JPH0272880A - マクロライド抗生物質の４”位アシル化酵素をコードする遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、マクロライド抗生物質の４“位をアンル化す
る酵素活性を宿主微生物に付与する遺伝子（“ａｃｙ　
Ｂ”と命名）を含むＤＮＡ断片、このＤＮＡ断片を含む
組換えＤＮＡプラスミドおよびａｃｙＢ遺伝子を含むＤ
ＮＡ断片を組み込んだプラスミドで形質転換された微生
物、並びに該形質転換体による４“位アシル化マクロラ
イド抗生物質の製造法に関する。

マクロライド抗生物質（１４員環および１６員環）は医
薬および動物薬（家畜用、水産用）として広く用いられ
ている有用な抗生物質である。１６員環マクロライド抗
生物質の４“位○Ｈ基のアシル化により抗菌活性が上が
ることがＳ、Ｏｍｕｒａら［ジャーナル・オブ・アンテ
ィビオティクス（Ｊ　ｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ａｎｔｉｂ
ｉｏｔｉｃｓ）　２８巻、４０１−４３３頁（１９８０
）］およびＲ、Ｏｋａｍｏｔｏら［ジャーナル・オブ・
アンティビオティクス（Ｊ　ｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ａｎ
ｔｉｂｉｏｔｉｃｓ）　２７巻、５４２−５４４頁（１
９７９）］によって報告されている。とくに後者の文献
において、タイロシンの３位および４“位をアシル化し
た誘導体を調製し、マクロライド抗生物質に耐性を有す
る種々の菌に対して薬効を調べ、３位および４″位、特
に４“位がアシル化されたタイロシンは、これら耐性菌
に対してタイロシンよりも薬理効果が高いことを明らか
にしている。しかるにタイロシン生産菌株は３位および
４″位が−ＯＨ型のものしか生産せず、これをアシル化
するためには後述するように−Ｈタイロシンを分離した
後、化学的方法あるいは生物学的方法による以外に適当
な方法がなかった。

本発明は、このようなマクロライド抗生物質の４“位ア
シル化生成物を本来直接生産し得ない菌株を遺伝子工学
的方法を用いて生産可能ならしめる工業上極めて有用な
方法を提供するものである。

従来の技術 従来、マクロライド抗生物質としては例えば次のような
ものが知られている。

式ｌ： タイロシン ＣＨ，ＣＨＯ スピラマイシンＩ スピラマイシン■ スピラマイシン■ 式３：アンゴラマイシン Ｈ −ＣＯＣＨ。

ＣＯＣＨｚＣＨｇ ｔ１３１．、ｌＪ ＼　′°２＼ １”４　　　　Ｑ 式４：ロイコマイシン ロイコマイシンＵ ＣＯＣＨ３ ０イコマイシンＶ 式５：デルタマイシンＸ これらのマクロライ ド抗生物質の４′ 位のアシ ル化のための方法としては化学的方法が一般的であるが
［大村ら：薬学雑誌、１０６巻７２９〜７５７頁（１９
８６）］分子中の特定の位置を効率良くアシル化するこ
とは困難であった。そこで、生物学的方法が提案された
［特公昭５３−１５１６０号公報］。ここで提案された
生物学的方法は、タイロシンのアシル化能を有する微生
物またはその培養液もしくは処理物、あるいは該微生物
より分離した酵素および含有物を用いてタイロシンをア
シル化する方法である。例えばストレプトマイセス・サ
ーモトレランス（Ｓ　ｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｔｈｅ
ｒｍ。

ｔｏｌｅｒａｎｓ）　ＡＴＣＣ１１４１６、ストレプト
マイセスΦハイグロスコピクス（Ｓ　ｔｒｅｐｔｏｍｙ
ｃｅｓ　ｈｙｇｒ。

５ｃｏｐｉｃｕｓ）Ａ　Ｔ　ＣＣ２１５８２、ストレプ
トマイセス・キタサトエンシス（Ｓ　ｔｒｅｐｔｏｍｙ
ｃｅｓ　ｋｉｔａｓａｔｏｅｎｓｉｓ）　Ｉ　ＦＯｌ　
３６８６等の菌体、培養液または細胞抽出液を用いて、
３位および／または４“位がＯＨＩのマクロライド抗生
物質を基質として添加し反応を行って変換している。し
かしながら、この方法によればマクロライド抗生物質生
産菌とアンル化活性を有する微生物が別々であり、工業
生産上経済的に不利である。

発明が解決しようとする課題 ３位および／または４″位ＯＨ型のマクロライド抗生物
質を生物学的にアンル化するためには、上述の如く、ま
ず該マクロライド生産菌株を培養し、マクロライド抗生
物質を単離した後、アンル化酵素を有する微生物によっ
て変換するという２段階の操作が必要であった。そこで
、これを改善し、マクロライド生産菌株単独でアンル化
マクロライドを生産することを目的として、マクロライ
ドアシル化酵素遺伝子を有する微生物より該酵素遺伝子
を単離し、これを遺伝子工学的手法によりマクロライド
生産菌株に導入し、直接アシル化マクロライドを生産さ
せるべく鋭意研究を行った。

課題を解決するための手段 近年の遺伝子工学技術の発展により、ある特定の生物か
ら所望の遺伝子をとり出し、これをそのままあるいは適
当なベクターに連結し、別の所望の微生物に導入するこ
とが可能となった［Ｄ　、Ａ　。

ホップウッドら：　Ｇｅｎｅｔｉｃ　ｍａｎｉｐｕｌａ
ｔｉｏｎ　ｏｆ　ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、Ｔｈｅ　
　Ｊ　ｏｈｎ　　Ｉ　ｎｎｅｓ　　Ｆ　ｏｕｎｄａｔｉ
ｏｎ　（１９８５）］　　。

そこで、本発明者らは、前述の如きマクロライド抗生物
質の３位および／または４″位アシル化酵素保有微生物
から該酵素遺伝子を単離すべく鋭意研究を行い、その結
果、ストレプトマイセス属に属する成る種の菌株から４
“位アシル化酵素遺伝子ａｃｙ　Ｂを単離することに成
功し、本発明を完成するに至った。

かくして、本発明によれば、ストレプトマイセス属に属
する菌株由来の、大きさが約３．１キロベース（ｋ　ｂ
）であり且つ添付第１図に示される制限酵素地図に示さ
れるＤＮＡ塩基配列によって特徴づけられるマクロライ
ド抗生物質の４図位アシル化酵素をコードする遺伝子ａ
ｃｙＢを含むＤＮＡ断片およびその制限酵素によるＤＮ
Ａ制限断片が提供される。

ここで、「制限酵素によるＤＮＡ制限断片」とは、制限
酵素によりアシル化酵素活性発現に必要な長さに分解さ
れた種々の大きさのＤＮＡ断片のことである。

本発明の遺伝子ａｃｙＢを含むＤＮＡ断片またはＤＮＡ
制限断片は、目的とするマクロライド抗生物質誘導体、
例えば４″位アシル化タイロシンを商業的に製造するう
えで有用であり、且つストレプトマイセス属および他の
抗生物質産生微生物に対する組み換えＤＮＡ技術の商業
的な利用を可能ならしめるという点で特に有用である。

以下、本発明の遺伝子ａｃｙ　Ｂを含むＤＮＡ断片の製
造、特性およびそれを用いた形質転換体によるアシル化
マクロライド抗生物質の生産について・さらに詳細に説
明する。

本発明の遺伝子ａｃｙ　Ｂを含むＤＮＡ断片の由来源と
なるストレプトマイセス属の菌株としては、マクロライ
ド抗生物質の４″位アシル化酵素の生産能をもつもので
あればいずれの菌株でも使用することができ、例えば ストレプトマイセス・キタサトエンシス（Ｓ　ｔｒｅｐ
ｔｏｍｙｃｅｓ　ｋｉｔａｓａｔｏｅｎｓｉｓ）、スト
レプトマイセス・ナルトポ不ンンス・パル・ジョサフイ
セテイクス（Ｓ　、　ｎａｒｂｏｎｅｎｓｉｓ　ｖａｒ
　ｊｏｓａｍｙｃｅｔ　１ｃｕｓ）、 ストレプトマイセス・ハイグロスコピクス（ＳＪｙｇｒ
ｏｓｃｏｐｉｃｕｓ）、 ストレプトマイセス・プラテンンス（Ｓ　、　ｐｌａｔ
ｅｎｓｉｓ）、 ストレプトマイセス・アルビレテイクリ（Ｓ　、ａｌｂ
ｉｒｅｔｉｃｕｌｉ）、 ストレプトマイセス・シネロクロモゲネス（Ｓ。

ｃ　ｉｎｅｒｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ）、ストレプト
マイセス・ジヤカルテンシス（Ｓ　、ｄｊａｋａｒｔｅ
ｎｓｉｓ）、 ストレプトマイセス・フルデインデイクス（Ｓ、ｆｕｒ
ｄｉｃｉｄｉｃｕｓ）、 ストレプトマイセス・マクロスポレウス（Ｓ、ｍａｃｒ
ｏｓｐｏｒｅｕｓ）、 ストレプトマイセス・テンダエ（Ｓ　、ｔｅｎｄａｅ）
、ストレプトマイセス・サーモトレランス（Ｓ、ｔｈｅ
ｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）、 ストレプトマイセス・デルタエ（Ｓ　、ｄｅｌｔａｅ）
等が挙げられるが、中でも、ストレプトマイセス・サー
モトレランスが好適である。

以下、この好適なストレプトマイセス・サーモトレラン
スを用いた場合について説明するが、他の菌株を用いた
場合からも同様にしてマクロライド抗生物質の４″位ア
シル化酵素をコードする遺伝子（ａｃｙ　Ｂ遺伝子）を
単離することができる。

〈ゲノムＤＮＡの調製〉 本発明のａｃｙ　Ｂ遺伝子含有ＤＮＡの供与体、ストレ
プトマイセス・サーモトレランス（Ｓ　、　Ｌｈｅｒｍ
。

ｔｏｌｅｒａｎｓ）は例えば、ジ・アメリカン・タイプ
・カルチャー畢コレクンヨン（Ｔ　ｈｅ　　Ａ　ｍｅｒ
　１ｃａｎＴｙｐｅ　　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　　Ｃｏ１１ｅ
ｃｔｉｏｎ）に寄託番号ＡＴＣＣ１１４１６で寄託され
ており、容易に入手可能な菌株である。

上記菌株を、例えば後記実施例１で詳述するように、２
８°Ｃで好気的に培養して対数増殖期の菌体を取得し、
ホップウッド（Ｈｏｐｗｏｏｄ）らの方法［シエ不テイ
ツク・マニピユレーション・オブーストレプトマイセス
（Ｇｅｎｅｔｉｃ　　Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎｏｆ　
　Ｓ　ｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）　　ニア０ラボラトリ
６マニユアル（Ａ　　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　　Ｍａｎ
ｕａｌ）　、ジョン・イ不ス・ファウンデーション（Ｊ
ｏｈｎ　　Ｉｎｎｅｓ　　Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ）、ノ
ーウィッチ（Ｎ　ｏｒｗｉｃｈ）　、英国、１９８５年
１に従って処理することにより、ａｃｙＢ遺伝子含有ゲ
ノムＤＮＡを調製することができる。

＜ＤＮＡ断片のベクタープラスミドへの挿入および形質
転換〉 上記の如くして得られるａｃｙＢ遺伝子含有ゲノムＤＮ
Ａを適当なベクタープラスミド、例えばｐ［Ｊ７０２、
ｐＩＪ９４３、ｐＩＪ３５０、ｐｕＣ１８等に連結する
。

ベクタープラスミドｐＩＪ７０２は、後記実施例２で詳
述するように、フェノール抽出、塩化セシウムによる密
度勾配超遠心によりその保有菌株から単離することがで
きる。得られるプラスミドｐＩＪ７０２を制限酵素Ｂａ
Ｑ■で消化し、それに上記ゲノムＤＮＡを制限酵素５ａ
ｕ３ＡＩで部分消化したＤＮＡ断片を挿入する。このよ
うにして得られるストレプトマイセス・サーモトレラン
スＡＴＣＣ１１４１６ゲノムＤＮＡの一部を含むプラス
ミドでストレプトマイセス・リビダンスＴＫ２４を形質
転換し、タイロシンアンル化能を付与された形質転換株
を取得する（詳細については後記実施例３参照）。この
タイロシンアシル化能ヲ付与された形質転換株よりプラ
スミドを抽出・精製することにより、約６キロベースの
ＤＮＡ挿入断片を含むプラスミドｐＡＯＹ−１７を得る
ことができる。

上記プラスミドｐＡＯＹ−１７を調製したと同様にして
、プラスミドｐＩＪ９４３の制限酵素ＢｇＱ■切断点に
ストレプトマイセス・サーモトレランス由来の約１３キ
ロベースの制限酵素５ａｕ３ＡＩ消化断片が挿入された
プラスミドｐＡＯ２０７を得ることができる（後記実施
例４参照）。

プラスミドｐＩＪ７０２はジ・アメリカン・タイプ・カ
ルチャー・コレクションより寄託番号ＡＴＣＣ３５２８
７のもと入手できる。また、ｐＩＪ９４３はホップウッ
ド（Ｈｏｐｗｏｏｄ）らによって開示されており［ジエ
ネティック・マニピユレーション・オブ・ストレプトマ
イセス（Ｇ　ｅｎｅｔ　ｉｃＭａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ
　　ｏｆ　　Ｓ　ｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）　ニア・ラ
ボラトリ＊　マニュアル（Ａ　　Ｌａｖｏｒａｔｏｒｙ
　　Ｍａｎｕａｌ）。

３１４−３１５頁、１９８５年、ザ・ジョン・イネス・
ファウンデーション（Ｔ　ｈｅ　　Ｊ　ｏｈｎ　　Ｉ　
ｎｎｅｓＦ　ｏｕｎｄａｔｉｏｎ）参照１、ザ・ジョン
・イネス・ストレプトマイセス・カルチャー・コレクシ
ョン（Ｔ　ｈｅ　Ｊ　ｏｈｎ　　Ｉ　ｎｎｅｓ　　Ｓ　
ｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　　ＣｕＨｕｒｅＣｏｌｌｅｃ
日Ｏｎ）、ジョン・イネス・インステイテユート（Ｊ　
ｏｈｎ　　Ｉ　ｎｎｅｓ　　Ｉ　ｎ５ｔｉｔｕｔｅ）　
、コルニレーン（Ｃｏｌｎｅｙ　　Ｌ　ａｎｅ）　、ノ
ルラッチ（Ｎｏｒｗｉｃｈ）　Ｎ　Ｒ４７Ｕ　Ｈ，イン
グランド（Ｅｎｇｌａｎｄ）よりストレプトマイセス・
リビダンス（Ｓ　ｔ？ｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　　Ｑｉｖｉ
ｄａｎｓ）　Ｔ　Ｋ　２４　／ｐＩ　Ｊ　９４３のもと
に入手できる。また、その宿主菌であるストレプトマイ
セス・リビダンスＴＫ２４も上記ジョン・イネス・イン
スティテユートより同様に入手できる。

