JPH027640B2 - - Google Patents
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、被検液中の成分、例えばあらかじめ
存在するATP（アデノシントリフオスフエート）、
またはADP（アデノシンジホスフエート）とキナ
ーゼ基質用リン化合物からキナーゼの反応により
遊離、生成したATPの定量またはATP定量に基
くキナーゼ、ADPおよびキナーゼ基質用リン化
合物のいずれか１つの成分の測定法に関する。 従来より、遊離、生成したATP、例えばクレ
アチンホスフエートとADPからクレアチンキナ
ーゼの作用によりクレアチンおよびATPを遊離、
生成する反応系のATPやあらかじめ存在する
ATPの測定法としては、例えばこのATPにグル
コースおよびヘキソキナーゼを作用せしめて
ADPおよびグルコース−６−リン酸を生成せし
め、このグルコース−６−リン酸にNADP（ニコ
チン・アデニン・ジヌクレオチド・リン酸）およ
びグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼを作
用せしめ、グルコノ−δ−ラクトンおよび還元型
NADPを生成せしめ、次いでこの還元型NADP
の生成量を紫外部領域の波長で吸光度測定してな
るものであつた。（Methods in Engymatic
Analysis第２巻第789頁）。 このように従来のATP測定またはATPを遊
離、生成する反応系におけるATP測定に関して
は、１モル比のATPから１モル比の定量成分た
る還元型NADPしか生成されず、定量性感度上
なお不充分なものであつた。 本発明者らは、微量のATP量の場合であつて
も良好な感度にて定量し得る方法について種々研
究した結果、 少なくとも被検液中に存在するATPに、脂
肪酸およびCoASH（コ・エンチームＡ）をア
シル−CoA・シンセターゼ（EC6.2.1.8）の作
用にてアシル−CoAを生成せしめ、 この生成したアシルCoAをアシル−CoA・
オキシダーゼ（米国特許第4346173号明細書参
照）の作用にてデヒドロアシル−CoAを生成
せしめ、 さらにこのデヒドロアシル−CoAをエノイ
ル−CoA・ヒドラターゼ（EC4.2.1.17）の作用
にてヒドロキシアシル−CoAを生成せしめ、 このヒドロキシアシル−CoAをNAD（ニコ
チン・アデニン・ジヌクレオチド）を用いて３
−ヒドロキシアシル−CoA・デヒドロゲナー
ゼ（EC1.1.1.35）の作用にて還元型NADの生
成を伴つて３−ケトアシル−CoAを生成せし
め、 さらにこの３−ケトアシル−CoAをCoASH
を用いて３−ケトアシル−CoA・チオラーゼ
（EC2.3.1.16）の作用にてアセチルCoAの生成
を伴つてアシル−CoAを生成せしめ、この生
成したアシル−CoAは、さらに上記ののア
シル−CoA・オキシダーゼの基質として作用
を受け、この反応サイクル内に入り、１サイク
ル毎にアシルCoAは炭素数２個の単位で減じ
たアシル−CoAを生成し、その際反応系にお
いて検出できる変化の成分、例えばNADから
還元型NADの生成量はアシルCoAの１サイク
ル毎に等モル比の量を生成するもので、このよ
うにして１モル比のATPによつて形成された
アシル−CoAからサイクル数に応じた高モル
比の還元型NADを生成せしめてなるもので、
高感度にてATPを定量する方法を完成した。 本発明は上記の知見に基いて完成されたもの
で、被検液中のATPを定量するに当たり、下記
の反応工程、、、、、 キナーゼ、ADPおよびキナーゼ基質用リン
化合物からATPを遊離させるか、ATPを含有
している被検液に、脂肪酸とCoASHおよびア
シル−CoA・シンセターゼ活性を有する酵素
を作用させてアシル−CoAとする反応工程、 アシル−CoAを、酸素およびアシル−
CoA・オキシダーゼ活性を有する酵素により
過酸化水素およびデヒドロアシル−CoAにす
る反応工程、 デヒドロアシル−CoAを、水およびエノイ
ル−OcA・ヒドラターゼ活性を有する酵素に
よりヒドロキシアシル−CoAにする反応工程、 ヒドロキシアシル−CoAを、NADおよび３
−ヒドロキシアシル−CoA・デヒドロゲナー
ゼ活性を有する酵素により還元型NADおよび
ケトアシル−CoAにする反応工程、 ケトアシル−CoAを、CoASHおよび３−ケ
トアシル−CoA・チオラーゼ活性を有する酵
素によりアシル−CoAにする反応工程、 の反応のための試薬および酵素を含む反応工程に
おいて、工程にて生成されたアシル−CoAを
工程におけるアシル−CoAの基質としてサイ
クリング反応せしめ、少なくとも工程で用いた
脂肪酸の炭素数に応じた２サイクル以上のサイク
リング反応を形成し、次いでサイクリング反応の
サイクル数に応じて検出できる高モル比の消費さ
れた成分の量または生成された成分の量の少なく
とも一成分を測定し、必要に応じて工程におい
てアシル−CoA・オキシダーゼ活性を有する酵
素の代わりに同効工程としてアシル−CoAを、
電子受容体およびアシル−CoA・デヒドロデナ
ーゼ活性を有する酵素によりデヒドロアシル−
CoAにする工程を含む反応工程であることを特
徴とする定量法である。 まず本発明の被検液としては少なくともATP
を含有するものであればよく、ATPをあらかじ
め含有してなる被検液やATPを遊離せしめてな
るATP含有被検液が挙られる。ATPを遊離せし
めてなるATP含有被検液としては、通常キナー
ゼ、ADPおよびキナーゼ基質用リン化合物によ
る酵素反応にてそのADPがリン酸化されてATP
を遊離、生成せしめる酵素反応系のものが挙られ
る。さらに詳しくは、下記の酵素反応系が例示さ
れるが、これらは例示であつて何んら本発明の対
象を限定するものではない。 クレアチンホスフエート＋ADP還元剤、Mg2+ ―――――――――――――――――→ クレアチンキナーゼ（EC2.7.3.2）クレアチン＋ATP （還元剤：β−メルカプトエタノール、還元型
グルタチオン、システイン、Ｎ−アセ
チルシステイン、ジチオスレイートー
ルなど） ホスホエノールピルビン酸＋ADPMg2+またはMn2+とK
+、NH+ 4Rb+又は ――――――――――――――――――――→ ピルベートキナーゼ（EC2.7.1.40） ピルビン酸＋ATP アセチルホスフエート＋ADPMg2+またはMn2+ ――――――――――――――――――→ アセテートキナーゼ（EC2.7.2.1）酢酸＋ATP カルバモイルホスフエート＋ADPMg2+ ――――――――――――――――――→ カルバメイトキナーゼ（EC2.7.2.2）NH3＋CO2＋ATP ４−ホスホ−Ｌ−アスパルテイト＋ADPMg2+ ―――――――――――――――――――→ アスパルテイトキナーゼ（EC2.7.2.4） Ｌ−アスパルテイト＋ATP 1.3−ジホスホ−Ｄ−グリセレイト＋ADPMg2+また
はMn2+ ――――――――――――――――――――――→ ホスホグリセレイトキナーゼ（EC2.7.2.3） ３−ホスホ−Ｄ−グリセレイト＋ATP アルギニンホスフエート＋ADPMg2+またはMn2+ ―――――――――― ――――――――→ アルギニンキナーゼ（EC2.7.3.3）Ｌ−アルギニン＋
ATP ADP＋ADPMg2+ ―――――――――――――――→ ミオキナーゼ（EC2.7.4.3）AMP＋ATP XDP＋ADPMg2+、Mn2+またはCa2+ XDP＋ADPMg2+、Mn2+またはCa2+ ―――――――――――――――――――――――――
―――→ XDP＋ADPMg2+、Mn2+またはCa2+ ―――――――――――――――――――――――――
―――→ ヌクレオサイドモノホスフエートキナーゼ（EC2.7.4.4
） XMP＋ATP （ただしＸ＝Ｕ、Ｉ、Ｇ、ＣまたはＡを示す） これらの酵素反応系におけるキナーゼとして
は、例えば前記のクレアチンホスフエート、ホス
ホエノールピルビン酸、アセチルホスフエート、
カルバモイルホスフエート、４−ホスホアスパル
テイト、１，３−ジホスホ−Ｄ−グリセレイト、
アルギニンホスフエート、ADP、XDPなどのキ
ナーゼ基質用リン化合物とADPとからキナーゼ
基質用リン化合物のリン酸基をADPに転位せし
めてATPを生成遊離する作用を有する酵素であ
ればよい。例えばクレアチンホスフエートをキナ
ーゼ基質用リン化合物とするクレアチンキナー
ゼ、ホスホエノールピルビン酸をキナーゼ基質用
リン化合物とするピルベートキナーゼ、アセチル
ホスフエートをキナーゼ基質用リン化合物とする
アセテートキナーゼなどやその他のカルバメイト
キナーゼ、アスパルテイトキナーゼ、ホスホグリ
セレイトキナーゼ、アルギニンキナーゼ、ミオキ
ナーゼ、ヌクレオサイドモノホスフエートキナー
ゼなどが挙られる。またこれらの酵素反応系にお
けるATPの定量の目的は、酵素反応系における
キナーゼ活性測定、ADPの定量およびキナーゼ
基質用リン化合物の定量のいずれか１つの成分の
定量のために行なわれるものであつて、また他の
２つの成分は試薬として用いればよい。またこれ
らのATPを遊離せしめる酵素反応系において、
用いられる被検液や試薬の量は測定すべき目的や
選択する条件によつて適宜変更設計すればよく、
特に限定されるものではなく、反応によつて遊離
されるATPの量が定量するに充分量生成遊離さ
れる条件であればよい。またATPを遊離せしめ
るに当つては、通常37℃近辺の温度条件にて行な
えばよく、また反応時間はATPが充分量生成遊
離されるに要する時間以上であればよく、通常１
分以上行なわれる。 また本発明に用いられる脂肪酸としては、飽和
または不飽和の炭素数10以上の高級脂肪酸が好ま
しい。例えば炭素数10のカプリン酸、炭素数12の
ラウリン酸、炭素数13のトリデシレン酸、炭素数
14のミリスチン酸、炭素数15のペンタデシレン
酸、炭素数16のパルミチン酸、パルミトオレイン
酸、炭素数17のマーガリン酸、炭素数18のステア
リン酸、オレイン酸、バクセン酸、12−オクタデ
セン酸、リノール酸、リノレン酸、炭素数19のノ
ナデシレン、炭素数20のアラキジン酸、９−アイ
コセン酸、11−アイコセン酸、11，14−アイコサ
ジエン酸、８，11，14−アイコサトリエン酸、ア
ラキドン酸、炭素数21のベヘニン酸、炭素数22の
リグノセリン酸、11−ドコセン酸、エルカ酸など
が挙られる。また炭素数８のカプリル酸も使用で
きるものの、高感度にて測定するに当つては上記
の高級脂肪酸を用いることが好ましい。さらに本
発明においてはCoASHが用いられる。 次いで本発明の被検液中のATPを測定するた
めのにおけるATPに脂肪酸を作用させてアシ
ル−CoAとする反応工程、、、および
の各反応工程を例示すれば、次の如くである。 反応工程；ATPに脂肪酸を作用させてアシ
ル−CoAにする反応工程である。例えばATP
を脂肪酸およびCoASHの共存下にてアシル−
CoA、AMPおよびピロリン酸（PPi）となす
反応を触媒する酵素活性を有するアシル−
CoA・シンセターゼ活性、脂肪酸および
CoASHに基く反応工程が挙られる。 反応工程；アシル−CoAをデヒドロアシル
−CoAにする反応工程である。例えばアシル
−CoAを酸素の存在下にデヒドロアシル−
CoAおよび過酸化水素となす反応を触媒する
酵素活性を有するアシル−CoA・オキシダー
ゼ活性および酸素に基く反応工程が挙られる。 反応工程；デヒドロアシル−CoAをヒドロ
キシアシル−CoAにする反応工程である。例
えばデヒドロアシル−CoAを水の存在下にヒ
ドロキシアシル−CoAとなす反応を触媒する
酵素活性を有するエノイル−CoA・ヒドラタ
ーゼ活性および水に基く反応工程が挙られる。 反応工程；ヒドロキシアシル−CoAをケト
アシル−CoAにする反応工程である。例えば
ヒドロキシアシル−CoAをNADの存在下にケ
トアシル−CoAおよび還元型NADとなす反応
を触媒する酵素活性を有する３−ヒドロキシア
シル−CoA・デヒドロゲナーゼ活性および
NADに基く反応工程が挙られる。 反応工程；ケトアシル−CoAをアシル−
CoAにする反応工程である。例えばケトアシ
ル−CoAをCoASHの存在下にアシル−CoAお
よびアセチル−CoAとなす反応を触媒する３
−ケトアシル−CoA・チオラーゼ活性および
CoASHに基く反応工程が挙られる。 これらの各反応工程を遂行せしめるために、各
反応に要する試薬および酵素活性を奏する各酵素
を用いればよく、また用いられる酵素としては、
動物由来のものでも、微生物由来のものでも使用
でき、またこれらは市販の酵素を用いてもよく、
また酵素含有組織から単離したものでもよい。ア
シル−CoA・シンセターゼ活性を奏する酵素
（EC6.2.1.3）としては、例えばモルモツト肝臓由
来のもの〔J.Biol.Chem.、204、329（1953）〕、ラ
ツト、マウス、ウシ、ブタなどの肝臓由来のもの
（特開昭55−74791号公報）、エシエリヒア・コリ
ー（Escherichia coli）由来のもの〔Eur.J.
