JPS5915637B2 - ピルビン酸オキシダ−ゼを用いる分析用キツトおよび分析法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、…約６．５〜８．５の範囲に至適ＰＨを有す
るピルビン酸オキシダーゼ（ＰｙｒｕｂａｔｅＯｘｉ−
Ｄａｓｅ）を用いる分析用キツトおよび分析法に関する
。

従来より、ピルビン酸オキシダーゼは、ピルビン酸、リ
ン酸および酸素からアセチルリン酸、二酸化炭素および
過酸化水素を生ずる反応を触媒するものであつて、この
酵素はＰＨ約５．５に至適…を有しており、ラクトパチ
ルス・デルブルツキイ（ＬａｃｔＯｂａｃｉｌｌｕｓｄ
ｅＩｂｒｉｉｃｋｉｉ）に存在することが報告されてい
る。

本発明者らは、静岡県田方郡大仁町の大根畑の土壌から
分離したペデイオコツカス（ＰｅｄｉＯｃＯ一Ｃｃｕｓ
）属に属する菌と同定されたＢ−０６６７株、ストレフ
トコッカス（ＳｔｒｅｐｔＯｃＯｃｃｕｓ）属に属する
と同定されたＢ−０６６８株がその培養物中に…約６．
５〜８．５の範囲に至適ＰＨを有するピルビン酸オキシ
ダーゼを産生することを見い出し、さらにこれらの生産
菌より得られたピルビン酸オキシダーゼがピルビン酸ま
たはピルビン酸を遊離する種々の系を含有する試料系に
おいて、有効にそのピルビン酸を分析し得ることを見い
出し、またピルビン酸の定量分析、ピルビン酸を生成す
る酵素反応系の酵素活性測定、ピルビン酸を生成する酵
素反応系の酵素の定量、ピルビン酸を生成する酵素反応
系の基質の定量をなし得ることを見い出した。

さらに研究の結果、少なくともＰＨ約６．５〜８．５の
範囲に至適ＰＨを有するピルビン酸オキシダーゼ、ＦＡ
Ｄ、チアミンピロフオスフエート、リン酸塩からなる反
応系を該ピルビン酸含有試料系と反応せしめることによ
り、良好にそのピルビン酸を分析し得、優れた分析用キ
ツトおよび分析法を確立した。さらにまた、該反応系に
おいてカルシウムイオン、コバルトイオン、マグネシウ
ムイオンまたはマンガンイオンを放出する該イオン放出
性の塩類を添加することにより、より良好なものが得ら
れ、またこの反応系に過酸化水素の呈色剤または螢光剤
などの指示楽を使用することによつて簡便かつ良好な分
析用キツトおよび分析法であることを見い出した。本発
明は上記の知見に基いて完成されたもので、…約６．５
〜８．５の範囲に至適ＰＨを有するピルビン酸オキシダ
ーゼを含有する反応系からなる分析用キツト、およびピ
ルビン酸またはピルビン酸を遊離する系を有してなる試
料系のピルビン酸の分析において、該試料系にＰＨ約６
．５〜８．５の範囲に至適…を有するピルビン酸オキシ
ダーゼを含有する反応系を作用せしめ、次いでその反応
によつて消費される成分または生成される成分を測定す
ることを特徴とする分析法であつて、その目的は有用な
分析用キツトおよび分析法を提供することである。

まず、本発明に使用されるＰＨ約６．５〜８．５の範囲
に至適…を有するピルビン酸オキシダーゼを含有する反
応系に用いられる…約６．５〜８．５の範囲に至適…を
有するピルビン酸オキシダーゼとしては、ピルビン酸、
無機リン酸および酸素からアセチルリン酸、二酸化炭素
および過酸化水素を生じる反応を触媒する酵素であれば
よく、好ましくはペデイオコツカス属に属する菌、スト
レフトコッカス属に属する菌、アエロコツカス属に属す
る菌で、ＰＨ約６．５〜８．５の範囲に至適…を有する
ピルビン酸オキシダーゼ生産菌、例えば同定されたペデ
イオコツカス・エス・ピ一・Ｂ＝０６６７（ＰｅｄｉＯ
ｃＯｃｃｕｓｓｐＢ−０６６７）株、ストレフトコッカ
ス・エス・ピ一・Ｂ−０６６８（ＳｔｒｃｐｔＯｃＯｃ
ｃｕｓｓｐ−Ｂ−０６６８）株やアエロコツカス・ビリ
ダンスＩＦＯｌ２２ｌ９（ＡｅｒＯｃＯｃｃｕｓｖｉｒ
ｉｄａｎｓＩＦＯｌ２２ｌ９）株、アエロコツカス・ビ
リダンスＩＦＯｌ２３ｌ７株、を培養して得られるＰＨ
約６．５〜８．５の範囲に至適…を有するピルビン酸オ
キシダーゼであり、またこれらの分離、同定した上記菌
株Ｂ−０６６７およびＢ−０６６８の菌学的性状および
その同定、命名の理由は次に記載する通りである。

以上の菌学的性状における、本菌Ｂ−０６６７，Ｂ−０
６６８はグラム陽性球菌で、カタラーゼ、オキシダーゼ
陰性で、グルコースから発酵的に酸を産生するが、糖（
グルコース）からガスを産生しないことなどから、バー
ジース・マニユアル・オブ・デイタミネイテイブ・バク
テリオロジイ一（Ｂｅｒｇｅｙ′ＳＭａｎｕａｌＯｆＤ
ｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅＢａｃｔｅｒｌＯｒＯｇｙ）
第８版（１９７４）および医学細菌同定の手引き（坂崎
利一訳）により検索すると、ペデイオコツカス属、スト
レフトコッカス属、が挙られ、さらに本菌とこれらの属
との鑑別にて性状を比較すれば、次の通りである。

