JPH03501800A - 種子及び植物への有益な微生物の供給 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 この出願は、“種子及び植物への有益な微生物の供給”と称する、１９８７年５ 月２０日に出願されたアメリカ特許出願第０５１、６３７号の一部継続出願であ る。

本発明は、種子及び植物に有益な微生物を供給するための方法及びそのような微 生物を含む種子及び植物に関する。より詳しくは、本発明は、活性的であり、且 つ有益な微生物を含む種子及び植物、そのような微生物を種子及び植物中に導入 するための方法及びそのような微生物を種子及び植物中に導入することによって 有益な微生物を有する植物をコロニー化するための方法に関する。

多くのタイプの微生物が種子及び植物に対して有害であることは良く知られた事 実である。しかしながら、多くのタイプの微生物がまた、植物に対して有益であ る。窒素固定化細菌、たとえばリゾビウムｓｐｐ、　（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　ｓ ｓｐ、）は、マメ科植物の根をコロニー化し、そしてこれらの植物により使用で きる形で窒素を供給する。生物学的調整剤として知られるいくつかの他の微生物 は、それらが種子及び植物に関係する場合、有害な微生物に対しである程度の保 護を有する種子及び植物を付与するように思われる。たとえば、トリコダーマｓ ｐｐ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｓｓｐ、）は、時々、種子上に被覆される場合 、化学的殺菌剤と同じぐらい効果的に種子を保護することができる。Ｃｈａｏ、 など、　、　Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ、　７６：６Ｃ１−６５（１９８６ ）。さらに他の微生物、たとえばアメリカ特許出願第７９９．９９９号（引用に より本胡細書に組込まれる）に開示される農業用化学物質を産生ずる内部共生ハ イブリッド微生物は、共生的に植物の内部をコロニー化し、そして有用な農業用 化学物質、たとえば殺虫剤をそれらの植物に供給する。

有益な微生物を有する植物及び種子のコロニー化は、種子の表面又は植物をとり まく土壌に直接微生物を適用することによって便利に達成されて来た。

たとえば根粒菌に関しては、その微生物は通常、種子上に被覆され、そしてそれ らは、植物がその種子から発生する場合、その植物の根及び根城をコロニー化す る。アメリカ特許第４．４３４．２３１号（Ｊｕｎｇによる）、アメリカ特許第 ４．３６７、６０９号（Ｌｌｏｙｃｌによる）、アメリカ特許第３．０５４．２ １９号（Ｐｏｒｔｅｒなどによる）及びアメリカ特許第２．９９５．８６７号（ Ｂｕｒｔｏｎによる）照のこと。他方、有益な微生物が、微生物の水基材の懸濁 液を調製し、そしてその懸濁液を植物にスズ１／−シ、そして植物をとりまく土 壌に直接それを適用することによって、植物に適用されて来た。これらの方法の すべては、有益な微生物を有する植物の表面（内部に対立するものとして）をコ ロニー化するために使用されて来た。

種子被覆及び土壌適用技法は、少なくとも２種の欠点を有する。まず第一に、あ る微生物は土壌中で十分に生存することができず、そして植物が微生物の侵入を 付与するために機械的に傷つけられなければ、植物が種子から発生する場合、植 物の根又は他の部分をコロニー化しないであろう。従って、種子上へのこれらの 微生物の被覆は、単に、得られる植物のコロニー化を引き起こすのみであろう。

第二に・種子の表面への適用により植物をコロニー化することができる微生物に 関してさえ、いくつかの微生物の生存率の自然な低下が存在し、そしてコロニー 化の効力が低下する。

本発明は、これらの欠点を克服するであろう有益な微生物を有する植物及び種子 をコロニー化するだめの方法の開発を行なって来た。病原性微生物が、病原菌の 水性Ｕ濁液を調製し、その病原菌懸濁液と種子とを混合し、そして種子中に病原 菌を押し込めるために真空浸潤の技法を用いることによっＲｅｐｏｒｔｅｒ、　 ５０：１１（１−１１１（１９６６）を参照のこと。病原性微生物はまた、真空 湿潤［Ｒｏｗｅｌｌ及びＤｅＶａｙ、Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ、　４３： ６５４〜６５８　（１９５３）　）により及び針なしの医療用ジェットインジェ クター［Ｗａｓｔｉｅ、Ｐｌａｎｔ　Ｐａｔｈｏ１ｏｇＬ３３：６１〜６３（１ ９８４））により植物中に接種されて来た。しかしながら、そのような技法は、 病原菌による種子又は得られる植物の破壊を導ひく。

本発明者は、有益な微生物が種子中に含浸され、それによってその微生物及び種 子が生存し続け、そして得られた植物が生存し、そして微生物によりコロニー化 されることを発見した。これは、特定の植物種に対してそれ自体病原性でないい く種かの微生物は、植物自体に病気を引き起こさないで、収穫前又は収穫後、そ の種の種子を攻撃し、そして破壊することができる事実の点から驚くべきことで ある。本発明者はまた、植物の表面に単に適用されることによって植物をコロニ ー化すると予測されるいくつかの有益な微生物は、コロニー化のために物理的に 植物中に注射されるか又は植物中への浸入を引き起こされる必要があることも発 見した。本発明者はまた、これらの発見を実施するための種々の技法も開発した 。

発明の要約 下記の好ましい態様の記載において示されるように、本発明は、中でも、有益な 微生物によりコロニー化される植物を得るために種子及び植物中にそのような微 生物を導入するための方法を包含する。この発明は、まず第一に、上記に概略し たように存在する微生物供給技法の欠点を克服するための手段を提供する。

従って、有益な微生物を種子中に導入するための方法を提供することが、本発明 の１つの目的である。

本発明のもう１つの目的は、有益な微生物を含む種子を供給することである。

本発明のもう１つの目的は、有益な微生物を含む種子を供給することである。

さらに本発明のもう１つの目的は、有益な微生物を含む種子を供給することであ る。

もう１つの目的は、有益な微生物によりコロニー化される植物を供給することで ある。

本発明の追加の目的及び利点は、続く記載に一部示され、そしてその記載から一 部明確であり、又は本発明の実施により教授され得る。本発明の目的及び利点は 、請求の範囲に特に指摘される手段及びそれらの組合せにより達成されるであろ う。

本明細書に具体化され、そして広く記載されるように、本発明の目的を達成する ためには、本発明は、発芽の後、微生物によりコロニー化される植物を生ぜしめ る、その中に含浸される有益な微生物を有する種子を供給する。好ましくは、微 生物は、代謝的に活性である場合、植物又はその種子中に導入されなければ、植 物をコロニー化することができない微生物である。最っとも好ましくは、微生物 は、タラビバクタ−（Ｃｌａｖｉｂａｃｔｅｒ）属から選択された株であり、こ の１種は、所望する特性を増強し又は付加するために遺伝的に組換えられ又は変 性されている。

本発明はまた、液体キャリヤー中、微生物のＬ！濁液を形成するために生物学的 に相溶するその液体キャリヤーに微生物を添加し、その懸濁液により種子を含浸 し、そして種子から過剰のキャリヤーを除去する（これによって微生物及び種子 の生存性が維持される）ことによって種子中に有益な微生物を導入するための方 法を提供する。１つの好ましい態様において、生物学的に相溶性の液体キャリヤ ーは、水溶液及び水溶性ガムを含んで成る。もう１つの好ましい態様においては 、その生物学的に相溶性の液体キャリヤーは実質的に無水有機溶媒であり、そし て微生物は休眠状態である。

本発明はまた、有益な微生物によりコロニー化される植物を得るための方法及び 液体キャリヤー中、微生物の懸濁液を形成するために生物学的に相溶性のその液 体キャリヤーに微生物を添加し、その懸濁液により種子を含浸し、そして植物を 得るためにその種子を成長せしめることによって製造された植物を提供する。

本発明はさらに、植物中の有益な微生物を導入するための方法及び液体キャリヤ ー中、微生物の懸濁液を形成するために生物学的に相溶性のその液体キャリヤー に微生物を添加し、そしてそのキャリヤーを植物中に導入することによって製造 された植物を提供する。

好ましい態様の記載 本発明の好ましい態様が詳細に記載され、そしてこれは、次の例と共に、本発明 の詳細な説明するのに役立つであろう。

本発明は、有益な微生物を含む種子及び植物に関する。微生物は一般的に、必要 ではないが、種子中において休眠状態（すなわち、生存しているが、代謝的に不 活性である）である。種子は、微生物による悪影響を実質的に及ぼさないで、発 芽し、そして成熟植物に成長することができる。発芽に基づいて、種子は、微生 物によりコロニー化される植物に発生する。従って、微生物及び）二子の生存性 は維持される。

