステロール等を加えることが好ましい。又、無
機物としては、リン酸，マグネシウム，カリウム等が挙
げらるが、培地成分は上記成分に限定されることなくそ
の他の成分も任意に用いることができる。培養は上記成
分を含む培地で、20〜40℃付近，好気的条件下で行うこ
とが好ましい。
炭素源としてグルコース、トレハロース等の糖類を、窒
素源としては肉エキス、ペプトン、酵母エキス等の有機
物を用いることができる。尚、３α−ＨＳＤＨの生産に
はステロイド類の添加が必要であり、コレステロール，
β−シトステロール等を加えることが好ましい。又、無
機物としては、リン酸，マグネシウム，カリウム等が挙
げらるが、培地成分は上記成分に限定されることなくそ
の他の成分も任意に用いることができる。培養は上記成
分を含む培地で、20〜40℃付近，好気的条件下で行うこ
とが好ましい。
かくして15〜48時間程度で目的物３α−ＨＳＤＨの蓄積
量は最大となる。本酵素は菌体内に蓄積する為、次にこ
れを抽出精製する。これは種々の公知の方法により達成
され、例えば得られた培養液を濾過助剤により濾過する
か、遠心分離により菌体を集めた後菌体を乳鉢，ダイノ
ミル，フレンチプレス，超音波等により破砕して菌体内
の３α−ＨＳＤＨを抽出せしめる。しかるのち、この抽
出液を限外ろ過法による濃縮又は硫安塩析法，有機溶剤
沈澱法，透析法などの方法を駆使することによって粗酵
素液となす。
量は最大となる。本酵素は菌体内に蓄積する為、次にこ
れを抽出精製する。これは種々の公知の方法により達成
され、例えば得られた培養液を濾過助剤により濾過する
か、遠心分離により菌体を集めた後菌体を乳鉢，ダイノ
ミル，フレンチプレス，超音波等により破砕して菌体内
の３α−ＨＳＤＨを抽出せしめる。しかるのち、この抽
出液を限外ろ過法による濃縮又は硫安塩析法，有機溶剤
沈澱法，透析法などの方法を駆使することによって粗酵
素液となす。
以上のようにして得た粗酵素は、イオン交換クロマトグ
ラフイーによる吸着及び溶出，分子量の差に基づくゲル
濾過法，疎水結合クロマトグラフイー法，アフイニテイ
クロマトグラフイー法，電気泳動法など一般的な酵素の
精製法を適宜選択、組み合わせて精製される。
ラフイーによる吸着及び溶出，分子量の差に基づくゲル
濾過法，疎水結合クロマトグラフイー法，アフイニテイ
クロマトグラフイー法，電気泳動法など一般的な酵素の
精製法を適宜選択、組み合わせて精製される。
このようにして得られた、本発明の３α−ＨＳＤＨの理
化学的性質は次のとおりである。
化学的性質は次のとおりである。
作用 補酵素（ＮＡＤ，ＮＡＤＰ）の存在下、ステロイドの３
α位水酸基を脱水素し、３−ケトステロイドを生成させ
る。
α位水酸基を脱水素し、３−ケトステロイドを生成させ
る。
基質特異性 デオキシコール酸、リトコール酸によく作用する。５α
−ステロイドと５β−ステロイドに対する反応性は等し
い。結果は第１表に示す。
−ステロイドと５β−ステロイドに対する反応性は等し
い。結果は第１表に示す。
至適ｐＨ 至適ｐＨはｐＨ8.0 〜9.0 である。
結果を第１図に示す。
安定ｐＨ 安定ｐＨ範囲40℃,15 分処理で、ｐＨ6.0 〜10.0であ
る。結果を第２図に示す。
る。結果を第２図に示す。
至適温度及び熱安定性 至適温度が55〜60℃であり、ｐＨ8.5,20分処理では40℃
まで 100％の残存活性があり、50℃に保存しても60％の
活性を示す。結果を第３図及び第４図に示す。
まで 100％の残存活性があり、50℃に保存しても60％の
活性を示す。結果を第３図及び第４図に示す。
阻害、活性及び安定化 ｐ−クロロマーキュリベンゾエート，モノヨード酢酸等
のＳＨ試薬により殆ど阻害されない。又、ＥＤＴＡ，２
価の金属イオンも活性に影響を与えない。結果を第２表
に示す。
のＳＨ試薬により殆ど阻害されない。又、ＥＤＴＡ，２
価の金属イオンも活性に影響を与えない。結果を第２表
に示す。
Ｋｍ値 コール酸 1.4×10-4Ｍ、デオキシコール酸 1.7×10