（ただし、＋は８５％以上で陽性、−は８５％以上で陰
性、ｄは菌株または菌種によつて異なる、ことを示す）
従つて、本菌Ｂ−０６６７についてみれば、ペデイオコ
ツカス属またはストレフトコッカス属に属するものと認
められ、さらにその諸性状について医学細菌の同定の手
引き、ジヤーナル・オブ・シエネラル・ミクロバイオロ
ジ一（ＪＯｕｒｎａＩＯｆＧｅｎｅｒａｌＭｉｃｒＯｂ
ｌＯｌＯｇｙ）旦旦、１８５〜１９７（１９６１）にて
対比すればペデイオコツカス・ウリナーエクイ（Ｐｅｄ
ｉＯｃＯｃｃｕｓｕｒｉｎａ−Ｅｑｕｉ）とよく一致す
るが、バージース・マニユアル・オブ・デイタミネイテ
イブ・バクテリオロジイ一第８版（１９７４）における
ペデイオコツカス・ウリナーエクイの性状とは若干違つ
ているため、本菌Ｂ一０６６７をペデイオコツカス属に
属する菌と同定し、ペデイオコツカス・エス・ピ一・Ｂ
−０６６７（ＰｅｄｉＯｃＯｃｃｕｓｓｐ．Ｂ−０６６
７）と命名した。

さらに本菌Ｂ−０６６８についてみれば、その性状より
ペデイオコツカス属よりストレフトコッカス属に属する
菌と同定されるもので、さらに医学細菌同定の手引きに
て対比すればストレフトコッカス・フアエシウム・バリ
エタス・トランス（ＳｔｒｅｐｔＯｃＯｃｃｕｓｆａｅ
ｃｉｕＩｎｖａｒ．ｄｕｒａｎｓ）とよく似ているが、
バージース・マニユアル・オブ・デイタミネイテイブ・
バクテリオロジイ一第８版（１９７４）ではストレフト
コッカス・フアエンウム・バリエタス・トランスの記載
がないため詳細な対比が行なえなかつたため、よつて本
菌Ｂ−０６６８をストレフトコッカス・エス・ピ一・Ｂ
一０６６８（ＳｔｒｅｐｔＯｃＯｃｃｕｓｓｐ．Ｂ−０
６６８）と命名した。さらに、このペデイオコツカス・
エス・ピ一・Ｂ−０６６７、およびストレフトコッカス
・エス・ピ一・Ｂ−０６６８は、各々、工業技術院微生
物工業技術研究所に微生物受託番号通知書［微生物受託
番号 微工研菌寄第４４３８号、ＦＥＲＭ−Ｐ．／Ｆ６
４４３８」、および「微生物受託番号 微工研菌寄第４
４３９号、ＦＥＲＭ−ＰＡ６４４３９」として寄託した
。さらにまた、以下に述べる如くして、これらの菌株を
培養し、かつ目的たる…約６．５〜８．５の範囲に至適
…を有するピルビン酸オキシダーゼを得るものである。
使用菌としては、例えば上記のペデイオコツカス・エス
・ピ一・Ｂ−０６６７、ストレフトコッカス・エス・ピ
一・Ｂ−０６６８、アエロコツカス・ビリダンスＩＦＯ
ｌ２２ｌ９、アエロコツカス・ビリダンスＩＦＯｌ２３
ｌ７などが挙られるが、これらの菌だけに限らず、ペデ
イオコツカス属、ストレフトコッカス属またはアエロコ
ツカス属に属する菌で…約６．５〜８．５の範囲に至適
…を有するピルビン酸オキシダーゼを生産する菌は、す
べて本発明においては使用することができるもので、こ
れらを培養するに当つては、ペデイオコツカス属、スト
レフトコッカス属またはアエロコツカス属に属する…約
６．５〜８．５の範囲に至適ＰＨを有するピルビン酸オ
キシダーゼ生産菌を、酵素を生産する通常の方法で培養
する。

培養の形態は通常液体培養で行うか、工業的には深部通
気攪拌培養を行うのが有利である。培地の栄養源として
は、微生物の培養に通常用いられるものが広く使用され
得る。

炭素源としては同化可能な炭素化合物であればよく、例
えばグルコース・シユクロース、ラクトース、マルトー
ス、フラグドーズ、糖密、ピルビン酸などが使用される
。窒素源としては利用可能な窒素化合物であればよく、
例えばペプトン、肉工キズ、酵母工キズ、カゼイン加水
分解物などが使用される。その他、リン酸塩、炭酸塩、
硫酸塩、マグネシウム、カルシウム、カリウム、鉄、マ
ンガン、亜鉛などの塩類が必要に応じて使用される。培
養温度は菌が発育し、ＰＨ約６．５〜８．５の範囲に至
適…を有するピルビン酸オキシダーゼを生産する範囲内
で適宜変更し得るが、特に好ましくは２５〜３７℃程度
である。

培養時間は、条件によつて多少異なるが、…約６．５〜
８．５の範囲に至適ＰＨを有するピルビン酸オキシダー
ゼが最高収量に達する時期を見計つて適当な時期に培養
を終了すればよく、通常は１８〜４８時間程度である。
次いで、この様にして得られた培養物から聞約６．５〜
８．５の範囲に至適ＰＨを有するピルビン酸オキシダー
ゼを採取するのであるが、本酵素は主として菌体内に存
在する。本酵素を採取するには、まず得られた培養物を
沢過または遠心分離などの手段により、その菌体を採取
し、次いでこの菌体を機械的方法またはリゾチームなど
の酵素的方法にて破壊し、また必要に応じてエチレンジ
アミン四酢酸（ＥＤＴＡ）およびトリトンＸ−１００（
商品名）、アデカトールＳＯ−１２０（商品名）などの
界面活性剤を添加して…約６．５〜８．５の範囲に至適
…を有するピルビン酸オキシダーゼを可溶化して水溶液
として分離、採取する。

