JPH0276810A - 脂質膜構造体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は式（１） （式中８Ｒ１は水素又は脂肪酸残基を、Ｒ１は水素又は
非環式炭化水素残基を、Ｒ３はアミノ基、アミジノ基又
はグアニジノ基を、ｎは１〜６の整数を意味する。但し
、ＲＩ及びＲ２が同時に水素である場合を除く、）で示
される化合物又はその塩を含有する脂、買膜構遺体に、
関する。

〈産業上の利用分野〉 本発明の脂質膜構造体は、腫瘍細胞等に対し特異的指向
性を有し、医療上有用なものである。

〈従来の技術〉 腫瘍細胞に対し特異的指向性を有するリポソームの研究
としては、現在のところモノクロナール抗体を用いてリ
ポソームの表面を修飾する方法が報告されている。

例えば、多日限の総説［医薬ジャーナル、２０゜８４３
　（ｔａａ４）　；細胞工学、、　Ｌ：　７２　（１９
８２）］や、大沢等の報告［ケミカル・アンド・ファー
マシェーティカルーブレテ４　：／、　３５．７４０　
（１９１ｍ７）］　。

ＰａｐａｈａｄＪｏｐｏｕｌｏｓ等の報告［キャンサー
ｅリサーチ・　■、　４９０４　（１９８６）］等があ
る。なかでも大沢等の方法によれば、リポソーム表面を
抗癌胎児性抗原抗体で修飾した小さな一枚廁リポソーム
が容易に癌細胞に取り込まれ、抗腫瘍効果が増強してい
ることが示されている。

しかしながら、これらモノクロナール抗体は。

大量生産が困難であり商品化は難しい現状にある。

〈発明が解決しようとする問題点〉 本発明者等は、効率的な癌細胞への特異的指向性を有し
、かつ再現性良く大量生産可能な脂質膜構造体について
鋭危検討した結果１本発明を完成した。

〈発明の構成〉 本発明は式（１）の化合物又はその塩を含有する脂質膜
構造体に関する。

式（１）の化合物における脂肪酸残基とは分枝を有して
もよい飽和又は不飽和の脂肪酸より水酸基を除くことに
より形成される基であり、その例としてはフォルミル、
アセチル、プロパノイル。

ブタノイル、ペンタノイル、ヘキサノイル、ヘプタノイ
ル、オクタノイル、デカノイル、ドデカノイル、トリデ
カノイル、テトラデカノイル、ペンタデカノイル、ヘキ
サデカノイル、ヘプタデカノイル、オクタデカノイル、
ノナデカノイル、エイコサノイル、ヘニコサノイル、ド
コサノイル、トリコサノイル、テトラコサノイル、ヘキ
サコサノイル、トリアコンタノイル、９−へキサデセノ
イル、９−オクタデセノイル、　９．１２−オクタデカ
ジェノイル、　９，１２．１５−オクタデカトリエノイ
ル、１１−エイコサノイル、　１１．１４−エイコサジ
ェノイル、１１゜１４．１７−ニイコサトリエノイル、
　４，８，１２．１６−ニイコサテトラエノイル、　１
３−ドデカノイル、　４，８．１２゜１５．１９−ドコ
サペンタエノイル、１５−テトラコモノイル。２−ドデ
シルヘキサデカノイル、２−テトラデシルヘキサデカノ
イル、２−ドデシルテトラデカノイル、２−テトラデセ
ニルへキサデセノイル、２−テトラデシルへキサデセノ
イル、２−テトラデセニルヘキサデカノイル等の炭素数
１〜３０のものを５好ましくは１４〜２０のものをあげ
ることができる。

又２式（１）における非環式炭化水素残基とは分枝を有
してもよい飽和もしくは不飽和の非環式炭化水素より水
素を１つ除くことにより形成される基であり、その例と
してはメチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、
ヘキシル、ヘプチル。

オクチル、ノニル８デシル、ドデシル、トリデシル、テ
トラデシル、ペンタデシル、ヘキサデシル、ヘプタデシ
ル、オクタデシル、ノナデシル。

エイコシル、ヘニコシル、トコシル、トリコシル、テト
ラコシル、ヘキサコシル、トリアコンチル、９−へキサ
デセニル、９−オクタデセニル、　９．１２−オフタデ
カシェニル、　９，１２．１５−オクタデカノイルニル
、　１１−エイコセニル、　１１．１４−エイコサジェ
ニル、　１１，１４．１７−ニイコサトリエニル、　４
，８，１２１６−ニイコサテトラエニル、　１３−トコ
セニル、４゜８．１２．Ｉｓ、１９−ドコサペンタエニ
ル、　１５−テトラコセニル、２−ドデシルテトラデシ
ル、２−ドデシルヘキサデシル、２−テトラデシルヘキ
サデシル、２−テトラデシルへキサデセニル、２−テト
ラデセニルヘキサデシル、２−ドデシルオクタデシル等
の炭素数１〜３０のものを、好ましくは１４〜２０のも
のをあげることができる。