実際、いくらかのタイプの種子が本発明で使用され得る。

これらは、農業、園芸又は装飾目的のために有用である単子葉植物及び双子葉植 物の両者の種子を包含する。特に、本発明のための種子を供給する植物の重要な グループは、穀類及びイネ科植物である。穀類は、小麦、ライ小麦、オオ麦、ラ イ麦、米及びカラス麦を包含するが、但しこれだけに限定されない。イネ科植物 は、芝生及び草類、たとえばコニズメノチャヒキ、イチゴツナギ、ウシノケグサ 及びギョウギシバを包含する。他のイネ科植物は、熱帯のイネ科植物、たとえば サトウキビ、トウモロコシ、キビ及びモロコシである。ナス科植物、たとえばジ ャガイモ、トマト、タバコ、ナス及ヒコショウは適切な植物であり、そしてアブ ラナ、たとえばカリフラワー、ブロッコリー、キャベツ、ケール及びキュウケイ カンランのような種子宿主もまた適切な植物である。他の適切な植物及び種子宿 主は、ニンジン、パセリ、サトウダイコン、綿、果樹、ベリー植物及びブドウを 包含する。さらに、本発明の種子及び植物は、木、たとえば松、トウヒ、モミ、 ロコシ、タイプ、米及び綿花の種子である。

微生物は、所望されるいづれかの植物をコロニー化することができる有益な微生 物である。それらは天然に存在し、遺伝的に構成され又は突然変異及び選択の生 成物である。

本明細書で使用される用語“微生物”とは、細菌、菌類（酵母を含む）、藻類及 びウィルスを包含する。本明細書で使用される用語“細菌”とは、細菌、細菌様 生物及びそれらの同等物、たとえば放線菌を意味する。

本明細書で使用される用語“有益な”とは、微生物が引き起こすいづれかの害よ りも植物により多くの有益性を最終的に付与する微生物を言及する。そのような 微生物が植物を有益にするかどうかの決定は、１又は多くの要因を考慮すること によって当業者により行なわれ得る。これらは、１）栄養物をより有益又は多量 にし：２）病原体に対する耐性を増強し又は誘発し；３）所望する化学物質、た とえば殺虫剤をそれ自体又は植物代謝物の転換により製造し；４）耐ストレス性 を付与し又は増強し；５）代謝効率、たとえば光合成効率を高め；そして６）毒 素を不活性化することを包含する。

用語“コロニー化”及び類似する用語は、植物の一部分の直接の環境内における 微生物の存在を言及する。たとえば、微生物は、アメリカ特許出願第７９９．９ ９９号に記載されるあるハイブリッドの内部共有微生物の場合におけるように植 物の維管束系をコロニー化することができ、根粒菌の場合におけるように植物の 根城をコロニー化することができ、又は氷−核生成性ブソイトモナツトの場合に おけるように植物の葉表面をコロニー化することができる。

好ましい態様においては、微生物は、代謝的に活性である場合、単に植物又は種 子又は周囲の土壌の表面に適用されても、植物をコロニー化することができない 微生物である。これらの微生物は、植物又はその種子の内部に導入される場合で のみ、有意な程度に植物をコロニー化することができる。

本発明の微生物は、１又は複数のそれらの所望する特性を高め又はそれらが天然 で有さない特性を得るために遺伝子的に構築され得る。本発明で使用される場合 、用語“遺伝子的に構築される”及び類似する用語は、種々の技法、たとえば組 換えＤＮＡ、組換えＲＮＡ、細胞融合、接合、プラスミドトランスファー、形質 転換、トランスフェクション、Ｉ−ランスダクション及びマイクロインジェクシ ョンのような技法（但し、これだけには限定されない〉を用いて、ＤＮＡ又はＲ ＮＡをそれらのゲノムから欠失し、それらのゲノム中においてＤＮＡ又はＲＮＡ を再配列し、又はＤＮＡ又はＲＮＡ（それらのゲノムにおけるＤＮＡ又はＲＮＡ を含む）をそれらのゲノムに付加し、又はＤＮＡ又はＲＮＡ　（異なった生物か らのＤＮＡ又はＲＮＡを含む）をそれらのゲノムに付加するために、ヒト介在に より操作された微生物を言及する。

化学物質は好ましくは、農業用化学物質、すなわち植物農業において有用な化学 物質であろう。これらは、殺虫剤、抗生物質、植物成長調節剤、肥料及びキレー タ−１たとえばヘモジブリン貧食細胞を包含するが、但しこれだけには限定され ない。殺虫剤は、殺昆虫剤、殺線虫剤、殺ダニ剤、除草剤、抗ウィルス剤及び抗 真菌剤を包含する。

突然変異誘発及び選択の従来の技法が、１又は複数の所望する特性を高めるため に天然に存在する微生物に適用され得る。たとえば、その技法は、植物の内部を コロニー化し又は生物調整剤として作用するそれらの能力を増強するために使用 され得る。従って、そのような微生物を含む種子及び植物はまた、本発明の範囲 内にある。

内部植物性寄生体、すなわち植物宿主と内部共生関係に入ることができる微生物 が、本発明において特に有用であや。

なぜならば、それらは、アメリカ特許出願第７９９．９９９号に記載されるよう に農業用化学物質を産生ずるために遺伝子的に構築され得るからである。ある内 部植物性寄生体はまた、生物学的調整剤としても作用する。微生物が内部植物性 寄生体であるかいなかは、特定の植物宿主に関して決定される。すなわち、それ はある種の植物に対しては病原体であり、そして他の植物に対しては内部植物性 寄生体である。

の場合、特に好ましい植物は、トウモロコシ、モロコシ、す号として、Ａｍｅｒ ｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ（１２３０１Ｐａ ｒｋ−ｌａｗｎ　Ｄｒｉｖｅ、　Ｒｏｃｋｕｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｃｌ　２ ０８５２　Ｌｌ、Ｓ、Ａ、）ｌ：寄託すｔ’Ｌ■旦　亜種　シノドンチスのため に有用である。なぜならば、この内部植物性寄生体は、植物の表面の開口部を通 して故意に導入されなければ、その宿主植物をコロニー化しないこと・ない。従 って、従来の種子被覆技法は、植物に内部植物性寄生体を運ぶ手段として使用さ れ得ない。

及びブスードモナス肛ｐ、　（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ肛ム）もまた、生物学的 調整剤であり得る。これらの調整剤は、発育する植物の根城をコロニー化し、そ して拮抗性態様で内因性ミクロフロラに対して作用し又は植物成長調節化合物を 産生ずるかにより、それらの生物学的調整剤性を及ぼしているように思える。

本発明で使用される微生物はまた、窒素を固定する微生物も包含する。これらは 、リゾビウム（ＲｈｉｚｏｂｉｕｍＬブラディヒゾビウム（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚ ｏｂｉｕｍ）及びフランキア（Ｆｒａｎｋｉａ）属の微生物を包含する。

従来の種子被覆技法の場合とは異なって、本発明の微生物は、外部の保護種子膜 （果皮又は種皮）の内部に存在する。

さらに、トウモロコシ及びダイスの両者の種子に関する実験ドンチスに関して、 その微生物は、コロニー化されるその得られる植物のために胚自体に存在するこ とを指摘する。

本発明の微生物は、発芽する種子が微生物に食物を供給することができるまで、 種子内で生存する微生物の能力を増強するであろう適切な食物源により微小封入 され得る。そのような食物源は、脱水された培養培地；たとえばシスティン及び ウシ血清アルブミンの成分；及び複雑な炭水化物又はアミノ酸源、たとえばミル ク、スターチ又は酵母抽出物を包含するが、但しこれだけには限定されない。食 物源及び微生物は、凍結乾燥、噴霧乾燥、リポソーム閉じ込め又は当業者に良く 知られている他の技法により封入され得る。そのような微小封入は、含浸された 種子の保存期限を長くすることができる。

本発明の種子は、また、微生物が種子の外表面上でのみ被覆される場合、発生す る植物をコロニー化することができる有益な微生物を含む種子を包含し、そのよ うなコロニー化は、微生物が果皮自体内に存在する場合、より効果的に、より急 トミウム、プスードモナス及びバシラス属の微生物を包含する。

本発明の種子の場合、微生物は好ましくは、休止している。

すなわち、それらは生存しているが、しかし代謝的に不活性である。それらは胞 子の形で存在することができる。それら用される場合に再活性化する。

本発明の種子は： （１）キャリヤー中における微生物の懸濁液を形成するために生物学的に適合す る液体キャリヤーに有益な微生物を添加し；そして （２）その懸濁液により種子を含浸し又はその種子中に懸濁液を導入することに より製造される。

好ましくは、過剰の！！濁液又はキャリヤーは、たとえば蒸発により種子から除 去される。この方法は、種子が発芽することができ、そして微生物がその得られ る植物をコロニー化することができるように、微生物及び種子の生存率を維持す るような手段で達成される。