-5Ｍ、タウロコール酸 7.1×10-5Ｍ、β−ＮＡＤ 7.4×
10-5Ｍである。
-5Ｍ、タウロコール酸 7.1×10-5Ｍ、β−ＮＡＤ 7.4×
10-5Ｍである。
分子量 セファデックスＧ−100 （登録商標，フアルマシア社
製）を用いたゲル濾過法により測定した結果、分子量約
58、000 である。
製）を用いたゲル濾過法により測定した結果、分子量約
58、000 である。
等電点 アンホラインによるショ糖濃度勾配電気泳動により測定
した結果、等電点pI 4.4である。
した結果、等電点pI 4.4である。
精製方法 培養液の菌体破砕液を、40％硫安塩析する。この沈澱を
リン酸緩衝液に溶解し透析した後、DEAEセファロース
（登録商標，ファルマシア社製）カラムに通液し吸着せ
しめ、食塩で溶出する。活性画分を限外濾過した後、リ
ン酸緩衝液で平衡化したアミノヘキシルセファロース
（登録商標，ファルマシア社製）カラムに通液し吸着せ
しめ、食塩で溶出する。更に、限外濾過により濃縮した
活性画分をセファデックスＧ−100 （登録商標，ファル
マシア社製）でゲル濾過を行い、次いで脱塩濃縮して本
酵素を得る。
リン酸緩衝液に溶解し透析した後、DEAEセファロース
（登録商標，ファルマシア社製）カラムに通液し吸着せ
しめ、食塩で溶出する。活性画分を限外濾過した後、リ
ン酸緩衝液で平衡化したアミノヘキシルセファロース
（登録商標，ファルマシア社製）カラムに通液し吸着せ
しめ、食塩で溶出する。更に、限外濾過により濃縮した
活性画分をセファデックスＧ−100 （登録商標，ファル
マシア社製）でゲル濾過を行い、次いで脱塩濃縮して本
酵素を得る。
活性測定法 コール酸ナトリウム（半井化学製）溶液（10mg／ml）
０．５ml、β−ＮＡＤ（オリエンタル酵母製）溶液（30
mg／ml）０．１ml、0.1 Ｍトリス塩酸緩衝液（pH 8.5）
2.8 mlを石英セルにとり、これに酵素液0.02mlを添加し
37℃で反応させ、340nm に於ける吸光度増加を測定す
る。
０．５ml、β−ＮＡＤ（オリエンタル酵母製）溶液（30
mg／ml）０．１ml、0.1 Ｍトリス塩酸緩衝液（pH 8.5）
2.8 mlを石英セルにとり、これに酵素液0.02mlを添加し
37℃で反応させ、340nm に於ける吸光度増加を測定す
る。
１単位とは１分間に１マイクロモルのＮＡＤＨを生成す
る酵素量を示す。
る酵素量を示す。
以上のように本発明の３α−ＨＳＤＨは、シュードモナ
ス・テストステロニー，シュードモナス・プチダ及びバ
チルス・スフエリカス由来の３α−ＨＳＤＨと多くの点
で異なっている。これらの比較を第３表に示す。
ス・テストステロニー，シュードモナス・プチダ及びバ
チルス・スフエリカス由来の３α−ＨＳＤＨと多くの点
で異なっている。これらの比較を第３表に示す。
これから判るように、本酵素は至適pHが他の酵素と比較
して低いこと、ＳＨ試薬や金属イオンの影響を全く受け
ず非常に安定であること等から、本発明の３α−ＨＳＤ
Ｈは従来のいずれの酵素とも性質を異にしており、新規
なものと断定できる。
して低いこと、ＳＨ試薬や金属イオンの影響を全く受け
ず非常に安定であること等から、本発明の３α−ＨＳＤ
Ｈは従来のいずれの酵素とも性質を異にしており、新規
なものと断定できる。
又、本酵素は前記の精製方法により胆汁酸測定で問題と
なる夾雑酵素、例えば３β，７α，12α， 17 α−ステ
ロイドデヒドロゲナーゼ等を除去することが可能であ
り、酵素使用量が少量であることと相まって３α−ステ
ロイドのみを特異的に定量することができる。
なる夾雑酵素、例えば３β，７α，12α， 17 α−ステ
ロイドデヒドロゲナーゼ等を除去することが可能であ
り、酵素使用量が少量であることと相まって３α−ステ
ロイドのみを特異的に定量することができる。
本発明の３α−ＨＳＤＨを用いた胆汁酸定量試薬は、該
酵素の補酵素であるＮＡＤのＮＡＤＨへの変換量をＮＡ