この様にして得た…約６．５〜８．５の範囲に至適…を
有するピルビン酸オキシダーゼの水溶液は、さらに濃縮
するか、または濃縮することなく可溶性塩類例えば硫安
、食塩などを用いて塩析せしめるか、さらに親水性有機
溶媒例えばメタノール、エタノール、アセトンなどを添
加することにより沈澱せしめればよい。さらにこの沈澱
物は、水に溶解し、半透膜にて透析せしめて、より低分
子量の不純物を除去することができる。また吸着剤ある
いはゲル済過剤などによる吸着タロマトグラフイ一、イ
オン交換クロマトグラフイ一あるいはゲルろ過などの手
段を用いて…約６．５〜８．５の範囲に至適…を有する
ピルビン酸オキシダーゼの溶液中の不純物を有効に除去
し、これらの手段により得られる酵素溶液は、減圧濃縮
凍結乾燥などの処理にて固形の…約６．５〜８．５の範
囲に至適…を有するピルビン酸オキシダーゼを得る。さ
らにこの…約６．５〜８．５の範囲に至適…を有するピ
ルビン酸オキシダーゼをより精製するに当つては、蛋白
質、酵素などの精製に通常用いられる手段、例えば吸着
クロマトグラフイ一、イオン交換クロマトグラフイ一、
ゲルろ過などを用いて精製すればよい。次に、このよう
にして得られた…約６．５〜８，５の範囲に至適ＰＨを
有するピルビン酸オキシダーゼの理化学的性質について
述べる。

なお、ペデイオコツカス・エス・ピ一・Ｂ−０６６７に
ついては単にＢ−０６６７、ストレフトコッカス・エス
・ピ一・Ｂ−０６６８についてはＢ−０６６８、アエロ
コツカス・ビリダンスＩＦＯｌ２２ｌ９についてはＩＦ
Ｏｌ２２ｌ９、アエロコツカス・ビリダンスＩＦＯｌ２
３ｌ７についてはＩＦＯｌ２３ｌ７としてその主産菌を
示す。（１）作用 ピルビン酸、無機リン酸および酸素からアセチルリン酸
、二酸化炭素および過酸化水素を生じる反応を触媒する
。

ＣＨ３ＣＯＣＯＯＨ＋ＨＯＰＯ３＋０２−ー→ＣＨ３Ｃ
ＯＯＰＯ「＋ＣＯ２＋Ｈ２Ｏ２（２）至適ＰＨ Ｂ−０６６７、Ｂ−０６６８、ＩＦＯｌ２２ｌ７および
ＩＦＯｌ２３ｌ７の各菌株より得られたＰＨ約６．５〜
８．５の範囲に至適ＰＨを有するピルビン酸オキシダー
ゼについて、反応聞の影響を求めた。

測定において、力価測定における緩衝液としてｐｌ］６
〜８の各リン酸塩緩衝液を使用し、各…でのＰＨ約６．
５，〜８．５の範囲に至適…を有するピルビン酸オキシ
ダーゼ活性の測定結果は、第１図に示す通りで、また第
１図における○○はＢ−０６６７、Δ−△はＢ−０６６
８、？一？はＦＯｌ２２ｌ９、☆−☆はＩＦＯｌ２３ｌ
７の各菌株により得られたＰＨ約６．５〜８．５の範囲
に至適ＰＨを有するピルビン酸オキシダーゼを示すもの
であり、それらのＰＨ約６．５〜８．５の範囲に至適Ｐ
Ｈを有するピルビン酸オキシダーゼの至適…は次の通り
である。

ただし、リン酸濃度、金属イオンの種類により多少の変
動が認められる。

（３）熱安定性 各４種の菌より得た酵素液０．１ｍ１に、１０μＭ（７
）ＦＡＤを含む１０ｍＭリン酸塩緩衝液（ＰＨ６．５）
０．９ｍ１を加え、０，４０，５０，６０および７０℃
で１０分間加熱した後、力価測定法に準じて、各加熱酵
素の活性を測定した。

その結果は、第２図に示す通りで、また第２図における
○−○はＢ−０６６７、△一△はＢ一０６６８、ローロ
はＩＦＯｌ２２ｌ９、★−★はＩＦＯｌ２３ｌ７の各菌
株による酵素を示すものであり、それらの熱安定性をみ
れば、Ｂ−０６６７、ＩＦＯｌ２２ｌ９、ＩＦＯｌ２３
ｌ７より得た酵素は４０２Ｃにおいて弱く活性化される
が６０℃以上ではほぼ完全に失活し、さらにＢ−０６６
８より得た酵素は４０℃における活性化の現象がみられ
ず、６０℃以上ではほぼ完全に失活する。（４） ＰＨ
安定性 各酵素溶液０．１ｗＬ１に、１０μＭＦＡＤを含む０．
２Ｍリン酸緩衝液（ＰＨ６〜８）および０．２Ｍトリス
一塩酸緩衝液（ＰＨ７〜９）を０．９Ｔｎ１加え、４０
℃で１０分間加熱した。

この加熱した酵素の酵素活性を、酵素液２０μ！を用い
、力価測定法に準じて測定した。その結果第３図に示す
通りで、また第３図における○−○（リン酸緩衝液）、
●−●（トリス一塩酸緩衝液）はＢ一０６６７、口一？
（リン酸塩緩衝液）、Ｉ−―（トリス塩酸緩衝液はＢ−
０６６８、Δ一△（リン酸緩衝液）、▲一▲（トリス一
塩酸緩衝液）はＩＦＯｌ２２ｌ９、☆−★（リン酸緩衝
液）、★−★（トリス一塩酸緩衝液）はＩＦＯｌ２３ｌ
７より得た酵素を示すもので、Ｂ一０６６７、ＦＯｌ２
２ｌ９およびＩＦＯｌ２３ｌ７より得た酵素はＰＨ７付
近で最も安定であり、Ｂ−０６６８より得た酵素は酸性
側で安定であつた。（５）種々の物質的影響 ４力価測定法において、Ｍ９Ｃｌ２の代りに、次に示す
種々の物質の水溶液を用いて、各菌体から得た酵素の酵
素活性を測定した。

また各物質の反応液中での濃度は５ｍＭであり、さらに
表示は５ｍＭＭ９Ｃ１２のときの活性を１００として相
対活性で示した。その結果、各菌体より得た酵素は、す
べて＋十 ＥＤＴＡに完全に阻害され、Ｍ９２、Ｃａ２，Ｍｎ２＋
およびＣＯ２＋により活性化されている。