Biochem.、12、576（1970）〕、バチルス・メガテ
リウム（Bacillus megaterium）由来のもの
〔Biochemistry ４(1)、85（1965）〕、その他、ア
エロバクター（Aerobactor）属に属する生産菌
（A.aerogenes IFO 3318）、セラチア（Seratia）
属に属する生産菌（Seratia marcescens IFO
3054）、プロテウス（Proteus）属に属する生産
菌（Proteusmirabilis IFO 3849）、スタフイロ
コツカス（Staphylococcus）属に属する生産菌
（Staphylococcus aureus IFO 3060）、シユード
モナス（Pseudomonas）属に属する生産菌
（Pseudomonas aeruginosa IFO 3919）、フザリ
ウム（Fusarium）属に属する生産菌（Fusarium
oxysporum IFO 5942）、キベレラ（Gibberella）
属に属する生産菌（Gibberella fujikuroi IFO
6604）、キヤンジタ（Candida）属に属する生産
菌（Candida lipolytica IFO 0717）などの微生
物由来のもの〔J.Bacteriol.、105(3)1216（1971）、
J.Bacteriol.、114(1)249（1973）、特開昭55−74790
号公報、特開昭55−99187号公報〕などが挙られ
る。またアシル−CoA・オキシダーゼ活性を奏
する酵素としては、例えばラツト肝臓由来のもの
〔Biochem.Biophy.Res.Commun.、83(2)479
（1978）〕、キヤンジダ属に属する生産菌
（Candida utilis、Candida lipolytica IFO
1548、Candida tropicalis IFO 0589）、サツカ
ロマイセス（Saccharomyces）属に属する生産
菌〔Saccharomyces cerevisiae IFO 0213、
Saccharomyces cerevisiae Y0036：DSM2138、
FERM−ＰNo.5174〕オイペニシリウム
（Eupenicillium）属に属する生産菌
（Eupenicillium javanicum IFO 7992）、モナス
カス（Monascus）属に属する生産菌
〔Monascus sp.M−4800：DSM2136、FERM−
ＰNo.5225〕、アスペルギルス（Aspergillus）属に
属する生産菌〔Aspergillus candidus Ｍ−
4815：DSM 2135、FERM−ＰNo.5226〕アースロ
バクター（Arthrobacter）属に属する生産菌
〔Arthrobacter sp.B−0720：DSM2137、FERM
−ＰNo.5224〕、マクロフオミナ
（Macrophomina）属に属する生産菌
（Macrophomina phaseoli ATCC14383）、クラ
ドスポリウム（Cladosporium）属に属する生産
菌（Cladosporium resinae IFO 6367）などの
微生物由来のもの〔Arch.Biochem.Biophys.、
176、591（1976）、特開昭55−118391号公報、特開
昭56−8683号公報、特開昭56−61991号公報、米
国特許第4346173号明細書、西ドイツ国出願第
93223874、６号明細書〕などが挙られる。またこ
のアシル−CoA・オキシダーゼ活性の代りにア
シル−CoA・デヒドロゲナーゼ〔Acyl−CoA
dehydrogenase、EC1.3.99.3、Acyl−CoA：
（acceptor）oxidoreductase〕活性を奏する酵
素、例えばブタ、ウシやヒツジの肝臓由来のもの
〔J.Biol.Chem.、218、717（1956）、J.Biol.Chem.、
218、701（1956）、J.Am.Chem.Soc.、75、2787
（1953）、Biochim.Biophys.Acta.、22、475
（1956）〕を用いて、アシル−CoAをデヒドロア
シル−CoAとなしてもよい。この際、電子受容
体、例えば２，６−ジクロロフエノールインドフ
エール、３−（ｐ−ヨードフエニル）−２−（ｐ−
ニトロフエニル）−５−フエニル−2H−テトラゾ
リウム・クロライド（INT）、３−（４，５−ジ
メチル−２−チアゾリル）−２，５−ジフエニル
−2H−テトラゾリウム・ブロマイド（MTT）、
３，3′−（４，4′−ビフエニリレン）−ビス（２，
５−ジフエニル−2H−テトラゾリウム・クロラ
イド）（Neo−TB）、３，3′−（３，3′−ジメトキ
シ−４，4′−ビフエニリレン）−ビス〔２−（ｐ−
ニトロフエニル）−５−フエニル−2H−テトラゾ
リウム・クロライド〕（ニトロテトラゾリウムブ
ルー：NTB）、３，3′−（３，3′−ジメトキシ−
４，4′ビフエニリレン）−ビス〔２，５−ビス
（ｐ−ニトロフエニル）−2H−テトラゾリウム・
クロライド〕（TNTB）、３，３−（３，3′−ジメ
トキシ−４，4′−ビフエニレン）−ビス（２，５
−ジフエニル−2H−テトラゾリラム・クロライ
ド）（TB）などを、好ましくはフエナジンメト
サルフエトとともに用いて反応を行なわせればよ
い。さらにエノイルーCoA・ヒドラターゼ活性
を奏する酵素（EC4.2.1.17）、３−ヒドロキシア
ルシ−CoA・デヒドロゲナーゼ活性を奏する酵
素（EC1.1.1.35）や３−ケトアシル−CoA・チオ
ラーゼ活性を奏する酵素（EC2.3.1.16）としては
適宜それらの酵素活性含有組織から単離してもよ
い〔J.Biol.Chem.、218、971（1956）、Angew.
Chem.、64、687（1952）、J.Biol.Chem.、207、
631（1954）、Biochim.Biophys.Acta.、26、448
（1957）、J.Biol.Chem.、208、345（1954）〕。また
これらのエノイルーCoA・ヒドラターゼ活性、
３−ヒドロキシアシル−CoA・デヒドロゲナー
ゼ活性および３−ケトアシル−CoA・チオラー
ゼ活性において、各酵素活性を同一蛋白上に有し
てなる複合活性酵素の酵素活性を用いることが好
ましい。この複合活性酵素生産菌としては、例え
ばエシエリヒア属に属する生産菌〔Escherichia
coli；Proc.Natl.Acod.Sci.、74(2)492（1977）〕、
シ
ユードモナス属に属する生産菌〔Pseudomonas
Fragi Ｂ−0771（FERM−ＰNo.5701）；特願昭56
−99314号明細書、米国特願第392010号明細書〕
が挙られる。特にこのシユードモナス属に属する
生産菌Ｂ−0771およびこの生産菌から得られた複
合活性酵素について述べれば、次の通りである。
まず本菌Ｂ−0771は山梨県北巨摩郡須玉町の梨畑
の土壌より分離したもので、その肉眼的および顕
微鏡的観察などに基く各種培地上における培養の
所見は以下に述べる通りである。 (A) 肉眼的特徴 (1) 普通寒天平板培地 丘状、円形で、周囲はなめらかな集落を形
成し、半光沢で、灰白色〜淡黄色を呈する。
可溶性色素は産生しない。 (2) 普通寒天斜面培地 線状に良好に生育する。半光沢で、灰白色
〜淡黄色を呈する。可溶性色素は産生しな
い。 (3) 液体培地 一様に混濁し、沈澱も生ずる。菌膜は形成
しない。 (B) 顕微鏡的特徴 まつすぐ、またはやや曲つた桿菌で、単独ま
たは二連で、たまに長連鎖になる。大きさは
0.4〜0.6×0.5〜3.0μｍで、極毛で運動する。芽
胞は形成しない。 (C) 生理的・生化学的特徴 グラム染色 − Ｏ・Ｆテスト ０ カタラーゼ ＋ オキシダーゼ ＋ レシチナーゼ − ウレアーゼ SSR培地 ＋ クリステンゼン培地 （＋） ゲラチンの加水分解 − デンプンの加水分解 − カゼインの加水分解 − エスクリンの加水分解 − アルギニンの加水分解 ＋ ポリ−β−ハイドロキシブチレイト（PHB）
の蓄積 − インドールの産生 − 硫化水素の産生 − アセトインの産生 − MRテスト − 硝酸塩の還元 − クエン酸の利用 ＋ 糖より酸の産生性 酸産生、ガス非産生：Ｌ（＋）アラビノース、
セロビオース、フラクトース、フコース、ガラク
トース、グルコース、グリセリン、ラクトース、
マルトース、マンノース、メリビオース、ラムノ
ース、シユクロース、トレハロース、キシロー
ス、 酸非産生、ガス非産生：アドニトール、ヅルシ
トール、メソーエリスリトール、イノシトールイ
ヌリン、マンニトール、メレジトース、ラフイノ
ース、サリシン、ソルボース、ソルビトール、ス
ターチ、 上記の通り、本菌Ｂ−0771は、グラム陰性で、
極毛で運動し、カタラーゼ、オキシダーゼ陽性で
あり、さらにグルコースを酸化的に分解する好菌
性の細菌である特徴を有していることから、シユ
ードモナス属に属する菌株と認められた。 さらに、ザ・ジヤーナル・オブ・ジエネラル・
ミクロバイオロジー（The Journal of General
Microbiology）25、379〜408（1961）に記載のシ
ユードモナス・フラギ（Pseudomonas fragi）
と対比した結果、よく一致した。 【表】 さらに本菌Ｂ−0771を、標準株であるシユード
モナス・フラギ・ATCC4973と比較実験を行なつ
た。その結果、第１表に示す通りであつた。 【表】 【表】 以上の通り、本菌Ｂ−0771は、標準株であるシ
ユードモナス・フラギ・ATCC4973とよく一致し
た。よつて本菌をシユードモナス・フラギ・Ｂ−
0771と命名した（微生物受託番号通知書、微生物
受託番号「微工研菌寄第5701号、FERM−ＰNo.
5701」）。さらに、本菌を培養して単離、精製され
た複合活性酵素の活性測定法、その理化学的性質
について述べる。 (1) 活性測定法 (a) エノイル−CoA・ヒドラターゼ活性測定
法 0.2M・トリスー塩酸緩衝液（PH9.0） 0.4ml 1M・KCl 0.1ml 40ｍＭ・NAD 0.1ml 15ｍＭ・パルミトエノイル−CoA 0.1ml １％牛血清アルブミン 0.05ml 0.25％NTB 0.1ml 30U／ml・ジアホラーゼ（東洋醸造社製）
0.1ml 125U／ml・３−ヒドロキシアシル−CoA・
デヒドロゲナーゼ（ベーリンガー社製）
0.01ml蒸留水 0.04ml 計 1.00ml 上記の組成を有する反応液を37℃、２分間
予備加温し、これに、酵素液50μを加えて
37℃、10分間反応せしめる。反応後これに、
0.5％ドデシル硫酸ナトリウム2.0mlを加えて
反応を停止せしめ、次いで波長550nｍにて
吸光度（△A550）を測定する。測定におい
て、１分間に1μmoleの還元型NADを生成す
る酵素量を１単位（1U）とする。また酵素
活性は、次式に従う。 酵素活性(U/ml)＝△A550×１／４×1000／50×１／10 (b) ３−ヒドロキシアシル−CoA・デヒドロ
ゲナーゼ活性測定法 0.2M・トリスー塩酸緩衝液（PH8.5） 0.5ml 1M・KCl 0.05ml 40ｍＭ・NAD 0.1ml 15ｍＭ・３−ヒドロキシパルミトイル−
CoA 0.1ml １％牛血清アルブミン 0.05ml 0.25％NTB 0.1ml30U／ml・ジアホラーゼ 0.1ml 計 1.00ml 上記の組成を有する反応液を37℃、２分間
予備加温し、これに、酵素液50μを加えて
37℃、10分間反応せしめる。反応後これに、
0.5％ドデシル硫酸ナトリウム2.0mlを加えて
反応を停止せしめ、次いで波長550nｍにて
吸光度（△A550）を測定する。測定におい
て、１分間に1μmoleの還元型NADを生成す
る酵素量を１単位（1U）とする。また酵素
活性は、次式に従う。 酵素活性(U/ml)＝△A550×１／４×100／50×１／10 (c) ３−ケトアシル−CoA・チオラーゼ活性
測定法 0.2M・トリス塩酸緩衝液（PH8.0） 0.2ml 10ｍＭ CoA SH 0.05ml 0.2ｍＭ・３−ケトパルミトイル−CoA 0.1ml 100ｍＭ・MgCl2 0.1ml １ｍＭ・ジチオスライトール 0.1ml蒸留水 0.45ml 計 1.00ml 上記の組成を有する反応液を1.0ml容石英
セルに加えて37℃とし、これに酵素液20μ
を加えて37℃にて反応せしめ、反応によつて
消費される３−ケトパルミトイル−CoAの
減少を波長303nｍにて経時的に吸光度
（OD303）測定する。測定において、１分間
に1μmoleの３−ケトパルミトイル−CoAを
消費する酵素量を１単位（1U）とする。ま
た酵素活性は、次式に従う。 酵素活性(U/ml)＝（１分間当りOD
303）×１／13.5×1000／20 (2) 酵素作用 １モルのデヒドロアシル−CoAおよび１モ
ルの水から１モルのヒドロキシアシル−CoA
を生成する反応を触媒するエノイル−CoA・
ヒドラターゼ活性、１モルのヒドロキシアシル
−CoAおよび１モルのNADから１モルのケト
アシル−CoAおよび１モルの還元型NADを生
成する反応を触媒する３−ヒドロキシアシル−
CoA・デヒドロゲナーゼ活性、１モルのケト
アシル−CoAおよび１モルのCoA SHから１
モルのアシルCoAおよび１モルのアセチル−
CoAを生成する反応を触媒する３−ケトアシ
ル−CoA・チオラーゼ活性の各酵素活性を示
す。 (3) 三種の酵素活性が同一蛋白上にあることの証
明 シユードモナス・フラギ・Ｂ−0771の培養物
からの菌体より得られた粗酵素から、数段の精
製工程にて精製酵素を得るもので（後述の複合
活性酵素の製造例参照）、この工程において三
種類の酵素活性を前記の活性測定表に基いて測
定した。その結果第２表に示す通りであつた。 【表】 （なお、酵素活性測定値は、その酵素含有液
中の蛋白量を求めて換算した値である） その結果、各酵素活性は、その粗酵素からの
各精製工程での活性の比率にてよく一致してい
るもので、かつ精製された酵素もその三種の酵
素活性を有していることから、この三種の酵素
活性は同一蛋白上にあるものと認められる。 さらに後述の製造例のトヨパールHW−60カ
ラムクロマトグラフイーにて得られた精製酵素
2.0mgを、キヤリア・アンホライトを用いる等
電点電気泳動にかけた後三種の酵素活性を、そ
の活性測定法に基いて測定した結果、PH4.9の
フラクシヨンに三種の酵素活性とも単一ピーク
上に検出された。 (4) 基質特異性 下記の種々の炭素数を有する３−ヒドロキシ
アシル−CoAを基質として用い、３−ヒドロ
キシアシル−CoA・デヒドロゲナーゼ活性測
定法に従つてその活性を測定した。 基 質 相対活性（％） ３−ヒドロキシカプロイル−CoA 56.5 ３−ヒドロキシカプリリル−CoA 88.1 ３−ヒドロキシカプリル−CoA 99.0 ３−ヒドロキシラウリル−CoA 100.0 ３−ヒドロキシミリストイル−CoA 98.0 ３−ヒドロキシパルミトイル−CoA 75.5 ３−ヒドロキシステアリル−CoA 30.5 ３−ヒドロキシアラチデリル−CoA 9.5 ３−ヒドロキシオレイル−CoA 57.5 ３−ヒドロキシリノレニル−CoA 99.0 さらに本複合活性酵素は、少なくともパルミ
トエノイル−CoA、３−クトパルミトイル−
CoAに基質特異性を有する。 (5) 至適PH 基質として３−ヒドロキシパルミトイル−
CoAを用い、３−ヒドロキシアシル−CoA・
デヒドロゲナーゼ活性測定法におけるPHをトリ
ス−塩酸緩衝液PH7.5〜9.5にて変化せしめて活
性を求めた。その結果、第１図に示す通り、そ
の至適PHはPH９付近であつた。 (6) PH安定性 10ｍＭの各種緩衝液（PH４〜７：ジメチルグ
ルタル酸−水酸ナトリウム緩衝液、PH7.5〜
９：トリス塩酸緩衝液）に溶解した酵素液
（15U／ml）を37℃、60分間放置した後その残
存活性を、３−ヒドロキシアシル−CoA・デ
ヒドロゲナーゼ活性測定法に基いて測定した。 その結果、第２図に示す通りで、PH５〜８の
範囲で安定であつた。 (7) 熱安定性 10ｍＭジメチルグルタル酸−水酸ナトリウム
緩衝液（PH7.0）に溶解した酵素液（15U／ml）
を各温度で10分間処理した後その残存活性を３
−ヒドロキシアシル−CoA・デヒドロゲナー
ゼ活性測定法に基いて測定した。 その結果、第３図に示す通りで、ほぼ50℃ま
での温度に対して安定であつた。 (8) 等電点 キヤリア・アンホライトを用いた焦点電気泳
動法により測定した結果、等電点はPH4.9にあ
つた。 (9) 金属イオンの影響 ３−ヒドロキシアシル−CoA・デヒドロゲ
ナーゼ活性についてその影響を測定した。 【表】 【表】 (10) 界面活性剤の影響 ３−ヒドロキシアシル−CoA・デヒドロゲ
ナーゼ活性についてその影響を測定した。 【表】 以上の通り、この複合活性酵素はエノイル−
CoA・ヒドラターゼ活性、３−ヒドロキシアシ
ル−CoA・デヒドロゲナーゼ活性および３−ケ
トアシル−CoA・チオラーゼ活性を同一蛋白上
に有するものである。 さらにこれらの各酵素活性において、用いられ
る酵素の活性測定法については、以下の通りであ
る。 ●アシル−CoA・シンセタービ活性測定法 0.2M リン酸緩衝液（PH7.5） 0.2ml 10ｍＭ ATP 0.1ml 10ｍＭ MgCl2 0.1ml 10ｍＭ CoASH 0.05ml ５％トリトンＸ 100含有１ｍＭパルミチン酸溶
液 0.2ml蒸留水 0.35ml 計 1.00ml 上記の組成を有する第１反応液を調整する。 また第２反応液として、下記組成の反応液を調
整する。 0.2M リン酸緩衝液（PH7.5） 0.5ml 20ｍＭ Ｎ−エチル・マレイミド 0.1ml 15ｍＭ ４−アミノアンチピリン 0.3ml 0.3％ ３−メチル−Ｎ−エチル−Ｎ−（β−ヒド
ロキシエチル）アニリン 0.25ml ペルオキシダーゼ（100PPU／ml） 0.1ml 0.5％ ナトリウムアジド 0.1ml アシル−CoA・オキシダーゼ（120U／ml） 0.1ml 蒸留水 0.55ml 計 2.00ml 上記組成を有する第１反応液に酵素液50μを
加えて37℃、10分間反応せしめる。反応後これを
第２反応液に加えて37℃、５分間反応せしめ、次
いで波長550mmにて吸光度（△A550）を測定する。
また酵素活性は、次式に従う。 酵素活性（Ｕ／mg）＝△A550／10／32.0×１／２×3.
