JPH0276573A - 微生物の生存性の維持方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、細菌細胞を長期に渡って安定化させる方法に
関する。この安定化は、細菌細胞と、ポリサッカライド
類（多糖類）なとの非架橋物質を含有するスラリーを形
成させることによって達成される。本発明はさらに、懸
濁物中に、非架橋ナトリウム・アルキイ、−１・（非架
橋アルギン酸すトリウム）と微生物を含有する組成物に
関する。また、本発明は、」−記組成物にさらに油を含
有させたエマルンヨン（乳濁物）に関する。さらに、本
発明は種子を被覆（コーチインク）するのに使用できる
乾燥粉末の組成物およびその用途に関する。

また、本発明は、この乾燥粉末を細菌接種物として使用
する農業分野に於ける用途に関する。また、本発明は、
粉末状に乾燥され、種子をコーティングするのに直接ま
たは浦に懸濁して使用される、溶液中に於けるアルギン
酸すトリウムおよび微生物の用途に関する。

微生物接種物（例えばリゾビウム（ｌｉｌ＋ｉｚｏｂｉ
ｕｍ））を使用すれば、穀物の収穫量が増大することは
昔から知られている。しかし、この方θ、は、微生物細
胞を穀物の種子に付着さゼることおよびこの微生物接種
物の生存性を維持させることの両方か可能な組成物の入
手可能性によってその利用が制限されてきた。ハードン
（Ｂ　ｕ　ｒ　ｔ　ｏ　ｎ　＋　Ｊ　、　Ｃ，％本国特
許第２．９９５．８６７号）は、メチルセルロースなど
の水溶性のガム（ｇｕｍｓ）か種子のコーティングに使
用できる可能性を開示している。このようなコーティン
グを利用することによって、２週間に渡り、微生物細胞
を生存させ、有用性を保持することができる。

この研究か成功を治めたことか刺激となって、他の研究
者も、もっと長期間細菌の牛（ｊ性を維持することがで
きる、その他の組成物を確立しようと試みるようになっ
た。ハムリン（Ｉｌａｍｒｉｎ、　Ｂ、　Ｓ、　Ａ、　
。

米国特許第３，６８８，４３７号）に開小された方法は
、ゼラチン−アルギン酸力ルシウｌ＼の泡からなる種子
コーティングの用途に関連するものであった。トムマー
ケス（１）ｏｍｍｅｒｇｕｅｓ、　Ｙ、　Ｒ，ら、米国
特許第４，１５５，７３７号）は、ポリアクリルアミド
種子コーチインクに、微生物接種物を埋め込む可能性を
開示している。

ポリサンカライドの７！・リノクスを使用して微生物接
種物中の細菌細胞を安定化させる可能性は、マグナー（
Ｍｕｇｎｉｅｒ、　Ｊ、ら、仏国特許第２．４６９゜８
６１号）か開示している。この特許は、細菌細胞の懸濁
物をアルキネート・ゲルに埋め込むことによって、これ
らの安定化か図れることを開示している。この特許に開
示されているゲルは、細菌細胞およびアルギン酸ナトリ
ウトの懸濁物を含有した溶液に塩化力ルンウムを添加す
ることによって調製されている。この塩化−））ルンウ
ムの添加は、それまでは可溶性であったアルキン酸すト
リウム混合物の沈澱および架橋を引き起こす。

これと同様のアルキネ−１・組成物かユング（Ｊｕｎｇ
、　Ｇ、欧州特許第１７，５６５号および米国特許第４
．４３４．２３　］号）によって開示されている。

これらの特許には、細菌細胞懸濁物を３有するアルキン
酸すトリウド る可能性のあることが開示されている。これらユングの
特許は、アルギン酸すトリウｌ−懸濁液をゲルに変換す
るために、硫酸カル／ウドを使用することを開示してい
る。この架橋反応は、リン酸ナトリウムをこの懸濁液に
添加すると遅らせることができる。この方法で処理され
た細菌細胞は、その生存性が６０［」以」二に増大する
。これらの特許には、さらに埋め込まれた微生物を微生
物接種物として農業分野に使用することが開示されてい
る。

架橋されたアルキネ−１・・ゲルは調製か容易であるの
で、微生物接種物に適した埋め込み用マトリックスとし
ての使用が推奨されているか、このようなマトリックス
は、キサンタン・カム（ｘａｎｔｈａｎ　ｇｕｍｓ）の
埋め込み用７トリソクスに劣ることかわかった。即ち、
キサンタン・ガムから構成される埋め込み用マトリック
スは、アルキネ−１・から構成されるマトリックスより
もより容易に微生物を土壌へ放出することか見いたされ
た［ユングらのＰｌａｎｔ　ａｎｄ　５ｏｉｌ、６５：
２１９−２３１（１９８２）］。

ユングら（欧州特許第８３２６７号）は、微生物細胞お
よびポリマー性ゲルを含有する組成物を開示しており、
これは、乾燥し、植物の種子に接種てぎる。この特許は
さらに、微生物細胞の架橋アルギネート懸濁物を微生物
接種物として使用することを開示している。

従来技術に於いて反映されているひとつの関心事は、適
当な埋め込み用物質は、表皮の離脱に耐えるのに十分な
強度の環境と、それにもかかわらす内部の成分を放出さ
せるのに十分な柔軟性を備えた反対の作用を持っていな
ければならず、かつ、適当な時期にマトリックスを分解
させることかできなければならないことである。この目
的を達成するだめの異なる２つの方法か発表された。レ
チンバッハ（ｌｉｅｄｅｎｂａｕｇｈ、　Ｍ、　Ｋ、、
Ｉ）、Ｃ，Ｔ、公表ＷＯ８５１０２９７２）らは、外部
の膜によって囲まれている架橋アルキネート−細菌細胞
懸濁物の、微生物接種物としての用途を開示している。