◎ さらに、力価測定にて示す反応系より、下記の物質
を除去した場合の酵素活性を次表に相対活性として示し
た。なお、リン酸除去の場合は、緩衝液として０．１Ｍ
ジメチルグルタル酸一水酸化ナトリウム緩衝液を用い、
また相対活性において力価測定における反応液の未処理
のときの活性を１００としたものであ・る。以上のこと
より、各酵素は、コフΥクタ一としてチアミンピロフオ
スフエート、ＦＡＤが必要であり、また基質としてリン
酸を必要とするものであることが明らかである。

また酸素電極を用いて、酵素反応中における酸素消費電
極を用いた結果、酵素活性（過酸化水素の発生）に比例
した酸素の消費が認められた。

一方、反応生成物は、次表の通りであつた。なお、酸素
消費量は溶存酸素計（商品名ＹＳＩ−溶存酸素計ＭＯｄ
ｅｌ− ５３）を用い、アセチルリン酸の定量はＦ．Ｌ
ｉｐｍａｎｎらの方法〔Ｊ．ＢｉＯｌ．Ｃｈｅｍ．ｌ３
４、４６３−４６４（ １９４０）〕により、また過酸
化水素の定量はＮ，Ｎ−ジメチルアニリン、４−アミノ
アンチピリンおよびワサビのペルオキシダーゼによる方
法により測定した。以上の結果より、上記の４種の菌よ
り産生する酵素は、明らかに聞約６．５〜 ８．５の範
囲に至適聞を有するピリピン酸オキシダーゼと分類づけ
られるものであつて、さらにこれら４種の酵素はすべ．
てフラピン蛋白であつた。また本発明のＰＨ約６．５〜
８．５の範囲に至適ＰＨを有するピルビン酸オキシダ
ーゼの力価測定法は次の通りである。

０．５Ｍピルビン酸カリウム ０．１ゴ ０．５Ｍリン酸塩緩衝液（ ｐ［−１７．０） ０．２
ＴｆＬ１！，０．２％４−アミノアンチピリン ０．Ｉ
ＴＲＪ！，０．２％Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリン ０．２
ゴ１０ｍＭＭｇＣｔ２５０Ｉｔｔ１０ｍＭチアミノピロ
フオスフエート ２０Ｉｔ１ペルオキシダーゼ（４５／
ゴ） ０．１ゴ１ｍＭＦＡＤ１０μｌ 蒸留水 ０．２２ゴ 上記の組成の反応液１．０ゴを試験管に分取し、３７℃
、３分間予備加温した後、酵素液２０μｌを加えて３７
℃、１０分間反応を行い、反応後、０．ＩＭＥＤＴＡを
含む０．ＩＭクエン酸緩衝液（ＰＨ６．Ｏ）２ゴを加え
て反応を停止し、次いで生じた紫色を５６５ｎｍの波長
にて比色定量する。

１分間に１μＭＯｌｅの過酸化水素を生じる活性を１単
位とした。

さらにまた、このような…約６．５〜８．５の範囲に至
適ＰＨを有するピルビン酸オキシダーゼを含有する反応
系においては、対応するピルビン酸との酵素反応を良好
に行なわせしめるために、ＰＨ約６．５〜８．５の範囲
に至適…を有するピルビン酸オキシダーゼとともにＦＡ
Ｄ（フラビンアデニンジヌクレオチド）、チアミンピロ
フォスフェート、ｊン酸塩が用いられ、さらに酵素活性
を活性化するためにカルシウムイオン、コバルトイオン
、マグネシウムイオンまたはマンガンイオンを放出する
イオン放出性の塩類、通常塩化物の形にて併用すればよ
く、さらにまたこの反応によつて生成する成分である過
酸化水素を呈色または螢光にて測定する指示薬を用いる
際は、それに必要な指示薬を適宜選択使用すればよい。

また、これらの使用割合としては、該反応系がピルビン
酸またはビルピン酸を遊離する系を有してなる試料系の
ピルビン酸に対して充分に酵素反応せしめるものであれ
ばよく、また試料系中のピルピン酸の含量、酵素反応の
温度、時間などによつて適宜変更されるものであるが、
例えば１テスト当り、ＰＨ約６．５〜８．５の範囲に至
適ＰＨを有するピルビン酸オキシダーゼ１〜２００程度
使用すればよく、さらに、この…約６．５〜８．５の範
囲に至適…を有するピルビン酸オキシダーゼは、その酵
素活性を劣化せしめない状態にて、マイクロカプセル化
手段、有機または無機担体などの共有結合手段、吸着手
段などの酵素の固定化手段を施したものを用いてもよく
、またＦＡＤＯ．ｌ〜２０ｎｍ０ｉｅ程度、チアミンピ
ロフオスフエート０．０５〜０．５μＭＯＩｅ程度、リ
ン酸塩無機リン酸１〜１０μＭＯｌｅ程度、さらにイオ
ン放出性塩類０．０５〜１０Ｉｔｍ０１ｅ程度使用すれ
ばよい。

さらにまた過酸化水素の指示薬としては、…約６．５〜
８．５の範囲に至適…を有するピルビン酸オキシダーゼ
の酵素作用によつて生成する過酸化水素の指示薬である
ことにより、少なくとも生成する過酸化水素の量のモル
数と同程度以上を使用すればよく、なおその際ペルオキ
シダーゼを使用する場合には生成する過酸化水素に対し
酵素触媒として使用するため、通常０．５〜２０Ｕ程度
使用すればよい。さらにこれらは、好ましいＰＨ＆Ｃ調
整した緩衝液に溶解した状態にて使用することが好まし
い。次いでこのようにして得られた反応系を、ピルビン
酸の分析において使用するものであるが、対象とするピ
ルビン酸またはピルビン酸を遊離する系を有してなる試
料系としては、少なくともピルビン酸を含有してなるも
のであれば何んら限定されるものではなく、例えばピル
ビン酸そのもの、血清、尿中などに存在するピルビン酸
、乳酸と乳酸脱水素酵素、アデノシンジフオスフエート
（ＡＤＰ）とピルビン酸キナーゼ、グリセリン、グリセ
ロキナーゼおよびピルビン酸キナーゼなどの種々の酵素
の組合せによるピルビン酸を生成する酵素反応系などの
溶液が挙られ、さらにこのピルビン酸を生成する酵素反
応系を例示するに当つてその測定の目的とともに詳しく
述べれば次の通りである。