微生物は、増殖を可能にし、又は生存率を高めるいづれかの培養培地中に存在す ることができる。好ましくは、その培養物は、実質的に純粋であり、すなわち所 望としない微生物を実質的に含まない。

生物学的に適合する液体キャリヤーは、微生物が懸濁液を形成することができ、 そして微生物又は種子のいづれかの死の原因にならないいづれかの液体である。

これは、水及び水基材の緩衝液、たとえばリン酸緩衝溶液を包含する。その懸濁 液は、液体キャリヤーに微生物の培養物を添加し、そして微生物と前記キャリヤ ーとを混合することによって、及び当業者に既知の関連技法により形成される。

好ましい態様においては、生物学的に適合する液体キャリヤーは、水溶液及び水 溶性ガムを含んで成る。そのようなガムは天然又は合成のものである。それらは 、ゼラチン、アルギン酸ナトリウム、ガラティガム、キサンタンガム、カラヤン ガム、Ｄｏｗ−Ｃｏｒｎｉｎｇ　１９４４Ａ／Ｂボリア　−（Ｄｏｗ−Ｃｏｒｎ 　ｉｎｇにより製造されるシリコーン油）、酸化ポリエチレン、Ｎａｔｒｏｓｏ ｌＴ″（）Ｉｅｒｃｕｌｅｓ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、により製造されるヒド ロキシエチルセルロース）、トラガカントガム、グアーゴム、アラビアゴム、イ ナゴマメゴム、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、スターチ及び Ｒｈｏｐｌｅｘ”　Ｂ−１５（Ｒｏｈｍ　＆　Ｈａａｓにより製造される水性ア クリル酸エマルジョン）を包含する。

メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、キサンタンガム及びＲｈｏｐ ｌｅｘＴＭが特に好ましい。これらのゴムは、微生物のための乾燥及び保存剤並 びに、種子内の微小割れ目又は細胞内空間にそれらを結合する物質として作用す るように思われる。それらは、好ましくは、水の体積当たり約０．１重量％〜約 １０重量％の濃度で使用される。

微生物が種子中に含浸された後、好ましくは過剰の懸濁液及びキャリヤーは除去 される。液体キャリヤーが無水有機溶媒である場合、乾燥は周囲温度で急速に達 成され得る。液体キャリヤーが水を含む場合、種子は、乾燥せしめられ、そして 当業者に既知の手段による乾燥温度の注意した選択が有益である。その乾燥は、 微生物の休止を引き起こす。ガムが使用される場合、それは、微生物が休止する ように十分な湿気が除かれ、さらにそれらが生存できるように十分な湿気が維持 されるマトリックスとして作用するように思える。

、液体キャリヤーはまた、微生物の生存性の維持を助ける緩衝液、及び界面活性 剤、たとえばＴ犠・ｅｅｎ　２０　（ポリオキシエテレンソルビクンモノラウレ ート）、Ｔ−・ｅｅｎ　４０　（ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミテー ト）　、Ｔｗｅｅｎ　６０　（ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレー１ −　）　、Ｔｗｅｅｎ　８０　（ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエーｈ 、）　、Ｔｗｅｅｎ　８５　（ポリオキシエチレンソルビクントリオレエート） 　、Ｒｅｇｕｌａｉｄ　−（ポリオキシエチレンポリブロボキシブロバノール） 及びアルキ）Ｌ、−２−エトキシエタノールジヒドロキシプロパン）及ヒ５ｕｒ ｆｅｌ　（８３％のパラフィン基材の石油；１５％のポリオール脂肪酸エステル 及びポリエトキシル化された誘導体、及び２％の未確認成分）を含むことができ る。界面活性剤は、微生物が堅い外側の種子の殻内にとどまるように、その殻に おける微小の割れ目及び裂は目の発生を助ける。有機溶媒及び浸透剤、たとえば ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）又はＮ、Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ ）はまた、一般的な溶媒としてのそれらの独特の特性により及び表面張力を減じ るそれらの能力によりたぶん、コロニー化を促進する。特に好ましい濃度は１％ のＤＭＳＯ又は３％のＤＭＦである。さらに、化学物質、たとえば殺カビ剤が、 それらが微生物に死をもたらさなければ、液体キャリヤーに添加され得る。殺カ ビ剤の毒性は、場合次で耐性であることが見出された。

他の態様においては、生物学的に適合する液体キャリヤーは、実質的に無水の有 機溶媒である。はとんどの有機溶媒は、代謝的に活性な微生物に対して毒性であ る。そのような場合、微生物は休止すべきであり、そして有機溶媒は実質的に無 水性であるべきである。なぜならば水は微生物を活性状態に再びするからである 。微生物は、溶媒に添加される前、従来の技法により休止され得る。凍結乾燥が 好ましい。

実際、種子又は休眠微生物に対して非毒性であり、そして微生物の休眠を維持す る有機溶媒が使用され得る。これらは、アセトン、ジクロロメタン、トリクロロ メタン（クロロホルム）、四塩化炭素、ＤＮＳＯＳＤＭＦ　、メタノール、エタ ノール、ベンゼン、ｎ−へキサン、シクロヘキサン、オルト−、メタ−及びバラ −キシレン、イソプロパツール及びｎ−ブタノールを包含する。揮発性有機溶媒 が特に好ましい。なぜならば、それらは工程の最後で容易に蒸発される利点を有 するからである。

種々の油もまた、有機溶媒として有用であることが見出された。これらは植物油 、鉱油、亜麻仁油及びシリコーン油を包含する。それらの油は、比較的不活性で あり、そして微生物及び種子に対して非毒性である。

含浸方法のパラメーター、たとえば液体キャリヤーのタイプ、界面活性剤、溶媒 及び浸透剤の存在及び濃度は、含浸方法を最適化するために当業者に既知である 手段により、種々の種子又は植物に依存して場合次第で変えることができる。

たとえば、好ましい態様においては、ＤＭＦの３％水溶液が、サトウモロコシ及 びトウモロコシの両者において高められたコロニー化効率を付与することができ る。

種子は、微生物懸濁液によりいくつかの異なった手段で含浸される。１つの方法 は、Ｇｏｔｈ、　匹（引用により本明細書に組込む）の技法に従って、種子に懸 濁液を適用し又は懸濁液と共に種子を混合し、そして真空下にすることを含んで 成る。排気の終りで、システムは急速な再加圧にゆだねられ、そして懸濁液が種 子中に流入される。真空の程度及び適用される時間の長さは、本発明の教授の観 点から、当業者により決定され得る。排気の好ましい時間は、少なくとも約１時 間である。トウモロフンのための特に好ましい時間は４０分である。この技法が 水基材システムにより使用される場合、種子は、懸濁液による浸透の容易さを高 めるために予備含浸され得る。いくらかの種子、たとえばトウモロコシは、−晩 （約１７時間）又は１日間、予備含浸され又は吸水される。

懸濁液による種子の含浸の第二方法は、種子に懸濁液を適用し又は種子と懸濁液 とを混合し、そして次に圧力をかけることを含んで成る。圧力の程度及び適用さ れる時間の長さは、本発明の教授の観点から当業者により決定され得る。圧力処 理の場合、いづれかのガスが使用され得、そして好ましい態様においては、０２ 及びＮ２が使用され得る。

三番目の技法においては、種子は、種子に懸濁液を適用し、又は種子と懸濁液と を混合し、そして次にその種子及び懸濁液を遠心分離にかけることにより含浸さ れる。他の態様においては、微生物の懸濁液が種子と共に混合され、そして次に その懸濁液及び種子が圧力下又は真空下で遠心分離され得る。

使用される特定の圧力は、当業者により決定され得る。遠心分離の速度及び長さ は、当業者により決定され得る。

四番目の技法は、種子中への懸濁液の力による注入を含む。

これは、針及び注射器、医学用の針なしのジェット注射器により又は高速微小射 出物上にｕＢ液を被覆し、そしてその射出物の被覆への浸入を引き起こすために 十分な力で種子中に射出物を推進せしめることにより行なわれ得る。それはまた 、堅い針により被膜を破壊することにより行なわれ得る。

針なしの注入は、液体キャリヤー中に懸濁された微生物の少量（約１０〜約１０ ００μＥ）を、小さなノズル又は、ｄ−ＩＪフィスを通してひじょうに高圧下で 推進することによって達成される。

液体蒸気がしばらくの間、凝着したまま残り、ぞして固体支持体に独力で穴を開 ける。医薬製品産業のために開発されて来た多くのこれらの注射器は、本発明の 方法に従って種子及び植物組織中に微生物を推進せしめるために使用され得る。