フラヘル（Ｆｒａｖｅｌ、　Ｄ、　Ｒ，、Ｐ　ｈｙｔｏ
ｐａｔｈｏｌｏｇｙ、　７５　：　７７４−７７７　（
１９８５）　）らは、増量剤として加えられた粘土（ク
レイ）または他の拐１′１を含有している架橋アルギ不
−１・−細菌細胞ｔＶＪ　判物の用途を開示している。

フラベル（Ｆｒａｖｅｌ）らによ−〕て開示されている
方法によれば、比較的均一の大きさの固形ペレットが製
造される。

」−記のように、従来技術は、種子の発芽および成長を
促進させるために、種子に微イ１物懸、判物を事前に接
種することが重要であることを示唆している。非常に多
くの異なる埋め込み川７１・１ノ・ソクスが従来技術と
して開示されている。特に重要なものは、架橋または沈
澱したアルギ不−！・を使用した７トリツクス組成物、
または非常に稠度の高いガム様組成物である。このよう
な組成物は、細菌細胞の生存性を長期間持続させること
、および、同時に、硬度および支持性について所望の特
性を持たせることに成功している。しかしながら、この
ようなゲルの調製には、さらなる−１１’ｒ！、か必要
であり、ケルおよびガムの両者は、操作りの困難性か伴
うものである。

＝７− 本発明は、細胞の生存性および細胞の保全性を、普通で
は細胞の生存性および保全性が低下するであろう条件下
（温度、ｐＨ１酵素反応等）に於いて、維持させるため
の改良方法に関する。本発明は、農業分野に於ける微生
物接種物を調製するのに有用である。

本発明は、細胞か環境条件から保護され、基質および共
因子に自由に接近できる液状システムの特性を利用する
ものである（ｙ、質や共因子はいってもこの液状システ
ムに加えることができる）。

本発明に係る液状システムは、種々の程度の流動性を有
することができるか、半一固体、粘性のケルまたはカム
様の性質は有していない。

本発明は、非架橋のポリサッカライド溶液が非休眠の微
生物細胞の生存性を安定化させることを発見したことに
基づいている。本発明に係るこのような溶液は、休眠中
の微生物細胞を以後の利用のために保存するのにも使用
することができる。

詳細には、本発明は、微生物の生存性を維持させるため
の方法であって、水分散性、実質的にｒｌＪ溶性、非架
橋ポリサッカライドからなる易流動性の組成物中に微生
物の懸濁物を保持することを特徴とする方法に関するも
のである。

さらに、本発明は、植物の種子に微生物を接種するため
の方法であって、（１）微生物の懸濁物および（ｉｉ）
水分散性、実質的に可溶性、非架橋ポリサッカライドか
らなる易流動性の組成物に、植物の種子を入れることを
特徴とする方θ、に関するものである。

本発明は、さらに、微生物の生存性を維持させるだめの
方法であって、微生物、および水分散性、実質的に可溶
性、非架橋ポリサッカライ！・からなる易流動性の組成
物を乾燥して乾燥組成物を製することを特徴とする方法
に関するものである。

本発明は、また、植物の種子に微生物を接種するための
方法であって、 （ａ）微生物、および水分散性、実質的に可溶性、非架
橋ポリサッカライＩ・からなる易流動性の組成物を乾燥
して乾燥組成物を製し、 （ｂ）該乾燥組成物を植物の種子に接触させることを特
徴とする方法に関するものである。

本発明は、また、微生物の生存性を維持することのでき
る組成物であって、微生物、および水分散性、実質的に
可溶性、非架橋ポリサッカライドからなる、乾燥した易
流動性の懸濁物であってもよい組成物を提供する。

本発明は、さらに、植物の種子に微生物を接種すること
のできる植物種子組成物であって、植物の種子、微生物
、および、水分散性、実質的に可溶性、非架橋ポリサッ
カライドからなる、乾燥されていることもある易流動性
の懸濁物を含有する組成物に関するものである。

本発明の組成物に関する諸態様は、本発明の方法に関す
る諸態様に使用することかでき、従って本発明の方法の
特徴は、必要な変更を加えて、本発明の組成物に応用で
きる。

本発明は、ポリサッカライドを含有する懸濁物、および
このような懸濁物を、微生物細胞を安定化または保存す
るための手段として使用することに関する。

本発明は、さらに、非架橋ポリサッカライドおよび微生
物を含有する溶液を乾燥し、粉末を製造すること、およ
びこの乾燥して得られた乾燥粉末の直接の使用または油
に分散した後の使用に関するものである。

本明細書に於いて使用している「微生物細胞」なる語句
は、広範囲の各種の微生物のいずれかを意味する。この
ような微生物の例としては、／ニードモナス（Ｐｓｅｕ
ｄｏｍｏｎａｓ）、セラチア（Ｓｅｒｒａｔ　ｉａ）、
アルスロバクタ−（Ａｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）、アソス
ピリルウム（Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）、リゾビウム
（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）およびバシルス（Ｂａｃｉｌｌ
ｕｓ）が挙げられる力へ、本発明は、植物の生長、発芽
、収穫量等に有益な影響を及ぼすあらゆる微生物の生存
性を維持させるために利用することができる。