ＤＨのもつ紫外部吸収によるＵＶ測定法，酵素螢光測定
法，酵素比色測定法，酵素増幅測定法，生物発光反応系
等測定法の種類に応じ、公知の試薬組成に本発明の３α
−ＨＳＤＨを処方することにより、優れた胆汁酸測定用
試薬が得られる。
酵素の補酵素であるＮＡＤのＮＡＤＨへの変換量をＮＡ
ＤＨのもつ紫外部吸収によるＵＶ測定法，酵素螢光測定
法，酵素比色測定法，酵素増幅測定法，生物発光反応系
等測定法の種類に応じ、公知の試薬組成に本発明の３α
−ＨＳＤＨを処方することにより、優れた胆汁酸測定用
試薬が得られる。
猶、ここで選択される測定方法は胆汁酸を含む生体試料
の種類に左右される。例えば、血液，脳脊髄液，腹水に
おいては酵素螢光測定法又は生物発光反応系が、胆汁，
腸液ではいずれの方法でも採用されうる。しかし、胃
液，尿，糞便等は前処理を行ってから測定する必要が生
ずる。
の種類に左右される。例えば、血液，脳脊髄液，腹水に
おいては酵素螢光測定法又は生物発光反応系が、胆汁，
腸液ではいずれの方法でも採用されうる。しかし、胃
液，尿，糞便等は前処理を行ってから測定する必要が生
ずる。
以下に本発明で用いられる、好ましい試薬組成の使用態
様を挙げる。
様を挙げる。
(1) ３α−ＨＳＤＨ 60単位／ β−ＮＡＤ 0.3m mol／ Ｔｒｉｓ-HCl 0.10 mol／ 界面活性剤 適量 0.156m mol／の胆汁酸を含んだ試料0.2 mlに上記組成
物2.5 mlを添加して室温,15 分間反応後340nm における
吸光度を測定する。
物2.5 mlを添加して室温,15 分間反応後340nm における
吸光度を測定する。
(2) Ｔｒｉｓ 0.13m mol／ ３α−ＨＳＤＨ 100 単位／ ジアホラーゼ 500 単位／ β−ＮＡＤ 1.0m mol／ レサズリン 10μmol／ 牛血清アルブミン12.2g／ 試料（2.7 μmol／までの胆汁酸）及びNaOH溶液0.1
mol／を上記溶液に添加し、ローターにて回転させ５
秒と300 秒の螢光強度（蛍光波長600nm,励起波長550nm
）を測定する。
mol／を上記溶液に添加し、ローターにて回転させ５
秒と300 秒の螢光強度（蛍光波長600nm,励起波長550nm
）を測定する。
(3) 試料（12μ mol／までの胆汁酸）0.02mlとＴＣＡ溶液
（３ｇ／）0.02mlを充分撹拌し、25℃に放置する。次
に、ルシフエラーゼ22.3mg／，ＦＭＮレダクターゼ２
単位／，ＦＭＮ４μ mol／，牛血清アルブミン８ｇ
／，リン酸0.11 mol／，デカナール0.2m mol／を
含有する液0.39mlと混ぜ、15〜20分間反応させる。更
に、β-ＮＡＤ（0.8m mol／）0.02ml及び３α−ＨＳ
ＤＨ（150単位／）0.05mlを添加し、最初の20秒間の
発光強度増加をみる。
（３ｇ／）0.02mlを充分撹拌し、25℃に放置する。次
に、ルシフエラーゼ22.3mg／，ＦＭＮレダクターゼ２
単位／，ＦＭＮ４μ mol／，牛血清アルブミン８ｇ
／，リン酸0.11 mol／，デカナール0.2m mol／を
含有する液0.39mlと混ぜ、15〜20分間反応させる。更
に、β-ＮＡＤ（0.8m mol／）0.02ml及び３α−ＨＳ
ＤＨ（150単位／）0.05mlを添加し、最初の20秒間の
発光強度増加をみる。
次に、本発明の実施例を示すが、本発明はこれらにより
制限されるものではない。
制限されるものではない。
実施例１ Nocardia sp.No.Ch 2-1 （FERN -P No.6217）をグルコ
ース５ｇ／，肉エキス５ｇ／，酵母エキス0.2 ｇ／
及び少量の消泡剤よりなる培地（ｐＨ7.2 ）200 mlを
入れた500 ml容の坂口フラスコに植菌し、30℃で24時間
振盪培養した。この種培養液をコレステエロース５ｇ／
，グルコース２ｇ／，肉エキス５ｇ／，リン酸水
素カリウム５ｇ／，硫酸マグネシウム0.2 ｇ／及び
消泡剤0.5 ｇ／の組成より成る培地（pH7.2 ）20を