上記プラスミドｐＡＯＹ−１７およびｐＡＯ２０７の制
限酵素切断点と機能地図を添付の第２図および第３図に
示す。

プラスミドｐＡＯＹ−１７およびｐＡＯ２０７に挿入さ
れたＤＮＡ断片中のａｃｙＢ遺伝子はさらに限定するこ
とが可能である。すなわち、挿入ＤＮＡ断片を適当な制
限酵素、例えば３ｇ１２ＩＩ、Ｓ　ａｃ　Ｉ、ＰｓｔＩ
などで消化してさらに小さなりＮＡ断片とし適当なスト
レプトマイセス属のプラスミド、例えばｐＩＪ７０２な
どへ挿入する。小さなりＮＡ断片を組み込んだプラスミ
ドでストレプトマイセス・リビダンスＴＫ２４を形質転
換して転換体のタイロシンの４Ｎ位アシル化能を観察し
、組み込まれたＤＮＡ断片がａｃｙＢ遺伝子を含むかど
うかを判定する（詳細については後記実施例７参照）。

かくしてプラスミドｐＡＯＹ−１７およびｐＡ。

２０７に挿入されているＤＮＡ断片中のａｃｙＢ遺伝子
を第１図に示すごとく限定することに成功した。このＤ
ＮＡ断片はプラスミドｐＡＯＹ−１７およびｐＡＯ２０
７に存在する共通ＤＮＡ領域に含まれている。

〈挿入したＤＮＡ断片とゲノムＤＮＡの相同性〉プラス
ミドｐＡＯＹ−１７およびｐＡＯ２０７に挿入されたＤ
ＮＡ断片の起源を分析するために、挿入断片の一部（制
限酵素Ｐｖｕｌ［の制限断片、１３キロベース）を［σ
−”Ｐ］　ｄＣＴＰでラベルし、ストレプトマイセス・
サーモトレランスＡＴＣＣ１１４１６とストレプトマイ
セス・リビダンスＴＫ２４のゲノムＤＮＡとの間のサザ
ンハイプリダイゼーション（Ｓ　ｏｕｔｈｅｒｎ　　ｈ
ｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）を行った。サザンハイプリ
ダイゼーションはサザン（Ｓ　ｏｕｔｈｅｒｎ）によっ
て開示されている［ジャーナル・オプ・モレキュラ・バ
イオロジー（Ｊ　ｏｕｒｎａｌ　　ｏｆ　　Ｍｏ１ｅｃ
ｕｌａｒ　　Ｂｉｏｌｏｇｙ）　、９８巻、５０３頁、
１９７５年１゜これによりｐＡＯＹ−１７８よびｐＡＯ
２０７の挿入ＤＮＡ断片はストレプトマイセス・サーモ
トレランスＡＴＣＣｌ　ｌ　４１６由来であることが確
認された。

（ａｃｙ　Ｂ遺伝子を含むＤＮＡ制限断片を組み込んだ
プラスミドの構築〉 前記のグラスミドｐＡＯＹ−１７８よびｐＡＯ２０７は
、ストレプトマイセス・レプリコン、タイロシン４＃位
アシル化酵素活性を付与する制限断片および選択マーカ
ーとしてのチオストレプトン耐性遺伝子を含宵するもの
である。しかして、上記両プラスミドはａｃｙＢ遺伝子
を含む本発明の多数のプラスミド類の有用な出発物質と
して利用することができる。

プラスミドの増殖および操作はストレプトマイセス属よ
りもエシェリヒア・コリの方が速やかで効率的であるか
ら、エシェリヒア・コリのプラスミド類、例えばｐＢＲ
３２２およびｐＵＣ１８などの中へ上記ａｃｙ　Ｂ遺伝
子を含むＤＮＡ制限断片を導入してエシェリヒア・コリ
中でその断片を複製する方が有利である。そのため後記
実施例５および６に詳述する手順に従ってプラスミドｐ
ＵＣ１８にａｃｙ　Ｂ遺伝子を含むＤＮＡ制限断片を組
み込むことにより、グラスミドｐＵＹ−１７、ｐＹ−１
７ΔＥｃｏ、ｐＵｓ８１、ｐＵＳ８２、ｐＳ　８２ΔＰ
ｓＬｓまたはｐＳ８２ΔＳａｃを調製することができる
。

プラスミドｐＵＣ１８は市販のもの（例えば、フアルマ
シア社製）を用いるのが便利である。上記プラスミド類
の制限酵素切断点および機能地図を添付の第４図ないし
第９図に示す。

ｐＵＹ−１７はエシェリヒア・コリのレプリコンと同時
にストレプトマイセス属のレプリコンを有しており、ス
トレプトマイセス・リビダンスＴＫ２４を形質転換して
、マクロライド抗生物質、例えばタイロシンの４″位ア
シル化能を付与することができる。プラスミドｐＳ　８
２△Ｐｓｔを除いた上記のグラスミド類はａｃｙＢ遺伝
子を完全Ｉこ保持しているが、プラスミドｐＳ　８２Δ
Ｐｓｔはａｃｙ　Ｂ遺伝子の一部が欠失している。ａｃ
ｙＢ遺伝子を完全に保持している上記プラスミドより制
限酵素例えばＳ　ｐｈ　Ｉ、Ｓ　ａｃ　Ｉなどによって
ａｃｙ　Ｂ遺伝子を含む制限断片を切り出すことができ
る。またその制限断片は、ｐＩＪ７０２、ｐＩＪ９４３
、Ｉ）ＩＪ３５０（Ｔ、キーザーら：モレキュラー・ア
ンド・ジェネラル・ジエネテイクス［Ｋ　１ｅｓｅｒ　
ａｔ　ａｌ、：Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　ａｎｄ　Ｇｅｎｅ
ｒａｌ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓｌ　　１８５巻、２２３−２
３８頁（１９８２））などのプラスミドヘ組み込むこと
ができる。組み換えられｔ；プラスミドはストレプトマ
イセス・リビダンスＴＫ２４を形質転換して、該菌株に
マクロライド抗生物質４“位アシル化能を付与すること
ができる。

本発明においてプラスミドの構築に使用するａｃｙ　Ｂ
遺伝子含有ＤＮＡ断片は通常ライダ８−ジョンを容易に
するために修飾することが可能である。

例えば、本発明のａｃｙＢ遺伝子含有ＤＮＡ断片に合成
リンカ−を結合することができ、それによって、その後
に行うライゲーンヨン反応に対して特異的な部位を都合
よく組み立てることが可能である。

本発明のａｃｙＢ遺伝子含有ＤＮＡ断片の宿主微生物へ
の導入に用いうるベクタープラスミドとしては、例えば
ｐＩＪ７０２、ｐＩＪ９４３、ｐＩＪ３５０、ｐＵＣ１
８等が挙げられるが、これに限定されるものではなく、
さまざまな宿主域で同程度に有用であることが知られて
いるストレプトマイセス・レプリコンやエシエリヒ、ア
・コリ・レプリコン類を含むベクタープラスミドも利用
でき、さらにレブリフン機能が破壊されない限り、該プ
ラスミドの一部をベクターとして利用することもできる
。

（ａｃｙＢ遺伝子含有断片の塩基配列の決定〉ａｃｙＢ
遺伝子含有断片のうち全部または一部を挿入断片として
もつプラスミド例えばｐＳ８２△ＳａｃやｐＳ８２△Ｐ
ｓｔなどを鋳型ＤＮＡとして用いればｄｉｄｅｏｘｙ鎖
末端法（Ｆ、サンガーら：プロシーデインダス・オブ・
ナショナル・アカデミツク０サイエンス［Ｆ　、ｓａｎ
ｇｅｒ　ａｔ　ａｌ、　：　Ｐ　ｒｏｃ、Ｎａｔ。

Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、］　７４巻、５４６３−５４６７頁
（１９７７））によりａｃｙ　Ｂ遺伝子のＤＮＡ塩基配
列を決定することができる。この方法に従いプラスミド
ルＳ８２△Ｓａｃ上のａｃｙ　Ｂ遺伝子含有断片の一端
である５ａｕ３Ａ１部位の配列ＧＡＴＣのＧを１として
始まる２７４９ｂ　（ベース）の塩基配列を第１Ｏ図の
ように決定することができる。さらに決定された塩基配
列中からオープン　リーディングフレームを検索するこ
とによりａｃｙ　Ｂ遺伝子の翻訳領域を求め且つそこに
コードされているマクロライド抗生物質の４＃位をアシ
ル化する酵素のアミノ酸配列を予想することができる。

このようにして第１Ｏ図に示す塩基配列から互いに逆方
向、すなわち配列中央部から外側へ向かう２個のオーブ
ン　リーディングフレームを見い出し、上流側のものを
ａｃｙＢ　ｌとして第１１図（ａ）に、そして下流側の
ものをａｃｙＢ　２として第１１図（ｂ）にそれぞれア
ミノ酸配列を示す。

（ａｃｙＢ遺伝子を含むＤＮＡ制限断片の有用性〉本発
明により提供されるマクロライド抗生物質４“位アシル
化酵素遺伝子ａｃｙ　Ｂを含むＤＮＡ制限断片は広い有
用性を有している。

本発明のＤＮＡ断片は例えばストレプトマイセス属およ
び関連微生物にベクタープラスミドに組み込んで導入す
ることができる。しかして得られる形質転換体は培養し
、培養菌体またはその培養液もしくは九理物あるいはマ
クロライド抗生物質４“位アシル化酵素またはその含有
物を用いて効率良く４″位アシル化マクロライド抗生物
質を生産することが可能である。

また、本発明のＤＮＡ断片の一部を用いてプローブ（ｐ
ｒｏｂｅ）を作製し、ａｃｙ　Ｂ遺伝子関連の遺伝子を
検索するのに有力な手段を提供することもできる。

本発明のａｃｙ　Ｂ遺伝子を用いて発現されるマクロラ
イド抗生物質の４＃位アシル化酵素は、特にタイロシン
の４＃位のアシル化に有用であるが、それに限られるも
のではなく、他のマクロライド抗生物質、例えばスピラ
マイシン、アンゴラマイシン、ロイコマイシン、デルタ
マイシン等の４“位アシル化能も有している。

従って、本発明のａｃｙＢ遺伝子が組み込まれたプラス
ミドを、これらマクロライド抗生物質の生産能をもつ微
生物に導入すれば、４＃位がアシル化されたマクロライ
ド抗生物質を直接生産させることが可能となる。

また、マクロライド抗生物質を生産しない微生物にかか
る組換えプラスミドを導入することも可能であり、その
形質転換株はマクロライド抗生物質を含む培地で培養す
れば、４“位がアシル化されたマクロライド抗生物質を
生成させることが可能である。

さらに、該形質転換株が生産する４“位アシル化酵素は
勿論、マクロライド抗生物質とアシル化剤との間の酵素
反応における触媒として使用することも可能である。

（ａｃｙＢ遺伝子を含むＤＮＡ制限断片を組み込んだプ
ラスミドによる微生物の形質転換〉本発明のａｃｙ　Ｂ
遺伝子を組み込んだプラスミドは、ベクタープラスミド
に応じた適当な宿主微生物に導入することができる。宿
主微生物はマクロライド抗生物質を生産する能力のある
微生物であっても、また、マクロライド抗生物質を生産
しない微生物であってもよく、使用しうる宿主微生物と
しては例えば、ストレプトマイセス・キタサトエンシス
（Ｓ　ｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｋｉｔａｓａｔｏｅｎ
ｓｉｓ）　、ストレプトマイセスｅナルポネンンス・パ
ル・ジョサマイセテイクス（Ｓ　、ｎａｒｂｏｎｅｎｓ
ｉｓ　ｖａｒ　ｊｏｓａｌＩｌｙｃｅｔｉｃｕｓ）　、
ストレプトマイセス・ハイグロスコピクス（Ｓ　、ｈｙ
ｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ）、ストレプトマイセスｅプラ
テンンス（Ｓ　、ｐｌａｔｅｎｓｉｓ）、　ストレプト
マイセス・アルビレテイクリ（Ｓ　、ａｌｂｉｒｅｔｉ
ｃｕｌｉ）、ストレプトマイセス・シ不ロクロモゲ不ス
（Ｓ　、ｃｉｎｅｒｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ）　、ス
トレプトマイセス・ジャカルテンンス（Ｓ　、ｄｊａｋ
ａｒｔｅｎｓｉｓ）　、ストレプトマイセス・マクロス
ポレウス（Ｓ　、ｍａｃｒｏｓｐｏｒｅｕｓ）、ストレ
プトマイセス・テンダエ（Ｓ　、　ｔｅｎｄａｅ）、ス
トレプトマイセス・デルタエ（Ｓ　、ｄｅｌＬａｅ）、
ストレプトマイセス・フラジアエ（Ｓ　、ｆｒａｄｉａ
ｅ）　、ストレプトマイセス・ユーリサーマス（Ｓ　、
ｅｕｒｙｔｈｅｒｍｕｓ）、ストレプトマイセス・アン
ポファシェンス（Ｓ。

ａｍｂｏｆａｃｉｅｎｓ）　、ストレプトマイセス・カ
スガエンシス（Ｓ　、ｋａｓｕｇａｅｎｓｉｓ）　、ス
トレプトマイセス・・エリスレウス（Ｓ　、ｅｒｙｔｈ
ｒｅｕｓ）　、ストレプトマイセス・カナミセティクス
（Ｓ　、ｋａｎａｍｙｃｅＬｉｃｕｓ）等が挙げられる
。

しかし一般には、マクロライド抗生物質の４″位のアン
ル化酵素を実質的に生産しないマクロライド抗生物質生
産菌、例えばアンゴラマイシン生産菌であるストレプト
マイセス・ユーリサーマスＡＴＣＣｌ　４９７５、タイ
ロシン生産菌であるストレプトマイセス・フラジアエＡ
ＴＣＣ１９６０９等が適しており、特に後者のストレプ
トマイセス・フラジアエＡＴＣＣｌ　９６０９が好適で
ある。

前記ａｃｙ　Ｂ遺伝子を保何する組換えグラスミドによ
るこれら宿主微生物の形質転換は、それ自体既知の方法
、例えばホップウッドの方法［ジエネテイツク・マニピ
ュレーＶヨン・オプ・ストレプトマイセスニア・ラボラ
トリ・マニュアル（Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｍａｎｉｐｕｌａ
ｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｓ　ＬｒｅｐＬｏｍｙｃｅｓ：　Ａ　
　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ）　１９８５年
、ザージョン　イネス・インステイテユート（Ｔ　ｈｅ
　Ｊ　ｏｈｎ　Ｉ　ｎｎｅｓｒ　ｎ５ｔｉｔｕｔｅ）　
］によって行なうことができる。

このようにして得られる形質転換体は、マクロライド抗
生物質を含む培地で培養することにより、４＃位がアシ
ル化されたマクロライド抗生物質を生成せしめることが
できる。或いはまた、マクロライド抗生物質を生産する
能力のある形質転換体の場合には、培地にマクロライド
抗生物質を添加しない培地で培養することによっても、
４“位がアシル化されたマクロライド抗生物質を生成せ
しめることができる。