・乳酸の定量または乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の測定測
定を目的として、ＬＤＨ 乳酸 ピルビン酸＋ＮＡＤＨ２ＮＡＤ ・ＡＤＰの定量またはピルビン酸キナーゼ（ＰＫ）の測
定測定を目的として、 ＡＤＰ＋ホスフオエノールピルピン酸 ーー旦Ｋ→ ＡＴＰ＋ピルビン酸 ・グルタミン酸一ピルピン酸一トランスアミナーゼ（Ｇ
ＰＴ）の測定測定を目的として、アラニン＋α−ケトグ
ルタル酸 ＧＰＴ ピルビン酸＋グルタミン酸 ・グルタミン酸−オキザロ酢酸−トランスアミナーゼ（
ＧＯＴ）の測定測定を目的として、アスパラギン酸＋α
−ケトグルタル酸一９９工→ オキザロ酢酸＋グルタミ
ン酸オキザロ酢酸脱炭酸酵素 オキザロ酢酸 ピルビン酸＋ＣＯ２ ・グリセリンの定量またはグリセロホスホキナーゼ（Ｇ
Ｋ）の活性測定を目的として、グリセリン＋ＡＴＰ−９
Ｋ−一→ グリセロール−３−リン酸＋ＡＤＰ ＡＤＰ＋ホスフオエノールピルピン酸 一』」（→ ピルビン酸＋ＡＴＰ ・トリグリセラードの定量を目的として、トリグリモラ
イド Ｊパーゼ（またはリボプロデインリパーゼ）グリセリン
＋脂肪酸、グリセリン＋ＡＴＰｑＫ→グリセロール−３
−リン酸＋ＡＤＰＡＤＰ＋ホスフオエノールピルピン酸 −Ｊリ（一→ピルビン酸＋ＡＴＰ ・クレアチニンまたはクレアチンホスフオキナーゼ（Ｃ
ＰＫ）の測定測定を目的として、一、 クレアチニナー
ゼ クレアチニン クレアチンＣＰＫ
クレアチン＋ＡＴＰ クレアチンリン酸＋ＡＤＰ ＡＤＰ＋ホスフオエノールピルピン酸 −ーＫ→ピルビン酸＋ＡＴＰ ・ミオキナーゼの測定測定を目的として、ミオキナーゼ ＡＴＰ＋ＡＭＰ゛ ２ＡＤＰ ＡＤＰ＋ホスフオエノールピルピン酸 ＰＫ ピルビン酸＋ＡＴＰ ・脂肪酸の定量またはチオキナーゼの活性測定を目的と
して、チオキナーゼ゛ 脂肪酸＋ＣＯＡ＋ＡＴＰ アシル−ＣＯＡ＋ＡＭＰ＋ＰＰｉ ミオキナーゼ ＡＭＰ＋ＡＴＰ゛ ２ＡＤＰ ＡＤＰ＋ホスフオエノールピルピン酸 ーー」り（→ピルビン酸＋ＡＴＰ これらの酵素反応系は例示であり、このピルビン酸を生
成する系は、適宜その酵素とこの酵素の基質を組合せる
ことによりなし得るものであり、特に主体成分が挙られ
るものである。

また上記の通り、ピルビン酸を遊離する系においては、
それらの酵素反応系によつて生成するピルビン酸を測定
するものであるから、このピルビン酸の測定は、同時に
その酵素の定量、その酵素活性の測定、または対応する
基質の定量を目的として使用するものである。次いで、
この試料系と反応系とをインキユベートして反応せしめ
るのであるが、まず一定量の反応系をキツト化せしめ、
このキツトに応じて対応する消費される成分または生成
される成分を測定するのである。

この測定する成分において、この消費される成分として
は好ましくは酸素の量の測定である。この消費される酸
素の量の測定においては溶存酸素計を使用することが挙
られる。またこの場合においては、酸素の測定であるた
め、上記の反応系における過酸化水素の指示薬の存在を
必要としないものである。さらに測定において、反応に
よつて生成される成分の測定としては、好ましくは過酸
化水素の量の測定である。この生成される過酸化水素の
量の測定においては過酸化水素電極計、例えばＹＳＩ社
製−オキシダーゼメーターを用いるか、または過酸化水
素の指示薬を用いて比色定量または螢゛光定量を行なえ
ばよい。さらに、このように反応せしめるに当つては反
応系および試料系を一定時間、好ましくは１０〜６０分
間程度、一定温度、好ましくは２０〜４０゜Ｃ、特に約
３５〜３７℃にて反応せしめればよく、その結果、上記
の如く反応系からなる消費される成分または生成される
成分を測定するものである。特に上記した生成される成
分である過酸化水素の測定におけるその指示薬としては
、過酸化水素の存在下で色調変化または螢光変化を受け
る１種もしくは２種以上の呈色剤または螢光剤からなる
組合せを使用すればよく、それらの指示薬について述べ
れば、例えば生成する過酸化水素と反応して安定した赤
色を形成する４価のチタン化合物とキシレノールオレン
ジによつて生成する過酸化水素の量をその呈色の強さに
よつて測定するか、フエノールまたはＮ，Ｎ−ジメチル
アニリンまたはホモバニリン酸などと４−アミノアンチ
ピリンおよびペルオキシダーゼとの反応によつて、その
色調または螢光の変化を測定してなる種々の組成が挙ら
れ、また上記の４−アミノアンチピリンの代りに４−ア
ミノフエナゾーンを用いてもよく、さらに２，６−ジタ
ロルフエノールインドフエノールとペルオキシダーゼと
の組合せ、グアヤク脂とペルオキシダーゼとの組合せな
どによるペルオキシダーゼを用いる種々の組成、方法が
挙られ、さらにこの指示薬においては溶液としてあらか
じめその目的に応じて混合使用して調整してもよい。ま
たこの反応後における測定において、消費される酸素の
量、生成される過酸化水素の量を上記の種々の手段を用
いて求め、次いで対応するピルビン酸の量をそれぞれ対
応する検量線より算出すればよく、さらに指示薬による
過酸化水素の量の測定においてはその指示薬による比色
または螢光に適する波長、例えば５６５ｎｍによる吸光
度測定を行なえばよい。さらにまた、消費される成分と
してリン酸塩や生成される成分としてアセチルリン酸を
、公知の手段を用いて測定してもよい。以上の如くして
行なうことにより、…約６．５〜８．５の範囲に至適…
を有するピルビン酸オキシダーゼを含有する反応系から
なる分析用キツト、お．よびこれを用いてなる種々の分
析法を良好になし得るものであつて、例えば上記の如く
、ピルビン酸試薬中のピルビン酸の測定、血清、尿中な
どのピルビン酸の測定、乳酸脱水素酵素、ピルビン酸キ
ナーゼ、グルタミン酸−ピルビン酸−トランスアミナー
ゼ、グルタミン酸一オギザロ酢酸−トランスアミナーゼ
、グリセロキナーゼ、リパーゼ、リポプロテインリパー
ゼ、クレアチニンホスフオキナーゼ、ミオキナーゼ、チ
オキナーゼなどの酵素活性や乳酸、ＡＤＰ、グリセリン
、トリグリセラード、クレアチニン、脂肪酸などの主に
生体成分の診断に必要な成分の測定に有用に利用される
ものであり、これらの有用性はピルビン酸を遊離する種
々の系に利用され得るものである。次に、本発明の実施
例および参考例を挙げるが本発明は何んらこれらによつ
て限定されるものではない。