更に９式（Ｉ）のｎについては、４又は３を好ましいも
のとしてあげることができる。

式（１）の化合物については、Ｒ１が脂肪酸残基で且つ
Ｒ２が非環式炭化水素残基である化合物が好ましく、こ
の場合にはＲ＋′ＥＬびＲ２の炭素数の和は１０〜４０
であることが望ましい。

式（１）の化合物は光学異性体を有し、該異性体及びそ
の混合物も本発明の範囲に含まれる。

本発明の脂質膜構造体とは極性脂質の極性基が界面の水
相側に向かって配列した膜構造を有する粒子を意味し、
その例としてはリポソーム、ミセル、マイクロエマルジ
ョン等があげられる。

次に本発明の式（Ｉ）の化合物又はその塩を含有する脂
質膜構造体の製造法について説明する。

ａ）　式（−Ｉ）の化合物、又はその塩を含有するリポ
ソームの製造法 ホスファチジルコリン、スフィンゴミエリン。

ホスファチジルエタノールアミン等のリン脂質。

糖脂質並びにジアルキル型合成界面活性剤等の膜形成脂
質を用いて公知の方法［アニュアル・レビュー・オブ・
バイオフィジックス・アンド・バイオエンジニアリング
　９．４６７（１９８０）］に従いリボソームの水分散
液を調製する。かかるリポソームはその膜中にコレステ
ロール、コレスタノール等のステロール類、ジアルキル
ホスフェート、ジアシルホスファチジン酸、ステアリル
アミン及びα−トコフェロール等を含んでいても良い。

調製したリポソームの水分散液に式（１）の化合物又は
その塩の水溶液を加えて一定時間放置、好ましくは膜の
相転Ｂ温度以上もしくは４０℃以上に加温し８次いで放
冷することにより目的とする式（１）の化合物又はその
塩を含有するリポソームを製造することができる。又、
前記膜形成脂質と式（りの化合物又はその塩をあらかじ
め混合し、これを公知のリポソームの製造法に従って処
理することによっても目的のリポソームを製造すること
がでとる。

ｂ）　式（１）の化合物又はその塩を含有するミセルの
製造法 ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオ
キシエチレンヒマシ油話導体、ポリオキシエチレン硬化
ヒマシ油誘導体、脂肪酸ナトリウム、胆汁酸ナトリウム
、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、ポリオキシエチ
レンアルキルエーテル等のミセル形成界面物質を、ミセ
ル形成１騨濃度以上で水に加え、ミセルの水分散液を調
製する。調製したミセルの水分散液に式（Ｉ）の化合物
又はその塩の水溶液を加え、一定時間放置、好ましくは
４０℃以上に加温し０次いで放冷することにより目的と
する式（Ｉ）の化合物又はその塩を含有するミセルを製
造することができる。又、ミセル形成物質と式（りの化
合物又はその塩をあらかじめ混合し１次いで公知のミセ
ルの製造法に従って処理することによっても目的とする
ミセルを製造することができる。

Ｃ）　式（１）の化合物又はその塩を含有するマイクロ
エマルシコンの製造法 前記ｂ）に従って製造したミセルに大豆油等の油脂を加
えてミセル内を飽和させ、不可逆的な油相分離が生じな
い程度まで油相を増加させることにより目的とする式（
１）の化合物又はその塩を含有するマイクロエマルシコ
ンを製造することができる。又、公知の方法に従って調
製したマイクロエマルシコンに式（りの化合物又はその
塩の水溶液を加え一定時間放置、好ましくは４０℃以上
に加温し６次いで放冷することによっても目的のマイク
ロエマルジョンを製造することができる。

以上のような脂質膜構造体の製造法において全脂質成分
に対する式（１）の化合物又はその塩の割合を変化させ
ることにより、生成する脂質膜構造体の種類を変化させ
ることができる場合がある６例えば、脂質としてホスフ
ァチジルコリンのみを用いた場合には９式（Ｉ）の化合
物又はその塩の全脂質成分に対する割合を約２７３モル
比以下にするとリポソームが生成し得、またそれ以上に
するとミセル又はマイクロエマルシコンが生成し得る。