微小射出物技法は、Ｋｌｅｉｎなど、、　Ｎａｔｕｒｅ、　３２７：７０〜７４ （１９８４）に開示され、そしてこれを本明細書に引用により組込む。微小射出 物に関しては、生物学的に適合する液体キャリヤー中に微生物を最初に懸濁しな いで、微小射出物上に直接微生物の培養物を被覆し、又は微小射出物中に微生物 を配置することが可能である。

注射技法の変法は、堅い針又は他の鋭い器具を用いて果皮を刺し、そして次に真 空又は圧力浸透法を用い又は即に、前記刺された種子を！！！濁液と接触せしめ ることである。

本発明の好ましい態様に関しては、真空又は圧力浸透法又は・懸濁液を力により 注入する種々の手段を使用することが好ましいが、但し必要なものではない。キ ャリヤーは単に種子に適用される必要があり、そしてキャリヤーが種子の皮を自 然に透過し、そしてその種子中に微生物を運ぶために十分な時間、種子と接触し たままにされる必要がある。本発明の好ましい態様のためには、有益な生物の透 過を増強する“割れ目”を引き起こすために、懸濁液に細かく分割された無機固 ・体、たとえば珪藻土、微粒状ガラス又はカーボランダムを添加することが好ま しいが、但し必要ではない。

種子が微生物懸濁液により含浸された後、種子は回収される。好ましくは、過剰 の懸濁液及び／又はキャリヤーが除かれる。液体キャリヤーが水又は揮発性有機 溶媒を含む場合、その水又は溶媒は、種子が保存される前、蒸発せしめられる。

その蒸発は、当業者に既知の種々の手段により種子を乾燥せしめることにより助 けられる。種子はすぐに植えられ又は発芽され、又は発芽まで貯蔵され得る。貯 蔵される場合、好ましくは、種子は調節されたレベルの湿度で貯蔵される。最適 な生存率を維持するためには、貯蔵のための湿度を選択することが必要である。

本発明の方法は、所望としない又は有害な微生物による種子の汚染を防ぐ特別な 予防策を取らないで実施され得る。しかしながら、汚染は、種子又は植物の損傷 を防ぐために、たとえば被覆、粉砕又はフィルム被覆により適用される殺カビ剤 又は他の従来の種子の処理により調節されることが好ましい。

本発明はまた、種子を通しての代わりに植物自体中に有益な微生物を直接導入す るための方法にも関する。病原体は植物中に直接導入され得ることは知られてい るが、本発明者は、ある有益な微生物、特にある内部植物性寄生体は、植物をコ ロニー化するために、たとえば注射により植物中に直接導入される必要があるこ とを決定した。発明者は、そのような導入が植物を制限して又は植物を傷つけな いで行なわれ得ることをさらに発見した。この方法は、植物の外表面を通して及 び植物の内部中に配置され又は強制されることによって植物に単に入ることがで きる微生物のために好ましい。そのようされたいづれの微生物でも使用され得る 。

本発明の方法は、キャリヤー中、微生物の懸濁液を形成するために生物学的に適 合できる液体キャリヤーに微生物を添加し、そしてその懸濁液を植物に含浸し又 は注入することを含んで成る。前記生物学的に適合できる液体キャリヤーは、培 養培地、水又は前で言及されたいづれかのキャリヤーである。

懸濁液は、本明細書で言及されるいづれかの技法を用いて植物中に含浸される。

真空及び圧力浸透法が実生に関して最っとも便利に使用される。針なし医療用注 射器又は微小射出物による注入法が、より成熟した植物に関して、より便利に行 なわれる。針なし注入技法は、Ｗａｓｔｉｅ、　Ｐｌａｎｔ　Ｐａｔｈｏｌｏｇ ｙ。

３３：６１〜６４　（１９８４）　（これは引用により本明細書に組込まれる） に開示される。

もう１つの態様においては、懸濁液は、それと界面活性剤とを混合し、そしてそ の混合物を適切な構造体、たとえば植物の先端上に置くことによって、植物中に 導入される。Ｈａｒｔ−ｍａｎ　ａｎｄ　Ｋｅ］ｍａｎ、　Ｐｈｙｔｏｐａｔｈ ｏｌｏｇｙ　６３：６５８〜６６３（１９７３）　（これは引用により本明細書 に組込まれる）を参照のこと。

本発明の生成物及びその生成物の製造方法の例が、次の例に示される。

例１ 予備実験を、細菌の純粋培養物により処理され、そして殺菌した容器に軸状に植 えられた表面殺菌された種子を用いてルスルホキシド（ＤＭＳＯ）の希釈溶液に より真空浸透される場合、１００％までのコロニー化効率を示し、そしてＮ、Ｎ −ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）の希釈溶液により真空浸透される場合、４３ ％までの効率を示した。

例２ ダイズの栽培変種植物“Ｐｅ１ｌａ”の１００個及び５０個の種子を、標準リン 酸緩衝溶液（ＰＢＳ）　（０，４５ｇ　／　１２でのＫＨ３ｐｏ４．１．１６ｇ ／βでのに２ＨＰＯ，及び８．５ｇ／ｌでのＮａＣｎ水溶液）中における、３％ ＤＭＦ１００ｄ中、１０ｇ個のコロニー形成単位／ｒｄ　（ＣＦＩＩ／ｍＡ）の 内部植物性寄生体細菌Ｃｘｃの５〜７日の培養物を含む懸濁液中に室温で置いた 。対照の種子も同様にして処理した。但し、ＤＭＦがＰＢＳ溶液に含まれなかっ た。含浸された種子を含む容器を、７０ｍｍ）１ｇに減圧した。その減圧状態を １時間、維持し、この間、減圧状態をチャンバーから急速に開放し、続いてすぐ に再排気する処置を３回行なった。すてての種子を、真空浸透の後にすぐに取り 出し、空気種子乾燥器中で１時間、周囲温度で空気乾燥せしめ、そして得られる 植物の細菌性コロニー化を評価するために、温室中でＭｅｔｒｏ−Ｍ　ｉｘ７Ｍ （Ｗ、Ｒ，Ｇｒａｃｅ　Ｃｏ、により製造された）はち植え用培地に３時間以内 で植えた。

植物を、種子を植えた後、２３日で収穫し、そして内部植物性寄生体ＣＸＣの存 在についてバイオアッセイした。発芽は、すべての処理物及び対照のために７０ 〜９０％の範囲で生じた。

ＤＭＦにより処理された種子に由来する植物のコロニー化は４８％であり、対照 的に、ＰＢＳのみにより処理された対照のコロニー化は７％であった。

例３ １１１ｉｎｏｉｓ　Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ　５ｅｅｄ、　Ｉｎｃ、、　Ｃｈａｍ ｐａｉｇｎ、　ｌ１ｌｉｎｏｉｓから得られた遺伝子型ＦＲ６３２のトウモロコ シの種子を、低温（１６℃）で、暗室中において３日間、ＰＢＳにより吸収せし めた（浸透せしめた）。この吸収は種子組織を軟化せしめ、そして種子中への針 の侵入を可能にした。この吸収の３日後、高濃度のＣＸＣを、針により刺すこと により、種々の胚部分に直接導入した。

次に、種々を、ＰＢＳ中、１０９個のＣＦＩＩ／−〇〇ｘｃを含む懸濁液中に室 温で置き、そして例２におけるようにして真空浸透せしめた。種子を、真空浸透 の後すぐに取り出し、周囲温・度で空気乾燥せしめ、そして得られる植物の細菌 性コロニ−化を評価するために、温室中でＭｅｔｒｏ−ＭｉｘＴＭはち植え用培 地に４時間以内で植えた。

植物を、種々を植えた後、２８日で収穫し、そして内部植物性寄生体の存在につ いてバイオアッセイした。成長した植物の１００％がコロニー化された。

例４ 遺伝子型ＦＲ６３２のトウモロコシの種子を、７０％エタノールにより１分以下 の間、すすぎ、次にＡｌｃｏｎｏｘＴＭ（Ａｌｃｏｎｏｘ　Ｉｎｃ。

により製造される）Ｉ！２当たり５０％Ｃ１ｏｒｏｘ”　３００ｍｇの溶液によ り１５分間、すすぐことにより表面殺菌した。Ｃ］ｏｒｏｘ”を、殺菌した蒸留 水により完全に除いた。次に種子を、細菌培養培地中に懸濁された１０９〜１０ ′１個のＣＦＵ／ｒｄのＣｘｃを含む懸濁液中に無菌状態で置いた。次に、鋭い 針を用いて、液体の表面下にそれらの種子を完全に入れたまま、種子の胚部分を 刺した。次に、７００ｍｍ／）Ｉｇの減圧を容器に行ない、この容器中において は、種子及び細菌溶液が例２におけるようにして２．５時間維持されていた。但 し、すべての操作は無菌下で行なわれた。種子を、真空浸透の後すぐに取り出し 、そして直接植えるか又は市販のＣａｐｔａｎ　５０ＷＰ”（Ｓｔａｕｆｆｅｒ により製造され、Ｍｅｙｅｒ　５ｅｅｄ　Ｃｏ、により売られている）のタルク による１：１０希釈溶液により被覆し、続いてすぐに植えた。植込みは、鉱物栄 養を有するホーグランド液により飽和されたＰｅｒｌｉ−ｔｅ　ＴＭ成長支持体 を含む無菌管中で行なった。