05／0.05×Ｃ （ただし、Ｃは酵素液中のアシル−CoA・シン
セターゼの濃度（mg／ml）を示す。） ●アシル−CoA・オキシターゼ活性測定法 0.2M トリス塩酸緩衝液（PH8.0） 0.1ml ５ｍＭ ４−アミノアンチピリン 0.05ml ３ｍＭ ジエチルメタトルイジン 0.05ml 0.5mg／mlペルオキシダーゼ 0.05ml 25ｍＭ パルミトイル−CoA 0.02ml蒸留水 0.23ml 計 0.50ml 上記組成を有する反応液に、酵素液10μを加
えて、37℃、10分間反応させた後0.5mlの4M尿素
を加えて反応を停止せしめ、次いでこれに１％ト
リトンＸ 100の２mlを加え、波長545mmにて比色
し、生成した過酸化水素の量を求める。酵素活性
は、１分間に1μmoleの過酸化水素を生成する酵
素量を１単位（1U）とする。 またエノイル−CoA・ヒドラターゼ活性測定
法３−ヒドロキシアシル−CoA・デヒドロゲナ
ーゼ活性測定法、３−ケトアシル−CoA・チオ
ラーゼ活性測定法は、前記複合活性酵素における
各活性測定法にて述べた方法と同一方法によるも
のである。 さらに各反応工程を遂行せしめるに当つて、使
用される各酵素活性の量としては反応せしめるに
充分な酵素活性を有していればよく、被検液中の
ATPの量や反応条件などに応じて適宜変更すれ
ばよく、特に限定されるものではない。例えば
0.005〜0.05μmoleのATPを含有するか、または
生成、遊離する被検液について37℃、30秒〜10分
間反応せしめるに当つて、アシル−CoA・シン
セターゼ活性は通常0.1U以上、好ましくは0.5〜
1U程度の酵素活性を奏する酵素の量を用いれば
よく、またアシル−CoA・オキシダーゼ活性は
通常1U以上、好ましくは５〜15U程度の酵素活
性を奏する酵素の量を用いればよい。さらに、エ
ノイル−CoA・ヒドラターゼ活性、３−ヒドロ
キシアシル−CoA・デヒドロゲナーゼ活性、３
−ケトアシル−CoA・チオラーゼ活性、または
それらの各酵素活性を同一蛋白上に有する複合活
性酵素の酵素活性は通常0.1U以上、好ましくは
１〜25U程度の酵素活性を奏する酵素の量を用い
ればよい。さらに反応に要する試薬、例えば反
応工程に要する脂肪酸およびCoASH、反応工
程に要するNAD、反応工程に要するCoASH
の各試薬の量としては、被検液中に存在する
ATPの量と用いる脂肪酸の炭素数に基いて行な
われるβ−酸化サイクル数との積に値する量以上
の充分な量にて用いればよく、例えば
ATP0.01μmoleの場合には脂肪酸は通常0.1μmole
程度以上、好ましくは0.5μmole程度以上、
CoASHは0.1μmole程度以上、好ましくは
0.5μmole程度以上、NADは0.1μmole程度以上、
好ましくは0.5μmole以上を用いればよい。さら
に反応工程において、アシル−CoA・オキシ
ダーゼ活性に基づく反応を行なわせしめるに当つ
ては、反応系に存在する酸素、即ち溶存酸素を利
用すればよく、また反応工程に要する水として
も反応系に存在する水を利用すればよい。さらに
アシル−CoA・シンセターゼ活性を良好にせし
めるために、マグネシウムイオンを放出できる水
溶性マグネシウム塩、好ましくは塩化マグネシウ
ムを用いればよい。また反応工程において、ア
シル−CoA・オキシダーゼ活性に基いて生成さ
れる過酸化水素を消去することが好ましく、通常
カタラーゼを用いて過酸化水素を分解、消去せし
めればよい。このようにして、少なくとも、脂肪
酸、CoASH、NAD、アシル−CoA・シンセタ
ーゼ活性、アシル−CoA・オキシダーゼ活性、
エノイル−CoA・ヒドラターゼ活性、３−ヒド
ロキシアシル−CoA・デヒドロゲナーゼ活性、
３−ケトアシル−CoA・チオラーゼ活性の各活
性を含有するATPの測定用組成物を調製すれば
よく、または少なくとも、キナーゼ、ADPおよ
びキナーゼ基質用リン化合物のいずれかの２成
分、脂肪酸、CoASH、NAD、アシル−CoA・
シンセターゼ活性、アシル−CoA・オキシダー
ゼ活性、エノイル−CoA・ヒドラターゼ活性、
３−ヒドロキシアシル−CoA・デヒドロゲナー
ゼ活性、３−ケトアシル−CoA・チオラーゼ活
性の各活性を含有する酵素反応系におけるキナー
ゼ活性、ADPおよびキナーゼ基質用リン化合物
のいずれか１成分の定量測定用組成物を調製すれ
ばよい。またこれらの測定用組成物において前記
複合活性酵素を、エノイル−CoA・ヒドラター
ゼ活性、３−ヒドロキシアシル−CoA・デヒド
ロゲナーゼ活性、および３−ケトアシル−
CoA・チオラーゼ活性の代りに用いることが好
ましく、さらに水溶性マグネシウム塩を含有せし
めることが好ましい。さらにこの測定用組成物に
カタラーゼやFAD（フラビンアデニンジヌクレオ
チド）を含有せしめることが好ましく、その他、
非イオン系界面活性剤、例えばトリトンＸ−100
（商品名）を含有せしめて測定用組成物となして
もよく、また一般に中性ないし弱アルカリ性の水
または緩衝液を用いて溶液となしてもよい。 次いでこのようにして得られた測定用組成物を
用いて、種々の被検液中のATPを測定するので
あるが、まず用いられる被検液の量としては通常
5μ以上を用いて、測定用組成物の通常１ml以
上の溶液に加えればよく、またその際の反応条件
としては、例えば反応温度は通常37℃近辺にて行
なえばよい。また反応時間としては特に限定され
るものでなく、反応時間は長時間とする方がより
高感度に変化を生ずるもので、通常20秒以上であ
ればよく、好ましくは30秒〜10分間程度である。
さらに反応媒体としては用いる各酵素活性の安定
PH域の媒体であればよく、通常弱酸性ないし弱ア
ルカリ性、例えばPH6.5〜8.5のリン酸緩衝液、ト
リスーHCl緩衝液、イミダゾール−HCl緩衝液、
ジメチルグルタール酸−NaOH緩衝液、ピペス
（PIPES）−NaOH緩衝液が用いられる。 このようにして反応せしめた後反応において検
出できる変化を測定するのであるが、この検出で
きる変化とは、１回のβ−酸化サイクルにて少な
くとも１分子の成分を消費するか、または生成す
る成分の変化である。簡便には反応に用いられる
NADから反応工程によつて生成される還元型
NADの量の変化を検出し、定量測定することが
簡便である。この還元型NADの測定手段として
は、例えば用いるANDに特異的吸収波長でなく、
還元型NADに特異的吸収波長である吸収波長域
の波長に基いて吸光度測定すればよい。NADは
260nｍ近辺に特異的極大吸収波長を有し、還元
型NADは260nｍ近辺および340nｍ近辺に特異的
極大吸収波長を有するもので、それ故還元型
NADの測定のための特異的吸収波長である吸収
波長域としては320nｍ〜360nｍ近辺であり、好
ましくは340nｍ近辺の波長である。この波長に
より、生成される還元型NADの量を検出できる
変化として測定する。さらに還元型NADの測定
手段としては、還元型NADの水素原子の受容能
を有する水素原子伝達系色原体の発色による方法
も挙られる。この還元型NADの水素原子の受容
能を有する水素原子伝達系色原体としてはINT、
MTT、Neo−TB、NTB、TNTBやTBなどの
水溶性テトラゾリウム塩などの電子受容体が用い
られ好ましくは水溶性テトラゾリウム塩とともに
ジアホラーゼを用いてその電子伝達を良好にせし
めたものを用いればよい。このこの水素伝達系色
原体をあらかじめ前記の測定用組成物に添加して
用いてもよく、または反応後に添加してもよく、
反応後に生成する還元型NADはこの水素原子伝
達系色原体と反応して色の変化を生ぜしめ、この
色調の変化をその吸光波長により吸光度を測定す
ればよい。さらに生成する還元型NADについて
詳しく述べれば、本発明における、、、
反応工程にて形成されるβ−酸化サイクルにおい
ては触媒する酵素の脂肪酸の炭素鎖長に対する基
質特異性から炭素数２で止まる。従つて炭素数16
個または18個の飽和脂肪酸であるパルミチン酸や
ステアリン酸の場合には７サイクルまたは８サイ
クルの反応を生じるもので、１モルのパルミチン
酸やステアリン酸から７モルまたは８モルの還元
型NADを生成する。さらに炭素数18の１つの不
飽和結合を有するオレイン酸の場合も８モル比の
還元型NADを生成する。このように飽和脂肪酸
または１つの不飽和結合を有する脂肪酸における
サイクル反応数は、その脂肪酸の炭素鎖長から反
応の止まる炭素数２の差を求め、さらにその値を
β−酸化サイクルにおける炭素数２の消失による
２での商を求めた値となるものである。さらに炭
素数18の２つの不飽和結合を有する脂肪酸である
リノール酸の場合には、３−ヒドロキシアシル−
CoA・デヒドロゲナーゼ活性の作用における立
体異性体に対する基質特異性のために５モル比の
還元型NADを生成して反応が終了する。また２
以上の不飽和結合を有する脂肪酸を用いる場合に
はエノイル−CoA・イソメラーゼや３−ヒドロ
キシアシル−CoAエピメラーゼの存在下におい
てはその立体異性体に基く基質特異性の影響をう
けないために、前記と同様に脂肪酸の炭素鎖長に
よる還元型NADを生成するものである。しかし、
２以上の不飽和結合を有する脂肪酸を用いる場合
にはそのβ−酸化サイクルが20秒以内と極めて短
時間に終了するために、ATP定量に当つては特
に好適である。このようにATP1モルに対して５
モル以上の還元型NADを生成するものであるこ
とから高感度にてATPまたはATPを遊離する酵
素反応系の１つの成分を測定できるものである。
さらにまたこの還元型NADの別の測定手段とし
て、例えばこの還元型NADにレザズリンなどの
蛍光用試薬の共存下ジアホラーゼを作用せしめて
反応によつて生成する蛍光成分の量を定量しても
よく、さらにこの還元型NADを基質とする酵素、
例えば還元型NAD・オキシターゼ活性を用いて
この酵素反応に基いて変化する成分を測定すれば
よく、好ましくは公知の固定化手段により固定化
酵素として加工せしめ、この固定化酵素を酸素電
極などに具備せしめた還元型NAD・オキシター
ゼ酵素電極を用いることにより、反応系に生成し
た還元型NADに作用して消費される酸素の量を
電気的に測定することによる還元型NADの測定
方法も利用できるもので、公知の種々の還元型
NADの定量手段が用いられる。さらにこの測定
された還元型NADの量に基いて、ATP含有量が
算出され、さらにこのATP含有量から被検液中
の酵素反応系におけるキナーゼ活性、ADPおよ
びキナーゼ基質用リン化合物の定量値が算出され
る。さらに前記の還元型NADを測定する代りに
反応において消費される酸素の量または生成され
る過酸化水素の量を検出できる変化として、例え
ば酸素電極または過酸化水素電極による電気的変
化にて測定してもよい。 このようにして、本発明の測定法および測定法
に基く組成分は、簡便かつ極めて高感度にて
ATPを測定し得るもので、さらにATPを遊離せ
しめる種々の被検液中の成分の測定のために利用
できる良好なもので、例えばクレアチンキナー
ゼ、ピルベートキナーゼやアセテートキナーゼな
どの酵素活性やクレアチンホスフエート、エノー
ルホスホピルベート、アセチルホスフエートや
ADPの定量において、簡便かつ高感度にて正確
に測定し得るものである。 次いで本発明の実施例および酵素の製造例を挙
げて具体的に述べるが、本発明はこれらによつて
何んら限定されるものではない。 実施例 １ 〔脂肪酸の選択〕 0.5M・イミダゾール−NCl緩衝液（PH7.0） 0.1ml 40ｍＭ・NAD 0.05ml 40ｍＭ・CoASH 0.05ml 50ｍＭ・MgCl2 0.03ml 10ｍＭ・ATP 0.1ml １ｍＭ・FAD 0.01ml アシル−CoA・シンセターゼ活性含有液（東洋
醸造社製、60U／ml） 0.02ml アシル−CoA・オキシダーゼ活性含有液（東洋
醸造社製、150U／ml） 0.1ml 複合活性酵素活性含有液（エノイル−CoA・ヒ
ドラターゼ活性400U／ml、３−ヒドロキシアシ
ル−CoA・デヒドロゲナーゼ活性200U／ml、３
−ケトアシル−CoA・チオラーゼ活性163U／
ml；東洋醸造社製；後述の複合活性酵素の製造例
参照） 0.1ml カタラーゼ（ベーリンガー社製、260000U／ml）
0.02ml 精製水 0.42ml 合計 1.0ml 上記組成を有する反応液1.0mlに、0.5ｍＭパル
ミチン酸、オレイン酸、リノール酸の各種脂肪酸
含有液20μを各々添加して37℃にて反応せし
め、添加後反応液における生成する還元型NAD
の量を340nｍの吸光度の増加の経時変化として
測定した。その結果は第４図に示す通りで、第４
図中実線（――）はリノール酸の場合、点線
（‐‐‐）はパルミチン酸の場合、一点鎖線（―‐
―‐）はオレイン酸の場合を示すものである。そ
の結果、パルミチン酸、オレイン酸の場合には、
約60〜70％の増加までは速く反応が進行するが、
終点に達するまでに３〜４分を必要とした。ま
た、リノール酸の場合は約20秒以内の極めて短時
間に終点に達したものであり、この結果から
ATP含有被検液による還元型NADに変換するに
はリノール酸を用いることが特に短時間で効率よ
くなし得るために好ましいと判断され、かつ30秒
程度の反応時間にて充分測定できるものと判断さ
れた。 〔リノール酸を用いるATPの定量〕 前記の反応液におけるATPの代りにリノール
酸を用いてATP測定用組成物を調製した。即ち
下記の組成を有する反応液を調製した。 0.5M・イミダゾール−HCl緩衝液（PH7.0） 0.1ml 40ｍＭ・NAD 0.05ml 40ｍＭ・CoASH 0.05ml 50ｍＭ・MgCl2 0.03ml 10ｍＭ・リノール酸（２％TritonX−100に溶解）
0.1ml １ｍＭ・FAD 0.01ml アシル−CoA・シンセダーゼ活性含有液（60U／
ml） 0.02ml アシル−CoA・オキシダーゼ活性含有液
（150U／ml） 0.1ml 複合活性酵素含有液（エノイル−CoA・ヒドラ
ターゼ活性400U／ml、３−ヒドロキシアシル−
CoA・デヒドロゲナーゼ活性200U／ml、３−ケ
トアシル−CoA・チオラーゼ活性163U／ml）
0.1ml カタラーゼ（260000U／ml） 0.02ml 精製水 0.42ml 合計 1.0ml この反応液1.0mlに、ATP含量０〜0.4ｍＭの
種々の濃度のATP溶液20μを加えて、37℃、１