本明細書に於いて使用している「ポリサッカライド」な
る語句は、懸濁物または微生物細胞に外部から添加しな
ければならないポリサッカライド、および適切な培養条
件下、例えば炭素源またはエネルキー源を過剰に加えて
微生物の培養を、生育の限定条件下（例えば、窒素枯渇
）に置くことによって、微生物により直接産生されるポ
リサッカライド、の両者を意味するものとする［サザー
ランド（Ｓｕｔｈｅｒｌａｎｄ、　１．Ｌ　）、Ｍｉｃ
ｒｏｂｉａｌ　Ｐｏ１ｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ　ａｎ
ｄ　Ｐｏ１ｙｓａｃｃｈａｒａｓｅｓ（ベーカリ−（Ｂ
ｅｒｋｅｌｅｙ）、グツデイ（Ｇｏｏｄａｙ）およびエ
ルウッド（ＥＩ　Ｉｗｏｏｄ）編）、Ａｃａｄ、Ｐｒｅ
ｓｓ　ＮＹ　（１９７９）］　。本発明に係るポリサッ
カライドの一例としては、藻類から得られるポリサッカ
ライドが挙げられる。このようなポリサッカライドは、
集合的に「アルギネート」と呼ばれる。本発明は、好ま
しくは、水溶液に実質的に溶解するポリサッカライドの
使用を目的とするものである。このようなポリサッカラ
イドの例としては、アルギネート、セルロースまたは澱
粉が挙げられる。本発明に係る可溶性ポリサッカライド
は、さらに非架橋であるものに限定される。

ポリサッカライドが分子間架橋を有さないか、または架
橋の程度がポリサッカライドか水溶液中に於ける溶解性
を保持できる程に小さければ、これらのポリサッカライ
ドは本発明に於いては「非架橋」とみなす。ポリサッカ
ライドのこれら溶液中に於ける濃度は、溶液の全容量に
対する濃度（例えば、重量／容量パーセント）として表
される。

別に明示していなければ、本発明のアルギネート−微生
物混合物は、アルギネ−１・を水に溶解し、次いで得ら
れたアルギネート溶液を培養ブロスに加えることによっ
て調製する。架橋の程度は１０％以下、好ましくは５％
以下である。

本発明は、「水分散性」、「易流動性」の組成物を使用
するものである。これらの言（・１句は、低粘性かつ流
動し得る組成物を意味するものである。

詳細には、この語句は、環境温度（４°Ｃ−３０°Ｃ）
に於いて固体、ゲルまたはガム状である組成物を排除す
るものである。

本明細書に於いて使用している「乾燥」なる語句は、水
を除去することを表したものである。これには、水の除
去を行えるあらゆる手段を使用できる。適当な操作は、
当業界周知の風乾、噴霧乾燥および凍結乾燥等である。

本明細書に於いて使用しているｒａｊｌなる語句は、エ
ーテルまたはアルコールなどの疎水性溶媒には溶解する
か、水には実質的に溶解しない大きいクラスの化合物を
意味する。本発明に使用するのに好適な油は、環境温度
で液状のものである。

この好適な油には、大豆油、力／う油（ｃａｎｏｌａ　
ｏｉｌ）、トウモロフン浦等が挙げられる。

既述したように、油は水に実質的に溶解しない。

従って、水／油混合物は、保存時には自然に分離しく密
度に基づいて）、ひ七つは油を含有し他方は水を含有す
る実質的に純粋な２つの溶液になり易いであろう。本発
明は、水／油混合物を用いて実施できるが、好ましくは
乳化剤を本混合物に加える。乳化剤は、水層の油への分
散性を高めることのできる物質である。乳化剤について
は、フエツチン力−（ＩＩｕｅＬｔｉｎｇｅｒ、　Ｒ，
）のＳｅｉ　ｆ、　、　０ｅｌｅ、　Ｆｅｔｔｅ、　Ｗ
ａｃｈｓｅ、　１０９：４５５−１７９（１９８３）に
開示されている。適当な乳化剤の例としては、アーラセ
ル８３ＴＭ（ＡｒｌａＣｅ１８３ＴＭ）、アーラセル１
８６ＴＭおよびツイーン８　］　　（Ｔｗｅｅｎ８　］
）が挙げられる。アーラセルＴＭはＩＣＩケミカル・コ
ーポレーション（ＩＣＩ　　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｒ
ｐ、）で製造されている。

本発明は、微生物細胞の生存性を安定化させるだめの手
段を提供し、これを利用すれば、微生物を広範囲の用途
に備えて保存することができる。

詳細には、本発明は、農業および工業用途に於ける接種
物中で、微生物の生存性を維持させるために使用するこ
とができる。本発明により細胞を安定化させれば、適切
な保存期間を得ることができ、次いで液状形態、易流動
性のコーティングを種子に容易に施すことができ、発芽
、生長および収穫量を増加させる等の各種の作用を１与
ることかできる。適用された微生物は種々の態様で機能
し、所望の応答を得ることができる。これらの微生物に
は、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）　、シュードモ
ナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、バシルス（Ｂａｃ　
ｉ　ｌ　Ｉ　ｕｓ）、アルスロバクタ−（Ａｔｈｒｏｂ
ａｃｔｅｒ）、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）およびア
ブスピリルウム（Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）属が包含
される。