さらに、形質転換体を培養し、その培養菌体又はその処
理物（例えば培養菌体を超音波処理によって破砕した無
細胞抽出液）の存在下にマクロライド抗生物質をアシル
化剤、例えばアセチルコエンサイムＡ１プロビオニルコ
エンザイムＡＳｎ−７’ｆ−ＩＪルコエンザイムＡ１　
イソバレリルコエンザイムＡ１フェニルアセチルコエン
ザイムＡ、Ｌるいはアシル基供与の生合成前駆体、例え
ばロイシン等と反応せしめることによっても４″−アシ
ル化マクロライド抗生物質を製造することができる。

かくして、本発明によれば、４“位が炭素数１〜５個ア
ルカノイル基、例えばアセチル、プロピオニル、ｎ−ブ
チリル、インバレリル基等でアシル化されたマクロライ
ド抗生物質、例えば４“アセチルタイロシン、４“−プ
ロピオニルタイロシン％４＃　　ｎ−ブチリルタイロシ
ン、４“−イソバレリルタイロシン、４“−アセチルア
ンゴラマイシン、４“−プロピオニルアンゴラマイシン
、４“−ｎ−プチリルアンゴラマインン、４“−イソバ
レリルアンゴラマイノン、４“−アセチルスピラマイシ
ン、４“−プロピオニルスピラマイシン、４“−〇−ブ
チリルスピラマイシン、４“インバレリルスピラマイン
ン等を製造することができる。

〈形質転換株の培養〉 本発明のａｃｙ　Ｂ遺伝子含有ＤＮＡ断片を含むプラス
ミドで形質転換した宿種微生物、例えばストレプトマイ
セス属微生物は、幾つかの異なった任意の培地を使用す
る多くの方法によって培養することができる。培養培地
に加えられる好ましい炭素源には例えば糖蜜、グルコー
ス、でん粉、油脂、グリセリン等が含まれ、窒素源とし
ては例えば大豆粉末、アミノ酸混合物、乾燥酵母、ペプ
トン類が含まれる。培地には栄養無機塩類もまた添加す
ることができ、これには例えばカリウム、ナトリウム、
マグネシウム、カルシウム、りん酸、塩素および硫酸イ
オン等を放出し得る通常の塩類が含まれる。必須微量成
分、例えばビタミン類もまた必要に応じて添加すること
かできる。こうした微量成分は通常、他の培地成分の添
加に付随する不純物の形で供給されうる。さらに培地に
は必要に応じて、アシル化すべきマクロライド抗生物質
を添加することもできる。

形質転換したストレプトマイセス属微生物の場合は、ｐ
Ｈ約５〜９の比較的広い範囲にまたがるｐＨの培地で好
気的条件下に、約２０〜４０’Ｏの温度範囲で培養する
ことができる。その際、プラスミドの安定性保持の上で
必要な条件、例えばチオストレプトンのような薬剤を選
択圧として添加することもできる。

以下に実施例を挙げて、本発明をさらに詳細に説明する
。これらの実施例は単に本発明を説明するためのもので
あり、本発明の範囲を限定するものではない。

の調製 （Ａ）　　ストレプトマイセス・サーモトレランス・Ａ
ＴＣＣｌＩ４１６の培養 グルコース０．４％、酵母エキス０．４％、麦芽エキス
１．０％および寒天１．５％よりなるスラント培地で２
８°Ｃで２週間培養した上記菌株を一白金耳取り、可溶
性でん粉２％、大豆粉末２％、酵母エキス０．１％、Ｋ
、ＨＰｏ、　　０．１％およびＭｇＳ　Ｏｉ・７Ｈ２０
０，０５％よりなる種母培地２５ｍ＋２に接種した。種
母培地は２５０ｍＱ容三角フラスコに入れ１２０°ＣＳ
　１５分間殺菌したものを用いた。接種したフラスコを
２８°Ｃで４８時間振とう培養して種母とした。１ｍＱ
の種母をＴＳＢ培地（トリブチイック・ソイ・ブロス）
本２５ｍ（１１こ接種した後、２８°Ｃで４８時間培養
した。

本ＴＳＢ培地は３０ｇ／Ｑの濃度で調製した。ＴＳＢ培
地は米国ミシガン州デトロイト（ＤｅｔｒｏｉＬ、　Ｍ
　ｉｃｈｉｇａｎ）のデイフコ・ラボラトリズ（Ｄ　１
ｆｃｏ　　Ｌ　ａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）社より入手し
Ｉこ　。

（Ｂ）　　ゲノムＤＮＡの調製 菌体を採集し１０００％シュークロース溶液で一回洗浄
した。続いて、２５％シュークロース／トリス−ＨＣＱ
（５０ｍＭ、ｐＨ８）を湿菌体重量Ｉｇ当り５ｍＱ加え
た。菌体を良く分散させた後、０．６ｍ（２のりゾチー
ム［ングマ・ケミカル社（Ｓｉｇｍａ　　Ｃｈｅｍｉｃ
ａｌ）　Ｃｏ、）製グレードＩ］溶液（ｌＯｍｇ／　ｍ
ｆｆ）を添加し良く混和した。３０°Ｃで３０分間イン
キュベートし、続いて０．６ｍｆｆのＥＤＴＡ溶液（０
，５Ｍ、ｐＨ８）とＯ、ｌ　ｍＱのプロナーゼＥ［シグ
マ・ケミカル社製］溶液（ｌ　Ｏｍｇ／　ｍ＋２）を加
えたのち３０°Ｃで５分間インキュベートした。

３．６ｍＱの３．３％ＳＤＳ　［シグマ・ケミカル社製
］溶液を加え３７℃で１時間インキュベートした。

フェノール５００ｇ、クロロホルム５００ｇをトリス−
ＨＣ（２（５０ｍＭＸｐＨ８）／ＮａＣ１２（ｔｏ。

ｍＭ）／ＥＤＴＡ　（５ｍＭ、ｐＨ８）２００ｍＱに混
合して得られたフェノール層を６ｍＱ加え、緩和な条件
で良く混合した。次いで、溶液を遠心（１０，ＯＯＯｒ
ｐｍ、２０分間）にて層分離を行い、水層約７ｍＱを得
た。水層に２ｍＱのクロロホルムを加えて緩和な条件下
で良く混和した後遠心し（１０，０００ｒｐｍ、　　Ｉ
　０分間）、水層約７ｍＱを得た。水層に３０μＱのり
ポヌクレアーゼＡタイプＩ−ＡＳ［シグマ・ケミカル社
製］溶液（ｌｏｍｇ／ｍＱ溶液を９０°ｃ、ｉｏ分間加
熱処理したもの）を加え、３７°Ｃで１時間インキュベ
ートした。

０．１容量の酢酸ナトリウム溶液（３Ｍ、ｐＨ４，８）
とｌ容量のインプロパツールを加えて良く混和した後、
室温で１０分間放置した。遠心分離（６、ＯＯＯｒｐｍ
、　　Ｉ　０分間）で沈でんを集めた。

沈でんを５ｍ４のＴＥバッファー［トリス−ＨＣｆ２（
Ｉ　ＯｍＭ、ｐＨ８）／ＥＤＴＡ（１ｍＭ、ｐＨ８）］
に溶解した後、０．５ｍ（！の酢酸ナトリウム溶液と１
２．１ｍ（＋のエタノールを加えて良く混和し、２０°
Ｃで一晩放置した。沈でんを遠心分離（６，０００ｒｐ
ｍ、　　Ｉ　０分間）で集め、デシケータ中で真空乾燥
した。２５ｍＱの培養液より約８００μｇのゲノムＤＮ
Ａが得られた。

（Ａ）　　ｐＩＪ７０２の調製 ストレプトマイセス・リビダンスＡＴＣＣ３５２８７の
胞子約１０’個を、チオペプチン本５μｇ／ｍＱを含有
するＹＥＭＥ＋３４％シュークロース培地（酵母エキス
０．３％、バンドペプトン０．５％、麦芽エキス０．３
％、グルコース１％、シュークロース３４％、殺菌後１
ｍ１２の２．５ＭＭｇＣＱ２溶液を添加）５００ｍ（２
に接種し、２８°Ｃで４８時間振とう培養した。

本チオペプチン（藤沢薬品工業製チオフィードよりクロ
ロホルム抽出にて調製）をチオストレプトンの代わりに
選択圧として用いた［ペスカおよびポルトレー（Ｓ　、
　Ｐ　ａｓｔｋａ　　ａｎｄＪ　、Ｗ、Ｂｏｌｄｌｅｙ
）　、アンティビオティック■（Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ
ｓ［［）　５５１　５７３頁、１９７５年スプリスプー
・フエルラーグ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ　−Ｖｅｒｌａｇ）
　］ 菌体を集め１０００％シュークロース溶液で一回洗浄し
た。次いで、４５ｍ（２の１０．３％シュークロース／
トリス−ＨＣＱ（２５ｍＭ、ｐＨ８）／ＥＤＴＡ　（２
１ｍＭ、　ｐＨ８）溶液に懸濁し、５ｍＱのリゾチーム
溶液（Ｉ　Ｏｍｇ／　ｒｎＱ、菌体懸濁に用いた溶液と
同じものに溶解）とりポヌクレアーゼタイプＩ−ＡＳ溶
液２５０μＱを加えて良く混和した後、３７°Ｃで３０
分間インキュベートした。続いて、３０ｍ＋２の０．３
　Ｍ　　ＮａＯＨ／　２％ＳＤＳ溶液を加えて良く混和
し、５５°Ｃで１５分間インキュベートした。実施例１
で用いたと同じフェノール溶液を２０ｍＱ加え良く混合
した。遠心分離（１５゜０００ｒｐｍ、　　１５分間）
で層を分離し、水層約７０ｍＱを得た。そこへ７ｍＱの
酢酸ナトリウム溶液（３Ｍ、ｐＨ無調整）および７０ｍ
Ｑのインプロパツールを加えて良く混和し、室温で１０
分間放置した。遠心分離（１５，ｏｏｏｒｐｍ、１５分
間）で沈でんを集め、ｌｏｍ（ｌのＴＨＥバッファー［
トリス−ＨＣＱ（ｌ　ＯｍＭ、ｐＨ８）／ＥＤＴＡ　（
１ｍＭ。

ｐＨ８）／ＮａＣＱ（５０ｍＭ）］に溶解した後、先に
述べたフェノール溶液５ｍ（２を加え良く撹拌した。

次に遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、１５分間）で層分
離を行ない、上層約１０ｍＱを得た。そこへ１ｍｆｆの
酢酸ナトリウム（３Ｍ、ｐＨ６）および１０ｍ１２のイ
ソプロパツールを加えて良く混和した。遠心分離（１５
，ＯＯＯｒｐｍ、１５分間）で沈でんを集め、ｌ　ｍＱ
Ｏ’）　１９　／−ルで洗浄乾燥した。沈でんを１１−
９　ｍＱ（７）Ｔ　Ｅ　／＜ッファーに溶解した後に、
１２．６ｇの塩化セシウムを加え、さらに０．６ｍＱの
臭化エチジウム溶液（ｌ　Ｏｍｇ／　ｍＱ）を加えた。

３６．０００ｒｐｍで６０時間遠心し、プラスミドバン
ドが含まれる画分をＴＥバッファーおよび塩化セシウム
で飽和したインプロパツールで５回抽出し、臭化エチジ
ウムを除去した。その後、透析用チューブに入れてＴＥ
バッファーに対し２４時間透析した。約１３０μｇのプ
ラスミドｐｔＪ７０２を取得した。

（Ｂ）　　ｐＩ　Ｊ　９４３の調製 プラスミドｐＩＪ７０２の調製法と実質的に同様にして
、ストレプトマイセス・リビダンスＴＫ２４／ｐＩＪ９
４３よりプラスミドｐＩＪ９４３を調製した。ｌＱの培
養液より約４５μｇのｐＩＪ９４３を得た。

実施例３　プラスミドｐＡＯＹ−１７の分離プラスミド
ｐＩＪ７０２　２０ｇｇを１０μＱのＴＥバッファーに
溶解し、そこにｌＱＸＢｇ（２１バツフアー　［ＮａＣ
Ｑ（ｌ　Ｍ）／）リス−Ｈ（１（１００ｍＭ、ｐＨ７，
４）／ＭｇＣＬ　（１００ｍＭ）／ジチオスレイトール
（ｌｏｏｍＭ）／牛血清アルブミン（Ｉｍｇ／ｍ（１）
　１１０　ｐＱ、水８０μαを加え、制限酵素Ｂｇ（２
１１にッポンジーン社製、５〜ｌ　５　ｕｎｉｔｓ／μ
ｆ２）　５μＱを加えて良く混和した後、３７°Ｃで１
５時間インキュベートした。反応物ラフエノール／クロ
ロホルム溶液で処理した後、０．１容の３Ｍ酢酸ナリト
ウム溶液と３容量のエタノールで切断されたプラスミド
を沈でんさせた。

沈でんを７０％エタノール、エタノールで洗浄した。制
限酵素Ｂｇｉ２ｎで切断されたプラスミドｐＩＪ７０２
を終濃度０．１ｇｇ／μＱとなるようＴＥバッファーに
溶解した。

実施例１と同様にして調製したストレプトマイセス・サ
ーモトレランスＡＴＣＣ１１４１６ゲノムＤＮＡ　３０
０ｇｇを９００μＱのＴＥバッファーに溶解し、１ＯＸ
ｓａｕ３ＡＩバツフ　７−　［ＮａＣＱ（５００ｍＭ）
／）リス−ＨＣＱ（１００ｍＭ、ｐＨ７，４）　／　Ｍ
ｇＣ（ｈ　（１００ｍＭ）　／ジチオスレイトール（ｌ
ｏｍＭ）］　４５０ｐＱを加え、水で４゜５ｍ１２とし
た。制限酵素５ａｕ３ＡＩを５ユニント加え、３７°Ｃ
で１時間部分消化を行った。制限酵素５ａｕ３ＡＩは米
国マサチュセツツ州０１．９１５−９９９０ビバリー・
トザー・ロード（Ｔ　ｏｚｅｒ　Ｒ。

ａｄ　Ｂｅｖｅｒｌｙ　ＭＡＯ１９１５−９９９０，Ｕ
、Ｓ。

Ａ、）のニューイングランド・バイオラブ（ＮｅｗＥ　
ｎｇｌａｎｄ　　Ｂ　１ｏｌａｂｓ）より入手した。フ
ェノール／クロロホルム処理後、エタノール沈でんを行
った。部分消化したゲノムＤＮＡを１００ｐＱのＴＥパ
ンファーに溶解した後、０．８％アガロースゲルを用い
３Ｖ／ｃｍの電圧で１５時間電気泳動を実施し、泳動終
了後臭化エチジウムでＤＮＡを染色した。トランスイル
ミ不−タ上で５〜ｌＯキロベースの画分とｌＯ〜２０キ
ロベースの画分を切り出し、各々をＤＮＡセル（第−化
学薬品製）に入れてゲルからＤＮＡを電気的に溶出させ
た。両画分から共に約５０μｇのＤＮＡ断片を得た。エ
タノール沈でんの後に、各々をＴＥバッファーに終濃度
０．５ｇｇ／μＱとなるように溶解した。