実施例 １ ０．２Ｍジメチルグルタル酸−ＮａＯＨ緩衝液５ｍ１上
記の組成を有する反応系を凍結乾燥して、ピルビン酸の
分析用キツト（酸素電極用、５０回分）を得た。

実施例 ２ 後述参考例２で得られたピルビン酸オキシダ一０．２Ｍ
ジメチルグ）レタノｋ俊−ＮａＯＨ緩衝液 ５ｄペル
オキシダーゼ（１００Ｕ／η、ワサビ製）２．５η０．
３％４−アミノアンチピリン ５ｍ１上記組成を
有する反応系を凍結乾燥して、ビルピン酸の分析用キツ
ト（比色測定用、５０回分）を得た。

なお添付試薬（１）として２５μＭＯｌｅのＭｎｃｚ２
を含む０．２％Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリン水溶液５０ａ
、および反応停止剤として０．１ＭＥＤＴＡを含む０．
１Ｍクエン酸緩衝液（ＰＨ６．Ｏ））１００７１Ｌ１を
添付した。

実施例 ３ 実施例１のキツトを蒸留水５０ｗＬ１に溶解し、この溶
液１．０ｍ１を分取して反応槽にとり、これに５．０ｍ
Ｍピルビン酸溶液０〜１００μ１１または人血清５０Ｉ
ｔ１および５．０冨Ｍ、ピルビン酸溶液０〜１００μｌ
、を加え３７゜Ｃで反応を行ない、その際の酸素消費量
をガルバニ一型酸素電極を用い測定した結果を第４図に
示した。

なおＯ−○はピルビン酸のみ、Δ−△は５０μ′人血清
にピルビン酸を添加した場合を示す。また実施例１のキ
ツトを蒸留水２５ＴＩＬｅに溶解し、この溶液０．５ｄ
を反応槽にとり、人血清０−０．５ｄを含む水溶液０．
５１ｎｉを添加し、３７℃で反応を行いこの時の酸素消
費量をガルバニ一型酸素電極を用いて測定した結果を第
５図に示した。その結果、第４図、第５図に示す通り、
それぞれの場合において、良い直線性が得られた。実施
例 ４ 実施例２に記載した凍結乾燥組成物をその添付試薬５０
Ｔｎ１を加えて溶解し、これを小試験管に１ｄずつ分注
し、３７℃に予備加温する。

これに５ｍＭピルビン酸カリウム溶液０〜５０μ！、叉
は人血清をそれぞれ、５０１ｔ１添加後さらに５ｍＭピ
ルビン酸カリウム溶液をＯ〜５０μ２添加し、３７℃で
１０分間反応を行い、反応後添付停止試薬２Ｔ１Ｌ１を
添加後、５６５ｎｍで吸光度を測定した。その結果を第
６図に示した。なお図中、○−Ｏはピルビン酸カリウム
、●−●は人血清５０μ！にピルビン酸添加、Δ−△は
過酸化水素による検量線を示す。その結果、それぞれの
場合ともに良い直線性が得られた。また上記ピルビン酸
の代りに２．５ｍＭ．過酸化水素０〜５０μＺを用いて
求めた検量線と良く一致し、良い定量性が得られた。ま
た、人血清０〜０．５Ｔ！Ｌｌを小試験管に分取し、そ
れぞれに蒸留水を加え、全量を０．５ｍ１とし、これに
実施例２の溶解液１．０ｄを添加し、３７℃で１０分間
反応した後、１．５Ｔ！Ｌｌの停止液を加えた後、５６
５ｎｍで比色定量した。その結果を第７図に示したもの
であり、その結果が良好な定量性が得られた。実施例
５ ０．２Ｍジメチルグルタール酸緩衝液（ＰＨ７．５）０
．２ｄ上記組成物に蒸留水を加えて１．０ｄとし、３７
℃に予備加温した後、ピルビン酸オキシダーゼ溶液（２
００Ｕ／ｄ）を２０μ！加え３７℃で１０分間反応した
後０．１Ｍ．ＥＤＴＡを含む０．１Ｍクエン酸緩衝液（
ＰＨ６．Ｏ）２．０Ｔｎ１を加え反応停止後、５６５ｎ
ｍにおける吸光度を測定した。

その結果、第８図（○一○）に示した通りであつて、Ａ
ＤＰ、ピルビン酸キナーゼ、ホスフオエノールピルピン
酸などを用いて、その生成する過酸化水素を測定して良
好な定量結果を得た。なお、図中、△一△は５ｍＭＡＤ
Ｐの代りに２．５ｍＡ過酸化水素を用いた検量線を示す
。実施例 ６ 上記反応組成物よりなる反応系を凍結乾燥し、グリセラ
ード測定用キツトとした。