分間反応せしめ、次いで反応終了後反応によつて
生成された還元型NADの量を波長340nｍでの吸
光度として測定した。その結果、第５図に示す通
りで、良好なATPの検量曲線が得られた。また
その結果に基いて還元型NADのミリ吸光係数か
ら計算するとATPに対して５モル比の還元型
NADが生成されたものであつた。 実施例 ２ 〔クレアチンキナーゼ活性測定〕 0.5M・イミダゾール−HCl緩衝液（PH7.0） 0.1ml 40ｍＭ・NAD 0.05ml 40ｍＭ・CoASH 0.05ml 50ｍＭ・MgCl2 0.03ml 10ｍＭ・リノール酸（２％TritonX−100に溶解）
0.1ml １ｍＭ・FAD 0.01ml アシル−CoA・シンセダーゼ活性含有液（60U／
ml） 0.02ml アシル−CoA・オキシダーゼ活性含有液
（150U／ml） 0.1ml 複合活性酵素含有液（エノイル−CoA・ヒドラ
ターゼ活性400U／ml、３−ヒドロキシアシル−
CoA・デヒドロゲナーゼ活性200U／ml、３−ケ
トアシル−CoA・チオラーゼ活性163U／ml）
0.1ml カタラーゼ 0.02ml 0.5M β−メルカプトエタノール 0.01ml 10ｍＭ ADP 0.1ml 0.2M クレアチンホスフエート 0.2ml 精製水 0.11ml 合計 1.0ml 上記の組成を有する反応液1.0mlに、クレアチ
ンキナーゼ（ベーリンガー社製；表示活性
380U／mg）の1μｇ／mlの溶液5μを添加し、37
℃にて反応せしめた。反応後反応によつて生成す
る還元型NADの量を波長340nｍの吸光度にて経
時的に測定した。 その結果を第６図に示す。またこの結果から１
分間あたりの吸光度増加は0.034であり、この値
からクレアチンキナーゼ活性を求めると
222.0U／mgであつた。なお算出式は以下の通り
である。 活性(U/mg)＝（１分間当りの増加値）
×１／6.1×５×1000／５×1000 また上記のクレアチンキナーゼ含有被検液の代
りにADP含有被検液を用い、かつその反応液に
おけるADPの代りにクレアチンキナーゼを用い
ることにより、簡便にADP定量用反応液が得ら
れる。またクレアチンホスフエートを被検液とし
て上記のクレアチンキナーゼ被検液の代りに用い
かつその反応液におけるクレアチンホスフエート
の代りにクレアチンキナーゼを用いることによ
り、簡便にクレアチンホスフエート定量用反応液
が得られる。 実施例 ３ 〔ピルベートキナーゼ活性測定〕 下記組成を有する反応液1.0mlにシグマ社ピル
ベートキナーゼ（タイプ）0.1U／mlの溶液を
５〜20μ添加して反応を開始し、37℃で340nｍ
における吸光度の増加を経時的に測定した。３分
間から４分間までの１分間あたりの吸光度の増加
と、ピルベートキナーゼ量との関係を第７図に示
した。第７図から明らかな通り酵素量と吸光度の
増加とは良好な直線関係が得られた。 0.2M トリエタノールアミン緩衝液（PH7.5）
0.15ml 10ｍＭ ホスホエノールピルビン酸 0.05ml 25ｍＭ MgCl2 0.1ml 100ｍＭ KCl 0.1ml 50ｍＭ ADP 0.1ml 50ｍＭ CoASH 0.05ml 10ｍＭ リノール酸（２％TritonX−100に溶解）
0.1ml 40ｍＭ NAD 0.05ml １ｍＭ FAD 0.01ml アシル−CoA・シンセターゼ活性含有液（60U／
ml） 0.02ml アシル−CoA・オキシダーゼ活性含有液
（150U／ml） 0.1ml 複合活性酵素含有液（エノイル−CoA・ヒドラ
ターゼ活性400U／ml、３−ヒドロキシアシル
CoA・デヒドロゲナーゼ活性200U／ml、３−ケ
トアシル−CoA・チオラーゼ活性163U／ml）
0.1ml 精製水 0.07ml 合計 1.0ml 実施例 ４ 〔アセチルホスフエートの定量〕 下記組成を有する反応液1.0mlに0.3ｍＭの種々
の濃度のアセチルホスフエート溶液20μを加え
て、37℃10分間反応を行なつた後、反応によつて
生成された還元型NAD量を波長340nｍでの吸光
度として測定した。その結果を第８図に示した。 0.2M トリエタノールアミン緩衝液（PH7.4）
0.2ml 20ｍＭ ADP 0.1ml 40ｍＭ CoASH 0.05ml 40ｍＭ NAD 0.05ml 50ｍＭ MgCl2 0.03ml 10ｍＭ リノール酸（２％TritonX−100に溶解）
0.10ml １ｍＭ FAD 0.01ml アシル−CoA・シンセターゼ活性含有液（60U／
ml） 0.02ml アシル−CoA・オキシダーゼ活性含有液
（150U／ml） 0.1ml 複合活性酵素含有液（エノイル−CoA・ヒドラ
ターゼ活性400U／ml、３−ヒドロキシアシル−
CoA・デヒドロゲナーゼ活性200U／ml、３−ケ
トアシル−CoA・チオラーゼ活性163U／ml）
0.1ml アセテートキナーゼ（シグマ社230U／ml）
0.05ml 精製水 0.19ml 合計 1.0ml 実施例 ５ 〔ADPの定量〕 下記組成を有する反応液1.0mlに０〜0.5ｍＭの
種々の濃度のADP溶液20μを加えて、37℃５分
間反応を行なつた後、反応によつて生成された還
元型NAD量を波長340nｍでの吸光度として測定
した。その結果、第９図に示す通りの良好な
ADPの検量線が得られた。 0.2M ピペス−NaOH 緩衝液（PH7.2） 0.2ml 40ｍＭ NAD 0.05ml 40ｍＭ CoASH 0.05ml 50ｍＭ MgCl2 0.03ml 10ｍＭ リノール酸（２％TritonX−100に溶解）
0.1ml １ｍＭ FAD 0.01ml 10ｍＭホスホエノールピルビン酸 0.1ml アシル−CoA・シンセターゼ活性含有液（60U／
ml） 0.02ml アシル−CoA・オキシダーゼ活性含有液
（150U／ml） 0.1ml 複合活性酵素含有液（エノイル−CoA・ヒドラ
ターゼ活性、400U／ml、３−ヒドロキシアシル
−CoA・デヒドロゲナーゼ活性200U／ml、３−
ケトアシル−CoA・チオラーゼ活性163U／ml）
0.1ml ピルベートキナーゼ（45U／ml） 0.1ml 精製水 0.14ml 合計 1.0ml 〔複合活性酵素の製造例〕 500ml容三角フラスコに100mlの培地（培地組
成：ペプトン1.5％、粉末酵母エキス0.5％、
KCl0.2％、NaCl0.1％、K2HPO40.1％、
MgSO40.05％、オレイン酸0.75％、PH7.0；15本
分）を入れ、120℃で加圧滅菌した後30℃にて、
シユードモナス・フラギ・Ｂ−0771（FERM−Ｐ
No.5701）を接種し、ロータリーシエーカーにて20
時間培養した。次いでこの培養物を併合し、
5000rpm、20分間遠心分離して培養菌体を得た。
さらに得られた菌体を1.50mgリゾチーム含有10ｍ
Ｍリン酸緩衝液（PH7.0）360mlに加えて可溶性の
粗製の複合活性酵素含有液（３−ヒドロキシアシ
ル−CoA・デヒドロゲナーゼ活性にて、その比
活性は3.0U／mgであつた。）340mlを得た。 得られた粗製の複合活性酵素290mlを氷槽中で
冷却後、予め−20℃に冷却したアセトン290mlを
添加し、生じた沈澱物を回収し、これを1MKCl
含有10ｍＭトリスー塩酸緩衝液（PH7.5）に溶解
し、さらに12000rpm、10分間遠心分離して不溶
物を除去した。得られた上清液の45mlを分取し、
これに22.5mlの飽和硫安溶液（PH7.0）を添加し、
生じた沈澱物を12000rpm、10分間遠心分離にて
除去した。次いで得られた上清液57mlに、さらに
飽和硫安溶液28mlを加えて沈澱せしめた。この沈
澱物を回収した後、1MKCl含有10ｍＭトリスー
塩酸緩衝液（PH7.5）の10mlに溶解し、10ｍＭト
リスー塩酸緩衝液（PH7.5）2.0に対して４℃で
20時間セルロースチユーブにて透析脱塩し、次い
でこれを凍結乾燥して、複合活性酵素粉末（３−
ヒドロキシアシル−CoA・デヒドロゲナーゼ活
性にて、その比活性は18.2U／mgであつた）77mg
を得た。 さらに得られた複合活性酵素粉末（３−ヒドロ
キシアシル−CoA・デヒドロゲナーゼ活性にて、
この比活性は18.2U／mgであつた。）77mgを20ml
の水に溶解し、これを、10ｍＭトリスー塩酸緩衝
液（PH7.5）で平衡化したDEAE−セフアロース
CL−6B（フアルマシア社製）のカラム（３×11
cm）にチヤージして吸着せしめ、同上緩衝液にて
カラムを洗浄した。次いで500mlの同上緩衝液と
0.4MKClを含んだ同上緩衝液500mlにて作製した
直線濃度勾配法による溶出を行なつた。52ml／時
間の流速で、９mlづつ分取し、各分画の酵素活性
を測定し、その活性画分（No.71〜80）90mlを得た
（３−ヒドロキシアシル−CoA・デヒドロゲナー
ゼ活性にて、その比活性は30.0U／mgであつた。）
さらにこの活性画分を、10ｍＭリン酸緩衝液（PH
7.5）２に対して透析した後、ハイドロキシア
パタイトゲルを充填したカラム（２×10cm）にチ
ヤージして吸着せしめた。300mlの10ｍＭリン酸
緩衝液（PH7.5）と300mlの0.5Mリン酸緩衝液
（PH7.5）とにて作製した直線濃度勾配法により溶
出を行なつた。33ml／時間の流速で５mlづつ分取
し、各分画の酵素活性を測定し、活性画分（No.46
〜62）85mlを得た（エノイルアシル−CoA・ヒ
ドラターゼ活性の比活性は210.3U／mg、３−ヒ
ドロキシアシル−CoA・デヒドロゲナーゼ活性
の比活性は105U／mg、３−ケトアシル−CoA・
チオラーゼ活性の比活性は85.6U／mgであつた）。
次いでこの活性画分を、限外過膜（アミコン社
製XM−50）を用いて濃縮後、これを、トヨパー
ルHW−60（東洋曹達社製）を充填したカラム
（1.1×90cm）にチヤージしてゲル過した（溶
媒：10ｍＭトリスー塩酸緩衝液PH7.5、
0.5MKCl）。3.5mlづつ分取し、活性画分（No.23〜
27）17.5mlを得、これを凍結乾燥して精製された
複合活性酵素を得た（３−ヒドロキシアシル−
CoA・デヒドロゲナーゼ活性にて、その比活性
は110U／mgであつた。収量20mg）。
存在するATP（アデノシントリフオスフエート）、
またはADP（アデノシンジホスフエート）とキナ
ーゼ基質用リン化合物からキナーゼの反応により
遊離、生成したATPの定量またはATP定量に基
くキナーゼ、ADPおよびキナーゼ基質用リン化
合物のいずれか１つの成分の測定法に関する。 従来より、遊離、生成したATP、例えばクレ
アチンホスフエートとADPからクレアチンキナ
ーゼの作用によりクレアチンおよびATPを遊離、
生成する反応系のATPやあらかじめ存在する
ATPの測定法としては、例えばこのATPにグル
コースおよびヘキソキナーゼを作用せしめて
ADPおよびグルコース−６−リン酸を生成せし
め、このグルコース−６−リン酸にNADP（ニコ
チン・アデニン・ジヌクレオチド・リン酸）およ
びグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼを作
用せしめ、グルコノ−δ−ラクトンおよび還元型
NADPを生成せしめ、次いでこの還元型NADP
の生成量を紫外部領域の波長で吸光度測定してな
るものであつた。（Methods in Engymatic
Analysis第２巻第789頁）。 このように従来のATP測定またはATPを遊
離、生成する反応系におけるATP測定に関して
は、１モル比のATPから１モル比の定量成分た
る還元型NADPしか生成されず、定量性感度上
なお不充分なものであつた。 本発明者らは、微量のATP量の場合であつて
も良好な感度にて定量し得る方法について種々研
究した結果、 少なくとも被検液中に存在するATPに、脂
肪酸およびCoASH（コ・エンチームＡ）をア
シル−CoA・シンセターゼ（EC6.2.1.8）の作
用にてアシル−CoAを生成せしめ、 この生成したアシルCoAをアシル−CoA・
オキシダーゼ（米国特許第4346173号明細書参
照）の作用にてデヒドロアシル−CoAを生成
せしめ、 さらにこのデヒドロアシル−CoAをエノイ
ル−CoA・ヒドラターゼ（EC4.2.1.17）の作用
にてヒドロキシアシル−CoAを生成せしめ、 このヒドロキシアシル−CoAをNAD（ニコ
チン・アデニン・ジヌクレオチド）を用いて３
−ヒドロキシアシル−CoA・デヒドロゲナー
ゼ（EC1.1.1.35）の作用にて還元型NADの生
成を伴つて３−ケトアシル−CoAを生成せし
め、 さらにこの３−ケトアシル−CoAをCoASH
を用いて３−ケトアシル−CoA・チオラーゼ
（EC2.3.1.16）の作用にてアセチルCoAの生成
を伴つてアシル−CoAを生成せしめ、この生
成したアシル−CoAは、さらに上記ののア
シル−CoA・オキシダーゼの基質として作用
を受け、この反応サイクル内に入り、１サイク
ル毎にアシルCoAは炭素数２個の単位で減じ
たアシル−CoAを生成し、その際反応系にお
いて検出できる変化の成分、例えばNADから
還元型NADの生成量はアシルCoAの１サイク
ル毎に等モル比の量を生成するもので、このよ
うにして１モル比のATPによつて形成された
アシル−CoAからサイクル数に応じた高モル
比の還元型NADを生成せしめてなるもので、
高感度にてATPを定量する方法を完成した。 本発明は上記の知見に基いて完成されたもの
で、被検液中のATPを定量するに当たり、下記
の反応工程、、、、、 キナーゼ、ADPおよびキナーゼ基質用リン
化合物からATPを遊離させるか、ATPを含有
している被検液に、脂肪酸とCoASHおよびア
シル−CoA・シンセターゼ活性を有する酵素
を作用させてアシル−CoAとする反応工程、 アシル−CoAを、酸素およびアシル−
CoA・オキシダーゼ活性を有する酵素により
過酸化水素およびデヒドロアシル−CoAにす
る反応工程、 デヒドロアシル−CoAを、水およびエノイ
ル−OcA・ヒドラターゼ活性を有する酵素に
よりヒドロキシアシル−CoAにする反応工程、 ヒドロキシアシル−CoAを、NADおよび３
−ヒドロキシアシル−CoA・デヒドロゲナー
ゼ活性を有する酵素により還元型NADおよび
ケトアシル−CoAにする反応工程、 ケトアシル−CoAを、CoASHおよび３−ケ
トアシル−CoA・チオラーゼ活性を有する酵