前述した８ｇ１２Ｉ［切断ベクターｐＩＪ７０２溶液９
０μＱ（９μｇＤＮＡ）と部分消化したゲノムＤＮＡ５
〜１０キロベース画分８０μＱ（４０ｇｇＤＮＡ）を良
く混和し、ＩＯ×ライゲーションバ・ソファ−［トリス
−Ｈ（１（５００ｇＭ％　ｐＨ８）ＭｇＣＱ２（ｌ　Ｏ
ＯｍＭ）　、ジチオスレイトール（２００ｍＭ）、ＡＴ
Ｐ　　（１００ｍＭ）］　　５０ｐＱとＴ４リガーゼに
ッポンジーン製、５０　Ｑ　ｕｎｉｔｓ／μｍ２）　４
μＱを加え、１６°Ｃで約１５時間ＤＮＡ鎖の連結反応
を行った。反応終了後、エタノール沈でん操作を行いＴ
Ｅバッファー２００μＱに溶解し　Ｉこ　。

（形質転換） ストレプトマイセス・リビダンスＴＫ２４の胞子約１０
６個を実施例２で用いｊ；と同じ２５ｍＱのＹＥＭＥ＋
３４％シュークロース培地（５ｍＭのＭｇＣＱ２および
０．５％のグリシンを含み、チオペプチンを含まない）
の入ったスプリング入り２５ＱｍＣ容三角フラスコに接
触し、２８°Ｃで３２時時間上う培養した。遠心分離で
菌体を集め１０ｍ（２の１０００％シュークロースで洗
浄した後、１ｍｇ／ｍＱのりゾチームを含んだＰ培地４
ｍＱに良く懸濁し、３０℃で４５分間インキュベートし
た。Ｐ培地はシュークロースｌ　Ｏ，３ｇ、ＫｚＳＯａ
　　０．０２５ｇ。

Ｍｇ（１，・６Ｈ，００，２０２ｇ、微量金属溶液＊０
．２ｍＱを脱イオン水で８０ｍ１２として１２０°Ｃ１
１５分殺菌した後、各々別に殺菌した０、５％ＫＨ２Ｐ
Ｏ，１ｍ１２，３．６８％　ＣａＣＱｘ”　２　Ｈｇ。

１０ｏ＋Ｑ、ＴＥＳ　　［２−（［トリス−（ヒドロキ
シメチル）メチル］アミン）エタンスルホン酸１バツク
７　　（０−２５Ｍ、ｐＨ７，２）ｌ　ＯｍＱを加えて
調製した。

本微量金属溶液はｔｃ中に次の塩を含有している：　Ｚ
ｎＣＱ、　　４０ｍｇ５　ＦｅＣｌ２．−６Ｈ２０２０
０ｍｇ％ＣｕＣＱ２・２　Ｈ２Ｏ１０ｍｇ１ＭｎＣＱ２
・４　Ｈｚｏ　　１０ｍｇ、　Ｎａ２ＢａＯｔ＠１０　
Ｈ２Ｏ１０ｍｇｘ　　（ＮＨａ）ｓＭＯｙｏｚａ”４Ｈ
，Ｏｌｏｍｇ インキユヘートシた後、綿ろ過で残っている菌糸を除去
した。遠心分離（３、ＯＯＯｒｐｍ、　　ｌ　０分間）
でプロトプラストを採集し、３〜４ＸＩＯ’個／１００
μＱとなるようにＰ培地に再懸濁した。前述したライゲ
ーション後のＤＮＡｆ［ｌＯμｃを加え、２５％ＰＥＧ
１００Ｏ［ＢＤＨケミカル（Ｃｈｅｍｉｃａｌ）社製１
の存在下に形質転換を実施しｔこ。

Ｐ培地で形質転換を行ったプロトプラストを洗浄した後
、１ｍ１２のＰ培地に再懸濁した。その０　、１　ｍＱ
をＲ２ＹＥ寒天プレート上へ接種し、２８°Ｃで１６時
間培養した。培養後、チオペプチンの終濃度が５０μｇ
／ｍＱとなるようにチオペブチンを含有する軟寒天培地
を重層し、２８°Ｃでさらに７２時間培養した。Ｒ，Ｙ
Ｅプレートは、ンユークロース１０．３ｇ、に２ＳＯ４
０，０２５ｇ。

ＭｇＣα２・６　ＨｚＯｌ　、ＯＬ　２ｇ−グルコース
Ｉｇ。

デイフコカザミノ酸０−０−０ｌバクト寒天２．２ｇを
蒸留水８０ｍ（２に溶解し、＋２０°Ｃ，１５分間殺菌
した後、各々殺菌した前述の微量金属溶液０．２ｍＬ　
　０．５％に８２ＰＯ４１ｍＱ、　　３．６８％ＣａＣ
Ｑｚ２Ｈｚ０　８ｍ＋２，２０％Ｌ−プロリン１゜５ｍ
ｆｆ、ＴＥＳバッファー　（０，２５Ｍ、ｐＨ７，４）
１０ｍ（２，ｌ　Ｎ　　ＮａＯＨＯ，５ｍＱ及び１０％
酵母エキス５ｍ＋２を加え、その２０ｍ１２を径９ｃｍ
のプラスティ７クシヤーレに分注して調製した。その後
クリーンベンチ内で約２時間乾燥させた。一方、軟寒天
培地はニュートリエンド・ブロス（Ｎ　ｕｔｒｉｅｎｔ
　　ｂｒｏｔｈ）　８ｇ及びバント寒天３ｇを蒸留水で
ｌＱとし１２０℃１５分間殺菌したものを用いた。

（アシル化活性を有する形質転換株の分離）得られた形
質転換株約２０００株を各々グルコース１％、酵母エキ
ス０．５％、麦芽エキス１％、Ｌ−ロインン０．０２％
、ＴＥＳバッファー（０゜２５Ｍ、ｐＨ７，２）ｌ　０
％、バント寒天１．５％及びチオベプチン５０μｇ／ｍ
Ｑよりなる寒天培地に接種し、２８°Ｃで一週間培養し
た。タイロシン終濃度が１０００μｇ／ｍＱとなるよう
に、タイロシンを含む軟寒天培地を重層し、２４時間培
養を継続しｔ；。生育しているコロニー中心を径約６ｍ
ｍのコルクポーラ−で打ち抜き、寒天片をシリカゲルＴ
ＬＣプレート［ワットマン（ＷｂａＬｍａｎ）社製、Ｌ
Ｋ６ＤＦ］に乗せ風乾した。プレートを酢酸エチル１５
０ｍＱ、ジエチルアミン３　ｍ１２．メタノール１．５
ｍ（＋及び水３ｍ（２からなる展開溶媒で展開した後、
２５３．７％ｍの紫外線照射下にアシル化されたタイロ
シンを検出した。約２０００株の形質転換株中菌株番号
Ｙ−１７がアシル化タイロシンを生産することを見い出
した。Ｙ−１７株の生産するアシル化タイロシンは、Ｔ
ＬＣ％ＨＰＬＣ，ＵＶスペクトラム、ＮＭＲスペクトラ
ム、抗菌スペクトラム等の分析結果から４″−イソバレ
リルタイロシンと同定させた。

形質転換株ストレプトマイセス・リビダンス＃Ｙ−１７
より、実質的に実施例２に記載した方法に従ってプラス
ミドを単離し、プラスミドｐＡＯＹ−１７を得た。この
プラスミドには約６キロベースの外来ＤＮＡが挿入され
ていた。第２図にその制限酵素切断部位および機能地図
を示す。制限酵素による切断位置は全てを記載したもの
ではなく、意味のある切断部位のみを示した。

実施例４　プラスミドｐＡＯ２０７の単離ベクタープラ
スミドとしてｐＩＪ９４３を用い、ゲノムＤＮＡ消化断
片として実施例３に記載のｌＯ〜２０キロベースの両分
を用いた。実質的に実施例３の方法に従ってタイロシン
アシル化能を持つ形質転換株ストレプトマイセス・リビ
ダンスＴＫ２４／ｐＡＯ２０７株を単離した。この株は
茨城系つくば電束１丁目１番３号の通商産業省工業技術
院微生物工業技術研究所に微工研条寄第１８８０号（Ｆ
ＥＲＭ　　ＢＰ−１８８０）として寄託されている。こ
の株より、実施例２に記載した方法に従って保持してい
るプラスミドｐＡＯ２０７を単離した。第３図にその制
限酵素切断点および機能地図を示す。プラスミドｐＡＯ
２０７には約１３キロベースのＤＮＡ断片が挿入されて
いる。

実施例３に記載した方法によって得たプラスミドｐＡＯ
Ｙ−１７を制限酵素Ｂｇｆ２ＩＩで切断し０．６μｇを
調製した。一方、大腸菌プラスミドｐＵＣ１８（東洋紡
製）を制限酵素ＢａｍＨＩで完全に切断した後、牛腸由
来アルカリフォスファターゼ［ベーリンガー・マンハイ
ム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　　Ｍａｎｈｅｉｍ）製］で
処理して約０．２μｇを得た。両者を混合しＩＯ×ライ
ゲーションパンファー２μＱとＴ４リガーゼｌμＱを加
え水で総量２０μＱとした後、１５°Ｃで１６時間反応
させた。ライゲーションしたＤＮＡは下記に示す方法に
よって大腸菌Ｋ１２ＪＭ１０３株を形質転換するのに使
用した。

形質転換受容能力を有する大腸菌Ｋ１２ＪＭ１０３株は
ファルマシア（Ｐ　ｈａｒｍａｃｉａ）社製のものを使
用した。単一コロニーを単離して、５０ｍ＋２のし一グ
ロス（バタトトリプトンｌ　Ｏｇ、ＮａＣＱｌｏｇ及び
バント酵母エキス５ｇを蒸留水でｌＱとして調製）に接
種し、３７°Ｃで５時間培養した。

培養液のＯ−Ｄ、６００ｎｍの吸収は約０．５を示した
。培養液を遠心分離（３０００ｒｐｍ、　５分間）して
菌体を集め、２ｍＱの５０　ｍＭ　ＣａＣ＋２２に懸濁
した。氷水浴で３０分間冷却した後、遠心分離（３００
０ｒｐｍ、　５分間、４°Ｃ）して菌体を集め、５ｎ＋
Ｑの５０ｍＭ　　ＣａＣＱｚに再懸濁した。この１００
μＱにライゲーションしたＤＮＡ　Ｉ　ＯμＱを加えた
。

氷水浴で３０分間インキュベートした後、４２℃で２分
間加熱ショックを与えた。これに１ｍＱのＬ−ブロスを
加えて３７°Ｃで１時間インキュベートしＩこ　。

プラスミドｐＵＣ１８上のＢａｍＨＩ部位は、ＱａｃＺ
α−断片をコードしているＤＮＡ配列の一部を形成して
いるポリリンカーに含まれている。大腸菌突然変異体Ｊ
Ｍ１０３株におけるｌ２ａｃｚσ−断片の発現は、該菌
株のβ−ガラクトシダーゼ活性を回復させる。ｐＵＣ１
８にあるポリリンカーの制限酵素切断部位にＤＮＡを挿
入することは、Ｑａｃ２σ−断片遺伝子を破壊しプラス
ミドｐＵＣ１８の持つＪＭ１０３株に対する相補的能力
を失わせる。β−ガラクトシダーゼは無色の化合物Ｘ−
ＧａＱ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β
−Ｄ−ガラクトピラノシド）を加水分解して青色の生産
物を生成するので、形質転換細胞中でプラスミドｐＵＣ
１８を持つ株とｐＵＣ１８にＤＮＡが挿入された形のプ
ラスミドを保有する株とを容易に識別することができる
。

先に述べた形質転換処理菌をアンピシリン１１００ｐ／
ｍＱ、　Ｘ　−ＧａＱ　　４０　ｐｇ／ｍＱおよびＩ　
ＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシ
ド）４０μｇ／ｍ４を含有しているし一寒天（Ｌ−ブロ
スｌＱ当たり寒天１５ｇを含む）平板上に接種し、３７
°Ｃで１５時間培養した。ＩＰＴＧはプラスミドｐＵＣ
１Ｂ上の１２ａｃ遺伝子の発現を誘導する働きがある。

形質転換株の中で、プラスミドｐＵＹ−１７の如＜ＤＮ
Ａが挿入されたプラスミドを含んでいるコロニーは白色
である。アンピシリン耐性で且つ白色のコロニーを２株
分離し、保有しているプラスミドを単離した。２株とも
同一のプラスミドｐＵＹ−１７を保有していた。プラス
ミドｐＵＹ−１７の制限酵素切断点および機能地図を第
４図に示す。

プラスミドｐＵＹ−１７はストレプトマイセス属のレプ
リコンを含むので、ストレプトマイセス・リビダンスＴ
Ｋ２４を形質転換してタイロシンの４“位をアシル化す
る能力を付与することができる。

上記のプラスミドｐＵＹ−１７を制限酵素Ｅｃ。

Ｒ１で切断した後、アガロースゲル電気泳動およびＤＮ
Ａセルを用いて約９キロベースの断片を得た。その断片
約０．ｌｐｇをｌＯμａのＴ　Ｅ　／（ッファーに溶解
し、ＩＯ×ライゲーションバッファー２μＱ及び水７μ
Ｑを加え、さらにＴ４リガーゼｌμαを加えて１５°Ｃ
で１６時間ライゲーションを行ない、前述したように大
腸菌Ｋ１２ＪＭ１０３を形質転換した。

転換株よりプラスミドｐＹ−１７△Ｅｃｏを単離した。

このプラスミドはストレプトマイセス属のレプリコンを
持たず、ストレプトマイセス・リビダンスＴＫ２４を形
質転換できない。第５図に上記プラスミドｐＹ−１７△
Ｅｃｏの制限酵素切断点および機能地図を示す。

ｐｓ　８２△Ｐｓｔ、　ｐｓ　８２△Ｓａｃの組み立て
手順 実施例４に記載の方法で得られＩ＝ｐＡＯ２０７を制限
酵素Ｓ　ｐｈ　Ｉで完全に切断した後、アガロースゲル
電気泳動とＤＮＡセルを用いて８．８キロベースのＤＮ
Ａ断片約ｌμｇを得た。この断片にはプラスミドｐＩＪ
９４３の持つチロシナーゼ遺伝子の一部とａｃｙ　Ｂ遺
伝子を完全に含むＤＮＡ断片が含まれていた。このＤＮ
ＡフラグメントとｐＵＳ１８の制限酵素ｓ　ｐｈ　ｒ消
化物につき、実施例５に記載の方法に従ってライゲーシ
ョンを行った。

大腸菌Ｋ１２ＪＭ１０３株を形質転換し、アンビリノン
耐性、白色の形質転換株よりプラスミドｐＵＳ８１およ
びｐＵ　Ｓ　８２を得た。第６図および第７図にプラス
ミドｐＵｓ８１およびｐＵ　Ｓ　８２の制限酵素切断部
位および機能地図を示す。ｐＵＳ８１とｐＵ　Ｓ　８２
とでは挿入ＤＮＡの向きが逆になっていた。