本発明は存在し得る非常に多くの非架橋ポリサッカライ
ド、例えば澱粉またはキサンタン・ガムなどを使用して
実施することができるが、アルギネート・ポリサッカラ
イド類を使用するのが好ましい。本発明は、約０’、０
１−２０％の範囲のポリサッカライド溶液を使用すれば
実施することができるか、０．５−２．５％のポリサッ
カライド溶液を使用するのが好ましく、最も好ましいア
ルギネートの濃度は約１．０−２．０％である。

本発明のポリサッカライド−細菌細胞懸濁物を調製する
には、所望の生物学的または産業上の作用を得るのに十
分に高い濃度の細胞培養物であるがこのような作用をネ
ガティブに妨害する程に高くない濃度、好ましくはｌリ
ットル当たり１−５０ｇ細胞（乾燥重量）の細胞を含有
した細胞の新鮮な、健康培養物の一部を、これと同量の
可溶性ポリサッカライドを含有する無菌溶液の一部と混
合する。次いで、この方法で処理した細菌培養物を、細
菌か生存できる温度、例えば４−３０℃で保存すればよ
い。細菌の安定性の程度は、試料の保存温度に無関係で
あることか見いたされた。

ポリサッカライド溶液には、例えば糖（ｓｕｇａｒｓ）
、＝１６− アミノ酸、タンパク質、塩類等の栄養因子または生長因
子を含有させることができる。さらに、このポリサッカ
ライド溶液には、本発明を実施する−して必要となり得
る、ハ・７フアーなとの浸透圧調節剤を含有させること
ができる。

本発明のひとつの態様としては、細菌細胞をポリサンカ
ライド溶液に懸ｌ蜀Ｉ−１次いでこれを、例えば浸漬、
噴霧乾燥なとの種々の方法によって種子に適用する。こ
のような方法は、キュル（Ｃｕｌｌ。

Ｓ、　Ｗ、　）らの欧州特許第９７，４５９号、ムグナ
ー（Ｍｕｇｎｉｅｒ、　Ｊ、　）らの仏画特許第２．７
１６９．８６］号、ユング（Ｊｕｎｇ、　Ｇ、　）らの
米国特許第４．４３４．２３１号およびレチンバッハ（
Ｒｅｄｅｎｂａｕｇｈ　１１．　Ｋ、　）らのＰＣＴ　
Ｎｏ、ＷＯ３５１０２９７２に開示されている。

本発明の好ましい態様は、細菌細胞を非架橋ポリサッカ
ライ１〜溶液に懸濁し、次いでこれを浦のエマルジョン
に加える。次いて、得られた組成物を、例えば水に希釈
して液体噴霧にイΦ用するか、またはこれを直接種子に
ツーティンフケることによって、これを農業用の接種物
として使用することができる。あるいは、ポリサッカラ
イト／細胞溶液を乾燥して粉末にすれば、それ単独か、
または好ましくは農芸化学物質と一緒に、保存を好適に
行うことができる。この粉末は、直接種子に適用できる
か、または水に溶解もしくは油に分散させて、種子に噴
霧可能な液状物とすることができる。

先に述へたポリサッカライド／細菌細胞懸濁物を種子に
適用するための操作法は、本発明の組成物に応用できる
ように、当業者によって容易に採用できる。しかしなが
ら、本懸濁物は、その表面に空気を吹き込み、３０°Ｃ
て乾燥するのか好ましい。これは、好ましくは、懸濁物
をインキュベーターに置き、滅菌濾過した空気を懸濁物
の表面全体に渡って吹き込むことによって行う。次いて
、得られた乾燥組成物を、混合によって種子にコーティ
ングさせればよい。

本発明を一般的に説明したが、本発明をより良く理解さ
せるために、具体的な実施例を以下に記載する。特に明
記しない限り、これらは単に本発明の説明を目的とする
ものであって、本発明の範囲の限定を意図するものでは
ない。

尖樵何↓ 微生物菌株の増殖 リゾビウム・ヤポニクム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　ｊａｐ
ｏｎｉｃｕｍ）培養物を、ＹＥＭ寒天平板（マンニト−
ル１０ｇ：デイン’：Ｊ　（Ｄｉｒｃｏ）酵母エキス０
　、　Ｊ　ｇ　：　Ｋ　２ＨＰＯ，０，５ｇ　；ＭｇＳ
Ｏ４・７　Ｈ２Ｏ０，２ｇ；ＮａＣ（！０．Ｉｇ；寒天
２０ｇ；ｌリットルになるまで水を加える）」−に保持
した。１ｏｏｚρの液体培養物」二を、培ｔｉｌｌＡ　
（ショ糖］Ｏｇ＋べ一プレックスＢ　３　Ｑ　Ｑ　（Ｖ
ｅｃｐｒｅｘ　Ｂ２Ｏ２）酵ＣＪ　ＩＩ己分解物０．５
ｇ　；　Ｋ、！−（Ｐｏ、　０．２２ｇ　；Ｍｇ５Ｏ，
・７Ｈ７００，Ｉｇ　：ＣａＣＱ２０．０４　ｇ；　Ｆ
ｅＣ（！ａ０．０２ｇ；水を１す７トルになるまで）］
００１１ｒＱにＹＥＭ寒天平板から得た１個のクローン
を接種することによって得た。この液体培養物を、１４
０　ｒｐｍの軌道シエイノＪ　−（ｏｒｂｉｔａｌ　５
ｈａｋｅｒ）て、３０℃７日間インキュへ一トシた。新
鮮な培養液１００１１ρを培地Ａ１リットルに移し、Ｉ
　４０　ｒｐｍの軌道シェイカーで３０°Ｃ１５−７日
間インキュへ−１・することによって、１リツトルの培
養物を得た。

