JPH0276823A - 血栓溶解剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は組換えプラスミノーゲンアクチベーター蛋白質
を含有する医薬組成物を提供することに関する。

本発明は、特にプラスミノーゲンアクチベーター蛋白質
をコードするポリデオキシリボヌクレオチドセグメント
によって発現され且つ実質的にウロキナーゼの特性を有
するプラスミノーゲンアクチベーター蛋白質生成物を有
効成分として含有する血栓溶解剤を提供することに関す
る。

本発明は人間のプラスミノーゲンアクチベーター遺伝子
に関するデオキシリポ核酸（ＤＮＡ）セグメントを提供
すると共に、このＤＮＡ部分をプラスミドベクターに組
入れ、次いでこのベクターをバクテリアまたは他の微生
物にとり込ませ、次いでこのバクテリアを培養して人間
のつ四キナーゼの性質を有するプラスミノーゲンアクチ
ベーター蛋白質を製造することにある。

静脈および動脈の凝血、肺塞栓、心臓内の血栓および組
織塞栓などの急性血栓症候群は処理の困難なものである
。閉塞自体のための現在の医学的治療には抗血液凝固が
含まれる。

現在の医学的アプローチはその基本的過程を停止させ、
そして血液の流れを回復して血管の閉塞または組織の破
壊の程度を限定するための通常の生理学機構に依存して
いる。血栓溶解作用または血栓溶解の治療は不快な血栓
を溶解させるための手段としてかなり興味あるものとい
える。抗血液凝固と血栓溶解治療との双方を使用するこ
とによって、医学的実施は血栓を迅速に溶解してその再
発を防ぐ手段をもつことになるであろう。最近、血栓溶
解治療への数種のアプローチが観察されており、その一
つは天然に産する線維素分解酵素系（ｆ＋ｂｒｔｎｏｌ
ｙｔ＋ｅ　ｅｎｚｙｍｅ　５ｙｓｔｅｉ＋）の活性剤の
組織内注入によるものである。広範な研究の行われたこ
のような試剤はウロキナーゼである。ウロキナーゼはプ
ラスミノーゲンからプラスミンへの転化を通して活性な
血栓溶解剤である。プラスミノーゲンは天然に産するプ
ラズマ前駆体であり、このものは活性剤の存在下、線維
素（ｆｉｂｒｉｎ）を加水分解しうろ蛋白分解酵素たる
プラスミンに転化する。ウロキナーセは構造未知の複雑
な蛋白質であり、人尿中に痕跡盪見出される。ウロキナ
ーゼは有力な血栓溶解剤であり、血液中に自然に依存す
る里よりも追かに多量を注射すると血栓溶解を促進する
。ウロキナーゼは１９５１年にはじめて記載され、その
後人尿からのウロキナーゼの分離および精製のための方
法が開発された。

ウロキナーセの分離および精製法は多（の刊行物、たと
えば米国特許筒２．９８３．６４７号；同第３．２５６
．１５８号；同第３．４７７、９１０号〜第３．４７７
、９１３号および第３．５４４．４２７号、に記載され
ている。

然しながら、尿の収集と処理の業務はウロキナーゼのこ
の資源を非実用的なものにしている。４００万ＣＴＡ単
位（ＣＴＡはＣｏｍｍ１ｔｔｅｅ　ｏｎ　Ｔｈｒｏｍｂ
ｏｌｙｔｉｃ　人ｇｅｎｔｓの略語）のウロキナーゼは
約１．５００リツトルの尿の処理を必要とするからであ
る。

後に人間の腎臓細胞の培養中に線維素分解活性が発表さ
れ、そしてこの活性は尿のウロキナーゼと免疫学的に区
別がつかないことが見出された。組織培養法を使用して
、さえ、生産コストが高くつき、その結果、ウロキナー
ゼの製造のための他の方法が望まれている。

本発明は、人間のウロキナーゼに関するプラスミノーゲ
ンアクチペーターをコードするデオキシリボ核酸（ＤＮ
Ａ）を組入れた修飾プラスミドを提供することにも関連
し、この修飾プラスミドはバクテリアまたは他の微生物
に導入することができ、次いでこのものを培養して抗生
物質化合物の製造と同じようにしてウロキナーゼ様物質
を製造することができる。

この修飾プラスミドはプラスミド中のヌクレオチド配列
の直接操作によってえられろ。記述のために、本発明を
バクテリウムＥ、　Ｃｏ１１　Ｋ−１２菌株Ｘ１７７Ｂ
ならびにプラスミドおよびそこからのベクターｐ　Ｂ　
Ｒ３２２を参照して以下に述べる。前者はＲａｖｅｎ　
Ｐｒｅｓｓ（Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）発行、Ｂｅｅｒｓ、　
Ｒ，Ｆ、およびＢａ５ｓｅｔｔ。