素によりアシル−CoAにする反応工程、 の反応のための試薬および酵素を含む反応工程に
おいて、工程にて生成されたアシル−CoAを
工程におけるアシル−CoAの基質としてサイ
クリング反応せしめ、少なくとも工程で用いた
脂肪酸の炭素数に応じた２サイクル以上のサイク
リング反応を形成し、次いでサイクリング反応の
サイクル数に応じて検出できる高モル比の消費さ
れた成分の量または生成された成分の量の少なく
とも一成分を測定し、必要に応じて工程におい
てアシル−CoA・オキシダーゼ活性を有する酵
素の代わりに同効工程としてアシル−CoAを、
電子受容体およびアシル−CoA・デヒドロデナ
ーゼ活性を有する酵素によりデヒドロアシル−
CoAにする工程を含む反応工程であることを特
徴とする定量法である。 まず本発明の被検液としては少なくともATP
を含有するものであればよく、ATPをあらかじ
め含有してなる被検液やATPを遊離せしめてな
るATP含有被検液が挙られる。ATPを遊離せし
めてなるATP含有被検液としては、通常キナー
ゼ、ADPおよびキナーゼ基質用リン化合物によ
る酵素反応にてそのADPがリン酸化されてATP
を遊離、生成せしめる酵素反応系のものが挙られ
る。さらに詳しくは、下記の酵素反応系が例示さ
れるが、これらは例示であつて何んら本発明の対
象を限定するものではない。 クレアチンホスフエート＋ADP還元剤、Mg2+ ―――――――――――――――――→ クレアチンキナーゼ（EC2.7.3.2）クレアチン＋ATP （還元剤：β−メルカプトエタノール、還元型
グルタチオン、システイン、Ｎ−アセ
チルシステイン、ジチオスレイートー
ルなど） ホスホエノールピルビン酸＋ADPMg2+またはMn2+とK
+、NH+ 4Rb+又は ――――――――――――――――――――→ ピルベートキナーゼ（EC2.7.1.40） ピルビン酸＋ATP アセチルホスフエート＋ADPMg2+またはMn2+ ――――――――――――――――――→ アセテートキナーゼ（EC2.7.2.1）酢酸＋ATP カルバモイルホスフエート＋ADPMg2+ ――――――――――――――――――→ カルバメイトキナーゼ（EC2.7.2.2）NH3＋CO2＋ATP ４−ホスホ−Ｌ−アスパルテイト＋ADPMg2+ ―――――――――――――――――――→ アスパルテイトキナーゼ（EC2.7.2.4） Ｌ−アスパルテイト＋ATP 1.3−ジホスホ−Ｄ−グリセレイト＋ADPMg2+また
はMn2+ ――――――――――――――――――――――→ ホスホグリセレイトキナーゼ（EC2.7.2.3） ３−ホスホ−Ｄ−グリセレイト＋ATP アルギニンホスフエート＋ADPMg2+またはMn2+ ―――――――――― ――――――――→ アルギニンキナーゼ（EC2.7.3.3）Ｌ−アルギニン＋
ATP ADP＋ADPMg2+ ―――――――――――――――→ ミオキナーゼ（EC2.7.4.3）AMP＋ATP XDP＋ADPMg2+、Mn2+またはCa2+ XDP＋ADPMg2+、Mn2+またはCa2+ ―――――――――――――――――――――――――
―――→ XDP＋ADPMg2+、Mn2+またはCa2+ ―――――――――――――――――――――――――
―――→ ヌクレオサイドモノホスフエートキナーゼ（EC2.7.4.4
） XMP＋ATP （ただしＸ＝Ｕ、Ｉ、Ｇ、ＣまたはＡを示す） これらの酵素反応系におけるキナーゼとして
は、例えば前記のクレアチンホスフエート、ホス
ホエノールピルビン酸、アセチルホスフエート、
カルバモイルホスフエート、４−ホスホアスパル
テイト、１，３−ジホスホ−Ｄ−グリセレイト、
アルギニンホスフエート、ADP、XDPなどのキ
ナーゼ基質用リン化合物とADPとからキナーゼ
基質用リン化合物のリン酸基をADPに転位せし
めてATPを生成遊離する作用を有する酵素であ
ればよい。例えばクレアチンホスフエートをキナ
ーゼ基質用リン化合物とするクレアチンキナー
ゼ、ホスホエノールピルビン酸をキナーゼ基質用
リン化合物とするピルベートキナーゼ、アセチル
ホスフエートをキナーゼ基質用リン化合物とする
アセテートキナーゼなどやその他のカルバメイト
キナーゼ、アスパルテイトキナーゼ、ホスホグリ
セレイトキナーゼ、アルギニンキナーゼ、ミオキ
ナーゼ、ヌクレオサイドモノホスフエートキナー
ゼなどが挙られる。またこれらの酵素反応系にお
けるATPの定量の目的は、酵素反応系における
キナーゼ活性測定、ADPの定量およびキナーゼ
基質用リン化合物の定量のいずれか１つの成分の
定量のために行なわれるものであつて、また他の
２つの成分は試薬として用いればよい。またこれ
らのATPを遊離せしめる酵素反応系において、
用いられる被検液や試薬の量は測定すべき目的や
選択する条件によつて適宜変更設計すればよく、
特に限定されるものではなく、反応によつて遊離
されるATPの量が定量するに充分量生成遊離さ
れる条件であればよい。またATPを遊離せしめ
るに当つては、通常37℃近辺の温度条件にて行な
えばよく、また反応時間はATPが充分量生成遊
離されるに要する時間以上であればよく、通常１
分以上行なわれる。 また本発明に用いられる脂肪酸としては、飽和
または不飽和の炭素数10以上の高級脂肪酸が好ま
しい。例えば炭素数10のカプリン酸、炭素数12の
ラウリン酸、炭素数13のトリデシレン酸、炭素数
14のミリスチン酸、炭素数15のペンタデシレン
酸、炭素数16のパルミチン酸、パルミトオレイン
酸、炭素数17のマーガリン酸、炭素数18のステア
リン酸、オレイン酸、バクセン酸、12−オクタデ
セン酸、リノール酸、リノレン酸、炭素数19のノ
ナデシレン、炭素数20のアラキジン酸、９−アイ
コセン酸、11−アイコセン酸、11，14−アイコサ
ジエン酸、８，11，14−アイコサトリエン酸、ア
ラキドン酸、炭素数21のベヘニン酸、炭素数22の
リグノセリン酸、11−ドコセン酸、エルカ酸など
が挙られる。また炭素数８のカプリル酸も使用で
きるものの、高感度にて測定するに当つては上記
の高級脂肪酸を用いることが好ましい。さらに本
発明においてはCoASHが用いられる。 次いで本発明の被検液中のATPを測定するた
めのにおけるATPに脂肪酸を作用させてアシ
ル−CoAとする反応工程、、、および
の各反応工程を例示すれば、次の如くである。 反応工程；ATPに脂肪酸を作用させてアシ
ル−CoAにする反応工程である。例えばATP
を脂肪酸およびCoASHの共存下にてアシル−
CoA、AMPおよびピロリン酸（PPi）となす
反応を触媒する酵素活性を有するアシル−
CoA・シンセターゼ活性、脂肪酸および
CoASHに基く反応工程が挙られる。 反応工程；アシル−CoAをデヒドロアシル
−CoAにする反応工程である。例えばアシル
−CoAを酸素の存在下にデヒドロアシル−
CoAおよび過酸化水素となす反応を触媒する
酵素活性を有するアシル−CoA・オキシダー
ゼ活性および酸素に基く反応工程が挙られる。 反応工程；デヒドロアシル−CoAをヒドロ
キシアシル−CoAにする反応工程である。例
えばデヒドロアシル−CoAを水の存在下にヒ
ドロキシアシル−CoAとなす反応を触媒する
酵素活性を有するエノイル−CoA・ヒドラタ
ーゼ活性および水に基く反応工程が挙られる。 反応工程；ヒドロキシアシル−CoAをケト
アシル−CoAにする反応工程である。例えば
ヒドロキシアシル−CoAをNADの存在下にケ
トアシル−CoAおよび還元型NADとなす反応
を触媒する酵素活性を有する３−ヒドロキシア
シル−CoA・デヒドロゲナーゼ活性および
NADに基く反応工程が挙られる。 反応工程；ケトアシル−CoAをアシル−
CoAにする反応工程である。例えばケトアシ
ル−CoAをCoASHの存在下にアシル−CoAお
よびアセチル−CoAとなす反応を触媒する３
−ケトアシル−CoA・チオラーゼ活性および
CoASHに基く反応工程が挙られる。 これらの各反応工程を遂行せしめるために、各
反応に要する試薬および酵素活性を奏する各酵素
を用いればよく、また用いられる酵素としては、
動物由来のものでも、微生物由来のものでも使用
でき、またこれらは市販の酵素を用いてもよく、
また酵素含有組織から単離したものでもよい。ア
シル−CoA・シンセターゼ活性を奏する酵素
（EC6.2.1.3）としては、例えばモルモツト肝臓由
来のもの〔J.Biol.Chem.、204、329（1953）〕、ラ
ツト、マウス、ウシ、ブタなどの肝臓由来のもの
（特開昭55−74791号公報）、エシエリヒア・コリ
ー（Escherichia coli）由来のもの〔Eur.J.
Biochem.、12、576（1970）〕、バチルス・メガテ
リウム（Bacillus megaterium）由来のもの
〔Biochemistry ４(1)、85（1965）〕、その他、ア
エロバクター（Aerobactor）属に属する生産菌
（A.aerogenes IFO 3318）、セラチア（Seratia）
属に属する生産菌（Seratia marcescens IFO
3054）、プロテウス（Proteus）属に属する生産
菌（Proteusmirabilis IFO 3849）、スタフイロ
コツカス（Staphylococcus）属に属する生産菌
（Staphylococcus aureus IFO 3060）、シユード
モナス（Pseudomonas）属に属する生産菌
（Pseudomonas aeruginosa IFO 3919）、フザリ
ウム（Fusarium）属に属する生産菌（Fusarium
oxysporum IFO 5942）、キベレラ（Gibberella）
属に属する生産菌（Gibberella fujikuroi IFO
6604）、キヤンジタ（Candida）属に属する生産
菌（Candida lipolytica IFO 0717）などの微生
物由来のもの〔J.Bacteriol.、105(3)1216（1971）、
J.Bacteriol.、114(1)249（1973）、特開昭55−74790
号公報、特開昭55−99187号公報〕などが挙られ
る。またアシル−CoA・オキシダーゼ活性を奏
する酵素としては、例えばラツト肝臓由来のもの
〔Biochem.Biophy.Res.Commun.、83(2)479
（1978）〕、キヤンジダ属に属する生産菌
（Candida utilis、Candida lipolytica IFO
1548、Candida tropicalis IFO 0589）、サツカ
ロマイセス（Saccharomyces）属に属する生産
菌〔Saccharomyces cerevisiae IFO 0213、
Saccharomyces cerevisiae Y0036：DSM2138、
FERM−ＰNo.5174〕オイペニシリウム
（Eupenicillium）属に属する生産菌
（Eupenicillium javanicum IFO 7992）、モナス
カス（Monascus）属に属する生産菌
〔Monascus sp.M−4800：DSM2136、FERM−
ＰNo.5225〕、アスペルギルス（Aspergillus）属に
属する生産菌〔Aspergillus candidus Ｍ−
4815：DSM 2135、FERM−ＰNo.5226〕アースロ
バクター（Arthrobacter）属に属する生産菌
〔Arthrobacter sp.B−0720：DSM2137、FERM
−ＰNo.5224〕、マクロフオミナ
（Macrophomina）属に属する生産菌
（Macrophomina phaseoli ATCC14383）、クラ
ドスポリウム（Cladosporium）属に属する生産
菌（Cladosporium resinae IFO 6367）などの
微生物由来のもの〔Arch.Biochem.Biophys.、
176、591（1976）、特開昭55−118391号公報、特開
昭56−8683号公報、特開昭56−61991号公報、米
国特許第4346173号明細書、西ドイツ国出願第
93223874、６号明細書〕などが挙られる。またこ
のアシル−CoA・オキシダーゼ活性の代りにア
シル−CoA・デヒドロゲナーゼ〔Acyl−CoA
dehydrogenase、EC1.3.99.3、Acyl−CoA：
（acceptor）oxidoreductase〕活性を奏する酵
素、例えばブタ、ウシやヒツジの肝臓由来のもの
〔J.Biol.Chem.、218、717（1956）、J.Biol.Chem.、
218、701（1956）、J.Am.Chem.Soc.、75、2787
（1953）、Biochim.Biophys.Acta.、22、475
（1956）〕を用いて、アシル−CoAをデヒドロア
シル−CoAとなしてもよい。この際、電子受容
体、例えば２，６−ジクロロフエノールインドフ
エール、３−（ｐ−ヨードフエニル）−２−（ｐ−
ニトロフエニル）−５−フエニル−2H−テトラゾ
リウム・クロライド（INT）、３−（４，５−ジ
メチル−２−チアゾリル）−２，５−ジフエニル
−2H−テトラゾリウム・ブロマイド（MTT）、
３，3′−（４，4′−ビフエニリレン）−ビス（２，
５−ジフエニル−2H−テトラゾリウム・クロラ
イド）（Neo−TB）、３，3′−（３，3′−ジメトキ
シ−４，4′−ビフエニリレン）−ビス〔２−（ｐ−
ニトロフエニル）−５−フエニル−2H−テトラゾ
リウム・クロライド〕（ニトロテトラゾリウムブ
ルー：NTB）、３，3′−（３，3′−ジメトキシ−
４，4′ビフエニリレン）−ビス〔２，５−ビス
（ｐ−ニトロフエニル）−2H−テトラゾリウム・
クロライド〕（TNTB）、３，３−（３，3′−ジメ
トキシ−４，4′−ビフエニレン）−ビス（２，５
−ジフエニル−2H−テトラゾリラム・クロライ
ド）（TB）などを、好ましくはフエナジンメト
サルフエトとともに用いて反応を行なわせればよ
い。さらにエノイルーCoA・ヒドラターゼ活性
を奏する酵素（EC4.2.1.17）、３−ヒドロキシア
ルシ−CoA・デヒドロゲナーゼ活性を奏する酵
素（EC1.1.1.35）や３−ケトアシル−CoA・チオ
ラーゼ活性を奏する酵素（EC2.3.1.16）としては
適宜それらの酵素活性含有組織から単離してもよ
い〔J.Biol.Chem.、218、971（1956）、Angew.