特に明記しない限り、他のすへての培養物は、Ｐ　Ａ　
Ｆ寒天培地（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）ンユードモナス寒天
Ｆ３８ｇ；グリセロール１０ｇ；寒天２０ｇ；ｌリット
ルになるまで水を加える）に保持した。液体培養物は、
ＴＳＢ（（ギブコ）トリプシン処理した大豆ブロス３０
ｇ　；　］リリットルになるまで水を加える）に、ＰＡ
Ｆ寒天平板から得られた１個のコロニーを接種し、Ｉ　
４　Ｏｒｐｍの軌道シエイカーで３０°Ｃ１４８時間イ
ンキュベートすることによって得た。

火楓敗７ ＲヤポニクムＵＳＤＡ１３８を実施例１に記載した方法
で増殖させた。新鮮な培養培地５０肩ρを、１％および
２％非架橋アルギン酸ナトリウムの滅菌溶液の等量と混
合し、アルキネート０゜５％または１％の試料を調製し
た。最終濃度１％のアルギネートを含有した試料を、１
°Ｃ１室温および３０°Ｃで保存した。０．５％のアル
キネ−１・を含有している試料を室温で保存した。周期
的に、これらの混合物を十分に撹拌し、生存した細胞（
生細胞）培養物をカウントするために試料を取り出した
。この実験結果を第１表に示す。この実験結果は、アル
ギネート・スラリー中の１？　ヤボニクム細胞の安定性
が保存温度によって本質的に影響を受けないことを立証
するものであった。

第１表 Ｌｏｇ生細胞カウント／ｍａ 試料　　　　０　１週　　４週　１０週　２１週　２６
週１％、４°ＣＢ、８４　８．４５　７，９９　９，０
６　９．５９　−−−−１％；室温　　９．６］　　８
．９３　９．８６　９．４４　８．６４　−−一−１％
：３０°Ｃ９，４２８，７０８，８５９，０６８，５３
８，１７０，５％；室温１０．４２　９，６８　９．６
２　９．２９　８．８６　−−−〜災施桝溢 リゾンビウム・ヤポニクム（Ｒｈｉｚｏｎｂｉｕｍ　ｊ
ａｐｏｎｉｃｕｍ）の安定性に対するポリサッカライｊ
ｊ　Ｑ　（’ＩＥ　ｆｆｌＲヤボニクムＵＳＤＡ１３８
を実施例１に記載した方法で増殖させた。この液体培養
物の試料を取り出し、非架橋ポリサッカライドと混合し
た。

この結果を第２表に示す。混合物は室温で保存し、生細
胞のカウントを計数するために、激しく撹拌した後、周
期的にサンプリングした。この実験結果は、広範囲の可
溶性ポリサッカライドか細菌細胞の生存性を保持させる
のに使用できることを示していた。

（以下余白） 追ス嚢 Ｌｏｇ生細胞カウント／ｍρ 試料　　　　　　　０　１週　　４週　１０週　３０週
２．５％デキストラン　　　　　　　　　７．７６　　
１０．４８　　　９，１４　　　８．７８　　　８．０
００．２５％つを一ターロフク”Ｂ１００　７．９２　
　　９．７８　　　８．３７　　　８，５２　　　６，
６０３．５％コーンスターチ　　　　　　　　？、８３
　　　９．５６　　　９．９３　　１０．５４　　　９
．２９０．５％カルボＮゾメチル　　　　　　　７．８
８　　　９．３３　　　９．２６　　１０．８４　　　
８．１８セルロース ０．５％ガッティーカム”　　　　　　　７．６３　　
　８５＋　　　　８．６５　　　８．３６　　　８３１
０５％クサンタンガム　　　　　　　　８．１．９　　
　９．７２　　　９．３９　　　９．１３　　　８．７
９１％アラビアゴム　　　　　　　　　　　７．７７　
　　９．２６　　　９．４７　　１０．２１　　　７．
８９０．５％ゼラチン　　　　　　　　　　　７．７３
　　　９．４２　　　９，５９　　　９．０４　　　−
−−−０．５％γルＸネート１０．５Ｍ　　　　　７，
８８　　　９，５５　　　９．０：（１０，９９９，２
：（ソルビトール １．５％カルボキシメチル　　　　　　　７．６１　　
　９，４４　　　９，４９　　　９．２６　　　７．５
６セル１−ス ２．５％アルＮネート　　　　　　　　　７．７＋　　
　　８．７４　　　９．０８　　　−−−−　　　−−
−−０．５％アルＮネート　　　　　　　　　７．７４
　　　９．３８　　　９．００　　　８．３１　　　７
．８５０．０５％アルＸネート　　　　　　　　７．７
７　　　８．８７　　　９．３４　　　８．３３　　　
−−−−−前頁表中 １　）　　：　ＷａｔｅｒＬｏｋ　Ｂ　１００２）　　
：　Ｇｕｍ　ｇｈａｔｔｉ ３）　　：　ｂｅｅｔ　ｍｏｌａｓｓｅｓ火樵咋↓ ンユートモナス・フルオレスセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍ。

ｎａｓ　ｆ’１ｕｏｒｃｓｃｅｎｓ）　　］　７　３４
、／ニードモナス０プチタ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　
ｐｕｔｉｄａ）　　］　−］　０４、シュードモナスｓ
　ｐ、　　（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｓｐ、）　　５
５　　　］、　４　。