入れた30容ジャーファメンターに植菌し、30℃で通気
撹拌しながら40時間培養した。培養液を遠心分離し、得
られた菌体を0.1 Ｍリン酸緩衝液（pH7.0 ）に懸濁しガ
ラスビーズにより菌体を破砕した。これを1000r.p.m.で
10分間遠心分離し清澄な菌体抽出液を得た。次に、硫酸
アンモニウムを40％飽和になるように加え酵素を沈澱せ
しめ、この沈澱を遠心分離で集め20mMリン酸緩衝液（pH
6.0 ）100 mlに溶解した。更に、セロファンチューブで
上記と同様の緩衝液にて15時間透析し、粗酵素液を得
た。
ース５ｇ／，肉エキス５ｇ／，酵母エキス0.2 ｇ／
及び少量の消泡剤よりなる培地（ｐＨ7.2 ）200 mlを
入れた500 ml容の坂口フラスコに植菌し、30℃で24時間
振盪培養した。この種培養液をコレステエロース５ｇ／
，グルコース２ｇ／，肉エキス５ｇ／，リン酸水
素カリウム５ｇ／，硫酸マグネシウム0.2 ｇ／及び
消泡剤0.5 ｇ／の組成より成る培地（pH7.2 ）20を
入れた30容ジャーファメンターに植菌し、30℃で通気
撹拌しながら40時間培養した。培養液を遠心分離し、得
られた菌体を0.1 Ｍリン酸緩衝液（pH7.0 ）に懸濁しガ
ラスビーズにより菌体を破砕した。これを1000r.p.m.で
10分間遠心分離し清澄な菌体抽出液を得た。次に、硫酸
アンモニウムを40％飽和になるように加え酵素を沈澱せ
しめ、この沈澱を遠心分離で集め20mMリン酸緩衝液（pH
6.0 ）100 mlに溶解した。更に、セロファンチューブで
上記と同様の緩衝液にて15時間透析し、粗酵素液を得
た。
この粗酵素液を20mMリン酸緩衝液（pH6.0 ）で平衡化し
たDEAEセファロース（登録商標，ファルマシア社製）10
0 mlを充填したカラムに通液し、酵素を吸着せしめた。
洗浄後、上記緩衝液中の食塩濃度を連続的に上昇せしめ
る溶出泡（食塩濃度０〜0.5 Ｍ）によりクロマトグラフ
イーを行い活性画分を得た。活性画分は限外濾過膜によ
り脱塩・濃縮した。この濃縮液を20mMリン酸緩衝液（pH
7.0 ）で平衡化したアミノヘキシルセファロース（登録
商標，ファルマシア社製）50mlを充填したカラムに通
し、吸着した酵素は0.1 Ｍ食塩を含む同緩衝液で洗浄
後、食塩濃度を0.1 〜0.4 Ｍに連続的に上昇させる溶出
方法により精製した。更に、この活性画分を限外濾過法
により濃縮した後、0.2 Ｍ食塩を含む10mMリン酸緩衝液
（pH8.0 ）で平衡化したセファデックスＧ−100 （登録
商標，ファルマシア社製）2.2 ×90cmでゲル濾過を行っ
た。再び限外濾過により脱塩・濃縮した後、7.5 ％アク
リルアミド（pH8.9 ）によるスラブ電気泳動を行ったと
ころ、本精製により得られた３α−ＨＳＤＨは単一なバ
ンドを示した。
たDEAEセファロース（登録商標，ファルマシア社製）10
0 mlを充填したカラムに通液し、酵素を吸着せしめた。
洗浄後、上記緩衝液中の食塩濃度を連続的に上昇せしめ
る溶出泡（食塩濃度０〜0.5 Ｍ）によりクロマトグラフ
イーを行い活性画分を得た。活性画分は限外濾過膜によ
り脱塩・濃縮した。この濃縮液を20mMリン酸緩衝液（pH
7.0 ）で平衡化したアミノヘキシルセファロース（登録
商標，ファルマシア社製）50mlを充填したカラムに通
し、吸着した酵素は0.1 Ｍ食塩を含む同緩衝液で洗浄
後、食塩濃度を0.1 〜0.4 Ｍに連続的に上昇させる溶出
方法により精製した。更に、この活性画分を限外濾過法
により濃縮した後、0.2 Ｍ食塩を含む10mMリン酸緩衝液
（pH8.0 ）で平衡化したセファデックスＧ−100 （登録
商標，ファルマシア社製）2.2 ×90cmでゲル濾過を行っ
た。再び限外濾過により脱塩・濃縮した後、7.5 ％アク
リルアミド（pH8.9 ）によるスラブ電気泳動を行ったと
ころ、本精製により得られた３α−ＨＳＤＨは単一なバ
ンドを示した。
実施例２ 実施例１で得られた培養ろ液に、DEAEセルロース（セル