さらに添付試薬〔１〕として、２５μＭＯｌｅｓＯＭｎ
Ｃｌ２を含む０．２％ジメチルアニリン溶液５０Ｔｆ１
１および反応停止液として０．１Ｍ．ＥＤＴＡを含む０
．１Ｍクエン酸緩衝液（ＰＨ６．Ｏ）１００ｄを添付し
た。実施例 ７実施例６の凍結乾燥物全量を添付試薬〔
１〕を用いＴ溶解し、その溶液１．０ｍ１を小試験管に
分注し、それぞれ、０〜５０μ！の人血清（１．０２μ
ＭＯｌｅｓ／ＴＩＬＩのトリグリセラード含有）、５ｍ
Ｍグリセリン溶液、４．２ｍＭトリオレインの０．１％
ＴｒｉｔＯｎＸ−１００溶液、２．５ｍＭの過酸化水素
溶液の各々を加え、３７℃で１０分間反応した。

その結果を第９図に示したものであつて、良好な直線性
が得られ、また過酸化水素による検量線とも良く一致し
、良好な定量性が認められた。なお図中、○一○はグリ
セリン、●一●はトリオレイン、▲一▲は人血清を、ま
た、△−△は過酸化水素による検量線の測定結果を示す
ものである。実施例 ８試薬１ ０．２Ｍジメチルグ）レタル酸−ＮａＯＨ緩衝液（ＰＦ
Ｉ７．５）３０ａ試薬２ 上記の試薬１（ＧＰＴ測定用）、試薬２（ＧＯＴ測定用
）のそれぞれの組成を有する反応系を凍結乾燥して、各
々１００テスト用のＧＰＴ，ＧＯＴ活性測定用キツトを
得た。

さらにその添付試薬〔１〕としで４２μＭＯｌｅｆ）Ｍ
ｎＣｌ２含有０．２％ジメチルアニリン溶液２１０ＷＬ
１（各キツトに対し、１００ｄづつ使用）、および反応
停止液として ！０．１Ｍ０）ＥＤＴＡを含む０５２
Ｍクエン酸緩衝液（Ｓ］５．０）４２０ｍｉ（各キツト
に対して２００ｍ１づつ使用：１テスト当り２．０Ｔｎ
１使用）を添付した。これらをもつて、血清トランスア
ミナーゼ活性測定用キツトとした。
１実施例 ９実施例８の試薬１の凍結乾燥物
たるＧＰＴ活性測定用キツト、および試薬２の凍結乾燥
物たるＧＯＴ活性測定用キツトの全量に、添付試薬〔１
〕１００ｍ１を各々に加えて溶解し、それぞれの溶液１
．０ＴｆＬ１を小試験管に分注し、３７℃で５分間予備
加温した。

次いでそれに、標準血清（カルビオケム社製、商品名：
ＭａｘｉｔＯｌ：ＧＰＴ７ＯＯＫＵ、ＧＯＴｌＯＯＯＫ
Ｕ／ＴｆＬｌ含有）を一定比率で希釈した溶液２０μＺ
を添加し、３７℃で１０分間反 二応し、反応後各々に
反応停止液２．０ＷＬｅを添加した後５６５ｎｍでその
吸光度を測定した。その結果、第１０図に示す通りであ
り、またその第１０図中●−●はＧＰＴ活性測定の結果
を示し、その第１０図中０−０はＧＯＴ活性測定の結２
果を示したもので、両酵素活性測定において、ともに吸
光度１．０付近（酵素活性約７５０ＫＵ／ｄ）まで良好
な直線性が得られた。

実施例 １０ 実施例８の試薬１の凍結乾燥物たるＧＰＴ活性５測定用
キツト、および試薬２の凍結乾燥物たるＧＯＴ活性測定
用キツトの全量に、添付試薬〔１〕１００ｄを各々に加
えて溶解し、それぞれの溶液１．０ｄを小試験管に分注
し、３７℃で５分間予備加温した。

次いで、それに各々人血清（４５種） ５２０μＺを添
加し、３７℃で２０分間反応し、反応後各々に反応停止
液２．０ｄを添加した後５６５ｎｍで吸光度を測定した
。さらに上記人血清について、ＬＫＢ社製ＧＯＴ，ＧＰ
Ｔ測定用キツト（酵素を用いる紫外部吸収法）（ＬＫＢ
法）で測・定し、そのＧＰＴ，ＧＯＴの活性の相関を求
めた。その結果、ＧＰＴ測定の場合の相関図は、第１１
図に示す通りであり、その相関係数γ０．９９８、回帰
式ｙ＝０．００２９５ｘ＋０．００３２、であつた。

また、ＧＯＴ測定の場合相関図は、第１２図に示す通り
であり、その相関係数γ＝０．９９６、回帰式ｙ＝０．
００２８７ｘ＋０．０１８０、であつた。

参考例 １グルコース１％、ペプトン１％、酵母工キズ
０．５％、Ｎａｃ！０．２％、ＫＨ２ＰＯ４Ｏ．ｌ％、
Ｋ２ＨＰＯ４Ｏ．ｌ％、Ｍ９ＳＯ４Ｏ．Ｏ５％、および
ＣａｃＯ３Ｏ．３％を含有する培地（ＰＨ７．Ｏ）１０
０Ｔｎ１を、５００ｍ１容三角フラスコに分注し、１２
０℃、２０分間加熱減菌した後、ペデイオコツカス・エ
ス・ピ一Ｂ一０６６７、ストレフトコッカス・エス・ピ
一ＢＯ６６８、アエロコツカス・ビリダンスＩＦＯｌ２
２ｌ９、アエロコツカス・ピリダンスＩＦＯｌ２３ｌ７
の各々の菌株を接種し、各々３０℃、２４時間、３００
ｒｐｍの条件下振盪培養し、培養終了後培養物を遠心分
離して菌体を回収し、１０ｍＭリン酸塩緩衝液（ＰＨ６
．５）にて洗浄後、再び遠心分離して菌体を回収した。