このようにして製される本発明の脂質膜構造体が腫瘍ｍ
胞等への指向性を有するには１通常その製造工程におい
て式（１）の化合物又はその塩の全脂質成分に対する割
合を約ｌ／４０モル比以上にすることが望ましい。

式（１）の化合物は公知の方法を適宜組合せることによ
り製造可能であり、以下にその代表的製造法を説明する
。

（１）Ｒ３がグアニジノ基の場合 （式中、３口は脂肪酸残基を、Ｒ２Ｉは非環式炭化水素
残基を意味し、ｎは前記と同じである）式（Ｉｌａ）の
化合物を適当な有機溶媒中硫酸の存在下硝酸と反応させ
ることにより式（Ｏｔａ）の化合物を製することができ
る。これを適当な有機溶媒中式Ｒ＋ｔＣＩで表される脂
肪酸クロリドと水酸化ナトリウム等の塩基の存在下反応
させることにより式（ＩＶａ）の化合物を製造すること
ができる。これを適当な有ｍ溶媒中パラジウム炭素等の
触媒の存在下接触還元することにより式（Ｉａ）の化合
物を製造することができる。これを適当な有ｍ溶媒中酸
の存在下で式Ｒ，，ＯＨで表される化合物でエステル化
することにより式（Ｉｂ）の化合物を製造することがで
きる。尚、式（Ｉｌａ）の化合物を該反応と同様にエス
テル化することにより式（Ｉ）においてがＲ１が水素で
あり、Ｒ３がグアニジノ基であり、Ｒ２が非環式炭化水
素残基である化合物を製造することができる。

（Ｂ）　　　　　　　　　　　　　　　（Ｉｆ−）（Ｉ
Ｃ９）（工ｄン （式中、　Ｒ１１，Ｒ２１及びｎは前記と同じである）
式（ｆｉｂ）の化合物を適当な有機溶媒中ベンジルオキ
シカルボニルクロリドと反応させることにより式（ＩＩ
Ｉｂ）のｆヒ合物を製することかできる。これを適当な
有機溶媒中式Ｒ目Ｃ！で表される脂肪酸クロリドと水酸
化ナトリウム等のアルカリの存在下反応させることによ
り式（ＩＶｂ）の化合物を製造することができる。これ
を適当な有機溶媒中パラジウム炭素等の触媒の存在下接
触還元することにより式（Ｉｃ）の化合物を製造するこ
とができる。これを適当な有機溶媒中酸の存在下で式Ｒ
２１０Ｈで表される化合物でエステル化することにより
式（Ｉｄ）の化合物を製造することができる。尚、式（
Ｉｌｂ）の化合物を該反応と同様にエステル化すること
により式（１）においてがＲ８が水素であり。

Ｒ３がアミノ基であり、Ｒ２が非環式炭化水素残基であ
る化合物を製造することができる。

本発明の脂質膜構造体が保持しうる薬物は脂質膜構造体
の種類によって異なる０例えば、リポソームが保持しつ
るものとしては特に制限がなく。

水溶性薬物及び脂溶性薬物１例えばメトトレキセート、
シスプラチン等をあげることができる。

又、ミセル及びマイクロエマルシコンの場合には脂溶性
薬物を保持可能なものとしてあげることができる。

本発明の脂質膜構造体において８式（１）の化合物又は
その塩は脂質膜構造体の膜中に疎水性相互作用を介して
強固に組み込まれており、又、モノマーとして遊離する
式（Ｉ）の化合物又はその塩は非常に少ないことをゲル
濾過法及び後述する試験例１によって確認した。

〈発明の効果〉 本発明の脂質膜構造体は優れた腫瘍細胞への指向性を有
し、かつ再現性よく大量生産することができる。

次に実施例及び試験例により本発明を説明するが１本発
明はこれによりて限定されるものではない。

対照例１ ジパルミトイルホスファチジルコリン（以後ＤＰＰＣと
略す）、コレステロールをモル比でｌ：１、全脂質量８
μモルになるように試験管にとり、クロロホルムに溶か
した後、窒素ガス気流中でクロロホルムを除去して試験
管のガラス壁にリピッドフィルムを生成させた。これに
リン酸緩衝化生理食塩液（９）１７．４．以下ＰＢＳと
略す）　　２ｍｌを加えてポルテックス・ミキサーで攪
拌振とうし、更に軽く超音波処理してリポソームの懸濁
液を調製した。これを４５〜５０℃に加温し０次いで０
．２μ重の孔径を有するポリカーボネート製メンブラン
フィルタ−を通過させ９粒径Ｑ、２μ国以下のリポソー
ムの懸濁液を調製した０次にこれを超遠心分１１（１５
万ｘｇ、　　１時間、　２回）した後上澄のみを除去し
、更にＰＢＳ５ｍｌを加えリポソーム懸濁液を得た。