植物を、種子を植えた後、３６日で収穫し、そして内部植物性寄生体の存在につ いてバイオアッセイした。発芽割合（７５％）又は得られる植物の内部植物性寄 生体コロニー化（８７％）に関して、Ｃａｐｔａｎ”′により処理された種子と 処理されなかった種子との間に差異は存在しなかった。

例５ 遺伝子型ＦＲ６３２のトウモロコシの種子を、１０’〜１０；１個のＣＦｔｌ／ ｍｆの内部植物性寄生体ＣＸＣを含むＰＢＳ中に、低温（１６℃）で、暗がり中 で吸収した。吸収した後３日で、１ｏ！１〜１０１１個のＣＦｔｌ／ｒｎ１．の ＣＸＣを、針により刺すことによって種子の胚部分に直接導入した。

次に種子を、ＰＢＳ中、約１０９個のＣＦＩＩ／ｒｄのＣＸＣを含む懸濁液中に 室温で置き、そして例２におけるようにして真空浸透せしめた。真空浸透せしめ た後、すぐに種子を取り出し、周囲温度で空気乾燥せしめ、Ｃａｐｔａｎ　５０ ＷＰ”の５０％希釈溶液（タルクを含む）により被覆し、そして得られる苗の細 菌性コロニー化を評価するために、鉱物栄養を含むホーグランド液により飽和さ れたＰｅｒｌｉｔｅ”（Ｗ、’Ｒ，Ｇｒａｃｅ　Ｃｏ、により製造された）成長 支持体を含む無菌管中に又はＭｅｔｒｏ−ＭｉｘＴ″はぢ植え用培地に温室中で ４時間以内で植えた。

種子を植えた後、１９日で植物を収穫し、そして内部植物性寄生体の存在につい てバイオアッセイした。無菌性試験管中で成長した１００％の植物が、内部植物 性寄生体により、コロニー化され、そして温室で成長した３３％の植物がコロニ ー化綿種“ＤＰＬ　５０″及びダイズ栽培変種植物“Ｆｏｒｒｅｓｔ”の種子を 、ＰＢＳ中、１０１０〜１０１個のＣＦｔｌ／ｍｊ２のＣＸＣを含む懸濁液中に 室温で置き、そして約１時間の間、ひじょうに高い減圧（２００ミクロンのＨｇ ）下で真空浸透せしめた。真空浸透の後すぐに、種子を取り出し、室温で空気乾 燥せしめ、そして得られる苗の細菌性コロニー化を評価するために、鉱物栄養を 含むホーグランド液により飽和されたＰｅｒｌｉｔｅＴＭ成長支持体を含む無菌 管中にすぐに植えた。

種子を植えた後、１６日で植物を収穫し、そして内部植物性遺伝子型ＦＲ６３２ のトウモロコシの種子を、例４におけるようにして表面殺菌し、そして（Ａ）水 中、１％Ｎａｔｒｏｓｏｌ”＋１％Ｃａｐｔａｎ　５０ＷＰ”、（’Ｂ）Ｓ８栄 養細菌増殖培地中、１％Ｎａｔｒｏｓｏｌ”＋　１％Ｃａｐｔａｎ　５０１１ｉ Ｐ”又は（Ｃ）ＰＢＳ中、１０”〜１０１個のＣＦｔｌ／ｍｊ？のＣＸＣの溶液 に置いた。さらに、ＣＸＣを、例４におけるようにして半分の種子の胚部分中に 注入した。

すべての処理された種子を、１．５時間、１００ポンド／インチ２（ｐｓｉ）の 圧力にかけた。すぐに種子を取り出し、そして例５におけるように無菌管に植え た。

種子を植えた後、３１日で植物を収穫し、そして内部植物性寄生体の存在につい てバイオアッセイした。注入はひじょうに発芽を減じたけれども（Ａ＋Ｂからの 注入された種子のためにはそれぞれ４１％及び２５％であり、対照的にＡ＋Ｂの 両者からの注入されなかった種子のためには９１％であった）、コロニー化の頻 度は、はとんどの処理で卓越していた：Ａ−注入された　１００％ 八−注へされなかった　９０％ Ｂ＝注入された　１００％ Ｂ−注入されなかった　７２％ Ｃ−注入された；全処置は、汚染の影響を受けたＣ−注入されなかった　５７％ 例８ 遺伝子型ＦＲ６３２のトウモロコシの種子を、暗室中で１日間、１６℃でＰＢＳ に吸収せしめ、次に種子の胚部分にＣＸＣを直接注入した。種子の続く真空又は 減圧浸透は行なわれなかった。

Ｅに比べて、たった１％の得られた植物のみがコロニー化した。従って、真空又 は減圧浸透は好都合なコロニー化のためには必須ではないけれども、それはほと んどの場合、ひじょうに有益である。

ス及び１％Ｔｗｅｅｎ　２０中、１．４　Ｘ　１０°個のＣＦＩＩ／ｄのＣｘｃ の懸濁液により１時間、例４におけるようにして真空浸透せしめた。種子を一晩 乾燥せしめ、そして次に得られる植物の細菌性コロニー化を評価するために、温 室中においてＭｅｔｒｏ−Ｍｉｘ”に植えた。植物を、植えた後、３３日で収穫 し、そして内部植物性寄生体の存在についてバイオアッセイした。処理された種 子に由来する植物のコロニー化は、２３％であり、そして種子の発芽は７０％で あった。

例１０ トウモロコシ（ＦＲ６３２）及びダイズ（Ｐｅｌｌａ）の種子を、鉱油、トウモ ロコシ油、シリコーン油又はＲｈｏｐｌｅｘ”　Ｂ−１５エマルジヨン中に２時 間含浸することにより処理した。次に種子をドリップ乾燥せしめ、そして発芽を 評価するために温室に植えた。植えた後、１２日で評価される発芽割合は次の通 りであ未処理の対照　９７％　１００％ ＰｈｏｐｌｅｘＢ−１５８９％　７６％鉱　油　２３％　９０％ トウモロコシ油　５９％　９８％ シリコーン油　２３％　９５％ 従って、一定の油による処置は、種子の発芽に劇的には影響を与えないであろう 。

他の実験は、ＣＸＣが１力月以上の間、これらの化合物のそれぞれの中に室温で 貯蔵され得、そして生存したまま残存することを示した。

例１１ ある揮発性有機溶媒を、種子発芽に対するそれらの効果について試験した。トウ モロコシ（ＦＲ６３２）及びダイズ（Ｐｅｌｌａ）の種子を、例４におけるよう にして下記溶媒により１時間真空浸透せしめることによって処理した。次に、種 子を室温で１時間空気乾燥せしめ、そして温室においてＭｅｔｒｏ−Ｍｉｘ”に 植えた。発芽を、１０日後（１〜５）又は５日後（６〜１２）（すべての数字は ％発芽率として与えられる）評価した：（１）未処理の対照　９４９６ （２）アセトン　９５９６ （３）四塩化炭素　９０９８ （４）ジクロロメタン　８４９７ （５）クロロホルム　８９８８ （６）シクロヘキサン　７５ （７）キシレン（ｏ、　ｍ、　ｐ）　８１（８）亜麻仁油　６６ （９）ｎ−へキサン　９３ （１０）イソプロパツール　７９ 他の実験は、内部植物性寄生体ＣＸＣが溶媒に添加される前、凍結乾燥される場 合、それはこれらの溶媒中での１時間以上の含浸処理を生存することができるこ とを示した。

例１２ ＰＢＳ中、１０９個のＣＦＬＩ／ｍＡのＣｘｃの懸濁液を、製造業者（Ｍｉｚｚ ｙ、Ｉｎｃ、、　Ｃｌ１ｆｔｏｎ　Ｆｏｒｇｅ、ＶＡ　２４４２２）の指示によ りＳｙｒ　ｉ　ｊｅｔＭａｒｋ　ｍ医療用注射器中に充填した。それぞれ５００ Ｉのアリコートを、土壌線のわずかな上の茎にガンを維持し、そして引き金を引 くことによって、５週間温室で成長せしめられたトウモロコシの植物及び３週間 温室で成長せしめられたダイズの植物に接種した。