次いで、この得られた菌体を、０．０２％リゾチームお
よび０．１％トリトンＸ−１００を含有する１０ｍＭリ
ン酸緩衝液（ＰＨ７．Ｏ）１０ＴｆＬ１に添加して、３
７゜Ｃで６０分間リゾチームを作用せしめた後、遠心分
離して、ピルビン酸オキシダーゼを含有する上清液を得
た。この上清液中の酵素活性は、各々次表に示す通りで
あつた。参考例 ２ 参考例１と同一の組成を有する培地２０′を、３０１容
シャー・フアーメイン一に加えて加熱滅菌した後、これ
に、参考例１と同様の方法にて予備培養したペデイオコ
ツカス・エス・ピ一Ｂ一０６６７の培養液２００ｍ１を
移植し、３０℃にて２４時間培養し、培養後、この培養
物を遠心分離して菌体（約１００ｆ１）を回収し、これ
を４１のリゾチーム溶液（０．２ｍｆ／ＩｆＬｌ）に浮
遊せしめ、さらにこれに４９のトリトンＸ−１００（商
品名）、３９のＥＤＴＡｌ４Ｏｄの１Ｍリン酸塩緩衝液
（ＰＦＩ６．５）を加え、３７℃で６０分間攪拌し、菌
体を破壊し、次いで得られた溶液を遠心分離して、その
上清液（約６０００Ｕ含有）を得た。

次いで、この上清液に硫安を添加し、その０．５４〜０
．７３飽和硫安で沈澱した画分を遠心分離して回収し、
得られた沈澱物を１０００ａの１０ｍＭリン酸塩緩衝液
（ＰＨ６．５）に加えて溶解し（５１６０Ｕ、回収率８
６％）、この溶液に０．６３容の冷アセトンを加えて遠
心分離して生じた沈澱物を除去し、得られた上清液に、
さらに０．３容のアセトンを加えて生じた沈澱物を遠心
分離して回収した。さらにこの沈澱物を、１０ｍＭリン
酸塩緩衝液（ＰＨ６．５）７０ｍ１に溶解し（４７５０
Ｕ、回収率７９．２％）、さらに硫安分画を行い、０．
５４〜０．７０飽和硫安で沈澱した画分を遠心分離して
、澱物を回収し、これを１０ｍＭリン酸塩緩衝液（ＰＨ
６．５）に溶解後、セフアデツクスＧ−２５（商品名）
のカラム（６．０×７０（Ｖ７！）にチヤジして、２８
０ｎｍの吸収を有する画分を回収、併合し、次いで凍結
乾燥してピルビン酸オキシダーゼ粉末（３９４０Ｕ、７
５８η、回収率６５．７％）を得た。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明のピルビン酸オキシダーゼの至適…、第
２図は本発明のピルビン酸オキシダーゼの熱安定性、第
３図は本発明のピルビン酸オキシダーゼの…安定性を示
すもので、第４図は本発明のピルビン酸オキシダーゼを
用いたピルビン酸の酸素電極による測定結果を、第５図
は本発明のピルビン酸オキシダーゼを用いた血清中ピル
ビン酸の酸素電極を用いた測定結果、第６図は本発明の
ピルビン酸オキシダーゼを用いたピルビン酸の比色法に
よる測定結果、第７図は本発明のピルビン酸オキシダー
ゼを用いた血清中のピルビン酸の定量結果を示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ ピルビン酸またはピルビン酸を遊離する系を有して
   なる試料系のピルビン酸の分析において、該試料系に少
   なくともｐＨ約６．５〜８．５の範囲に至適ｐＨを有す
   るピルビン酸オキシダーゼ、ＦＡＤ、チアミンピロフォ
   スフェート、リン酸塩およびカルシウムイオン、コバル
   トイオン、マグネシウムイオンおよびマンガンイオンか
   らなるイオン放出性塩類の群より選ばれる塩類を含有す
   る反応系を作用せしめ、次いでその反応によつて消費さ
   れる成分または生成される成分を測定することを特徴と
   する分析法。 ２ ピルビン酸を遊離する系が、ピルビン酸を生成する
   酵素反応系である特許請求の範囲第１項記載の分析法。 ３ ｐＨ約６．５〜８．５の範囲に至適ｐＨを有するピ
   ルビン酸オキシダーゼを含有する反応系が少なくともｐ
   Ｈ約６．５〜８．５の範囲に至適ｐＨを有するピルビン
   酸オキシダーゼ、ＦＡＤ、チアミンピロフォスフェート
   、リン酸塩、カルシウムイオン、コバルトイオン、マグ
   ネシウムイオンおよびマンガンイオンからなるイオン放
   出性塩類より選ばれる塩類、および過酸化水素の指示薬
   からなる反応系である特許請求の範囲第１項記載の分析
   法。 ４ 過酸化水素の指示薬が、ペルオキシダーゼ、４−ア
   ミノアンチピリンおよびフェノールまたはＮ，Ｎ−ジメ
   チルアニリン、またはホモバニリン酸からなる指示薬で
   ある特許請求の範囲第３項記載の分析法。 ５ ｐＨ約６．５〜８．５の範囲に至適ｐＨを有するピ
   ルビン酸オキシダーゼが、ペデイオコッカス属に属する
   ｐＨ約６．５〜８．５の範囲に至適ｐＨを有するピルビ
   ン酸オキシダーゼ生産菌より得られた酵素である特許請
   求の範囲第１項または第３項記載の分析法。 ６ ｐＨ約６．５〜８．５の範囲に至適ｐＨを有するピ
   ルビン酸オキシダーゼが、ストレプトコッカス属に属す
   るｐＨ約６．５〜８．５の範囲に至適ｐＨを有するピル
   ビン酸オキシダーゼ生産菌より得られた酵素である特許
   請求の範囲第１項または第３項記載の分析法。７ ｐＨ
   約６．５〜８．５の範囲に至適ｐＨを有するピルビン酸
   オキシダーゼが、アエロコッカス属に属するｐＨ約６．
   ５〜８．５の範囲に至適ｐＨを有するピルビン酸オキシ
   ダーゼ生産菌より得られた酵素である特許請求の範囲第
   １項または第３項記載の分析法。 ８ 消費される成分が酸素である特許請求の範囲第第１
   項記載の分析法。 ９ 生成される成分が過酸化水素である特許請求の範囲
   第１項記載の分析法。