実施例！ ＤＰＰＣ，コレステロール及びＮ−ココイル−し−アル
ギニンエチルエステル（以下ＣＡＥＥと略す）をモル比
でｌ：ｌ：Ｑ、０５．全脂質量で８μモルになるように
試験管にとり、クロロホルム及びメタノールの混液（容
積比９；１）に溶かし、以下対照例１と同様にしてリポ
ソーム懸濁液を得た。

実施例２ ＤＰＰＣ，コレステロール及びＣＡＥＥをモル比でｌ：
１：０．１　、全脂質量で８μモルになるように試験管
にとり、以下対照例１と同様にしてリポソーム懸濁液を
得た。

実施例３ ＤＰＰＣ，コレステロール及びＣＡＥＥをモル比で１：
１：０．１５．全脂質量で８μモルになるように試験管
にとり、クロロホルム及びメタノールの混液（容積比９
：１）に溶かし、以下対照例１と同様にしてリポソーム
懸濁液を得た。

実施例４ ＤＰＰＣ，コレステロール及びＮ−バルミトイル−し−
アルギニン（以下ＦＡＡと略す）をモル比でｌ：１：０
．０５．全脂質量で８μモルになるように試験管にとり
、クロロホルム及びメタノールの混液（容積比９：１）
に溶かし、以下対照例１と同様にしてリポソーム懸濁液
を得た。

実施例５ ＤＰＰＣ，コレステロール及びＦＡＡをモル比で１：ｌ
：Ｑ、１　、全脂質量で８μモルになるように試験管に
とり、クロロホルム及びメタノールの混液（容積比９：
１）に溶かし、以下対照例１と同様にしてリポソーム懸
濁液を得た。

実施例６ ＤＰＰＣ，コレステロール及びＦＡＡをモル比でｉ：１
：Ｑ、１５．全脂質量で８μモルになるように試験管に
とり、クロロホルム及びメタノールの混液（容積比９：
１）に溶かし、以下対照例１と同様にしてリポソーム懸
濁液を得た。

対照例２ 卵黄レシチン５．５４μモル、コレステロール１．８５
μモル、ホスファチジン酸０．６２μモルを試験管中で
クロロホルム及びメタノール混液（容積比　９：１）に
溶かし、更に３トジバルミトイルホスフアチジルコリン
４．０μＣｋを加えた０次に窒素ガス気流中で有機溶媒
を除去して試験管のガラス壁にリビッドフィルムを生成
させた。これにＰＢＳ　　５ａ＋１を加えてポルテック
ス・ミキサーで攪拌振とうし、更に軽く超音波処理して
リポソームの懸濁液を調製した。これを４０〜４５℃に
加温し９次いで０．２μｌの孔径を有するポリカーボネ
ート製メンブランフィルタ−を通過させ１粒径０．２μ
厘以下のリポソームの懸濁液を得た。

実施例７ 卵黄水スフ７チジルコリン４．８μモル６コレステロー
ル１．６μモル、ホスファチジン酸１．０７μモル、Ｃ
ＡＥＥ　Ｏ，５３μモルを試験管中に採り。

クロロホルム及びメタノール混液（容積比９：１）に溶
かし、更に３トジパルミトイルホスフアチジルコリン２
μＣＬを加えた。以下対照例２と同様にしてリポソーム
懸濁液を得た。

実施例８ 卵黄ホスファチジルコリン４．２４μモル、コレステロ
ール１．４１μモル、ホスフアチジン酸１．４１μモル
、ＣＡＥＥ　０．９４μモルを用いる他は、実施例７と
同様にしてリポソーム懸濁液を得た。

実施例９ ジステアロイルホスファチジルコリン４．２１μモル、
ジセチルリン酸２．１１μモル、ＣＡＥＥｌ、６８μモ
ルを試験管中でクロロホルム及びメタノール混液（容積
比　９：１）に溶かした０次に窒素ガス気流中で有機溶
媒を除去して試験管のガラス壁にリピッドフィルムを生
成させた。ここに３■−イヌリン３００μＣｔを含有す
るｌ諷鋪イヌリンのＰＢＳ溶液を５ｍｌを加えた他は、
対照例２と同様にしてリポソーム懸濁液を調製した。得
られたリポソーム懸濁液を超遠心分離（１５万８ｇ、１
時間、２回）し、上澄みを除去することによりリポソー
ムに保持されなかったイヌリンを除去し、沈漬にＰＢＳ
を加えて最終的にイヌリンをその内水相に保持するリポ
ソーム懸濁液２．５ｍｌを得た。ジステアロイルホスフ
ァチジルコリンのコリン基をマーカーとして酵素法によ
り定量したところ、得られた懸濁液は１ｍｌ当たり全脂
質として２．２′μモル、またイヌリンのリポソームに
よる保持率は１．８零であつた。