接種の後、３０日で植物を収穫し、そして植物の某組織中における内部植物性寄 生体の存在についてバイオアッセイした。

この態様で接種されたトウモロコシ及びダイズ植物のそれぞれ９６％及び９３％ が、内部植物性寄生体によりコロニー化され２０日間温室で成長せしめられた、 遺伝子型ＦＲ６３２のトウモロコシ植物を、１％Ｔｗｅｅｎ　２０　、４０　、 ６０　、８０及び８５中、３Ｘ１０’個のＣＦＵ／ｍＡのＣｘｃを含む懸濁液数 滴を植物の輪生体く先端）に添加することによって処理した。

接種の後、３５日で植物を収穫し、そして植物の某組織における内部植物性寄生 体の存在についてバイオアッセイした。

それらの植物は、次の％コロニー化を示１−た７９０％（Ｔｗｅｅｎ２０＞　、 　３３％（Ｔｗｅｅｎ　４０）、　５４％（Ｔｗｅｅｎ　６０）、　３４％（Ｔ ｗｅｅｎ　８０）及び５５％（Ｔｗｅｅｎ　８５）。

例１４ サトウモロコシ種”Ｅａｒｌｉｋｉｎｇ”（１，！ｅｙｅｒ　５ｅｅｄ　Ｃｏ、 　により供給される）及びフィールド、トウモロコシ種“Ｄｅｋａｌｂ　Ｔ　１ １００”（Ｄｅｋａｌｂ−Ｐｆｉｚｅｒ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓにより供給される） の種子を、１６℃で暗やみにおいてインキュベートした。種子を含浸するために 十分におおうために、十分な蒸留された脱イオン水（００−Ｈ２Ｃ）を含むビー カーに種子を置いた。吸収の後、１．３．５及び１７時間で、種子を取り出し、 そして対数増殖期の半固体培地上から収穫された約３Ｘ１０ｓ個のＣＦＩＪ／− のＣＸＣを含むＰＢＳ中、３％ＤＭＦの溶液中に置いた。次にこれらの含浸され た種子を、すぐに、圧力ガスとしての窒素により２００ボンド／インチ２（ｐｓ ｉ）の圧力に２０分間、ゆだねた。含浸（乾燥）されなかった種子もまた、上記 圧力下での接種処置（Ｐ、１．）にゆだねた。接種に続いて、種子を、４０℃で ５．５時間（Ｅａｒｌｉ−ｋｉＢ）又は３時間＜Ｔ　１ｌｏＯ）、空気オーブン 中で乾燥せしめ、そしてＣａｐｔａｎ　４０００（Ｇｕｓｔａｆｓｏｎにより製 造される）により被覆した。この処理は、１５０個の種子当たり、配合された生 成物、すなわち３５％以上の活性成分の７倍希釈溶液］、、２ｍＩ２の割合で適 用された。乾燥の後、種子を、得られる苗の細菌性コロニー化を評価するために 、温室中のＭｅｔｒｏ−ＭｉｘＴ″はち植え用培地に植えた。植物を、植えた後 、約２カ月で収穫し、そして内部植物性寄生体Ｃｘｃの存在についてアッセイし た。アッセイは、可能性ある汚染物の増殖よりもＣＸＣの増殖を選択的に増強す るように企画された半固体富化培地のブ１／−ト上に、表面を殺菌された茎部分 の底の切断端からの樹液を絞り出すことによって行なわれた。コロニー化の割合 の％は、次の通りであった： 種　類　前　処　理　％コロニー化 Ｅａｒｌｉｋｉｎｇ　乾燥　０ 〃　１時間の吸収　Ｏ 〃　３時間の吸収　６ 〃　５時間の吸収　１７ 〃１７時間の吸収　９３ Ｔ　１１００　乾燥　０ “　１時間の吸収　２ “　３時間の吸収　２ 〃　５時間の吸収　１０ 〃１７時間の吸収　４６ 例１５ サトウモロコシ種“Ｈｏｗ　Ｓｗｅｅｔ　Ｉｔ　Ｉｓ”（Ｃｒｏｏｋｈａｍ　Ｃ ｏ、からの）及び”Ｗｈｉｔｅ　Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ”＜５ｔｏｋｅｓ　５ｅｅ ｄ　Ｌｔｄ、からの）の種子を、例１４におけるようにして一晩（約１７時間） ｌ！Ａ収せしめた。次に、吸収された種子及び乾燥対照の両者を、半固体培地上 で対数増殖物から収穫されたｌＸｌ０”個のＣＦＩＩ／＋７１７！のＣｘｃを含 むＰＢＳ中、３％ＤＭＦの溶液中に置いた。次に、これらの含浸された種子をす ぐに、７００ｍｍＨｇの減圧の適用から成る真空接種処理（ν、１）に１時間ゆ だねた。種子をすぐに取り出し、そして約２３℃で押込空気下で１時間乾燥せし めた。

種子をＣａｐｔａｎ　５０ＩｌｌＰ”により被覆し、温室中に植え、そして例１ ４におけるようにして評価した。

種　類　前　処　理　％コロニー化 Ｈｏｗ　Ｓｗｅｅｔ　Ｉｔ　Ｉｓ　乾燥　１２〃１７時間の吸収　７０ １’！ｈｉｔｅ　ＬｉｇｈｔｎｉＢ　乾燥　０〃１７時間の吸収　７１ 例１６ “Ｅａｒｌｉｋｉｎｇ”種のサトウモロコシの種子を、例１４におけるようにし て１７時間吸収せしめた。その種子を、例１４におけるようにして、ＰＢＳ中、 ３％ＤＭＦ又はＰＢＳ中、１％Ｄ　Ｍ　Ｓ　ＯにおけるｌＸｌ０１０個のＣＦＵ ／−〇ＣＸＣにより圧力接種し、そして例１５におけるようにして乾燥せしめた 。種子をＣａｐｔａｎ５０ＷＰＴＭにより被覆し、温室に植え、そして例１４に おけるようにして評価した。

種　類　前　処　理　処　理　％コロニー化Ｅａｒｌｉｋｉｎｇ　乾　燥　３％ ＤＭＦ　３６〃１７時間の吸収　〃８３ 〃　乾燥　ＰＢＳ　３８ 〃１７時間の吸収　〃９４ 〃　乾燥　１％ＤＭＳＯ６０ 〃１７時間の吸収　７７９０ 例１７ この実験における種子は、例１６と同じ態様で接種され、そして操作される。但 し、種子は、１９８７年８月、マリーランド州）ｔｏｗａｒｄ　Ｃｏｕｎｔｙの 畑に潅泡を行わないで植えられた。評価は、例１４におけるようにして行なわれ た。

種　類　前　処　理　処　理　％コロニー化Ｅａｒｌｉｋｉｎｇ　乾燥　３％Ｄ １１！Ｆ　３８〃１７時間の吸収　〃８８ 例１８ Ｅａｒｌｉｋｉｎｇ″種のサトウモロコシの種子を、例１６におけるようにして ３％ＤＭＦ中、６３Ｘ１０’個のＣＦＩＩ／ｍｆのＣＸＣにより接種した。但し 、圧縮酸素を用いて、処理容器を加圧した。

種子を例１６におけるようにして操作し、そして評価した。但し、それらを、− 晩乾燥せしめた。

種　類　前　処　理　処　理　％コロニー化Ｅａｒｌｉｋｉｎｇ　乾燥　３％Ｄ ＭＦ、０２２２〃１７時間の吸収　“　９２ 〃　乾燥　３％ＤＭＦ、Ｎ２２１ 〃１７時間の吸収　〃８７ 例１９ “Ｅａｒ　］　ｉｋ　ｉｎｇ”種のサトウモロコシ及びＴ　１１００種のフィー ルドコーンの種子を、例１６におけるようにしてｌＸｌ０１０個のＣＦｔｌ／ｍ ｆｆ１のＣＸＣにより吸収せしめ、そして圧力接種せしめた。

それらを、押込空気流中において２３℃で５．５時間（Ｅａｒｌｉｋｉｎｇ）又 は４０℃で３時間＜Ｔ　１１００）乾燥せしめた。すべての接種された種子を、 殺カビ剤、すなわちＣａｐｔａｎ　４０００により処理し、そして例１４におけ るようにして評価した。