得られたプラスミドｐＵＳ８２　１１１ｇを制限酵素Ｐ
ｓｔＩで切断した後、アガロースゲル電気泳動とＤＮＡ
セルを用いて５．２キロベースの７ラグメント約０．ｌ
ｐｇを得た。このフラグメントをＴＥバッファーに溶解
し、Ｔ、リガーゼを用いてセルフライゲーションを行っ
た後、実施例５に記載の方法に従って大腸菌Ｋ１２ＪＭ
１０３株を形質転換して、アンピシリン耐性、白色のコ
ロニを約２０株分離した。分離した形質転換株よりプラ
スミドを単離した。得られたプラスミドは全て同一のｐ
Ｓ　８２△Ｐｓｔであった。第８図（ａ）にプラスミド
ｐＳ８２△Ｐｓｔの制限酵素切断部位と機能地図を示す
。プラスミドｐＳ　８２へＰｓｔではａｃｙＢ遺伝子の
一部が欠失していた。

同様にして、プラスミドｐＵＳ８２を制限酵素Ｓ　ａｃ
　Ｉで切断してセルフライゲーションさせ、プラスミ）
’ｐｓ　８２へＳａｃを得た。第９図にプラスミドｐＳ
８２△Ｓａｃの制限酵素切断部位と機能地図を示す。プ
ラスミドｐＳ　８２ΔＳａｃは、ａｃｙＢ遺伝子を完全
に保持していた。

実施例７　　ａｃｙＢ遺伝子の限定 プラスミドｐＡＯＹ−１７およびｐＡＯ２０７に挿入さ
れているＤＮＡ断片中に含まれているａｃｙＢ遺伝子を
限定するために、実施例３および４に記載した方法に従
ってプラスミドｐＡＯＹ−１７およびｐＡ○２０７を調
製した。両プラスミドの挿入ＤＮＡ部分を詳細に検討し
た結果、約４キロベースのＤＮＡが共通であることが判
明した（第２図および第３図参照）。この共通ＤＮＡ領
域を有するプラスミドｐＳ８２△ＰｓＬ及びｐＳ　８２
△Ｓａｃを実施例６に記載した方法に従って調製しｔこ
　。

プラスミ　ドｐＳ　８２ΔＳａｃ　　Ｏ，５，ｕｇを１
０μ（２のＴＥバッファーに溶解し、２μＱの１ＯＸｓ
ｐｈ■／（ツフア−と制限酵素５ｐｈＩＩＯユニツトを
加え水で２０μＱとした後、３７°Ｃで４時間消化した
。反応混合液２μＱをアガロースゲル電気泳動にかけて
消化が完結していることを確認した。

一方、実施例２に記載した方法に従って調製したプラス
ミドｐＩＪ７０２　０．５μｇを全く同様にして消化し
た後、牛腸由来アルカリ７オスフアターゼで３７°Ｃ１
３０分間処理した。次いで７０６Ｃで１５分間加熱した
。これに前述したプラスミドｐＳ　８２△Ｓａｃの制限
酵素Ｓ　ｐｈ　Ｉ消化物０．１μｇを加え、フェノール
／クロロホルム処理およびエタノール沈でんを行った。

エタノールで沈でんさせたＤＮＡペレットをｌＯμＱの
ＴＥバッファーに溶解した。実施例３に記載の方法に従
ってライゲーションを行い、反応物でストレプトマイセ
ス・リビダンスＴＫ２４を形質転換した。得られた形質
転換体のタイロシンの４＃位アシル化能を調べたところ
、形質転換株は全てタイロシンの４＃位をアシル化した
。

プラスミドｐＳ　８２△Ｓａｃの場合と全く同様にして
プラスミドｐｓ　８２△ＰｓｔをプラスミドｐＩＪ７０
２のＳ　ｐｈ　Ｉ切断点へ組みこんだプラスミドを調製
し、ストレプトマイセス・リビダンスＴＫ２４を形質転
換した。形質転換株のタイロシンの４″位アシル化能を
調べたがいずれの形質転換株もタイロシンの４”位アシ
ル化能を示さなかった。

この結果から、第９図に示すプラスミドｐＳ８２△Ｓａ
ｃの制限酵素切断点および機能地図において、５ａｕ３
　Ａ　Ｉ　／　ＢｇＱＩ［からＰｓｔＩまでの領域はタ
イロシンの４″位アシル化能を付与するために必須であ
り、ａｃｙ　Ｂ遺伝子の一部と考えられる。

実施例６に記載した方法に従ってプラスミドｐＵＳ８１
を調製した。そのｌμｇをＴＥバッファーＬｏｐαに溶
解し、１ＱＸｓａｃｌバツフアー２μＱ及び制限酵素ｌ
Ｏユニットを加え水で２０μαとした後、３７°Ｃで４
時間消化した。反応液を０．８％アガロースゲルにのせ
電気泳動を行った。

約３．３キロベースのＤＮＡ断片を含むアガロースを切
り出し、ＤＮＡセルを用いて電気溶出して約０．１／７
ｇのＤＮＡ断片を得た。このＤＮＡ断片はプラスミドｐ
ＩＪ９４３のチロシナーゼ遺伝子の一部（２４０ベース
）及びｐＵＣ１８のマルチクローニングサイトの一部を
含んでいる。

この得られた約３．３キロベースのＤＮＡ断片を実施例
３に記載した方法に従ってプラスミドｐＩＪ７０２の制
限酵素Ｓ　ａｃ　Ｉ切断点へ挿入し、ストレプトマイセ
ス・リビダンスＴＫ２４を形質転換した。形質転換体は
全てタイロシンの４“位をアシル化した。形質転換体が
保持するプラスミドはやや不安定であった。

上記のごとく約３．１キロベースに限定できたａｃｙ　
Ｂ遺伝子を含むＤＮＡ断片の制限酵素切断点を決定した
（第１図参照）。第１図の制限酵素地図の作成にあたっ
ては、種々の制限酵素で単独あるいは二重に消化し消化
物をアガロースゲル電気泳動にかけ、各ＤＮＡ断片の泳
動距離を測定して大きさを測定した。アガロースゲル濃
度はＤＮＡ断片の大きさに応じて０．６％から１％の範
囲内で使用した。ＤＮＡのサイズマーカーとしてλ／Ｈ
１ｎｄＩ［ＩおよびｕＸ　ｌ　７４／Ｈａｅｍ　（共に
ニラポンジーン製）を用いた。

ａｃｙＢ遺伝子のＰｓｔｌ−５ａｃｌ断片（１，２ｋｂ
）およびＰｓｔｌ−３ｐｈｌ断片（２，１ｋｂ）を大腸
菌ベクターｐＵＣ１８にサブクローニングし、各々の断
片をもつプラスミドｐＭＡＢ７　Ｃ第８図（ｂ））とｐ
Ｓ８２△Ｐｓｔ（実施例６参照）を得た。そして、この
２つのプラスミドあるいはそれらのプラスミドから特定
の領域を欠失させてできた新たなプラスミドをＤＮＡ塩
基配列決定用に用いた。ここで欠失の方法として、ベク
ター側の適当なりローニングサイトとａｃｙ　Ｂ断片側
の適当な制限部位間で欠失を起こさせる方法を用いた。

例えば、ｐｓ８２△ＰｓｔのＮ　ｃｏ　１部位から配列
決定をするのに都合のよいプラスミドを構築するために
以下に示す方法を用いて欠失プラスミドを構築し　Ｉこ
　。

ｐｓ８２△Ｐｓｔ（５μｇ） ↓ エタノール沈でん ７０％エタノール洗浄 ↓ ＴＥバッファー２３μＱに溶解 ３７°Ｃ１１５分間 ↓ ７０°０，１０分間 ↓ フェノール時クロロホルム抽出 ↓ エタノール沈でん ７０％エタノール洗浄 ↓ ＴＥバッファー５０μＱに溶解（０，１μｇ／μＱ）■ ２μＱ　　（０，２μｇ）前述のＤＮＡ溶液１５μＱＨ
２０ ２μ４．ＩＯＸライゲーションバッファー［０，５Ｍト
リス塩酸（ｐＨ８，０）、Ｏ，１ＭＭｇＣＯ２，０，２
Ｍ　　ＤＴＴ、　　１０ｍＭＡＴＰ］ ｌｐＱ　　（５００ｕ）Ｔ４ＤＮＡリガーゼにツポンジ
ーン製） １１６°Ｃ，１５時間 反応液ｌＯμＱを大腸菌コンピテントセル（ＪＭ１０３
株）１００μＱに添加 形質転換株よりプラスミドを抽出し、電気泳動にて目的
クローンを選択する。

さらに別の欠失方法として、エキソヌクレアーゼ■、ｓ
ｔヌクレアーゼでＤＮＡ断片を特定の末端より反応時間
依存的に徐々に分解することにより配列決定に都合のよ
い一部重複域をもつ連続した一連の欠失プラスミドを得
た。例えば、ｐＭＡＢ７断片中Ａｐａｌより削り込んだ
一連の欠失プラスミドは次のようにして得た。

４０ｐＱ、（１０ｕｇ）ｐＭＡＢ７　　Ｐｓｔ−Ａｐａ
Ｉ断片 ５μＱＩＯ×エキソヌクレアーゼＩＩＩ　［０，５Ｍト
リス・ＨＣＱ　（ｐＨ８，０）、５０ｍＭ　　ＭｇＣＯ
２，０，１Ｍメルカプトエタノール１ ５μＱ　　（２５ｕ）エキソヌクレアーゼ■にツポンジ
ーン製） ■　２μｆ２８２０ ２μＱ　ｌ０ＸＳＩヌクレアーゼバツフアー［０゜３３
Ｍ酢酸ナトリウム、０．５Ｍ　　ＮａＣＱ。

３０ｍＭ　　Ｚｎ５Ｏ４（ｐＨ４−５）］ｌｐＱ　　（
２ｕ）Ｓｔヌクレアーゼ（ベーリンカーマンハイム製） ｌ　μａ　　０．２Ｍ　　　ＥＤＴＡ フェノール・クロロホルム抽出；エタノール沈でん、７
０％エタノール洗浄 ↓ ２３μＱのＴＥに溶解 以下、Ｋ　ｌｅｎｏｗフラグメントによる反応から前述
と同じ方法による。

このようにサブクローン化して得られる２つのプラスミ
ドおよびそれら由来の欠失プラスミドをアルカリ変性に
より一本鎖ＤＮＡとし、−回の反応に１〜２μｇの変性
ＤＮＡをシーフェンスの鋳型ＤＮＡとして用いた。この
方法としては版部らの方法［Ｈａｔｔｏｒｉ、Ｍ、　＆
　５ａｓａｋｉ、Ｙ、：　Ａｎａｌ。

Ｂ　ｉｏｃｈｅｍ、　　１５２　、２３２−２３８　（
１９８６）参照１に従った。シーフェンスの方法は基本
的にはサンガーのｄｉｄｅｏｘｙ鎖末端法［Ｓ　ａｎｇ
ｅｒ　、　Ｆ　、ｅｔａｌ：Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　
　ｏｆ　　ｔｈｅ　　Ｎａｔｉｏｎａｌ　　Ａｃａｄｅ
ｍｙ　　ｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓ　Ｕ、Ｓ、Ａ、、７４．
５４６３　５４６７（１９７７）参照］に従った。すな
わち、シーケネースキット（Ｕ　ｎ１ｔｅｄ　Ｓ　Ｌａ
ｔｅｓ　Ｂ　ｉｏｃｈｅｍｉｃａｌＣｏｒｐｏｒａｔ　
ｉｏｎ製）およびＣａ−”Ｐｌ　　ｄＣＴＰ（Ａ　ｍｅ
ｒｓｈａｍ）を用いてａｃｙＢ遺伝子をコードする領域
を含むＤＮＡ塩基配列を決定した。そのＤＮＡ塩基配列
を第１０図に示す。

決定された塩基配列をもとにオープン　リーディングフ
レーム（ＯＲＦ）を調べた。Ｍ、Ｊ、Ｂｉｂｂらの報告
［Ｍ、Ｊ　、Ｂ　ｉｂｂ　ｅｔ　ａｌ、ジーン（Ｇ　ｅ
ｎｅ）　。

３０巻、１５７〜１６６頁（１９８４）］に従って検討
した結果、配列の中央部から５ａｕ３Ａｒ末端に向かう
ＯＲＦとＳ　ｐｈ　Ｉ末端へ向かうＯＲＦを見い出した
。これら２個のＯＲＦを各々ａｃｙＢ　ｌ、ａｃｙＢ２
と命名した。ａｃｙＢ　１は第１Ｏ図の１２４５番目の
ＡＴＧから始まり８１番目のＴＡＧに終るＯＲＦであり
、ａｃｙＢ　２は１５６９番目のＧＴＧまたは１６０８
番目のＡＴＧより始まり２７３０番目のＴＧＡに終るＯ
ＲＦと決定された。第１１図（ａ）にａｃｙＢ　ｌ　、
第１１図（ｂ）にａｃｙＢ　２のＤＮＡ塩基配列および
アミノ酸配列を示す。

の生産性 ストレプトマイセス・リビダンスＴＫ２４を実施例３の
方法に従ってプラスミドｐＡＯ２０７で形質転換させた
。得られた形質転換体の培養は以下のごと〈実施した。

形質転換体をチオベプチン５０μｇ／ｍＱを含むＧＹＭ
寒天斜面培地（グルコース０．４％、酵母エキス０．４
％、麦芽エキス１％及び寒天１．５％、ｐＨを６．８に
調製）に接種し、生育した形質転換体−白金耳を２５ｍ
（２の種母培地（２％溶性でん粉、２％大豆粉、０．１
％酵母エキス、０．１％に２ＨＰＯい０．０５％Ｍｇ５
Ｏ，・７Ｈ２０及び５μｇ／ｍＱチオペプチン）に接種
し、２８°Ｃで４８時間振とう培養した。

調製した種母１ｍ（２を３０μｇ／ｍ１２のチオペプチ
ンを含む５０ｍＱの生産培地（ガラクトース４％、大豆
粉２％、酵母エキス０．１％、ＫＨ，Ｐｏ。

０．０５％及びＭｇＳ　Ｏ、・７Ｈ，ＯＯ，０５％）に
接種し、２８°Ｃで４８時間培養した。そこへ、タイロ
シンとＬ−ロイシンの混合溶液を終濃度がそれぞれ１０
００μｇ／ｍａおよび４００ｐｇ／ｍＱとなるように加
え、２８°Ｃでさらに４８時間培養を継続した。培養終
了後、発酵ブロスのｐＨを０．１ＭのＮａ５ＰＯ＋で９
．０とし、等量のトルエンで抽出した。トルエン層２０
μＱをシルカゲルＴＬＣプレート　［メルク（Ｍｅｒｃ
ｋ）社製、Ａｒｔ５７１５］にスポットし、酢酸エチル
ｌ　５０　ｍＱ、ジエチルアミ７３　ｍＱ、メタノール
１．５ｍ（１＋及び水３ｍ＋２からなる溶媒で展開した
。風乾して溶媒を除去した後、ＴＬＣ−クロマトスキャ
ナＣ５−９２０（ＴＬＣ５ｃａｎｎｅｒ　　ＣＳ　−９
２０、高滓製作所製）で生成したアシル化タイロシンを
測定した。下記第１表にその結果を示す。