試験例１ 対照例１及び実施例１〜６で得られたリポソームの懸濁
液のゼータ−電位をゼータ−サイザー１１（マルバーン
社製）で測定した。測定には内径０．７ｍｍのキャピラ
リー型のセルを用い、測定条件は、測定温度：２５℃、
溶媒粘度：　０．８９０３ポアズ。

溶媒屈折率：　１．３３．セル電圧：９０ボルト、セル
電流：　２ミリアンペアで行った。この結果を表１に示
した。

表１　各種リポソーム懸濁液のゼータ−電位の測定結果 上記の結果から式（Ｉ）の化合物はリポソーム膜中に組
み込まれていることが確認された。

試験例２ １）　マウス肝癌細胞株であるＭＨ−’１３４を含む浮
遊液（培地はＲＰＩＪＩ−１６４０、ｐ）ｌ　７）をと
り、遠心分離（ｌｏｏｏｒｐｍ、１０分）により細胞を
沈降させた後、上清液を捨てた０次にＰＢＳを加えて細
胞を再浮遊させ、　１本あたり　４ＸＩＱ’個のＭＨ−
１３４を含むよう細胞浮′ａ液を試験管に４ｍｌずつ１
８木に分注し、これらをあらかじめ３７℃に保温してお
いた。次にあらかじめ３７℃に加温しておいた対照例２
及び実施例７．８で調製したリポソーム懸濁液を全脂質
量がそれぞれ０．３２μモルになるように各処方６本ず
つ加えた。これを３７℃でインキュベート（無振盪）シ
、１時間、３．５時間で各処方３本ずつサンプリングし
て、遠心分離（ｌｏＯＱｒｐｍ、１０分、２回ＰＢＳ）
により細胞のみを分取した後、これらに取り込まれた放
射活性を液体シンチレーション法により測定した。結果
を表２に示した。なお、試験後の細胞数はローリ−法に
よる蛋白の定量を行うことにより補正して求め、リポソ
ームの取り込み量であられした。

２）１）で癌細胞を再浮遊させるのに用いたＰＢＳに子
牛胎児血清を５を含んだ場合について１）と同様に試験
を行った。結果を表３に示した。

３）２）のＭ）！−１３４の代わりにヒト白血病癌細胞
株であるＨＬ−６０を用いた以外はｌ）と同様に試験を
行フた。結果を表４に示した。

表２ 表３ （平均上標準偏差） 表４ （平均士標準偏差） 表２〜４から明らかなように０式＜ｒ＞の化合物で修飾
したリポソームは対照のリポソームに比べ腫瘍細胞によ
り多く取り込まれることから９本発明の脂質膜構造体は
優れた癌細胞への指向性を有することが確認された。

試験例３ ＭＨ−１３４の細胞数がＲＰＭＩ−１１ｉ４９培養液２
ｍｌ中にｔ、ｓｘ　ｔｏ’個含まれるものを使用し、実
施例９で調製したリポソーム懸濁液を全脂質量として０
．１６μモルを加え、更にサンプリング時間をＯ，Ｓ、
ｔ。

２．３時間とする以外は試験例２と同様にして行った。

対照として、　０．１５７μＣｉの３トイヌリンを含２
．６２ｎモルのイヌリンのＰＢＳ溶液をＭト１３４細胞
の培養液に加え、以下同様にして試験した。結果を表５
に示した。なお、試験後の細胞数はローリ−法による蛋
白の定量を行うことにより補正して求め、リポソームの
取り込み量であられした。

表５ 表５から明らかなように１本発明にかかわるリポソーム
が癌細胞に取り込まれることにより、該リポソーム内水
相のイヌリンも腫瘍細胞内に取り込まれていることが確
認された。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 式 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｒ＿１は水素又は脂肪酸残基を、Ｒ＿２は水素
   又は非環式炭化水素残基を、Ｒ＿３はアミノ基、アミジ
   ノ基又はグアニジノ基を、ｎは１〜６の整数を意味する
   。但し、Ｒ＿１及びＲ＿２が同時に水素である場合を除
   く。）で示される化合物又はその塩を含有する脂質膜構
   造体