Chem.、64、687（1952）、J.Biol.Chem.、207、
631（1954）、Biochim.Biophys.Acta.、26、448
（1957）、J.Biol.Chem.、208、345（1954）〕。また
これらのエノイルーCoA・ヒドラターゼ活性、
３−ヒドロキシアシル−CoA・デヒドロゲナー
ゼ活性および３−ケトアシル−CoA・チオラー
ゼ活性において、各酵素活性を同一蛋白上に有し
てなる複合活性酵素の酵素活性を用いることが好
ましい。この複合活性酵素生産菌としては、例え
ばエシエリヒア属に属する生産菌〔Escherichia
coli；Proc.Natl.Acod.Sci.、74(2)492（1977）〕、
シ
ユードモナス属に属する生産菌〔Pseudomonas
Fragi Ｂ−0771（FERM−ＰNo.5701）；特願昭56
−99314号明細書、米国特願第392010号明細書〕
が挙られる。特にこのシユードモナス属に属する
生産菌Ｂ−0771およびこの生産菌から得られた複
合活性酵素について述べれば、次の通りである。
まず本菌Ｂ−0771は山梨県北巨摩郡須玉町の梨畑
の土壌より分離したもので、その肉眼的および顕
微鏡的観察などに基く各種培地上における培養の
所見は以下に述べる通りである。 (A) 肉眼的特徴 (1) 普通寒天平板培地 丘状、円形で、周囲はなめらかな集落を形
成し、半光沢で、灰白色〜淡黄色を呈する。
可溶性色素は産生しない。 (2) 普通寒天斜面培地 線状に良好に生育する。半光沢で、灰白色
〜淡黄色を呈する。可溶性色素は産生しな
い。 (3) 液体培地 一様に混濁し、沈澱も生ずる。菌膜は形成
しない。 (B) 顕微鏡的特徴 まつすぐ、またはやや曲つた桿菌で、単独ま
たは二連で、たまに長連鎖になる。大きさは
0.4〜0.6×0.5〜3.0μｍで、極毛で運動する。芽
胞は形成しない。 (C) 生理的・生化学的特徴 グラム染色 − Ｏ・Ｆテスト ０ カタラーゼ ＋ オキシダーゼ ＋ レシチナーゼ − ウレアーゼ SSR培地 ＋ クリステンゼン培地 （＋） ゲラチンの加水分解 − デンプンの加水分解 − カゼインの加水分解 − エスクリンの加水分解 − アルギニンの加水分解 ＋ ポリ−β−ハイドロキシブチレイト（PHB）
の蓄積 − インドールの産生 − 硫化水素の産生 − アセトインの産生 − MRテスト − 硝酸塩の還元 − クエン酸の利用 ＋ 糖より酸の産生性 酸産生、ガス非産生：Ｌ（＋）アラビノース、
セロビオース、フラクトース、フコース、ガラク
トース、グルコース、グリセリン、ラクトース、
マルトース、マンノース、メリビオース、ラムノ
ース、シユクロース、トレハロース、キシロー
ス、 酸非産生、ガス非産生：アドニトール、ヅルシ
トール、メソーエリスリトール、イノシトールイ
ヌリン、マンニトール、メレジトース、ラフイノ
ース、サリシン、ソルボース、ソルビトール、ス
ターチ、 上記の通り、本菌Ｂ−0771は、グラム陰性で、
極毛で運動し、カタラーゼ、オキシダーゼ陽性で
あり、さらにグルコースを酸化的に分解する好菌
性の細菌である特徴を有していることから、シユ
ードモナス属に属する菌株と認められた。 さらに、ザ・ジヤーナル・オブ・ジエネラル・
ミクロバイオロジー（The Journal of General
Microbiology）25、379〜408（1961）に記載のシ
ユードモナス・フラギ（Pseudomonas fragi）
と対比した結果、よく一致した。 【表】 さらに本菌Ｂ−0771を、標準株であるシユード
モナス・フラギ・ATCC4973と比較実験を行なつ
た。その結果、第１表に示す通りであつた。 【表】 【表】 以上の通り、本菌Ｂ−0771は、標準株であるシ
ユードモナス・フラギ・ATCC4973とよく一致し
た。よつて本菌をシユードモナス・フラギ・Ｂ−
0771と命名した（微生物受託番号通知書、微生物
受託番号「微工研菌寄第5701号、FERM−ＰNo.
5701」）。さらに、本菌を培養して単離、精製され
た複合活性酵素の活性測定法、その理化学的性質
について述べる。 (1) 活性測定法 (a) エノイル−CoA・ヒドラターゼ活性測定
法 0.2M・トリスー塩酸緩衝液（PH9.0） 0.4ml 1M・KCl 0.1ml 40ｍＭ・NAD 0.1ml 15ｍＭ・パルミトエノイル−CoA 0.1ml １％牛血清アルブミン 0.05ml 0.25％NTB 0.1ml 30U／ml・ジアホラーゼ（東洋醸造社製）
0.1ml 125U／ml・３−ヒドロキシアシル−CoA・
デヒドロゲナーゼ（ベーリンガー社製）
0.01ml蒸留水 0.04ml 計 1.00ml 上記の組成を有する反応液を37℃、２分間
予備加温し、これに、酵素液50μを加えて
37℃、10分間反応せしめる。反応後これに、
0.5％ドデシル硫酸ナトリウム2.0mlを加えて
反応を停止せしめ、次いで波長550nｍにて
吸光度（△A550）を測定する。測定におい
て、１分間に1μmoleの還元型NADを生成す
る酵素量を１単位（1U）とする。また酵素
活性は、次式に従う。 酵素活性(U/ml)＝△A550×１／４×1000／50×１／10 (b) ３−ヒドロキシアシル−CoA・デヒドロ
ゲナーゼ活性測定法 0.2M・トリスー塩酸緩衝液（PH8.5） 0.5ml 1M・KCl 0.05ml 40ｍＭ・NAD 0.1ml 15ｍＭ・３−ヒドロキシパルミトイル−
CoA 0.1ml １％牛血清アルブミン 0.05ml 0.25％NTB 0.1ml30U／ml・ジアホラーゼ 0.1ml 計 1.00ml 上記の組成を有する反応液を37℃、２分間
予備加温し、これに、酵素液50μを加えて
37℃、10分間反応せしめる。反応後これに、
0.5％ドデシル硫酸ナトリウム2.0mlを加えて
反応を停止せしめ、次いで波長550nｍにて
吸光度（△A550）を測定する。測定におい
て、１分間に1μmoleの還元型NADを生成す
る酵素量を１単位（1U）とする。また酵素
活性は、次式に従う。 酵素活性(U/ml)＝△A550×１／４×100／50×１／10 (c) ３−ケトアシル−CoA・チオラーゼ活性
測定法 0.2M・トリス塩酸緩衝液（PH8.0） 0.2ml 10ｍＭ CoA SH 0.05ml 0.2ｍＭ・３−ケトパルミトイル−CoA 0.1ml 100ｍＭ・MgCl2 0.1ml １ｍＭ・ジチオスライトール 0.1ml蒸留水 0.45ml 計 1.00ml 上記の組成を有する反応液を1.0ml容石英
セルに加えて37℃とし、これに酵素液20μ
を加えて37℃にて反応せしめ、反応によつて
消費される３−ケトパルミトイル−CoAの
減少を波長303nｍにて経時的に吸光度
（OD303）測定する。測定において、１分間
に1μmoleの３−ケトパルミトイル−CoAを
消費する酵素量を１単位（1U）とする。ま
た酵素活性は、次式に従う。 酵素活性(U/ml)＝（１分間当りOD
303）×１／13.5×1000／20 (2) 酵素作用 １モルのデヒドロアシル−CoAおよび１モ
ルの水から１モルのヒドロキシアシル−CoA
を生成する反応を触媒するエノイル−CoA・
ヒドラターゼ活性、１モルのヒドロキシアシル
−CoAおよび１モルのNADから１モルのケト
アシル−CoAおよび１モルの還元型NADを生
成する反応を触媒する３−ヒドロキシアシル−
CoA・デヒドロゲナーゼ活性、１モルのケト
アシル−CoAおよび１モルのCoA SHから１
モルのアシルCoAおよび１モルのアセチル−
CoAを生成する反応を触媒する３−ケトアシ
ル−CoA・チオラーゼ活性の各酵素活性を示
す。 (3) 三種の酵素活性が同一蛋白上にあることの証
明 シユードモナス・フラギ・Ｂ−0771の培養物
からの菌体より得られた粗酵素から、数段の精
製工程にて精製酵素を得るもので（後述の複合
活性酵素の製造例参照）、この工程において三
種類の酵素活性を前記の活性測定表に基いて測
定した。その結果第２表に示す通りであつた。 【表】 （なお、酵素活性測定値は、その酵素含有液
中の蛋白量を求めて換算した値である） その結果、各酵素活性は、その粗酵素からの
各精製工程での活性の比率にてよく一致してい
るもので、かつ精製された酵素もその三種の酵
素活性を有していることから、この三種の酵素
活性は同一蛋白上にあるものと認められる。 さらに後述の製造例のトヨパールHW−60カ
ラムクロマトグラフイーにて得られた精製酵素
2.0mgを、キヤリア・アンホライトを用いる等
電点電気泳動にかけた後三種の酵素活性を、そ
の活性測定法に基いて測定した結果、PH4.9の
フラクシヨンに三種の酵素活性とも単一ピーク
上に検出された。 (4) 基質特異性 下記の種々の炭素数を有する３−ヒドロキシ
アシル−CoAを基質として用い、３−ヒドロ
キシアシル−CoA・デヒドロゲナーゼ活性測
定法に従つてその活性を測定した。 基 質 相対活性（％） ３−ヒドロキシカプロイル−CoA 56.5 ３−ヒドロキシカプリリル−CoA 88.1 ３−ヒドロキシカプリル−CoA 99.0 ３−ヒドロキシラウリル−CoA 100.0 ３−ヒドロキシミリストイル−CoA 98.0 ３−ヒドロキシパルミトイル−CoA 75.5 ３−ヒドロキシステアリル−CoA 30.5 ３−ヒドロキシアラチデリル−CoA 9.5 ３−ヒドロキシオレイル−CoA 57.5 ３−ヒドロキシリノレニル−CoA 99.0 さらに本複合活性酵素は、少なくともパルミ
トエノイル−CoA、３−クトパルミトイル−
CoAに基質特異性を有する。 (5) 至適PH 基質として３−ヒドロキシパルミトイル−
CoAを用い、３−ヒドロキシアシル−CoA・
デヒドロゲナーゼ活性測定法におけるPHをトリ
ス−塩酸緩衝液PH7.5〜9.5にて変化せしめて活
性を求めた。その結果、第１図に示す通り、そ
の至適PHはPH９付近であつた。 (6) PH安定性 10ｍＭの各種緩衝液（PH４〜７：ジメチルグ
ルタル酸−水酸ナトリウム緩衝液、PH7.5〜
９：トリス塩酸緩衝液）に溶解した酵素液
（15U／ml）を37℃、60分間放置した後その残
存活性を、３−ヒドロキシアシル−CoA・デ
ヒドロゲナーゼ活性測定法に基いて測定した。 その結果、第２図に示す通りで、PH５〜８の
範囲で安定であつた。 (7) 熱安定性 10ｍＭジメチルグルタル酸−水酸ナトリウム
緩衝液（PH7.0）に溶解した酵素液（15U／ml）
を各温度で10分間処理した後その残存活性を３
−ヒドロキシアシル−CoA・デヒドロゲナー
ゼ活性測定法に基いて測定した。 その結果、第３図に示す通りで、ほぼ50℃ま
での温度に対して安定であつた。 (8) 等電点 キヤリア・アンホライトを用いた焦点電気泳
動法により測定した結果、等電点はPH4.9にあ
つた。 (9) 金属イオンの影響 ３−ヒドロキシアシル−CoA・デヒドロゲ
ナーゼ活性についてその影響を測定した。 【表】 【表】 (10) 界面活性剤の影響 ３−ヒドロキシアシル−CoA・デヒドロゲ
ナーゼ活性についてその影響を測定した。 【表】 以上の通り、この複合活性酵素はエノイル−
CoA・ヒドラターゼ活性、３−ヒドロキシアシ
ル−CoA・デヒドロゲナーゼ活性および３−ケ
トアシル−CoA・チオラーゼ活性を同一蛋白上
に有するものである。 さらにこれらの各酵素活性において、用いられ
る酵素の活性測定法については、以下の通りであ
る。 ●アシル−CoA・シンセタービ活性測定法 0.2M リン酸緩衝液（PH7.5） 0.2ml 10ｍＭ ATP 0.1ml 10ｍＭ MgCl2 0.1ml 10ｍＭ CoASH 0.05ml ５％トリトンＸ 100含有１ｍＭパルミチン酸溶
液 0.2ml蒸留水 0.35ml 計 1.00ml 上記の組成を有する第１反応液を調整する。 また第２反応液として、下記組成の反応液を調
整する。 0.2M リン酸緩衝液（PH7.5） 0.5ml 20ｍＭ Ｎ−エチル・マレイミド 0.1ml 15ｍＭ ４−アミノアンチピリン 0.3ml 0.3％ ３−メチル−Ｎ−エチル−Ｎ−（β−ヒド
ロキシエチル）アニリン 0.25ml ペルオキシダーゼ（100PPU／ml） 0.1ml 0.5％ ナトリウムアジド 0.1ml アシル−CoA・オキシダーゼ（120U／ml） 0.1ml 蒸留水 0.55ml 計 2.00ml 上記組成を有する第１反応液に酵素液50μを
加えて37℃、10分間反応せしめる。反応後これを
第２反応液に加えて37℃、５分間反応せしめ、次
いで波長550mmにて吸光度（△A550）を測定する。
また酵素活性は、次式に従う。 酵素活性（Ｕ／mg）＝△A550／10／32.0×１／２×3.