種　類　前処理　処理　乾燥　％コロニー化Ｅａｒｌｉｋｉｒ＋ｇ、乾燥　３％ Ｄｌ、ＩＰ　２３℃　６〃１７時間の吸収　〃〃９５ 〃　乾燥　ＰＢＳ　〃７ 〃１７時間の吸収　〃〃９４ 〃　乾燥　１％ＤＭＳＯ２３℃　２ 〃１７時間の吸収　〃〃９１ Ｔ　１１００　乾燥　３％ＤＭＦ　〃０〃１７時間の吸収　〃〃６６ 〃　乾燥　ＰＢＳ〃０ 〃１７時間の吸収　〃〃６４ 〃　乾燥　１％ＤＭＳＯ〃０ 〃１７時間の吸収　〃〃６９ Ｅａｒｌｉｋｉｎｇ　乾燥　３％ＤＭＦ　４０℃　４〃１７時間の吸収　／／　 ／／　８９ 〃　乾燥　ＰＢＳ　〃０ 〃１７時間の吸収　〃〃８７ 〃　乾燥　１％ＤＭＳＯ〃０ 〃１７時間の吸収　ノｌ／／９６ 種　類　前処理　処理　乾燥　％コロニー化Ｔ　１１００　乾燥　３％ＤＭＦ　 〃０〃１７時間の吸収　〃〃５３ 〃　乾燥　ＰＢＳ〃０ ７１７時間の吸収　〃〃５２ 〃　乾燥　１％ＤＭＳＯ〃０ ７１７時間の吸収　〃〃５６ 例２０ ＰＲ６３２種のフィールドコーン及び“Ｅａｒｌｉｋｉｎｇ”種及び”５ｅｎｅ ｃａ　Ｈｏｒｉｚｏｎ”種（Ｒｏｂｓｏｎｌｓ　５ｅｅｄ　Ｆｏｒｍｓからの） のサトウモロコシの種子を、例１４におけるようにして圧力接種した。

但し、圧力は３０分間適用され、そして瞬間的に圧力を開放し、そしてすぐに再 加圧することを断続的に３回行なった。種子を押込空気流下で２３℃で一晩乾燥 せしめ、Ｃａｐｔａｎ　５０ＷＰ”により被覆し、温室に植え、そして例１４に おけるようにして評価した。

種　類　前　処　理　処　理　％コロニー化ＰＲ６３２１７時間の吸収　３％Ｄ 　Ｍ　Ｆ　２８Ｅａｒｌｉｋｉｎｇ　１７時間の吸収　〃９７Ｓｅｎｅｃａ　Ｈ ｏｒｉｚｏｎ　１７時間の吸収　２７７例２１ 多くの種類のトウモロコシ［Ｅａｒｌｉｋｉｎｇ、Ｗｈｉｔｅ　Ｓｕｎｇｌｏｗ （Ｍｅ−ｙｅｒ　５ｅｅｃｌ　Ｃｏ、からの）及びＥａｒｌｙ　Ｓｕｎｇｌｏｗ 　（ｔ、！ｅｙｅｒ　５ｅｅｄ　Ｃｏ。

からの）］の乾乾燥子を、例１４におけるようにして、３％ＤＭＦ中、５Ｘ１０ ９個のＣＦＩ］／ｄのＣｘｃによる圧力接種にゆだねた。但し、圧力処理の期間 は１時間であった。種子を、押入空気種子乾燥機上で一晩乾燥せしめ、Ｃａｐｔ ａｎ　５０ＷＰ”により被覆し、温室に植え、そして例１４におけるようにして 評価した。

種　類　前　処　理　処　理　％コロニー化Ｅａｒｌｉｋｉｎｇ　乾燥　３％Ｄ ＭＦ　２０Ｗｈｉｔｅ　Ｓｕｎｇｌｏｗ　／／　／／　５０Ｅａｒｌｙ　Ｓｕｎ ｇｌｏｗ　〃　〃　８５例２２ ４種のサトウモロコシ種及び１種のフィールドコーン種の種子を、３％ＤＭＦ溶 液を用いて１７時間吸収せしめ、そして圧力（Ｐ、　１．）又ハ真空（Ｖ、ｌ、 ）下で接種した。実験は例１５（Ｖ、１．）におけるようにして行なわれた。但 し、Ｐ、１．が使用される場合、それは例１４におけるようにして行なわれた。

種　類　前　処　理　処　理　％コロニー化）ｌｏｗ　Ｓｗｅｅｔ　Ｉｔ　Ｉｓ 　１７時間の吸収　３％ＤＭＦ：Ｖ、　１．　１２Ｅａｒｌｙ　Ｓｕｎｇｌｏｗ 　／／　／／　ＢＥａｒｌｉｋｉＢ　１２ 〃〃 ５ｅｎｅｃａ　ｔｌｏｒｉｚｏｎ　〃　〃　４種　類　前　処　理　処　理　％ コロニー化ＦＲ６３２０ Ｈｏｗ　Ｓｗｅｅｔ　Ｉｔ　Ｉｓ　〃３％ＤＭＦ：Ｐ、１．　６８Ｅａｒｌｙ　 Ｓｕｎｇｌｏｗ　ｉｔ　”　９２Ｅａｒ］　ｉｋｉｎｇ　７９ Ｓｅｎｅｃａ　ｔｌｏｒｉｚｏｎ　／／／１８４ＦＲ６３２１３ 例２３ ５種のサトウモロコシ種及び１種のフィールドコーン種の種子を、例２２におけ るようにして圧力又は真空のいづれかにより接種した。但し、ＣＸＣは、３％Ｄ ＭＦにおけるよりもむしろＳ８細菌培養培地に由来した。

種　類　前　処　理　処　理　％コロニー化Ｈｏｗ　Ｓｗｅｅｔ　Ｉｔ　Ｉｓ　 １７時間の吸収　Ｓ８：Ｖ、１．１２Ｗｈｉｔｅ　Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ〃ｔｔ　 ９Ｅａｒｌｙ　Ｓｕｎｇｌｏｗ　”　／／３ＥａｒｌｉｋｉｎｇＢ Ｓｅｎｅｃａ　１ｌｏｒｉｚｏｎ　“／／　ＯＦＲ６３２０ Ｈｏｗ　Ｓｗｅｅｔ　Ｉｔ　Ｉｓ〃Ｓ８；Ｐ、１．　４８Ｗｂｉｔｅ　Ｌｉｇｈ ｔｎｉｎｇ　〃〃８１Ｅａｒｌｙ　Ｓｕｎｇｌｏｗ　〃〃８３ＥａｒｌｉｋｉＢ 　７３ 種　類　前　処　理　処　理　％コロニー化５ｅｎｅｃａ　ｔｌｏｒｉｚｏｎ　 ″６８ＦＲ６３２１９ 例２４ ７種のフィールドコーン種及び１種のサトウモロコシ種の種子を、例２２におけ るようにして３％ＤＭＦ中、ＣＸＣにより真空又は圧力接種した。しかしながら 、種子は初めに、表面を殺菌された。特に、それらは、７０％エタノールにより ２分間すすぎ、湿潤剤として添加されるＡｌｃｏｎｏｘ　Ｔ′′界面活性剤を有 する４０％Ｃ１ｏｒｏｘ”溶液中に１５分間、含浸せしめ、無菌のすすぎ水によ り少なくとも３回すすぎ、そして最後に、層流キャビネット中における吸収紙上 で１５分間の乾燥にゆだねた。

接種の後、種子を層流キャビネット中で１．５時間乾燥せしめ、Ｃａｐｔａｎ　 ５０ＷＰ”により処理し、Ｐｅｒ　１　ｉ’ｔｅ”及びホーグランド栄養溶液を 含む無菌管に植え、そして２８℃で人工光下でイノキュベートした。２週間後、 実生を温室のポットに移し、そして例１４におけるようにして評価した。

種　類　前　処　理　処　理　％コロニー化（Ｌ）ＩＩ　ｘｌ（９３）Ｌｔ１３ ８殺菌された表面　３％ＤＭＦ；Ｐ、Ｉ、　８５（ＭＯ１７ＸＬＨ５１）Ａ６３ ４　〃〃７７ＬＨ１３２Ｘ　ＬＩＩ５１　４７ Ａ６３２ｘ　Ｌ）１３９　９５ Ｌｆ１３８ｘ　Ａ６３２　９３ 種　類　前　処　理　処　理　％コロニー化ＦＲ６３２８０ Ｔ　１１００　６９ Ｅａｒｌｉｋｉｎｇ２１ （ＬＨ１３２ＸＬ）１５１）ＬＨ３８〃３％ＤＭＦ；ν、１．０＜ＭＯ１７ＸＬ Ｈ５８）Ａ６３４　〃”　０ＬＨ１３２ｘ　Ｌ）１５１　０ ＦＲ６３２３ Ｔ　１１００　３５ Ｅａｒｌｉｋｉｎｇ　１１ 例２５ ＰＲ６３２種のフィールドコーンの種子を、例２４におけるようにして３％ＤＭ Ｆ又はＳ８のいづれかにおけるＣＸＣにより真空接種した。但し、真空は開放さ れ、そしてすぐに再加圧された。このような循環を、１時間の真空接種の間、３ 回行なった。植物を、１７日でのＣｘｃによるコロニー化について評価しくこの 時、それらは、試験管から温室に移された）、そして続いて２力月でのコロニー 化を評価した。