バ社製）を適量加え、１時間撹拌した後ろ紙で濾過し
た。DEAEセルロースに吸着した３α−ＨＳＤＨは0.3 Ｍ
食塩水で溶出せしめた後、この液をオクチルアガロース
カラム（50ml容量）に通液し、吸着させた。洗浄後、１
％コール酸ナトリウムを含む１Ｍ食塩水にて溶出し、溶
出液は限外ろ過法により脱塩，濃縮した。更に、セファ
デックスＧ−25（登録商標、ファルマシア社製）により
脱塩した。この精製法により得られた３α−ＨＳＤＨ
は、電気泳動で単一なバンドを示した。
バ社製）を適量加え、１時間撹拌した後ろ紙で濾過し
た。DEAEセルロースに吸着した３α−ＨＳＤＨは0.3 Ｍ
食塩水で溶出せしめた後、この液をオクチルアガロース
カラム（50ml容量）に通液し、吸着させた。洗浄後、１
％コール酸ナトリウムを含む１Ｍ食塩水にて溶出し、溶
出液は限外ろ過法により脱塩，濃縮した。更に、セファ
デックスＧ−25（登録商標、ファルマシア社製）により
脱塩した。この精製法により得られた３α−ＨＳＤＨ
は、電気泳動で単一なバンドを示した。
実施例３ 実施例１で得られた３α−ＨＳＤＨを用い胆汁酸の定量
を行った。
を行った。
β−ＮＡＤ（オリエンタル酵母製）４μ mole ，トリト
ンＸ−100 （片山化学製）1.5 mg，３α−ＨＳＤＨ0.2
単位を含む0.1 Ｍトリス塩酸緩衝液（pH8.5 ）３mlに、
種々の濃度のコール酸ナトリウム（半井化学製）溶液を
0.1 ml加え、37℃で10分間反応後、340nm における吸光
度を測定した。
ンＸ−100 （片山化学製）1.5 mg，３α−ＨＳＤＨ0.2
単位を含む0.1 Ｍトリス塩酸緩衝液（pH8.5 ）３mlに、
種々の濃度のコール酸ナトリウム（半井化学製）溶液を
0.1 ml加え、37℃で10分間反応後、340nm における吸光
度を測定した。
第４表に示すように、良好な結果が得られた。
実施例４ β−ＮＡＤ（オリエンタル酵母製）４μmole,トリトン
Ｘ−100 （片山化学製）1.5 mg，３α−ＨＳＤＨ0.2 単
位，ニトロテトラゾリウムブルー（同仁化学製）0.05m
g，ジアホラーゼ（天野製薬製）３単位を含む0.1 Ｍト
リス塩酸緩衝液（pH8.5 ）３mlに、種々の濃度のコール
酸ナトリウム（半井化学製）溶液を0.1 ml加え、37で10
分間反応後、560nm における吸光度を測定した。
Ｘ−100 （片山化学製）1.5 mg，３α−ＨＳＤＨ0.2 単
位，ニトロテトラゾリウムブルー（同仁化学製）0.05m
g，ジアホラーゼ（天野製薬製）３単位を含む0.1 Ｍト
リス塩酸緩衝液（pH8.5 ）３mlに、種々の濃度のコール
酸ナトリウム（半井化学製）溶液を0.1 ml加え、37で10
分間反応後、560nm における吸光度を測定した。
第５表に示すように、良好な結果が得られた。
実施例５ ３α−ＨＳＤＨ〔液状品及び凍結乾燥粉末（活性３単位
／mg）〕の経時的安定性を、４℃の条件で行った。
／mg）〕の経時的安定性を、４℃の条件で行った。
第６表に、液状品の各pHに於ける安定性及び凍結乾燥粉
末の安定性を相対活性（％）で示す。
末の安定性を相対活性（％）で示す。
表から明らかなように、３α−ＨＳＤＨは長期間にわた
り活性を保持していることが判る。
り活性を保持していることが判る。
発明の効果 本発明で用いられる３α−ＨＳＤＨは、従来の３α−Ｈ
ＳＤＨに比べ至適ｐＨが低い為、使用する酵素の微量化
に伴うコストの大幅な減少をうることができる他、キッ
ト中に存在する補酵素（ＮＡＤ，ＮＡＤＰ）の安定な条
件下で胆汁酸を測定することができる。
ＳＤＨに比べ至適ｐＨが低い為、使用する酵素の微量化
に伴うコストの大幅な減少をうることができる他、キッ
ト中に存在する補酵素（ＮＡＤ，ＮＡＤＰ）の安定な条
件下で胆汁酸を測定することができる。
更に、本酵素はＳＨ試薬，金属イオンの影響を全く受け
ず且つ安定性が高い為、試薬保存性に優れることなどの
利点を併せもつので、生体体液中の胆汁酸の定量に有利