05／0.05×Ｃ （ただし、Ｃは酵素液中のアシル−CoA・シン
セターゼの濃度（mg／ml）を示す。） ●アシル−CoA・オキシターゼ活性測定法 0.2M トリス塩酸緩衝液（PH8.0） 0.1ml ５ｍＭ ４−アミノアンチピリン 0.05ml ３ｍＭ ジエチルメタトルイジン 0.05ml 0.5mg／mlペルオキシダーゼ 0.05ml 25ｍＭ パルミトイル−CoA 0.02ml蒸留水 0.23ml 計 0.50ml 上記組成を有する反応液に、酵素液10μを加
えて、37℃、10分間反応させた後0.5mlの4M尿素
を加えて反応を停止せしめ、次いでこれに１％ト
リトンＸ 100の２mlを加え、波長545mmにて比色
し、生成した過酸化水素の量を求める。酵素活性
は、１分間に1μmoleの過酸化水素を生成する酵
素量を１単位（1U）とする。 またエノイル−CoA・ヒドラターゼ活性測定
法３−ヒドロキシアシル−CoA・デヒドロゲナ
ーゼ活性測定法、３−ケトアシル−CoA・チオ
ラーゼ活性測定法は、前記複合活性酵素における
各活性測定法にて述べた方法と同一方法によるも
のである。 さらに各反応工程を遂行せしめるに当つて、使
用される各酵素活性の量としては反応せしめるに
充分な酵素活性を有していればよく、被検液中の
ATPの量や反応条件などに応じて適宜変更すれ
ばよく、特に限定されるものではない。例えば
0.005〜0.05μmoleのATPを含有するか、または
生成、遊離する被検液について37℃、30秒〜10分
間反応せしめるに当つて、アシル−CoA・シン
セターゼ活性は通常0.1U以上、好ましくは0.5〜
1U程度の酵素活性を奏する酵素の量を用いれば
よく、またアシル−CoA・オキシダーゼ活性は
通常1U以上、好ましくは５〜15U程度の酵素活
性を奏する酵素の量を用いればよい。さらに、エ
ノイル−CoA・ヒドラターゼ活性、３−ヒドロ
キシアシル−CoA・デヒドロゲナーゼ活性、３
−ケトアシル−CoA・チオラーゼ活性、または
それらの各酵素活性を同一蛋白上に有する複合活
性酵素の酵素活性は通常0.1U以上、好ましくは
１〜25U程度の酵素活性を奏する酵素の量を用い
ればよい。さらに反応に要する試薬、例えば反
応工程に要する脂肪酸およびCoASH、反応工
程に要するNAD、反応工程に要するCoASH
の各試薬の量としては、被検液中に存在する
ATPの量と用いる脂肪酸の炭素数に基いて行な
われるβ−酸化サイクル数との積に値する量以上
の充分な量にて用いればよく、例えば
ATP0.01μmoleの場合には脂肪酸は通常0.1μmole
程度以上、好ましくは0.5μmole程度以上、
CoASHは0.1μmole程度以上、好ましくは
0.5μmole程度以上、NADは0.1μmole程度以上、
好ましくは0.5μmole以上を用いればよい。さら
に反応工程において、アシル−CoA・オキシ
ダーゼ活性に基づく反応を行なわせしめるに当つ
ては、反応系に存在する酸素、即ち溶存酸素を利
用すればよく、また反応工程に要する水として
も反応系に存在する水を利用すればよい。さらに
アシル−CoA・シンセターゼ活性を良好にせし
めるために、マグネシウムイオンを放出できる水
溶性マグネシウム塩、好ましくは塩化マグネシウ
ムを用いればよい。また反応工程において、ア
シル−CoA・オキシダーゼ活性に基いて生成さ
れる過酸化水素を消去することが好ましく、通常
カタラーゼを用いて過酸化水素を分解、消去せし
めればよい。このようにして、少なくとも、脂肪
酸、CoASH、NAD、アシル−CoA・シンセタ
ーゼ活性、アシル−CoA・オキシダーゼ活性、
エノイル−CoA・ヒドラターゼ活性、３−ヒド
ロキシアシル−CoA・デヒドロゲナーゼ活性、
３−ケトアシル−CoA・チオラーゼ活性の各活
性を含有するATPの測定用組成物を調製すれば
よく、または少なくとも、キナーゼ、ADPおよ
びキナーゼ基質用リン化合物のいずれかの２成
分、脂肪酸、CoASH、NAD、アシル−CoA・
シンセターゼ活性、アシル−CoA・オキシダー
ゼ活性、エノイル−CoA・ヒドラターゼ活性、
３−ヒドロキシアシル−CoA・デヒドロゲナー
ゼ活性、３−ケトアシル−CoA・チオラーゼ活
性の各活性を含有する酵素反応系におけるキナー
ゼ活性、ADPおよびキナーゼ基質用リン化合物
のいずれか１成分の定量測定用組成物を調製すれ
ばよい。またこれらの測定用組成物において前記
複合活性酵素を、エノイル−CoA・ヒドラター
ゼ活性、３−ヒドロキシアシル−CoA・デヒド
ロゲナーゼ活性、および３−ケトアシル−
CoA・チオラーゼ活性の代りに用いることが好
ましく、さらに水溶性マグネシウム塩を含有せし
めることが好ましい。さらにこの測定用組成物に
カタラーゼやFAD（フラビンアデニンジヌクレオ
チド）を含有せしめることが好ましく、その他、
非イオン系界面活性剤、例えばトリトンＸ−100
（商品名）を含有せしめて測定用組成物となして
もよく、また一般に中性ないし弱アルカリ性の水
または緩衝液を用いて溶液となしてもよい。 次いでこのようにして得られた測定用組成物を
用いて、種々の被検液中のATPを測定するので
あるが、まず用いられる被検液の量としては通常
5μ以上を用いて、測定用組成物の通常１ml以
上の溶液に加えればよく、またその際の反応条件
としては、例えば反応温度は通常37℃近辺にて行
なえばよい。また反応時間としては特に限定され
るものでなく、反応時間は長時間とする方がより
高感度に変化を生ずるもので、通常20秒以上であ
ればよく、好ましくは30秒〜10分間程度である。
さらに反応媒体としては用いる各酵素活性の安定
PH域の媒体であればよく、通常弱酸性ないし弱ア
ルカリ性、例えばPH6.5〜8.5のリン酸緩衝液、ト
リスーHCl緩衝液、イミダゾール−HCl緩衝液、
ジメチルグルタール酸−NaOH緩衝液、ピペス
（PIPES）−NaOH緩衝液が用いられる。 このようにして反応せしめた後反応において検
出できる変化を測定するのであるが、この検出で
きる変化とは、１回のβ−酸化サイクルにて少な
くとも１分子の成分を消費するか、または生成す
る成分の変化である。簡便には反応に用いられる
NADから反応工程によつて生成される還元型
NADの量の変化を検出し、定量測定することが
簡便である。この還元型NADの測定手段として
は、例えば用いるANDに特異的吸収波長でなく、
還元型NADに特異的吸収波長である吸収波長域
の波長に基いて吸光度測定すればよい。NADは
260nｍ近辺に特異的極大吸収波長を有し、還元
型NADは260nｍ近辺および340nｍ近辺に特異的
極大吸収波長を有するもので、それ故還元型
NADの測定のための特異的吸収波長である吸収
波長域としては320nｍ〜360nｍ近辺であり、好
ましくは340nｍ近辺の波長である。この波長に
より、生成される還元型NADの量を検出できる
変化として測定する。さらに還元型NADの測定
手段としては、還元型NADの水素原子の受容能
を有する水素原子伝達系色原体の発色による方法
も挙られる。この還元型NADの水素原子の受容
能を有する水素原子伝達系色原体としてはINT、
MTT、Neo−TB、NTB、TNTBやTBなどの
水溶性テトラゾリウム塩などの電子受容体が用い
られ好ましくは水溶性テトラゾリウム塩とともに
ジアホラーゼを用いてその電子伝達を良好にせし
めたものを用いればよい。このこの水素伝達系色
原体をあらかじめ前記の測定用組成物に添加して
用いてもよく、または反応後に添加してもよく、
反応後に生成する還元型NADはこの水素原子伝
達系色原体と反応して色の変化を生ぜしめ、この
色調の変化をその吸光波長により吸光度を測定す
ればよい。さらに生成する還元型NADについて
詳しく述べれば、本発明における、、、
反応工程にて形成されるβ−酸化サイクルにおい
ては触媒する酵素の脂肪酸の炭素鎖長に対する基
質特異性から炭素数２で止まる。従つて炭素数16
個または18個の飽和脂肪酸であるパルミチン酸や
ステアリン酸の場合には７サイクルまたは８サイ
クルの反応を生じるもので、１モルのパルミチン
酸やステアリン酸から７モルまたは８モルの還元
型NADを生成する。さらに炭素数18の１つの不
飽和結合を有するオレイン酸の場合も８モル比の
還元型NADを生成する。このように飽和脂肪酸
または１つの不飽和結合を有する脂肪酸における
サイクル反応数は、その脂肪酸の炭素鎖長から反
応の止まる炭素数２の差を求め、さらにその値を
β−酸化サイクルにおける炭素数２の消失による
２での商を求めた値となるものである。さらに炭
素数18の２つの不飽和結合を有する脂肪酸である
リノール酸の場合には、３−ヒドロキシアシル−
CoA・デヒドロゲナーゼ活性の作用における立
体異性体に対する基質特異性のために５モル比の
還元型NADを生成して反応が終了する。また２
以上の不飽和結合を有する脂肪酸を用いる場合に
はエノイル−CoA・イソメラーゼや３−ヒドロ
キシアシル−CoAエピメラーゼの存在下におい
てはその立体異性体に基く基質特異性の影響をう
けないために、前記と同様に脂肪酸の炭素鎖長に
よる還元型NADを生成するものである。しかし、
２以上の不飽和結合を有する脂肪酸を用いる場合
にはそのβ−酸化サイクルが20秒以内と極めて短
時間に終了するために、ATP定量に当つては特
に好適である。このようにATP1モルに対して５
モル以上の還元型NADを生成するものであるこ
とから高感度にてATPまたはATPを遊離する酵
素反応系の１つの成分を測定できるものである。
さらにまたこの還元型NADの別の測定手段とし
て、例えばこの還元型NADにレザズリンなどの
蛍光用試薬の共存下ジアホラーゼを作用せしめて
反応によつて生成する蛍光成分の量を定量しても
よく、さらにこの還元型NADを基質とする酵素、
例えば還元型NAD・オキシターゼ活性を用いて
この酵素反応に基いて変化する成分を測定すれば
よく、好ましくは公知の固定化手段により固定化
酵素として加工せしめ、この固定化酵素を酸素電
極などに具備せしめた還元型NAD・オキシター
ゼ酵素電極を用いることにより、反応系に生成し
た還元型NADに作用して消費される酸素の量を
電気的に測定することによる還元型NADの測定
方法も利用できるもので、公知の種々の還元型
NADの定量手段が用いられる。さらにこの測定
された還元型NADの量に基いて、ATP含有量が
算出され、さらにこのATP含有量から被検液中
の酵素反応系におけるキナーゼ活性、ADPおよ
びキナーゼ基質用リン化合物の定量値が算出され
る。さらに前記の還元型NADを測定する代りに
反応において消費される酸素の量または生成され
る過酸化水素の量を検出できる変化として、例え
ば酸素電極または過酸化水素電極による電気的変
化にて測定してもよい。 このようにして、本発明の測定法および測定法
に基く組成分は、簡便かつ極めて高感度にて
ATPを測定し得るもので、さらにATPを遊離せ
しめる種々の被検液中の成分の測定のために利用
できる良好なもので、例えばクレアチンキナー
ゼ、ピルベートキナーゼやアセテートキナーゼな
どの酵素活性やクレアチンホスフエート、エノー
ルホスホピルベート、アセチルホスフエートや
ADPの定量において、簡便かつ高感度にて正確
に測定し得るものである。 次いで本発明の実施例および酵素の製造例を挙
げて具体的に述べるが、本発明はこれらによつて
何んら限定されるものではない。 実施例 １ 〔脂肪酸の選択〕 0.5M・イミダゾール−NCl緩衝液（PH7.0） 0.1ml 40ｍＭ・NAD 0.05ml 40ｍＭ・CoASH 0.05ml 50ｍＭ・MgCl2 0.03ml 10ｍＭ・ATP 0.1ml １ｍＭ・FAD 0.01ml アシル−CoA・シンセターゼ活性含有液（東洋
醸造社製、60U／ml） 0.02ml アシル−CoA・オキシダーゼ活性含有液（東洋
醸造社製、150U／ml） 0.1ml 複合活性酵素活性含有液（エノイル−CoA・ヒ
ドラターゼ活性400U／ml、３−ヒドロキシアシ
ル−CoA・デヒドロゲナーゼ活性200U／ml、３
−ケトアシル−CoA・チオラーゼ活性163U／
ml；東洋醸造社製；後述の複合活性酵素の製造例
参照） 0.1ml カタラーゼ（ベーリンガー社製、260000U／ml）
0.02ml 精製水 0.42ml 合計 1.0ml 上記組成を有する反応液1.0mlに、0.5ｍＭパル
ミチン酸、オレイン酸、リノール酸の各種脂肪酸
含有液20μを各々添加して37℃にて反応せし
め、添加後反応液における生成する還元型NAD
の量を340nｍの吸光度の増加の経時変化として
測定した。その結果は第４図に示す通りで、第４
図中実線（――）はリノール酸の場合、点線
（‐‐‐）はパルミチン酸の場合、一点鎖線（―‐
―‐）はオレイン酸の場合を示すものである。そ
の結果、パルミチン酸、オレイン酸の場合には、
約60〜70％の増加までは速く反応が進行するが、
終点に達するまでに３〜４分を必要とした。ま
た、リノール酸の場合は約20秒以内の極めて短時
間に終点に達したものであり、この結果から
ATP含有被検液による還元型NADに変換するに
はリノール酸を用いることが特に短時間で効率よ
くなし得るために好ましいと判断され、かつ30秒
程度の反応時間にて充分測定できるものと判断さ
れた。 〔リノール酸を用いるATPの定量〕 前記の反応液におけるATPの代りにリノール
酸を用いてATP測定用組成物を調製した。即ち
下記の組成を有する反応液を調製した。 0.5M・イミダゾール−HCl緩衝液（PH7.0） 0.1ml 40ｍＭ・NAD 0.05ml 40ｍＭ・CoASH 0.05ml 50ｍＭ・MgCl2 0.03ml 10ｍＭ・リノール酸（２％TritonX−100に溶解）
0.1ml １ｍＭ・FAD 0.01ml アシル−CoA・シンセダーゼ活性含有液（60U／
ml） 0.02ml アシル−CoA・オキシダーゼ活性含有液
（150U／ml） 0.1ml 複合活性酵素含有液（エノイル−CoA・ヒドラ
ターゼ活性400U／ml、３−ヒドロキシアシル−
CoA・デヒドロゲナーゼ活性200U／ml、３−ケ
トアシル−CoA・チオラーゼ活性163U／ml）
0.1ml カタラーゼ（260000U／ml） 0.02ml 精製水 0.42ml 合計 1.0ml この反応液1.0mlに、ATP含量０〜0.4ｍＭの
種々の濃度のATP溶液20μを加えて、37℃、１
分間反応せしめ、次いで反応終了後反応によつて
生成された還元型NADの量を波長340nｍでの吸
光度として測定した。その結果、第５図に示す通
りで、良好なATPの検量曲線が得られた。また
その結果に基いて還元型NADのミリ吸光係数か
ら計算するとATPに対して５モル比の還元型
NADが生成されたものであつた。 実施例 ２ 〔クレアチンキナーゼ活性測定〕 0.5M・イミダゾール−HCl緩衝液（PH7.0） 0.1ml 40ｍＭ・NAD 0.05ml 40ｍＭ・CoASH 0.05ml 50ｍＭ・MgCl2 0.03ml 10ｍＭ・リノール酸（２％TritonX−100に溶解）
0.1ml １ｍＭ・FAD 0.01ml アシル−CoA・シンセダーゼ活性含有液（60U／
ml） 0.02ml アシル−CoA・オキシダーゼ活性含有液
（150U／ml） 0.1ml 複合活性酵素含有液（エノイル−CoA・ヒドラ
ターゼ活性400U／ml、３−ヒドロキシアシル−
CoA・デヒドロゲナーゼ活性200U／ml、３−ケ
トアシル−CoA・チオラーゼ活性163U／ml）
0.1ml カタラーゼ 0.02ml 0.5M β−メルカプトエタノール 0.01ml 10ｍＭ ADP 0.1ml 0.2M クレアチンホスフエート 0.2ml 精製水 0.11ml 合計 1.0ml 上記の組成を有する反応液1.0mlに、クレアチ
ンキナーゼ（ベーリンガー社製；表示活性
380U／mg）の1μｇ／mlの溶液5μを添加し、37
℃にて反応せしめた。反応後反応によつて生成す
る還元型NADの量を波長340nｍの吸光度にて経
時的に測定した。 その結果を第６図に示す。またこの結果から１
分間あたりの吸光度増加は0.034であり、この値
からクレアチンキナーゼ活性を求めると
222.0U／mgであつた。なお算出式は以下の通り
である。 活性(U/mg)＝（１分間当りの増加値）
×１／6.1×５×1000／５×1000 また上記のクレアチンキナーゼ含有被検液の代
りにADP含有被検液を用い、かつその反応液に
おけるADPの代りにクレアチンキナーゼを用い