種　類　前　処　理　処　理　アッセイ　％コロニー化ＦＲ６３２殺菌された表 面　Ｓ８；Ｖ、ｌ、　１７日７０〃〃３％ＤＭＦ；Ｖ、１．　〃、１１ ’　〃Ｓ８；Ｖ、１．　２力月　１００〃〃３％ＤＭＦ；Ｖ、１．　”　１００ 例２６ ＰＲ６３２種のトウモロコシの種子を、例１４におけるようにして１７又は４１ 時間吸収せしめ、この後、それらを約１０９個のＣＦＩＩ／−のＣＸＣの溶液の 存在下で種々の期間遠心分離し、種子を乾燥せしめ、Ｃａｐｔａｎ　５０ＷＰＴ ＋により被覆し、植え、そして例１５におけるようにして評価した。

吸　収　Ｃｘｃキャリヤー　遠心分離　％コロニー化ｌｄ　ＤＤＨ２０５分　５ １ｄ　ＰＢＳ　５分　１０ ＩＰＢＳ　１０分　１１ 〃〃１５分　１６ ２ｄ　〃　５分　４５ 〃〃１５分　２１ 例２７ ３．４Ｘ１０Ｓ個のＣＦＩＩ／ｉｆｆのＣＸＣを含む、ＤＤ−Ｈ，Ｏ中、３種の 界面活性剤の水性懸濁液を、ピペットにより、１３日目のトウモロコシの植物（ ＦＲ６３２種）の輪生体にしたたり落ちるまで適用した。植物を、例１４におけ るようにしてコロニー化について評価した。

処　理　％コロニー化 １％Ｒｅｇｕｌａｉｄ　６０ １％Ｔｗｅｅｎ　２０　７５ １％５ｕｒｆｅｌ　７１ ＤＤ−８２０対照　９ 例２８ 約５Ｘ１０’個のＣＦＵ／Ｉｎ！！、のＣＸＣを含む、ＤＤ−８，０ヰ、界面活 性剤の溶液２ｍｌを、温室中でＰＲ６３２種のトウモロコシを発育する輪生体中 に噴霧したく手動式のアトマイザ−噴霧器を用いて）。いくつかの植物を、６０ ０メツシユのカーボランダム（Ｃａｒｂ、）により軽く散布され、その後すぐに 、Ｃｘｃにより噴霧された。植物を、例１４におけるようにしてＣＸＣコロニー 化について評価した。

下記週で接種される場合の％コロニー化処　理　１週　２週　１星　土星　−Ｌ 週−ｙ至未処理の対照　ｏｏｏｏｏ。

０％５ｕｒｆｅｌ＋Ｃａｒｂ、　０　０　４４　３０　２０　００．１％５ｕｒ ｆｅｌ＋Ｃａｒｂ、　０　５　１６　５６　３８　−０．３％５ｕｒｆｅｌ＋Ｃ ａｒｂ、　Ｏ１５３５３３２０−０，５％５ｕｒｆｅｌ＋Ｃａｒｂ、　０　２２ 　３１　７７　１０　−０．７％５ｕｒｆｅｌ＋Ｃａｒｂ、　４１　３２　３２ 　５８　１７　０下記週で接種される場合の％コロニー化１．０％５ｕｒｆｅｌ ＋Ｃａｒｂ、２１　３２　５３　４６　２５　００．５％５ｕｒｆｅ］＋Ｃａｒ ｂ、　０　５　５３　２９　１２　００．７％５ｕｒｆｅｌ＋Ｃａｒｂ、　１４ 　４２　３１　８６　１４　０１．０％５ｕｒｆｅｌ＋Ｃａｒｂ、　３９　４８ 　５６　３８　１４　０種々の修飾及び変更が本発明の方法及び生成物に行なわ れることは当業者にとって明らかであろう。たとえば、有益な微生物による種子 及び植物のコロニー化の程度及び発芽する含浸された種子の％は、当業者により 最適化されるであろう。

従って、本発明は、請求の範囲内で修飾及び変更を行なうことができる。

国際調査報告

Claims (28)

【特許請求の範囲】
1. １．種子に含浸される有益な微生物を有する種子であって、発芽後、前記微生物 によりコロニー化された植物を生ぜしめる種子。
2. ２．前記微生物が休眠状態で存在する請求の範囲第１項記載の種子。
3. ３．代謝的に活性である場合、前記微生物は、前記植物又はその種子に導入され なければ、前記植物をコロニー化することができない請求の範囲第２項記載の種 子。
4. ４．前記微生物が、前記植物のための窒素を固定する内部植物性寄生体、生物学 的調整剤又は微生物である請求の範囲第１項記載の種子。
5. ５．前記微生物が、それらが天然で産生しない化学物質を産生せしめるために遺 伝子的に構築された内部植物性寄生体である請求の範囲第１項記載の種子。
6. ６．前記微生物がリゾビウム属からのクラビバクター層から選択された株である 請求の範囲第１項記載の種子。
7. ７．前記微生物がクラビバクターｘｙｌｉ亜種シノドンチスの株である請求の範 囲第１項記載の種子。
8. ８．前記種子がグラミニアエ、レクミノサエ又はマルバセアエ科から選択された 種子である請求の範囲第１項記載の種子。
9. ９．農業用化学物質を産生し、そして植物との内部共生関係に入る能力を有する 遺伝的に構築された微生物を含む種子。
10. １０．前記微生物が適切な食物源によりマイクロカプセル化されている請求の範 囲第１項記載の種子。
11. １１．種子中に有益な微生物を導入するための方法であって、生物学的に適合さ れる液体キャリヤーにおける前記微生物の懸濁液を形成するために前記キャリヤ ーに前記微生物を添加し； 前記懸濁液により前記種子を含浸し、そして前記種子から過剰のキャリヤーを除 き、それによって前記微生物及び前記種子の生存率を維持する段階を含んで成る 方法。
12. １２．前記微生物が、前記過剰のキャリヤーが前記種子から除かれる場合、休眠 する請求の範囲第１１項記載の方法。
13. １３．代謝的に活性である場合、前記微生物は、前記植物又はその種子中に導入 されなければ、前記植物をコロニー化することができない請求の範囲第１１項記 載の方法。
14. １４．前記微生物が、前記植物のための窒素を固定する内部植物性寄生体、生物 学的調整剤又は微生物である請求の範囲第１１項記載の方法。
15. １５．前記生物学的に適合できる液体キャリヤーが水溶液及び水溶性ガムを含ん で成る請求の範囲第１１項記載の方法。
16. １６．前記生物学的に適合できる液体キャリヤーが実質的に無水の有機溶媒であ り、そして前記微生物が休眠中である請求の範囲第１１項記載の方法。
17. １７．前記種子の含浸段階が真空浸透又は圧力浸透によりなされる請求の範囲第 １１項記載の方法。
18. １８．前記種子の含浸段階が、前記種子の殻を針により刺し、そして前記針によ り又は針なしジェット注入器により前記種子中に前記懸濁液を注入することを含 んで成る請求の範囲第１１項記載の方法。
19. １９．前記種子の含浸段階が、高速度微小射出物上に又はその中に前記懸濁液を 被覆し、そして前記微小射出物の前記種子中への透過を引き起こすのに十分な力 で、前記種子に対して前記微小射出物を推進せしめることを含んで成る請求の範 囲第１１項記載の方法。
20. ２０．前記種子の含浸段階が、前記種子の胚内に前記懸濁液を付与することを含 んで成る請求の範囲第１１項記載の方法。
21. ２１．前記種子が、前記懸濁液により含浸される前、吸収せしめられる請求の範 囲第１１項記載の方法。
22. ２２．前記種子の含浸段階が、前記種子及び前記懸濁液を遠心分離にゆだねるこ とによって達成される請求の範囲第１１項記載の方法。
23. ２３．前記懸濁液かまた、細かく粉砕された無機固形物又は微粒状ガラス又はカ ーボランダムをも含む請求の範囲第１１項記載の方法。
24. ２４．前記種子の表面が、前記懸濁液により含浸される前、殺菌される請求の範 囲第１１項記載の方法。
25. ２５．有益な微生物によりコロニー化される植物を得るための方法であって： 前記キャリヤー中における前記微生物の懸濁液を形成するために生物学的に適合 する液体キャリヤーに前記微生物を添加し； 前記懸濁液により種子を含浸し；そして前記植物を得るために前記種子を成長せ しめる段階を含んで成る方法。
26. ２６．請求項２５記載の方法により作られる植物。
27. ２７．植物中に有益な微生物を導入するための方法であって：前記キャリヤー中 における前記微生物の懸濁液を形成するために生物学的に適合できる液体キャリ ヤーに前記微生物を添加し；そして 前記懸濁液により前記植物を接種する段階を含んで成る方法。
28. ２８．請求項２７記載の方法により作られる植物。