第１表 リビダンスＴＫ２４ 同上　　　ｐＩＪ９４３　　０ 同上　　　ｐＡＯ２０７１，２５ ＡＴＣＣ１１４１６ 本ストレプトマイセス・サーモトレランスＡＴＣＣ１１
４１６に対する相対量で示した。

プラスミドを保有していない株の培養は、チオペブチン
を含まない種母培地および生産培地を用いて行なった。

実施例ＩＯ本発明の遺伝子ａｃｙ　Ｂ含をＤＮＡ断片実
施例１および４に記載の方法に従って、プラスミドｐＡ
Ｏ２０７を含むストレプトマイセス・リビダンスＴＫ２
４およびストレプトマイセス・サーモトレランスＡＴＣ
Ｃ１１４１６を培養し、各々菌体を調製した。得られた
菌体的ｌｏｇをＴＥＳバッファ　　（０，２５Ｍ、ｐＨ
７，２）２０ｍＱに懸濁した。氷水浴中で、トミー精工
製超音波破砕機ＵＲ２００−Ｐ型を用いて８０Ｗ、５分
間処理した。遠心分離（１４，０００ｒｐｍ、　３０分
間）して上溝を調製し、得られた上溝中のタイロシン４
＃位アシル化酵素活性と測定した。上清中のたん白１％ 量はＵＶ、２８０ｎｍの吸収（Ｅｌ。ｍ−１０，０とし
て計算した）で測定した。活性測定条件は下記のとおり
であった。

粗酵素液　　５０μＱ ＴＢＳバッファー（０，２５Ｍ　ｚｐＨ７，２）　ｌ　
３０μＱ タイロシン（ｌｏｍＭ　）　　ｌＯｐ　Ｑインバレリル
ＣｏＡ　（ｌｏｍＭ）　ｌ　ＯｐＱ３０°Ｃ，１時間イ
ンキュベーション。

反応終了後２０μＱの１ＮＮａＯＨを加え、５０μＱの
トルエンで抽出した。２０μＱのトルエン抽出物をシリ
カゲルＴＬＣプレートヘスボットし、実施例８に記載し
た方法によって生成したアシル化タイロシンを測定した
。下記第２表に結果を示す。

第２表 リビダンスＴＫ２４ 同上 ＩＪ９４３ 同上 ＡＯ２０７ １，５ ＡＴＣＣ１１４１６ ＊比活性はｕｎｉｔ／ｍｇたん自として算出し、ストレ
プトマイセス・サーモトレランスＡＴＣＣ１１４ｌ６に
対する相対値で表した。また、１ｕｎｉｔは生成アシル
化タイロシンｎｍｏｉ２ｅ／　１時間とした。

の生産 （Ａ）　　ｐ　ｒ　Ｊ　３５０の調製 プラスミドｐＩＪ７０２のＤＮＡ２／７ｇをＢｃＱバッ
ファー［トリス−ＨＣＱ　　（ｐＨ７，５）１０ｍＭ、
ＭｇＣＱｚ　７ｍＭ、ＮａＣ（２６０ｍＭ及び２−メル
カプトエタノール７ｍＭ］５０μＱに溶解し、制限酵素
Ｂｃ４１　（ＴＯＹＯＢＯ製）を２ｕｎｉｔｓ加え、５
０°Ｃ，５分間部分消化を行った。

フェノール／クロロホルム処理後エタノール沈でんによ
り精製を行った。このＤＮＡをライゲーションバッファ
ー５０μＱに溶解し、Ｔ４リガーゼにツポンジーン製、
５００ｕｎｉｔｓ／　ｐＱ　）　２　ｐＱを加え、１６
℃で１５時間反応を行った。反応終了後エタノール沈で
ん操作を行いＴＥバッファー１００μＱに溶解した。

つぎに、ストレプトマイセス・リビダンスＴＫ２４のプ
ロトプラストを実施例３と同じ方法により調製し、前述
のｐＩＪ７０２のＢｃＱ１部分消化物を用いて実施例３
と同じ方法で形質転換を行った。これよりチオペプトン
（５０μｇ／ｍ（２）耐性で且つメラニン色素非生産性
のコロニーを選択し、そのプラスミドを抽出、精製し、
ｐＩＪ３５０　（４，１ｋｂ）が得られた。

（Ｂ）　　ｐＭＡＢＩの構築 放線菌のプラスミドｐＴＪ３５０に大腸菌プラスミドｐ
ＵＣ１８を連結し、ｐ　Ｉ　Ｊ　３５０にマルチクロー
ニングサイトを導入した。

まず、ｐＩＪ３５０　２μｇをＰｓｔｌバッファー　［
Ｔｒｉｓ−ＨＣＱ　　（ｐＨ７，５）２０ｍＭ、ＭｇＣ
ＬＩＯｍＭ及びＮａＣＱ　１５０ｍＭ］　５０ｐＱに溶
解し、制限酵素Ｐｓｔｌにツポンジーン製、２０．００
０ｕｎｉｔｓ／ｉＱ）　　ｌ　ｐＱを加えて３７°Ｃ１
４時間反応を行った。エタノール沈でん操作を行い蒸留
水５０μαに溶解した。別に、ｐＵＣ１８のＨｉｎｃ　
Ｕ　（Ｓａ１２　Ｉ）制限酵素サイトを８ｇ１２Ｉ［サ
イトに改変したプラスミド（ｐＵＣ−Ｂｇ）２μｇをＰ
ｓｔバッファー５０μｇに溶解し、制限酵素Ｐｓｔｌを
２０　ｕｎｉｔｓ加えて３７°Ｃ１４時間分解した。エ
タノール沈でん操作により精製し蒸留水５０μＱに溶解
した。両者のＤＮＡ溶液を混合し、ｌＯ倍濃度のりガー
ゼバッファーｌＯμα及びＴ４リガーゼｌ　、０００ｕ
ｎｉｔｓを加え、１６°０１２０時間反応を行った。エ
タノール沈でん処理によりＤＮＡを精製し、最後に沈で
んをＴＥバッファー５０μαに溶解した。この溶液ｌＯ
μＱを用いて、実施例５に示した方法により大腸菌に−
１２ＪＭ１０３株を形質転換した。アンピシリン耐性で
あり且つＩ　ＰＴＧ誘導条件下Ｘ−ｇａ１２プレート上
で白色の形質転換体のプラスミドをしらべ、プラスミド
ｐＵＣ−ＢｇのＰｓｔＩ部位にプラスミドｐＴＪ３５０
のＰｓｔｌ開裂フラグメントが連結されたプラスミドｐ
ＵＪ　３５０　（６，８ｋｂ）を得ることができた。

つぎに、実施例６で示したプラスミドｐＵＳ８１のＤＮ
Ａ１５μｇをＳ　ａｃ　１バツフｙ　　［ｌＯｍＭＴｒ
ｉｓ−ＨＣｆｆ　　（ｐＨ７，５）　、７ｍＭ　　Ｍｇ
ＣＱｚ、２０ｍＭ２−メルカプトエタノール及び１００
μｇ／＋ＩＩＱ牛血清アルブミン］５０μＱに溶解し制
限酵素５ａｃＩにツボンジーン製、ｌ　５　ｕｎｉｔｓ
／ｍＱ）２．５μＱを加え、３７°Ｃで４時間消化した
。

反応液を０．８％アガロース電気泳動により分離し、約
３．３ｋｂのＤＮＡ断片を含むアガロースを切り出し、
ＤＮＡセル（第−化学薬品製）に入れて電気泳動により
ＤＮＡを溶出回収した。エタノール沈でん処理後、ＴＥ
バッファー５０μＱに溶解した。この溶液２０μａと前
述したｐＵＪ　３５０のＳ　ａｃ　Ｉ分解ＤＮＡ断片２
ｐｇとを混合し、１０倍濃度のライゲーションバッファ
ー１０μＱとＴ４リガーゼにツポンジーン製、５　Ｑ　
Ｑ　ｕｎｉｔｓ／μｍ２）４μＱおよび蒸留水７０μα
を加え、１６°Ｃで１５時間反応を行った。反応終了後
エタノール沈でん操作を行い、ＴＥバッファー１００μ
ａに溶解した。このＤＮＡ溶液２０μＱを用いて大腸菌
に一１２ＪＭ１０３株を実施例５で示した方法により形
質転換した。アンピシリン（５０μｇ／ｍ１２）耐性コ
ロニーのもつプラスミドをしらべることにより、ｐＵＪ
３５０のＳ　ａｃ　１部位にａｃｙ　Ｂ遺伝子を含むＤ
ＮＡ断片を挿入連結したプラスミドｐＭＡＢ１が得られ
た。以上のプラスミド構築の工程を第１２図に示す。

（Ｃ）　　ｐＭＡＢ　ｌのＳ　、１ｉｖｉｄｕｎｓへの
導入及びマクロライドの変換 ストレプトマイセス・リビダンスＴＫ２４を実施例３の
方法に従ってプラスミドｐＭＡＢＩにより形質転換した
。得られた形質転換体の培養は以下のごと〈実施した。

形質転換体をチオペプチン５０μｇ／ｍＱを含むＧＹＭ
寒天斜面培地（グルコース０．４％、酵母エキス０．４
％、麦芽エキス１％及び寒天１．５％、ｐＨを６．８に
調製）に接種し、生育した形質転換体の一白金耳を２５
ｍＱの種母培地（２％可溶性でん粉、２％大豆粉、０゜
１％酵母エキス、０．１％に、ＨＰＯい　０．０５％Ｍ
　ｇ　Ｓ　Ｏ４・７　Ｈ２０及び５ｐｇ／ｍＱチオペプ
チン）に接種し、２８°Ｃで４８時間振とう培養した。

調製した種母１ｍ１２を３０μｇ／ｍＱのチオペプチン
を含む５０ｍＱの生産培地（ガラクトース４％。

大豆粉２％、酵母エキス０．１％、ＫＨ，Ｐｏ。

０．０５％及びＭｇＳＯ４・７Ｈ２００，０５％）に接
種し２８°Ｃで４８時間培養した。この培養液に４“−
ＯＨ型のマクロライドであるタイロシン、スピラマイシ
ン、アンゴラマイシン、ロイコマイシンＵ１０イコマイ
シンＶまたはデルタマイシンＸを２００μｇ／ｍＱとな
るように加え、さらにＬ−ロイシンを２００μｇ／ｍＱ
となるように加え、２８°Ｃでさらに４８時間培養を継
続した。培養終了後、発酵液のｐＨを０．１ＭのＮａ、
ＰＯ。

で９．０とし、当量のトルエンで抽出した。トルエン層
２０μＱをシリカゲル薄層プレート（メルク［Ｍｅｒｃ
ｋ１社製、Ａｒｔ５７１５）にスポットし、各展開剤で
展開した。展開剤組成は次のとおりであった。

（１）　　ｎ−ヘキサン３Ｑｍ１２．アセトン１０ｍＱ
。

メタノール］ｍＱ、ベンゼン２５＋ＩＩＱ及び酢酸エチ
ル２０１１１α； あるいは （２）　ベンゼン８５＋＋＋２１メタノールＬＯｒｘＱ
及びトルエン５＋ｌＱ： あるいは （３）　ベンゼン５０＋ＩＱ及びアセトン５Ｑ＋＋＋Ｑ
展開後風乾して溶媒を除去した後、ＴＬＣクロマトスキ
ャナーＣ５−９３０（高滓製作所）で分析した。各抗生
物質の４’−ＯＨ体および４“−〇−インバレリル体の
移動度（Ｒｆ）は次のとおりである。

０内にＲｆ値を示す。

タイロシン（０，２２）　、４“−〇−イソバレリルタ
イロシン（０，４９）； スピラマイシンＩ（０，０５７）、４′−〇−インバレ
リルスピラマイシンＩ　（０，２５）；アンゴラマイシ
ン（０，２６）、４“−〇−インバレリルアンゴラマイ
シン（０，５１）；以上は展開溶媒（１）を使用した。

ロイコマイシンＵ　（０，１２）　、４“−イソバレリ
ルロイコマイシンＵ　（０，６５）；ロイコマイシンＶ
（０，０８）、４“−イソバレリルロイコマイシンＶ（
０，５０）；以上は展開溶媒（２）を使用した。

デルタマイシンＸ　（０，２０）　、４＃−イソバレリ
ルデルタマイシンＸ　（０，７０）；以上は展開溶媒（
３）を使用した。

（Ｄ）　　ｌ）ＭＡＢＩによる形質転換ストレプトマイ
セス・フラデイエＡＴＣＣｌ　９６０９のスラント培養
物の一白金耳量をＧＰＹ培地（グルコース１．０％、ポ
リペプトン０．４％、酵母エキス０．４％、Ｍ　ｇ　Ｓ
　０４　’　７　Ｈ！　ＯＯ−０５％、Ｋ　ｚ　ＨＰ　
Ｏ４０−１％及びグリシン０．０５％、ｐＨ７，２）２
０ｍ＋２を入れた２５０ｍ＜２容三角フラスコに接種し
、２８°０１４８時間振とう培養した。この培養液０．
５＋＋ｌαを実施例３に示すＹＥＭＥ＋１５％シューク
ロース培地（５ｍＭのＭｇＣＱ２および０．５％のグリ
シンを含む）２５ｍＱを入れたスプリング入り２５０ｍ
（２三角フラスコに接種し、２８℃で４０時時間上う培
養した。

遠心分離（３，００Ｏｒｐｍ、１５分間）により菌体を
集め、ｌＱｍ１２のｌ０１３％シュークロースで洗浄し
た後、１ｍｇ／ｍＱのリゾチームを含んだＰ培地４ｍＱ
によく懸濁し、３０°Ｃで１時間反応を行った。Ｐ培地
の組成は実施例３に示したとおりである。反応後締ろ過
により残っている菌糸を除去し、遠心分離（３，００Ｏ
ｒｐｍ、１０分間）によりプロトプラストを集め３ＸＩ
Ｏ’個／１００μＱとなるようにＰ培地に懸濁した。こ
れに前述したｐＭＡＢ　ｌ溶液（１５μｇ／１０μＱ）
１０μＱを加え、２５％ＰＥＧ１００Ｏ［ＢＤＨケミカ
ル（Ｃｈｅｍｉｃａｌ）社製１の存在下で形質転換を実
施した。形質転換を行ったプロトプラストをＰ培地で洗
浄した後、ＩｍＱのＰ培地に再懸濁した。そのＱ　、　
ｌ　ｍＱをＲ３培地（シュークロース１３．５ｇ５ＫＣ
Ｑ　０．０５％、グルコース１．０ｇ１ポリペプトン０
．４ｇ１酵母エキス０．４ｇ、ＴＥＳバッファー０．５
７３ｇ、ｔｏ％ＭｇＣ（２゜溶液６．ＩｍＱ、バント・
アガー２．０ｇ及び蒸留水１００＋ｎＱ；オートクレー
ブ滅菌後ＫＨ，ＰＯ。