に応用することができ、正確な検査データを提供するこ
とが可能である。
ず且つ安定性が高い為、試薬保存性に優れることなどの
利点を併せもつので、生体体液中の胆汁酸の定量に有利
に応用することができ、正確な検査データを提供するこ
とが可能である。
第１図は、本発明で用いられる３α−ＨＳＤＨのｐＨと
活性の関係を示す図である。 第２図は、本発明で用いられる３α−ＨＳＤＨのｐＨと
安定性の関係を示す図である。 第３図は、本発明で用いられる３α−ＨＳＤＨの反応温
度と活性の関係を示す図である。 第４図は、本発明で用いられる３α−ＨＳＤＨの温度と
安定性の関係を示す図である。
活性の関係を示す図である。 第２図は、本発明で用いられる３α−ＨＳＤＨのｐＨと
安定性の関係を示す図である。 第３図は、本発明で用いられる３α−ＨＳＤＨの反応温
度と活性の関係を示す図である。 第４図は、本発明で用いられる３α−ＨＳＤＨの温度と
安定性の関係を示す図である。
Claims (2)
- 【請求項１】ノカルジア属微生物の培養により得られ、
至適pHが8.0〜9.0にあり、３α−ヒドロキシステロイド
に対し基質特異性を有する３α−ヒドロキシステロイド
デヒドロゲナーゼを含有する系からなることを特徴とす
る胆汁酸測定用試薬。 - 【請求項２】ノカルジア属に属する菌株がノカルジア・
エスピーNo.Ｃｈ２−１（Nocardia sp.No.Ｃｈ２−１）
ＦＥＲＭ−Ｐ No.6217である特許請求の範囲第１項記
載の胆汁酸測定用試薬。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60290098A JPH0644878B2 (ja) | 1985-12-23 | 1985-12-23 | 胆汁酸測定用試薬 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60290098A JPH0644878B2 (ja) | 1985-12-23 | 1985-12-23 | 胆汁酸測定用試薬 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS62151199A JPS62151199A (ja) | 1987-07-06 |
| JPH0644878B2 true JPH0644878B2 (ja) | 1994-06-15 |
Family
ID=17751765
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60290098A Expired - Lifetime JPH0644878B2 (ja) | 1985-12-23 | 1985-12-23 | 胆汁酸測定用試薬 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0644878B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104359906B (zh) * | 2014-11-28 | 2017-06-27 | 山东博科生物产业有限公司 | 一种稳定、抗干扰能力强的血清总胆汁酸检测试剂 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS57194351A (en) * | 1981-05-26 | 1982-11-29 | Shimadzu Corp | Bile acid analysing method |
-
1985
- 1985-12-23 JP JP60290098A patent/JPH0644878B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS62151199A (ja) | 1987-07-06 |
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