／ニードモナスｓｐ、６７−４、バシルスｓｐ。

（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ、）　８６　６４およびシュ
ードモナス・プチダＧ２−８を実施例１に記載した方法
で増殖させ、これと等量の滅菌した１％非架橋アルキネ
ート溶液と混合した。得られた混合物を室温で保存し、
周期的に撹拌し、生細胞をカウントするためにサンプリ
ングした。この実験の結果を第３表に示す。この実験結
果は、１％アルギネート・スラリーが好適に各種の細菌
株を安定化させていることを示している。

第３表 Ｌｏｇ生細胞カウント／ｍＱ 微生物　　　０　１週　　４週　　８週　１０週　３４
週Ｐ、フルオレスセンス　　　１１．８８　　１１．８
３　　１１．０２　　８．１６　　７．４３　　７．０
０Ｐ、プチダ　ｌ−１０４１０，１９１１，３３１０，
３２８，２７７，４５７，４０シ１−ド（ナス　Ｓｐ、
　　　１１．８０　　１１．０８　　　９，６２　　８
．７６　　６，６１　　７．２２シス−トモナス　ｓｐ
、　　　１１．８５　　１２．０４　　１０．２７　　
８，２２　　７．２１　　８．２９バシルス　ｓｐ、　
　　　　　　　９．４９　　　９．８６　　　９．３６
　　７．７９　　７．０３　　８．２０Ｐ、プチダ　Ｇ
２−８　　　１０．４１　　１１．７３　　１１．４８
　　８，２６　　７．２５　　８．２６ハ焦棗す旦 シュードモナス・フルオレスセンス１７−３４、シュー
ドモナス・プチダ１−１０４、ンユードモナスｓｐ、５
５−１４、シュードモナスｓｐ、６７−４、バシルスｓ
ｐ、８６−６４およびシュードモナス・プチダＧ−２８
の新鮮な健康培地の一部を、実施例１に記載の方法で増
殖さｌ−た。この部分標本を、これと等量の滅菌した１
％非架橋アルギネート溶液と混合し、滅菌した２、２次
ρガラス管に分注した。このガラス管を完全に満たし、
堅く栓をし、次いで３０’Ｃまたは室温で保存した。

周期的に試料を撹拌し、生細胞のカウントを計測した。

この実験の結果を第４表に示す。この実験結果は、アル
ギネート溶液中で細胞の生存性を維持するためには、適
当なガス交換が必要であることを示している。

第４表 Ｌｏｇ生細胞カウント／ｍＱ 微生物　　保存温度　０　　１週　２週　３週　５週シ
ュードモナス　ｓｐ　　　　　室温　　　１１．８０　
　１＋、６＜　　　５．７０　　４，７２　　３．９７
５５−１４　　　３０℃　１１．８８　１１．６７　８
．１５　１．７９　　０ａＵ’Ｕ　　Ｈ！、４ｂ　　−
−−−５，６２４，２５３，３２実施例６ Ｒ，ヤポニクム培養物を実施例１に記載の方法で増殖さ
せた。新鮮かつ健康なＲ，ヤボニクム培養物２５０好を
滅菌した１％非架橋アル牛ネート溶液２５０ｍｇと混合
した。この混１′ｒ物を溶液Ａと命名する。溶液Ａの］
００順部分量を取り出し、以下のものを混合した：フー
ト・アンド・コスメテイック・ブルー・ダイ（Ｆｏｏｄ
　ａｎｄ　Ｃｏｓｍｅｔｉｃ　Ｂｌｕｅ　Ｄｙｅ）＃　
］　　（最終色素濃度−１０％）（これにより、混合物
Ｂが調製される）またはフード・アンド・コスメテイッ
ク・ブルー・タイ＃１　（最終色素濃度−１，０％）お
よびＴｗｅｅｎ８　］　　（最終濃度−２０％）（これ
により、混合物Ｃが調製される）。」１記混合物は、（
ｉ）滅菌する前にアルギネ−１・に加え（ブルー・ダイ
）、おｔび（ｉｉ）個別に滅菌して最終混合物（Ｔ　ｗ
ｅｅｎ）に加えた。

次いで、上記の混合物の４好を滅菌した４、５−２７＝ Ｒρガラス管に分注した。さらに、溶液Ｃの０．８尻ρ
を、滅菌した鉱油３．２ｍＯを入れたバイアルビンに分
注した（溶液りが調製される）。次いで、これらのバイ
アルビンのすべてを堅＜封管し、室温で保存した。バイ
アルビンを周期的に取り出し、激しく撹拌した後に、生
細胞のカウント分析用にサンプリングした。第５表は、
混合物Ａ−Ｄに於ける細胞の生存性に対する時間の作用
を示している。

さらに、調製時にＡ−Ｄの混合物の試料０．４ｍ夕を使
用して大豆の種子１０ｇ試料をコーティングした。コー
ティングした種子の一部を周期的に取り出し、コーティ
ングした種子に於いて生存している生細胞の数を測定で
きるようにした。第６図は、大豆にコーティングした混
合物Ａ−Ｄの細胞の生存性に対する時間の作用を示すも
のである。

Ｒヤボニクムの生存性をずへての混合物で維持させる間
、アルギネート／細胞／浦エマルションは種子のコーテ
ィングを容易にし、種子の流動性を高めたのてこの組成
物は好ましい組成物である。