（０，５％）１．ｏｍｆｆ　、ＣａＣｆ２ｇ（５Ｍ）Ｏ
−３ｍＱ及びＮａＯＨ（ｌＮ）１．８ｍ（２を添加する
）上へ接種し、２８°Ｃで１６時間培養した。培養後、
チオペプチンの終濃度が５μｇ７ｍ（ｌまたは２５μｇ
／ｍＱとなるようにチオペプチンを含有する軟寒天培地
を重層して２８°Ｃでさらに７日間培養した。軟寒天培
地はニュートリエンドブロス（Ｎｕｔｒｉｅｎｔ　ｂｒ
ｏｔｈ）　８　ｇ及びバント・アガー３ｇに蒸留水１１
２を加え、１２０°Ｃ１１５分間オートクレーブ滅菌を
行った。

チオペプチン５μｇ／ｍＱの培地上には多数のコロニー
が現われたが、２５μｇ１ｍＱ上では耐性コロニーは少
なかった。２５μｇ／ｍＱに耐性を示した１株をストレ
プトマイセス・７ラジ工ＭＡＲ−０１株と名付け（以下
、ＭＡＲ−０１株と称す）生産試験を行った。

生産用培地（可溶性でんぷん０．５％、グルコース０．
５％、酵母エキス０６５％、麦芽エキス１゜０％及びチ
オペブチン５μｇ／ｍＱ　）　５０ｍＱを含むコイル入
り２５０ｍｆ２容三角フラスコにＭＡＢ０１株を一白全
耳接種し、２８°Ｃで２１日間振とう培養した後１ｎＱ
をとり、Ｋ　２　ＨＰ　Ｏ４０−２ｇ及びトルエン０．
２ｍＱを加え、激しく撹拌抽出した。遠心分離（３，Ｏ
ＯＯｒｐｍ、１０分間）により上層のトルエン層をとり
、薄層クロマトグラフィーを行った。薄層プレートは［
メルク（Ｍｅｒｃｋ）社製］Ａｒｔ５７１５を用い、展
開溶媒は酢酸エチル７５ｍＱニジエチルアミン１．５ｍ
（２：水１゜５ｍｆ２：メタノール０．７５ｍＱを用い
た。このプレートを乾燥後波長２８０ｎｍにおいてクロ
マトスキャナー（高滓製作所製ａｓ−９３０）により分
析し、さらに１０％Ｈ２ＳＯ４浸漬後、１０５°Ｃ１５
分間加熱発色することにより位置を確認した。

タイロシンはＲｆ（相対移動度）値が０．６２であり、
形質転換体による生産物は、タイロシンの外に、Ｒｆ−
０，６９の４“−アセチルタイロシン、Ｒｆ−０，７４
の４“−プロピオニルタイロシン、Ｒｆ−０，７７の４
“−イソバレリルタイロシンが認められた。

プラスミドｐＭＡＢＩ）こよる形質転換を行わない対象
株ではアシル化タイロシンの生産は認められなかった。

（Ｅ）　４“−イソバレリルタイロシンの確認上述の生
産用培地ｌαの培養液（５０＋＋＋Ｑ入り培地２０本培
養）より、ｐＨ８，５において酢酸エチルで抽出操作を
行い、酸性水（０，０１ＮＨＣＱ）２００ｍ１２に転溶
後再びｐ　Ｈ８，５とし、酢酸エチル５０ｍＱで抽出し
た。この抽出液をｌＯｍＱに濃縮し、薄層プレート（メ
ルク　［Ｍｅｒｃｋ１社製Ａｒｔ５７１５）　５枚に各
２ｍＱを帯状にスポツティングし、上述の展開溶媒で展
開しＩ；。風乾後Ｒｆ−０，７７のスポット部分のシリ
カゲルを削りとり、アセトンｌＯｍＱで抽出した。抽出
液を真空蒸発濃縮器にて蒸発乾固し、４ｍｇの白色粉末
が得られた。この物質について物理化学的性状をしらべ
た結果を次に示す。

分子量：９９９（ケミカル・インパクト質量分析により
脱水イオンビーク９８２が得 られた） 旋光度［σｌ？Ｔ３（ｃｌ、ｏＳＭｅＯＨ）：　　５０
．８紫外部吸収ピークλＥｔ０Ｈ（Ｅ１％）：　２８２
（２１７）ｍａｘ　　　１ｃｍ ’Ｈ−ＮＭＲ（δ、　　ｐｐｍ）　　：０．９７　　（
ＯＣＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２）　　。

１．８　　（１２−ＣＨ３）、２．２８（○ＣＣＨ２Ｃ
Ｈ（ＣＨ３）２）、２−５（Ｎ（ＣＨ，）２）、３．５
（３“−ＯＣＲ、）。

３．６（２”’−ＯＣＨ，）、４．１５（旧′）。

４．５５（Ｈ１’〜）、４．６０　（Ｈ４“）。

５．０５（Ｈ１″）、　　５．９５　　（Ｈｌ　３）。

６．２５　　（Ｈ１０）、　　７．３　　（Ｈｌ　　１
）　。

９．７　　（ＣＨＯ）　。

第１３図に’Ｈ−ＮＭＲの図を示す。

以上の結果を文献値［Ｒ，○ｋａｍｏｔｏ　ｅｔ　ａｌ
、　ニザ・ジャーナル・オブ・アンティビオティクス（
ＴｈｅＪ　ｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ
ｓ）　３３巻、１３００〜１３０８頁（１９８０）］　
と比較して４″−〇イソバレリルタイロシンと決定され
た。

つぎに、前述の薄層プレート上Ｒｆ−０，６９の部分の
シリカゲルを削りとり、上述と同じ方法でアセトン抽出
、濃縮、乾固を行った。白色粉末４．５ｍｇが得られ、
その物理化学的性状をしらべ　ｌ二　。

分刊１９５７ 旋光度［α］Ｗ　（ｃ　ｌ　、０、ＭｅＯＨ）：　−５
０，５紫外部吸収ビークλＥｔ０Ｈ（Ｅ　１９Ａ）　：
　２８３（２１８）ｍａｘ　　　　１ｃｍ ’Ｈ−ＮＭＲ（δ＋　　ｐｐｍ）　　：１．８　　（１
２−ＣＨ，）、　　２．１　３（−ＣＯＣＨ３）、　　
２．５（Ｎ（ＣＨ３）２）。

３．５（３“−〇ＣＨ３）、３．６３（２’″０ＣＨ３
）、　　４．２　　（Ｈ１’）、　　４．５２（Ｈｌ”
’）、　　４．５７　　（Ｈ４”）、　　５．０５（Ｈ
ｌ“）、　　５．９　　（Ｈｌ３）、　　６．２３（Ｈ
ｌ　　Ｏ）、　　７．３　　（Ｈ１１）　　、　　９．
７（ＣＨＯ）　　。