ることにより、簡便にADP定量用反応液が得ら
れる。またクレアチンホスフエートを被検液とし
て上記のクレアチンキナーゼ被検液の代りに用い
かつその反応液におけるクレアチンホスフエート
の代りにクレアチンキナーゼを用いることによ
り、簡便にクレアチンホスフエート定量用反応液
が得られる。 実施例 ３ 〔ピルベートキナーゼ活性測定〕 下記組成を有する反応液1.0mlにシグマ社ピル
ベートキナーゼ（タイプ）0.1U／mlの溶液を
５〜20μ添加して反応を開始し、37℃で340nｍ
における吸光度の増加を経時的に測定した。３分
間から４分間までの１分間あたりの吸光度の増加
と、ピルベートキナーゼ量との関係を第７図に示
した。第７図から明らかな通り酵素量と吸光度の
増加とは良好な直線関係が得られた。 0.2M トリエタノールアミン緩衝液（PH7.5）
0.15ml 10ｍＭ ホスホエノールピルビン酸 0.05ml 25ｍＭ MgCl2 0.1ml 100ｍＭ KCl 0.1ml 50ｍＭ ADP 0.1ml 50ｍＭ CoASH 0.05ml 10ｍＭ リノール酸（２％TritonX−100に溶解）
0.1ml 40ｍＭ NAD 0.05ml １ｍＭ FAD 0.01ml アシル−CoA・シンセターゼ活性含有液（60U／
ml） 0.02ml アシル−CoA・オキシダーゼ活性含有液
（150U／ml） 0.1ml 複合活性酵素含有液（エノイル−CoA・ヒドラ
ターゼ活性400U／ml、３−ヒドロキシアシル
CoA・デヒドロゲナーゼ活性200U／ml、３−ケ
トアシル−CoA・チオラーゼ活性163U／ml）
0.1ml 精製水 0.07ml 合計 1.0ml 実施例 ４ 〔アセチルホスフエートの定量〕 下記組成を有する反応液1.0mlに0.3ｍＭの種々
の濃度のアセチルホスフエート溶液20μを加え
て、37℃10分間反応を行なつた後、反応によつて
生成された還元型NAD量を波長340nｍでの吸光
度として測定した。その結果を第８図に示した。 0.2M トリエタノールアミン緩衝液（PH7.4）
0.2ml 20ｍＭ ADP 0.1ml 40ｍＭ CoASH 0.05ml 40ｍＭ NAD 0.05ml 50ｍＭ MgCl2 0.03ml 10ｍＭ リノール酸（２％TritonX−100に溶解）
0.10ml １ｍＭ FAD 0.01ml アシル−CoA・シンセターゼ活性含有液（60U／
ml） 0.02ml アシル−CoA・オキシダーゼ活性含有液
（150U／ml） 0.1ml 複合活性酵素含有液（エノイル−CoA・ヒドラ
ターゼ活性400U／ml、３−ヒドロキシアシル−
CoA・デヒドロゲナーゼ活性200U／ml、３−ケ
トアシル−CoA・チオラーゼ活性163U／ml）
0.1ml アセテートキナーゼ（シグマ社230U／ml）
0.05ml 精製水 0.19ml 合計 1.0ml 実施例 ５ 〔ADPの定量〕 下記組成を有する反応液1.0mlに０〜0.5ｍＭの
種々の濃度のADP溶液20μを加えて、37℃５分
間反応を行なつた後、反応によつて生成された還
元型NAD量を波長340nｍでの吸光度として測定
した。その結果、第９図に示す通りの良好な
ADPの検量線が得られた。 0.2M ピペス−NaOH 緩衝液（PH7.2） 0.2ml 40ｍＭ NAD 0.05ml 40ｍＭ CoASH 0.05ml 50ｍＭ MgCl2 0.03ml 10ｍＭ リノール酸（２％TritonX−100に溶解）
0.1ml １ｍＭ FAD 0.01ml 10ｍＭホスホエノールピルビン酸 0.1ml アシル−CoA・シンセターゼ活性含有液（60U／
ml） 0.02ml アシル−CoA・オキシダーゼ活性含有液
（150U／ml） 0.1ml 複合活性酵素含有液（エノイル−CoA・ヒドラ
ターゼ活性、400U／ml、３−ヒドロキシアシル
−CoA・デヒドロゲナーゼ活性200U／ml、３−
ケトアシル−CoA・チオラーゼ活性163U／ml）
0.1ml ピルベートキナーゼ（45U／ml） 0.1ml 精製水 0.14ml 合計 1.0ml 〔複合活性酵素の製造例〕 500ml容三角フラスコに100mlの培地（培地組
成：ペプトン1.5％、粉末酵母エキス0.5％、
KCl0.2％、NaCl0.1％、K2HPO40.1％、
MgSO40.05％、オレイン酸0.75％、PH7.0；15本
分）を入れ、120℃で加圧滅菌した後30℃にて、
シユードモナス・フラギ・Ｂ−0771（FERM−Ｐ
No.5701）を接種し、ロータリーシエーカーにて20
時間培養した。次いでこの培養物を併合し、
5000rpm、20分間遠心分離して培養菌体を得た。
さらに得られた菌体を1.50mgリゾチーム含有10ｍ
Ｍリン酸緩衝液（PH7.0）360mlに加えて可溶性の
粗製の複合活性酵素含有液（３−ヒドロキシアシ
ル−CoA・デヒドロゲナーゼ活性にて、その比
活性は3.0U／mgであつた。）340mlを得た。 得られた粗製の複合活性酵素290mlを氷槽中で
冷却後、予め−20℃に冷却したアセトン290mlを
添加し、生じた沈澱物を回収し、これを1MKCl
含有10ｍＭトリスー塩酸緩衝液（PH7.5）に溶解
し、さらに12000rpm、10分間遠心分離して不溶
物を除去した。得られた上清液の45mlを分取し、
これに22.5mlの飽和硫安溶液（PH7.0）を添加し、
生じた沈澱物を12000rpm、10分間遠心分離にて
除去した。次いで得られた上清液57mlに、さらに
飽和硫安溶液28mlを加えて沈澱せしめた。この沈
澱物を回収した後、1MKCl含有10ｍＭトリスー
塩酸緩衝液（PH7.5）の10mlに溶解し、10ｍＭト
リスー塩酸緩衝液（PH7.5）2.0に対して４℃で
20時間セルロースチユーブにて透析脱塩し、次い
でこれを凍結乾燥して、複合活性酵素粉末（３−
ヒドロキシアシル−CoA・デヒドロゲナーゼ活
性にて、その比活性は18.2U／mgであつた）77mg
を得た。 さらに得られた複合活性酵素粉末（３−ヒドロ
キシアシル−CoA・デヒドロゲナーゼ活性にて、
この比活性は18.2U／mgであつた。）77mgを20ml
の水に溶解し、これを、10ｍＭトリスー塩酸緩衝
液（PH7.5）で平衡化したDEAE−セフアロース
CL−6B（フアルマシア社製）のカラム（３×11
cm）にチヤージして吸着せしめ、同上緩衝液にて
カラムを洗浄した。次いで500mlの同上緩衝液と
0.4MKClを含んだ同上緩衝液500mlにて作製した
直線濃度勾配法による溶出を行なつた。52ml／時
間の流速で、９mlづつ分取し、各分画の酵素活性
を測定し、その活性画分（No.71〜80）90mlを得た
（３−ヒドロキシアシル−CoA・デヒドロゲナー
ゼ活性にて、その比活性は30.0U／mgであつた。）
さらにこの活性画分を、10ｍＭリン酸緩衝液（PH
7.5）２に対して透析した後、ハイドロキシア
パタイトゲルを充填したカラム（２×10cm）にチ
ヤージして吸着せしめた。300mlの10ｍＭリン酸
緩衝液（PH7.5）と300mlの0.5Mリン酸緩衝液
（PH7.5）とにて作製した直線濃度勾配法により溶
出を行なつた。33ml／時間の流速で５mlづつ分取
し、各分画の酵素活性を測定し、活性画分（No.46
〜62）85mlを得た（エノイルアシル−CoA・ヒ
ドラターゼ活性の比活性は210.3U／mg、３−ヒ
ドロキシアシル−CoA・デヒドロゲナーゼ活性
の比活性は105U／mg、３−ケトアシル−CoA・
チオラーゼ活性の比活性は85.6U／mgであつた）。
次いでこの活性画分を、限外過膜（アミコン社
製XM−50）を用いて濃縮後、これを、トヨパー
ルHW−60（東洋曹達社製）を充填したカラム
（1.1×90cm）にチヤージしてゲル過した（溶
媒：10ｍＭトリスー塩酸緩衝液PH7.5、
0.5MKCl）。3.5mlづつ分取し、活性画分（No.23〜
27）17.5mlを得、これを凍結乾燥して精製された
複合活性酵素を得た（３−ヒドロキシアシル−
CoA・デヒドロゲナーゼ活性にて、その比活性
は110U／mgであつた。収量20mg）。
第１図はシユードモナス・フラギ・Ｂ−0771
（FERM−ＰNo.5701）から得られた複合活性酵素
の３−ヒドロキシアシル−CoA・デヒドロゲナ
ーゼ活性の至適PHを示す曲線を示し、第２図は該
複合活性酵素の３−ヒドロキシアシル−CoA・
デヒドロゲナーゼ活性のPH安定性を示す曲線を示
し、第３図は該複合活性酵素の３−ヒドロキシア
シル−CoA・デヒドロゲナーゼ活性の熱安定性
を示す曲線を示し、第４図は各種脂肪酸による還
元型NADの量の増加の経時変化を示し、第５図
はATPの検量曲線を示し、第６図はクレアチン
キナーゼによる還元型NADの量の増加の経時変
化を示し、第７図はピルベートキナーゼ活性に対
する還元型NADの量の増加によるピルベートキ
ナーゼ活性測定としての検量線を示し、第８図
は、アセチルホスフエートの検量線を示し、第９
図はADPの検量線を示す。
（FERM−ＰNo.5701）から得られた複合活性酵素
の３−ヒドロキシアシル−CoA・デヒドロゲナ
ーゼ活性の至適PHを示す曲線を示し、第２図は該
複合活性酵素の３−ヒドロキシアシル−CoA・
デヒドロゲナーゼ活性のPH安定性を示す曲線を示
し、第３図は該複合活性酵素の３−ヒドロキシア
シル−CoA・デヒドロゲナーゼ活性の熱安定性
を示す曲線を示し、第４図は各種脂肪酸による還
元型NADの量の増加の経時変化を示し、第５図
はATPの検量曲線を示し、第６図はクレアチン
キナーゼによる還元型NADの量の増加の経時変
化を示し、第７図はピルベートキナーゼ活性に対
する還元型NADの量の増加によるピルベートキ
ナーゼ活性測定としての検量線を示し、第８図
は、アセチルホスフエートの検量線を示し、第９
図はADPの検量線を示す。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 被検液中のATPを定量するに当たり、下記
の反応工程、、、、 キナーゼ、ADPおよびキナーゼ基質用リン
化合物からATPを遊離させるか、ATPを含有
している被検液に、脂肪酸とCoASHおよびア
シル−CoA・シンセターゼ活性を有する酵素
を作用させてアシル−CoAとする反応工程、 アシル−CoAを、酸素およびアシル−
CoA・オキシダーゼ活性を有する酵素により
過酸化水素およびデヒドロアシル−CoAにす
る反応工程、 デヒドロアシル−CoAを、水およびエノイ
ル−CoA・ヒドラターゼ活性を有する酵素に
よりヒドロキシアシル−CoAにする反応工程、 ヒドロキシアシル−CoAを、NADおよび３
−ヒドロキシアシル−CoA・デヒドロゲナー
ゼ活性を有する酵素により還元型NADおよび
ケトアシル−CoAにする反応工程、 ケトアシル−CoAを、CoASHおよび３−ケ
トアシル−CoA・チオラーゼ活性を有する酵
素によりアシル−CoAにする反応工程、 の反応のための試薬および酵素を含む反応工程に
おいて、工程にて生成されたアシル−CoAを
工程におけるアシル−CoAの基質としてサイ
クリング反応せしめ、少なくとも工程で用いた
脂肪酸の炭素数に応じた２サイクル以上のサイク
リング反応を形成し、次いでサイクリング反応の
サイクル数に応じて検出できる高モル比の消費さ
れた成分の量または生成された成分の量の少なく
とも一成分を測定し、必要に応じて工程におい
てアシル−CoA・オキシダーゼ活性を有する酵
素の代わりに同効工程としてアシル−CoAを、
電子受容体およびアシル−CoA・デヒドロデナ
ーゼ活性を有する酵素によりデヒドロアシル−
CoAにする工程を含む反応工程であることを特
徴とする定量法。 ２ 、および反応工程が、エノイル−
CoA・ヒドラターゼ活性、３−ヒドロキシアシ
ル−CoA・デヒドロゲナーゼ活性および３−ケ
トアシル−CoA・チオラーゼ活性の各酵素活性
を同一蛋白上に有してなる複合活性酵素の酵素活
性に基く反応工程である特許請求の範囲第１項記
載の定量法。 ３ 複合活性酵素が、シユードモナス・フラギに
属する複合活性酵素生産菌から得られた酵素であ
る特許請求の範囲第２項記載の定量法。 ４ シユードモナス・フラギに属する複合活性酵
素生産菌が、シユードモナス・フラギ・Ｂ−0771
菌である特許請求の範囲第３項記載の定量法。 ５ 生成する還元型NADの量の定量が、NADに
特異的吸収波長でなく、還元型NADに特異的吸
収波長である吸収波長域の波長による定量である
特許請求の範囲第１項記載の定量法。 ６ 吸収波長域の波長が、320nｍ〜360nｍ近辺
である特許請求の範囲第５項記載の定量法。 ７ 吸収波長域の波長が、340nm近辺である特許
請求の範囲第６項記載の定量法。 ８ 生成する還元型NADの量の定量が、還元型
NADの水素原子の受容能を有する水素原子伝達
系色原体の発色による定量である特許請求の範囲
第１項記載の定量法。 ９ 還元型NADの水素原子の受容能を有する水
素原子伝達系が、ジアホラーゼおよび水溶性テト
ラゾリウム塩を含有する水素原子伝達系である特
許請求の範囲第８項記載の定量法。 １０ 被検液中の成分が、ATPである特許請求
の範囲第１項記載の定量法。 １１ 被検液中の成分が、キナーゼ、ADPおよ
びキナーゼ基質用リン化合物から遊離される
ATPである特許請求の範囲第１項記載の定量法。 １２ キナーゼの測定、ADPの測定およびキナ
ーゼ基質用リン化合物の測定のいずれかの１つの
成分の測定である特許請求の範囲第１１項記載の
定量法。 １３ キナーゼの測定が、クレアチンキナーゼ、
ピルベートキナーゼ、アセテートキナーゼの測定
である特許請求の範囲第１２項記載の定量法。 １４ キナーゼ基質用リン化合物が、クレアチン
ホスフエート、ホスホエノールピルベート、アセ
チルホスフエートの測定である特許請求の範囲第
１２項記載の定量法。 １５ 少なくとも、下記組成 ・キナーゼ、ADPおよびキナーゼ基質用リン化
合物のいずれか２つの成分、 ・脂肪酸、 ・CoASH、 ・NAD、 ・アシル−CoA・シンセターゼ活性を有する酵
素、 ・アシル−CoA・オキシダーゼ活性を有する酵
素、 ・エノイル−CoA・ヒドラターゼ活性を有する
酵素、 ・３−ヒドロキシアシルCoA・デヒドロゲナー
ゼ活性を有する酵素、 ・３−ケトアシル−CoA・チオラーゼ活性を有
する酵素、 を含有する特許請求の範囲第１項記載の定量法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP21963682A JPS59130195A (ja) | 1982-12-14 | 1982-12-14 | Ａｔｐの新規定量法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP21963682A JPS59130195A (ja) | 1982-12-14 | 1982-12-14 | Ａｔｐの新規定量法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS59130195A JPS59130195A (ja) | 1984-07-26 |
| JPH027640B2 true JPH027640B2 (ja) | 1990-02-20 |
Family
ID=16738626
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP21963682A Granted JPS59130195A (ja) | 1982-12-14 | 1982-12-14 | Ａｔｐの新規定量法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS59130195A (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103822890B (zh) * | 2014-02-27 | 2016-01-20 | 中南大学 | 一种用于atp检测的方法及其配套的光学适配子传感器 |
-
1982
- 1982-12-14 JP JP21963682A patent/JPS59130195A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS59130195A (ja) | 1984-07-26 |
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