種子の外皮に於ける好適な生存性は、これらの混合物が
種子接種物としても使用できることを示している。

第５表 Ｌｏｇ生細胞カウント／ｍρ ０　３週　　７週　１０週　　１６週　３７週Ａ　　　
１ｏ４ｏ　　９．５ｇ　　９．３３　９．２６　８．１
．１　７．７５Ｂ　　　ｉＯ，９３１０，９３９，８＋
、　　９．３９　７，７１　７．９９Ｃ９，６５８，４
６９，２（１８，７５６３０６，３１Ｄ　　　Ｉｏ、５
２　１０．６２　１０．１８　９．９２　８，７０　８
．２０第６表 Ｌｏｇ生細胞カウント／種了種子温で保存）０　２時間
　４時間　６時間　２４時間　　Ｊ週Ａ　　　６，２２
　　５，８７　　５，５５　　４，６２　　４．６４　
　３．２７Ｂ　　　６．６１　　６．３５　　６，４３
　　４，６６　　５，２４　　３．６５Ｃ６，０１５゜
４７　　５．］、２　　４．８＋　　　４．４８　　２
．７３Ｄ　　　５，３９　　５．６６　　５．３５　　
４．２５　　５．２４　　３．７９実施例７ ハシルスｓｐ、８６−６４を実施例１に記載の方法で増
殖さゼた。新鮮かつ健康な培地５０好を、６％アルギネ
ー１・、４％アルギネート：２％アルキ′ネート；４％
アルキネートおよび゛１．８％生理食塩水；４％アルギ
ネートおよび１．０Ｍショ糖；４％アルキネートおよび
１％活性炭；４％アルギネー１・および１５％サイクロ
デキストリン；４％アルギネートおよび２％トウモロコ
シ澱粉；４％アルギネートおよび２％グリセロール；４
％アルギネートおよび１％セラチン；または４％テキス
トランを含有する溶液の等量と混合し、以下の組成を有
する混合物を調製した：混合物Ａ−培養培地」−３％ア
ルギネー１・；混合物Ｂ−培養培地＋２％アルギネート
：混合物Ｃ−培養培地＋１％アルギネート；混合物Ｄ−
培養培地＋２％アルキネ−）＋０．９％生理食塩水、混
合物Ｅ−培養培地→−２％アルギネート十Ｑ、５Ｍシヨ
糖；混合物Ｆ−培ｎ地＋２％アルギ不−１−＋０．５％
活性炭、混合物Ｇ−培養培地−ト２％アルギネート＋０
．７５％サイクロデキストリン；混合物Ｈ−培１ｔｔｌ
ｌ＋２％アルギネート＋１％トウモロコシ澱粉；混合物
Ｉ−培養培地＋２％アルキネート＋１％グリセロール；
混合物Ｊ−培養培地＋２％アルギネート＋Ｑ、　５％セ
ラチン：混合物１く一培養培地＋２％デキストラン。す
へてのアルキネート溶液には、非架橋アルキネートシか
含まれていなかった。これらの混合物を室温で保存し、
周期的にサンプリングして生細胞のカウントを測定した
。得られた結果を第７表に示す。これは、種々のアジュ
バントを共に含有した各種のポリサンカライド混合物お
よびアルキネートがバシルスｓｐ、８６−６４の安定性
を高めたことを示している。

（以下余白） 筆り嚢 Ｌｏｇ生細胞カウント／ｍ１２ ０　４週　１０週　２９週 Ａ　　８．９４　８，９１　７．５２　７．２８Ｂ　　
　８．６８　８Ｊ８　７，５２　７．５１Ｃ８，６Ｊ　
　８．０６　６．０９　７．９８Ｄ　　　８，７５　８
．７８　７，３３　６．５０Ｅ　　　８．７１　８．７
７　７．５２　５．５９Ｆ　　　８．６０　９．２６　
７，９０　７．２３Ｇ　　　８．６４　８．１３　６．
４５　６．５１Ｈ８，６９８，５６７，１２７，６３ １８，６９８，７５７，８９７，６０ Ｊ　　　８．８０　８，０９　７．５９　７．２４Ｋ　
　　８．７３　　ｇ、３２　６，４３　６．５５実施例
８ シュードモナス・フルオレスセンス１７−３４、シュー
ドモナスｓｐ、５５−１４およびバシルス−３２＝ Ｓｐ、８４−６４の５０好部分量を実施例１に記載の方
法で増殖させた。培養物は、２５０肩ρ容量エーレンマ
イヤーフラスコ中で増殖させた。培養ブロス５０好を、
以下の非架橋ポリサッカライド組成を有する溶液の等量
と混合した：　（Ａ）４％アルギネート；　　（Ｂ）２
％フート・アンド・コスメテイック・ブルー・ダイ＃ｌ
を加えた４％アルギネート：（Ｃ）２％活性炭を加えた
２％（最終濃度）フード・アンド・コスメテイック・ブ
ルー・タイ＃１　（青色色素）を含む４％アルギネート
。さらに、培養物１０πＱを」−記アルギネート／色素
混合物１０好、ならびに（Ｄ）滅菌大豆油８０Ｒ（１、
（Ｅ）　Ａｒ１ａｃｅ１８３ＴＭ（アーラセル８３ＴＭ
）２ｉＣを加えた滅菌大豆油７８ｚＣまたは（Ｆ）アー
ラセル１８６ＴＮ２ｚρを加えた滅菌大豆油７８ＪＩｉ
２のいずれかと混合した。すべてのフラスコに脱脂綿の
栓をし、室温で保存した。種々の時間に、混合物を十分
に撹拌し、生細胞のカウント数の測定を行った。