第１４図に’Ｈ−ＮＭＲの図を示す。

以上の結果よりこの物質は４“−〇−アセチルタイロシ
ンであることが確認された。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の遺伝子ａｃｙＢを含むＤＮＡ断片の制
限酵素地図であり、 第２図はプラスミドｐＡＯＹ−１７の制限酵素切断点及
び機能地図であり、 第３図はプラスミドｐＡＯ２０７の制限酵素切断点及び
機能地図であり、 第４図はプラスミドｐＵＹ−１７の制限酵素切断点及び
機能地図であり、 第５図はプラスミドｐＹ−１７△Ｅｃｏの制限酵素切断
点及び機能地図であり、 第６図はプラスミドｐＵｓ８１の制限酵素切断点及び機
能地図であり、 第７図はプラスミドｐＵ　Ｓ　８２の制限酵素切断点及
び機能地図であり、 第８図（ａ）及び（ｂ）はそれぞれプラスミドｐＳ　８
２△Ｐ　ｓｔ、プラスミドｐＭＡＢ７の制限酵素切断点
及び機能地図であり、 第９図はプラスミドｐＳ　８２△Ｓａｃの制限酵素切断
点及び機能地図であり、 第１Ｏ図はａｃｙ　ＢのＤＮＡ塩基配列であり、第１１
図（ａ）及び（ｂ）はそれぞれａｃｙＢ　１およびａｃ
ｙＢ　２の塩基配列、アミノ酸配列を示す図であり、 第１２図はプラスミドｐＭＡＢＩの構築工程を示す図で
あり、 第１３［ｆｆｌは４“−〇−インバレリルタイロシンの
’Ｈ−ＮＭＲの図であり、 第１４図は４“−〇−アセチルタイロシンの”Ｈ−ＮＭ
Ｒの図である。 第１図 第３図 第４図 第５図 第７図 ｐｈＩ 第６図 ｐｈ　ｌ ５ａｕｊＡＩ／Ｂｃ）ＩＩ［ 第８図 鍬） ｓｔ　Ｉ 第１０図　ｆの１ ＧＡＴＣＡＣＡＣＴＣ ＴＣＣＡＣＧＧＧＣＧ ＣＧＧＣＧＡＧＧＧＣ ＣＣＧＧＴＣＧＴＣＣ ＡＣＧＧＡＧＴＧＣＣ ＧＧＴＴＣＧＧＡＣＣ ＧＣＣＧＧＣＧＴＣＣ ＧＣＧＧＣＣＧＴＣＣ ＡＴＧＡＣＣＧＧＣＴ ＧＡＡＧＴＧＣＡＧＧ ＧＣＣＣＣＡＧＣＧＣ ＧＣＧＡＧＣＡＧＧＧ ＧＧＣＧＧＣＣＧＧＴ ＧＣＣＧＧＴＡＡＴＡ ＣＣＧＣＣＧＧＣＧＡ ＧＴＡＣＴＧＧＡＴＧ ＧＣＡＣＧＡＧＧＴＡ ＧＴＧＡＧＴＴＣＣＣ ＣＡＴＣＧＴＣＣＴＧ ＡＧＧＡＧＣＧＧＡＣ ＴＴＣＧＡＧＧＡＡＣ ＣＴＧＡＣＧＣＡＣＧ ＧＣＧＣＣＣＣＧＣＡ ＣＧＣＧＴＣＧＧＣＴ ＧＧＡＣＧＧＧＧＣＧ ＴＧＧＧＴＧＴＣＧＡ ＧＧＧＧＡＣＣＧＣＣ ＣＡＧＧＧＴＴＣＧＣ ＴＣＴＣＣＡＣＧＡＡ ＡＡＣＧＣＣＧＡＣＡ ＣＡＧＣＧＴＧＡＡＧ ＴＣＡＧＣＣＣＧＡＣ ＧＴＧＴＣＣＣＡＣＴ ＧＣＣＣＴＧＣＴＴＣ ＡＧＣＧＧＴＧＣＣＣ ＡＴＣＡＧＧＴＡＧＴ ＧＡＡＧＧＣＧＡＡＧ ＣＣＡＧＣＡＧＣＡＣ ＧＴＣＣＣＣＡＧＣＣ ＧＣＣＧＣＧＣＡＣＡ 第１０図 ＴＣＡＣＣＧＡＣＧＧ ＧＡＧＣＡＧＣＡＧＣ ＧＧＡＣＧＧＴＣＡＡ ＴＣＧＴＡＧＴＧＧＴ ＧＡＡＣＧＴＣＡＣＣ ＣＴＧＡＧＡＡＣＡＧ ＧＣＣＡＧＧＧＧＡＣ ＣＣＡＧＣＧＴＣＣＣ ＴＣＴＧＧＧＣＣＡＴ ＡＧＣＡＣＧＡＡＣＴ ＣＡＣＣＧＧＣＧＧＧ ＴＧＡＡＣＣＡＣＣＡ ＧＧＣＡＴＧＴＣＣＧ ＣＡＧＧＧＧＣＧＧＧ ＧＣＡＧＣＡＧＴＧＣ ＡＴＧＧＡＧＡＣＧＧ ＣＡＣＣＧＣＧＧＣＧ ＡＧＡＧＣＣＧＧＴＣ ＴＴＧＧＴＧＡＡＧＡ ＧＡＡＣＧＧＧＡＡＣ イの２ ＣＣＡＣＣＧＡＧＧＣ ＧＣＧＡＴＣＡＣＣＧ ＣＧＣＧＣＣＧＧＧＧ ＴＣＧＧＣＡＣＣＧＣ ＧＣＧＡＡＣＡＣＣＧ ＣＧＣＧＡＣＧＣＡＧ ＧＣＧＧＧＣＣＣＣＴ ＣＧＧＡＴＣＡＣＧＡ ＧＡＧＣＡＴＣＣＣＧ ＣＣＡＧＣＡＧＣＣＧ ＡＡＣＡＴＧＴＡＧＡ ＣＣＧＣＡＧＣＴＧＣ ＧＧＴＣＣＣＡＣＧＧ ＣＴＧＧＣＣＧＧＣＡ ＧＡＣＣＡＧＧＧＧＧ ＣＧＧＣＣＡＣＧＧＡ ＧＣＣＣＡＣＣＧＣＣ ＣＧＴＡＣＧＧＡＣＣ ＡＧＧＣＧＡＡＧＡＧ ＡＴＧＧＣＧＴＡＧＡ 第（０図　イＱ３ ＡＧＡＡＣＡＧＣＴＣ ＧＡＣＣＡＣＧＣＣＡ ＧＣＴＧＣＣＧＴＡＣ ＣＧＧＧＧＡＡＣＣＡ ＡＧＣＡＧＣＡＧＧＴ ＴＣＣＧＴＣＣＣＡＣ ＣＣＡＴＧＴＴＧＧＧ ＧＣＣＡＧＣＡＣＧＡ ＣＡＣＣＡＧＣＡＧＣ ＧＣＡＧＣＧＡＧＴＡ ＧＴＧＣＧＣＣＧＣＣ ＣＡＣＣＴＴＧＧＡＣ ＧＡＣＣＣＧＣＣＣＡ ＡＡＡＣＣＧＣＴＧＡ ＧＡＡＣＧＡＧＡＣＣ ＣＣＡＧＣＣＧＧＴＴ ＴＧＣＡＧＣＧＣＧＧ ＧＧ丁ＧＴＴＣＴＴＧ ＧＴＧＴＣＧＡＴＡＴ ＡＡＴＡＣＣＡＧＴＡ ＧＣＡＧＧＡＧＡＧＣ ＣＣＧＧＧＴＴＣＡＴ ＴＣＧＴＧＧＴＧＧＴ ＴＧＣＣＴＧＧＡＴＣ ＴＣＧＴＧＡＧＣＡＧ ＡＣＣＧＡＴＣＧＧＣ ＣＴＣＧＴＴＧＡＧＧ ＴＣＡＧＣＡＧＣＧＴ ＡＣＧＧＧＣＡＧＧＴ ＣＧＣＧＣＧＧＡＣＣ ＧＣＣＡＧＡＡＧＴＴ ＴＴＧＴＣＧＧＧＣＡ ＧＧＴＧＡＧＧＡＣＧ ＧＣＡＴＧＡＡＧＡＡ ＧＴＣＡＧＣＧＧＧＣ ＣＡＧＣＧＧＧＡＡＣ ＡＡＴＴＧＡＴＣＴＣ ＡＡＧＡＡＣＧＧＣＴ ＡＴＧＧＧＡＧＧＴＧ ＧＡＧＣＧＧＡＧＡＴ 第１０図 ＧＡＡＡＣＧＣＡＴＣ ＣＧＧＧＡＡＧＡＴＧ ＧＧＣＡＴＧＧＧＴＧ ＧＧＡＣＧＧＧＴＧＧ ＡＴＧＴＣＴＡＡＧＧ ＣＣＧＣＣＧＧＧＣＡ ＧＡＣＡＡＡＧＡＧＴ ＧＣＧＣＧＡＣＡＧＴ ＣＡＣＣＧＣＴＧＣＡ ＣＧＧＴＧＧＴＴＴＣ ＧＡＣＧＣＧＧＡＴ　Ｔ ＧＡＡＡＣＡＣＧＧＡ ＴＣＧＣＧＧＣＧＧＴ ＧＴＧＴＧＣＧＧＧＡ ＧＧＣＣＴＣＧＧＣＡ ＣＧＧＡＡＣＧＡＡＴ ＴＧＧＣＣＡＧＣＡＧ ＧＴＧＧＡＴＣＡＡＧ ＧＧＧＴＣＡＴＡＧＴ ＣＣＧＴＧＴＧＯＣＴ イの４ ＣＣＧＣＣＧＡＧＣＧ ＴＴＴＣＧＧＣＡＧＧ ＡＣＣＴＣＧＣＧＧＣ ＧＴＧＧＧＡＧＣＡＧ ＣＡＣＣＧＣＧＣＧＧ ＡＧＧＣＧＴＡＴＣＴ ＧＴＧＡＧＣＣＧＣＣ ＧＧＴＧＴＧＴＴＣＣ ＣＧＧＣＣＧＧＣＧＡ ＧＴＣＡＣＣＧＧＧＣ ＴＡＡＴＣＡＴＣＣＧ ＣＧＡＣＧＧＴＴＣＴ ＧＴＧＡＣＧＣＧＡＧ ＡＧＡＡＴＴＧＴＧＴ ５ｏＯ ＣＣＴＧＧＡＴＴＴＡ ＴＡＡＣＴＧＡＧＧＣ ＧＴＣＴＴＴＴＣＣＡ ＣＧＧＣＴＴＧＴＧＡ ＧＣＡＣＡＧＴＡＴＴ ＣＡＡＡＡＣＣＧＴＣ 第１０図　イの５ ＧＧＣＣＴＣＣＡＴＧ ＧＴＧＴＣＣＡＴＧＡ ＡＣＧＣＡＣＡＴＣ丁 ＣＴＣＧＧＡＧＣＴＧ ＴＧＣＧＣＣＧＧＧＣ ＡＡＧＡＧＧＧＧＣＧ ＣＣＧＴＧＧＴＣＴＧ ＡＧＧＧＡＣＧＣＡＡ ＡＡＣＣＴＣＧＣＣＧ ＴＧＡＡＧＧＣＧＣＣ ＡＣＣＴＣＣＡＣＣＡ ＧＧＡＴＣＣＡＣＣＴ ＣＴＣＣＧＴＧＣＧ丁 ＣＣＣＧＣＴＡＣＧＣ ＧＴＡＣＧＣＧＧＧＧ ＧＡＴＣＣＧＣＣＣＣ ＡＣＡＡＧＧＣＡＧＧ ＧＴＣＧＧＣＧＴＧＧ ＣＧＴＡＣＣＣＧＡＣ ＴＧＧＴＣＡＧＣＴＧ ＴＧＧＧＡＣＡＣＣＧ ＣＧＡＣＴＴＣＧＡＴ ＣＣＧＡＧＡＣＣＴＧ ＴＴＣＡＧＴＴＣＧＣ ＣＧＡＣＣＡＧＣＧＣ ＡＡＣＡＧＴＡＣＧＴ ＣＴＣＡＣＣＧＣＴＣ ＧＡＣＣＧＣＣＣＧＣ ＣＧＴＴＣＧＴＣＧＧ ＧＣＧＧＡＣＣＡＧＡ ＣＴＴＣＧＴＧＧＣＣ ＧＧＧＡＣＴＧＧＣＧ ＧＣＣＧＣＧＣＴＧＧ ＣＧＡＣＣＡＧＡＣＧ ＡＣＧＣＧＴＧＧＧＴ ＡＴＧＧＴＧＧＴＣＴ ＧＧＧＡＣＧＧＴＣＧ ＧＣＣＧＧＣＧＣＴＴ ＣＴＧＧＧＧＣＧＧＧ ＴＣＡＧＣＡＧＡＧＣ 第 ０図 ＴＡＣＧＧＧＣＴＣＴ ＣＧＡＣＧＣＣＡＴＧ ＴＧＡＡＣＴＧＧＣＡ ＧＧＣＧＧＣＧＧＡＣ ＴＣＡＣＧＡＴＣＧＧ ＣＧＴＡＣＧＧＣＧＡ ＣＴＣＧＴＣＧＡＣＣ ＡＣＴＣＡＣＧＣＧＣ ＴＧＴＴＧＧＣＧＣＧ ＡＴＧＧＡＣＧＣＧＣ ＧＣＴＧＣＣＣＣＧＧ ＣＧＣＴＧＴＣＣＧＣ ＴＣＧＴＴＴＣＴＣＴ ＣＧＧＣＧＡＴＣＴＴ ＴＣＧＣＣＧＧＣＡＧ ＣＴＧＧＡＣＡＧＧＣ ＣＴＧＧＣＣＣＧＣＣ ＴＧＧＡＡＣＡＧＣＴ ＡＧＧＣＧＣＣＣＴＧ ＧＧＧＣＴＣＣＡＴＣ 千の６ ＧＧＣＴＣＧＣＣＴＣ ＴＣＧＧＣＡＣＣＧＧ ＴＣＴＧＡＣＧＣＴＧ ＣＧＧＧＣＧＡＣＣＧ ＣＡＧＣＴＧＡＧＣＧ ＧＧＡＧＧＡＧＡＡＧ ＴＧＧＴＧＧＣＧＧＡ ＴＣＧＡＡＣＣＧＧＧ ＴＣＣＧＧＴＧＧＴＧ ＧＧＡＴＣＧＣＣＡＣ ＣＴＧＧＴＴＣＧＧＧ ＧＧＣＴＧＡＴＣＡＡ ＴＡＡＧＧＧＴＧＡＧ ＣＣＧＣＴＣＧＣＣＣ ２３０゜ ＣＣＧＧＧＧＣＣＡＡ ＧＣＧＣＧＣＡＧＧＴ ＣＡＧＣＡＣＣＴＣＡ ＣＡＡＧＣＧＧＣＴＣ ＴＧＧＡＧＴＧＧＣＡ ４ｏＯ ＡＧＣＴＴＣＧＴＣＧ 箒 ０口 ＣＣＣＣＧＴＧＣＡＡ ＡＣＣＧＡＴＣＡＧＣ ＣＡＣＧＣＴＣＣＴＧ ＴＧＴＧＧＣＧＣＧＣ ＣＧＡＣＣＣＧＣＧＧ ＣＡＣＣＧＡＣＣＴＣ ＡＣＣＧＣＧＧＣＧＣ ＣＴＧＧＣＣＡＴＧＣ ＣＧＴＧＧＡＣＧＣＣ ＧＣＧＴＣＡＧＣＣＴ ＡＴＣＣＧＣＧＡＣＴ ＣＴＣＣＴＴＣＣＡＧ ＧＴＣＡＣＧＴＧＡＣ ＡＴＡＧＣＣＣＡＣＧ ＴＴＣＣＴＧＣＡＣＣ ＧＣＡＣＣＣＣＣＡＣ ＣＴＧＴＣＣＣＧＣＴ ＴＣＡＣＧＧＧＧＣ イの７ ＣＧＴＧＧＴＧＣＴＧ ＴＧＣＣＧＣＡＧＣＧ ＣＴＧＴＴＣＧＧＧＧ ＣＡＡＣＣＧＣＡＧＧ ＡＣＣＴＧＴＧＧＣＴ ＡＣＧＴＣＣＴＧＧＡ ＡＣＴＧＣＴＧＣＧＧ ＴＧＡＣＣＴＧＣＣＧ ＧＡＣＴＴＣＧＣＣＣ ＧＧＧＣＧＴＣＧＧＣ ＴＣＧＡＧＧＧＣＣＧ ＧＧＣＴＧＧＣＡＣＣ ＡＣＴＧＧＣＣＴＣＧ ＣＣＣＴＡＣＧＣＣＴ ２了００ ＧＡＣＡＣＣＧＣＣＣ ＧＧＣＣＣＣＧＧＣＣ ＧＡＣＧＧＴＧＡＧＧ 第１ １図（ａ） ＡｌａＭｅｔＰｈｅＰｒｏＰｈｅＬｅｕＰｈｅＡｌａＰ
ｈｅＰｈｅＴｈｒＬｙｓＶａｌＡｒｃ＋ＴｈｒＡｓｐＡ
ｒｇ第１１図（α） イの２ 第１１国（り 壬の３ ５ｅｒＧｌｙＴｈｒＰｒｏＴＲＭ ＡｒｑＰｈｅＡＬａＧｌｙＧｌｙＬｙｓＧＬｎＧＬｙＴ
ｙｒＴｙｒＡｒｑＧｌｎＴｒｐＡｓｐＴｈｒＰｒｏＡＬ
ａ第１ １図（ｂ） にの／ 膚し１１　図　（ｂン イの２

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ストレプトマイセス属に属する菌株由来の、大きさ
   が約３．１キロベース（ｋｂ）であり且つ下記図に示さ
   れる制限酵素地図によって特徴づけられるマクロラード
   抗生物質の４″位のアシル化酵素をコードする遺伝子ａ
   ｃｙＢを含むＤＮＡ断片およびその制限酵素によるＤＮ
   Ａ制限断片。 制限酵素地図 ▲数式、化学式、表等があります▼ ２、ストレプトマイセス属に属する菌株が、ストレプト
   マイセス・キタサトエンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅ
   ｓ　ｋｉｔａｓａｔｏｅｎｓｉｓ）、ストレプトマイセ
   ス・ナルボネンシス・バル・ジヨサマイセテイクス（Ｓ
   ．ｎａｒｂｏｎｅｎｓｉｓ　ｖａｒ　ｊｏｓａｍｙｃｅ
   ｔｉｃｕｓ）、ストレプトマイセス・ハイグロスコピク
   ス（Ｓ．ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ）、ストレプトマ
   イセス・プラテンシス（Ｓ．ｐｌａｔｅｎｓｉｓ）、ス
   トレプトマイセス・アルビレテイクリ（Ｓ．ａｌｂｉｒ
   ｅｔｉｃｕｌｉ）、ストレプトマイセス・シネロクロモ
   ゲネス（Ｓ．ｃｉｎｅｒｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ）、
   ストレプトマイセス・ジヤカルテンシス（Ｓ．ｄｊａｋ
   ａｒｔｅｎｓｉｓ）、ストレプトマイセス・フルデイシ
   デイクス（Ｓ．ｆｕｒｄｉｃｉｄｉｃｕｓ）、ストレプ
   トマイセス・マクロスポレウス（Ｓ．ｍａｃｒｏｓｐｏ
   ｒｅｕｓ）、ストレプトマイセス・テンダエ（Ｓ．ｔｅ
   ｎｄａｅ）、ストレプトマイセス・サーモトレランス（
   Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）及びストレプトマ
   イセス・デルタエ（Ｓ．ｄｅｌｔａｅ）より選ばれる請
   求項１記載のＤＮＡ断片およびその制限酵素によるＤＮ
   Ａ制限断片。 ３、ストレプトマイセス属に属する菌株がストレプトマ
   イセス・サーモトレランス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅ
   ｒａｎｓ）ＡＴＣＣ１１４１６である請求項２記載のＤ
   ＮＡ断片およびその制限酵素によるＤＮＡ制限断片。 ４、マクロライド抗生物質がタイロシン、スピラマイシ
   ン、アンゴラマイシン、ロイコマイシン及びデルタマイ
   シンより選ばれる請求項１記載のＤＮＡ断片およびその
   制限酵素によるＤＮＡ制限断片。 ５、マクロライド抗生物質がタイロシンである請求項４
   記載のＤＮＡ断片およびその制限酵素によるＤＮＡ制限
   断片。 ６、下記のアミノ酸配列 【アミノ酸配列があります】 をコードするＤＮＡ部分と、下記のアミノ酸配列【アミ
   ノ酸配列があります】 をコードするＤＮＡ部分とを含む請求項１記載のＤＮＡ
   断片およびその制限酵素によるＤＮＡ制限断片。 ７、下記の塩基配列 【遺伝子配列があります】 を有する請求項１記載のＤＮＡ断片およびその制限酵素
   によるＤＮＡ制限断片。 ８、請求項１〜７のいずれかに記載のＤＮＡ断片を含有
   するプラスミド。 ９、ｐＩＪ７０２、ｐＩＪ９４３、ｐＩＪ３５０及びｐ
   ＵＣ１８より選ばれるべクタープラスミドに、請求項１
   〜７のいずれかに記載のＤＮＡ断片を組み込んだ組換え
   プラスミドである請求項８記載のプラスミド。 １０、組換えプラスミドがｐＭＡＢＩである請求項９記
   載のプラスミド。 １１、請求項８〜１０のいずれかに記載のプラスミドで
   形質転換された微生物。 １２、宿主微生物がストレプトマイセス・リビダンス（
   Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｌｉｖｉｄａｎｓ）ＴＫ２
   ４またはストレプトマイセス・フラジアエ（Ｓ．ｆｒａ
   ｄｉａｅ）ＡＴＣＣ１９６０９である請求項１１記載の
   微生物。 １３、宿主微生物が、マクロライド抗生物質の４″位の
   アシル化酵素を実質的に生産しないマクロライド抗生物
   質生産菌である請求項１１記載の微生物。 １４、マクロライド抗生物質生産菌がストレプトマイセ
   ス・フラジアエ（Ｓ．ｆｒａｄｉａｅ）ＡＴＣＣ１９６
   ０９である請求項１３記載の微生物。 １５、マクロライド抗生物質を含む培地で請求項１１〜
   １４のいずれかに記載の微生物を培養し、生成する４″
   位がアシル化されたマクロライド抗生物質を採取するこ
   とを特徴とする４″−アシル化マクロライド抗生物質の
   製造方法。 １６、請求項１３または１４記載の微生物を培地で培養
   し、生成する４″位がアシル化されたマクロライド抗生
   物質を採取することを特徴とする４″−アシル化マクロ
   ライド抗生物質の製造方法。 １７、マクロライド抗生物質をアシル化剤と請求項１１
   〜１４のいずれかに記載の微生物菌体またはその処理物
   の存在下に反応せしめることを特徴とする４″−アシル
   化マクロライド抗生物質の製造方法。