得られた結果を第８表に示す。これは、アルギネート／
細胞溶液を油エマルンヨンに加えることにより、細胞の
生存性が増強することを示している。

（以下余白） く■００国！ ３５一 実施例９ 傷存判 リゾ細菌株の培養物を実施例１に記載の方法で調製した
。

新鮮かつ健康な培養物を、等量の滅菌４％アルギ不−１
・と混合した。次いて、培養物／アルギネ−１・溶液の
一部を、比率３０％水・６８％油、２％乳化剤（′Ｆｗ
ｅｅｎ８１　）のカメラまたは大豆油のいずれかのエマ
ルジョンに入れ、混合物を調製し、次いてこれを使用し
て、混合物６０ｕ１．、／種子１０ｇでカメラの種子を
コーティングするか、または混合物７５ｕＬ／大豆２５
ｇで大豆をコーティングした。種子試料を周期的に取り
出し、生細胞のカウントを計測した。得られた結果を第
９表に示す。これは、微生物の種子の接種物のデリバリ
ーンステムとしての本調製物の有用性を示してい第９表 カメラ・巴ヱ沙−に旦２つ９１畳４ノシー４２動−子公
ｐＰ−二！−イーイ之Ｌｏｇ生細胞ノＪウント／種子 ０２時間　２４時間　４８時間　９６時間γシス［リル
ム　ｓｐ、　　　　　２，９４　　　２．５８　　　１
，９８　　　　２．１４　　　　−−−Ｌｏｇ生細胞カ
ウント／種子 ０２時間　２４１１！、ｌｊｌ　　４Ｂ時間　９６時間
バシルス　ｓ＋）、８６−６４　　　５．３］　　　　
　４．９２　　　４．５６　　　　−−−−　　　　３
．８１７ゾスドリルム　ｓｐ、　　　　　　ＬＯ６３，
４３３，０３−−−−２，２ＩＰ、プチダ　５７−１０
　　　　　４．９５　　　　４．伺　　　３．９５　　
　　−−−−　　　　３．３３実施例１則 ん譚臥±−１０２省俳弁作 セラチア・リクイファソエンス（ＳｅｒｒａＬｉａ　ｌ
１ｑｕｉｆａｃｉｅｎｓ）　Ｉ　−］　０２を実施例１
に記載の方法で増殖させた。新鮮かつ健康なセラチア・
リクイファシェンス］−１０２培養物の一部を１％滅菌
非架橋アルキネートと混合した。次いて、４リツトル容
量のエーレンマイヤーフラスコ中で、得られた混合物１
００ｉｆｆの表面のすべてに、滅菌濾過した空気（３０
’Ｃ、リットル７分）を吹き込んでこの混合物を乾燥し
た。次いで、得られた物質を、蓋をした容器で保存し、
周期的にサンプリングして生細胞のカウントを計測した
。得られた結果を第１０表に示す。これは、この調製物
がＳ、ｌＪクイファンエンスｓｐ、１−１０２の生存性
を維持させるのに使用できることを示している。

第１０表 Ｌｏｇ生細胞カウント／ｇ ０　　３日　　　９日　　　１５日　　６０日１０．２
１　　１２．１１．　　　＋１．６０　　１２．０６　
　１１．２８上記の如く、本発明に係る具体的な実施例
によって本発明を説明したが、本発明はさらに改良する
ことのできることは理解できるであろう。また、本願出
願は、一般的な本発明の原理に従う限り、あらゆる変法
、用途または改良法を包含するものであり、これには、
本発明に関連する当業界既知の、または慣用の操作法な
らびに、発明の詳細な説明および特許請求の範囲に記載
した本発明の本質的な特徴に応用できるような、本明細
書に於ける記載から発展される方法などが包含される。

特許出願人　アレリックス・インコーホレイテッド

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、水分散性、実質的に可溶性、非架橋ポリサッカライ
   ドを含有する易流動性の組成物中に微生物の懸濁物を保
   持することを特徴とする微生物の生存性を維持する方法
   。 ２、（ｉ）微生物の懸濁物および（ｉｉ）水分散性、実
   質的に可溶性、非架橋ポリサッカライドを含有する易流
   動性の組成物を植物の種子に接触させることを特徴とす
   る植物の種子に微生物を接種する方法。 ３、微生物、および水分散性、実質的に可溶性、非架橋
   ポリサッカライドを含有する易流動性の組成物を乾燥す
   ることを特徴とする微生物の生存性を維持する方法。 ４、（ａ）微生物、および水分散性、実質的に可溶性、
   非架橋ポリサッカライドを含有する易流動性の組成物を
   乾燥し、 （ｂ）得られた乾燥組成物を植物の種子に接触させるこ
   と を特徴とする植物の種子に微生物を接種する方法。 ５、組成物がさらに油を含有することを特徴とする請求
   項１から請求項４までのいずれかに記載の方法。 ６、非架橋ポリサッカライドがアルギネートである請求
   項１から請求項５までのいずれかに記載の方法。 ７、アルギネートが濃度０．１−１０％で組成物中に存
   在する請求項６に記載の方法。 ８、乾燥を、環境温度に於ける風乾によって行う請求項
   ３から請求項７までのいずれかに記載の方法。 ９、微生物、および水分散性、実質的に可溶性、非架橋
   ポリサッカライドを含有する、乾燥した易流動性の懸濁
   物であってもよい微生物の生存性を維持させることので
   きる組成物。 １０、植物の種子、微生物、および、水分散性、実質的
   に可溶性、非架橋ポリサッカライドからなる乾燥されて
   いることもある易流動性の懸濁物を含有する組成物であ
   って、植物の種子に微生物を接種することのできる植物
   種子組成物。