Ｅ、Ｇ共著ｒＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　Ｍｏ１ｅｃｕｌ
ｅｓ、　　Ｉｍｐａｃｔ　ｏｎ　５ｃｉｅｎｃｅ　ａｎ
ｄＳｏｃｉｅｔｙＪ　　（１９７７年）第４５頁に記載
されており、後者はＢｏ−１ｉｖａｒら（Ｇｅｎｅ、　
２　、第９５頁、　１９７７年）によって記述されてい
る。本発明者は人間のプラスミノーゲンアクチベーター
であるウロキナーゼをコードするＤＮＡセグメントをバ
クテリアに組入れた。乙のようにしてこの微生物は人間
の胎生腎臓細胞の組織培養から分離したウロキナーゼと
類似の免疫学的なおよびプラスミノ−ゲン活性剤の性質
を有するプラスミノーゲンアクチベーターを製造する新
しい能力を８１１４する。この遺伝子工学の方法は簡単
にいうと（１１人間の胎生腎臓細胞からのメツセンジャ
ーリボ核酸（ｍＲＮＡ）の分！、！２１　　分離したｍ
ＲＮＡの存在の実証、（３）組換えＤＮＡ合成に適する
ｍＲＮＡからの相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）の実験室的合成
、（４）上記（３）で合成したＤＮＡとベクターまたは
プラスミドＤＮＡとを含む組換えＤＮＡの合成、（５）
　　この組換えＤＮＡによるバクテリアの形質転換なら
びにプラスミノーゲンアクチベーター生産のため形質転
換細胞の検出および選択、および（６）形質転換細胞か
らのプラスミノーゲンアクチベーターの分離と化学的お
よび生物学的性質の特性の記述からなる。

ヌクレオチド配列のこの新しい操作技術は、−菌株もし
くは種からの周知のもしくは同定されたヌクレオチド配
列を別のものへ導入しこれによって所望の性質を付与す
ることを可能にする。ＤＮＡの二重らせん構造に関して
、ＤＮＡ分子のからみ合った相補性のストランドはホス
フェート基を通して結合する４つのデオキシリボヌクレ
オチド即ちデオキシ−リボアデノシン−５′−ホスフェ
ート（ｄＡＭＰ）、チミジン−５′−ホスフェート（Ｔ
ＭＰ）、デオキシ−リボグアノシン−５′−ホスフェー
ト（ｄＧＭＰ）およびデオキシ−リボシチジン−５′−
ホスフェ−１−（ｄＣＭＰ）から作られている。それぞ
れのストランドの遺伝子情報はデオキシリボヌクレオチ
ドの特定の配列において具体化される。あるＤＮＡ分子
中のヌクレオチドの配列はある特定の蛋白質の配列を決
定し、そしてアミノ酸の配列はまた蛋白質の構造と機能
とを確立する。それ故、ＤＮＡのヌクレオチド配列は有
機体の性質を作る蛋白質を正確に規定する。

組換えＤＮＡの操作はバクテリアから分離されろ制限エ
ンドヌクレアーゼ酵素として知られる蛋白質によるＤＮ
Ａのストランドの開裂により始まる。その酵素はＤＮＡ
鎖を特定の配列部位で切断する。その切断は必ずしも二
つのストランドの同じ位置で起きるとはいえないで、そ
の分けられたストランドは相補性の末端を持ちそのため
適当な条件下で一緒に結合して端部対端部でそれらが結
合しうる。２種の異なった資源からのＤＮＡ　（その両
者は適切な標識配列をもつ）について同一の制限酵素を
使用するならば、結合性の端部を有する配列がその結果
生ずるであろう。それ故、任意の資源からの２つの配列
を組換えて単一のＤＮＡ分子にすることができる。

組換え用ＤＮＡを取得する別の方法は、メツセンジャー
ＲＮＡを二重ストランド相補ＤＮＡに逆転写することで
ある。合成されたＤＮＡは次いでこれを以下に述べるよ
うにしてブラスミド中に組入れることができる。ＤＮＡ
取得のこの方法は好ましいものである。それは、唾乳動
物染色体のＤＮＡの遺伝子が蛋白質を伝達しない配列を
多くの基合金み、そのためＤＮＡから蛋白質への遺伝子
情報伝達の直線性が中断されるからである。Ｅ、　Ｃｏ
１１のようなバクテリアの場合、その単純な円形染色体
に加えて、それは細胞の染色体から物理的に分離してい
る遺伝子単位であるプラスミドもしくは余分の染色体要
素として知られる一個またはそれ以上の独立に複製され
ろサークル状物をもつこともできる。これらのプラスミ
ドもしくはベクターはバクテリアから分離することがで
き、制限酵素によって開口もしくは開裂することができ
、そして組換えの一成分として使用することができる。

組入れるべきＤＮＡをプラスミドＤＮＡに接合した後、
この円形プラスミドはこれを閉じることができ、そして
プラスミドは細胞にもどされうる。そこでそれはそれ自
身の自然のヌクレオチド配列のみならず加えたものをも
転写しつつ複製を再び始めるであろう。それ故、えられ
るバクテリアの菌株はバクテリアの繁殖の際に、組入れ
たヌクレオチド配列のコピーを・維持するであろう。

本発明は添付の図面を参照して更によく理解されるであ
ろう。

第１図はウロキナーゼに関連したプラスミノーゲンアク
チベーター蛋白質を伝達するプラスミド含有ＤＮＡの制
限地図を図式的に説明するものである。

第２図は形質転換細胞からのウロキナーゼ様物質の親和
クロマトグラフからえられたデータを説明するグラフで
ある。

プラスミドは二重ストランドＤＮＡからなり少なくとも
１つの転写位置を含むものと信じられている。添付の第
１図を参照して、そこにはウロキナーゼに関連したプラ
スミノーゲンアクチベーターをコードするＤＮＡセグメ
ントを組入れたＥ、　Ｃｏ１１プラスミドｐ　Ｂ　Ｒ３
２２を図式的に示しである。このプラスミドもしくはベ
クターｐ　Ｂ　Ｒ３２２はＢｏｌｉｖａｒらによって記
述されている（Ｇｅｎｅ、　２　、第９５頁、　１９７
７年）。第１図に示すように、このｐ　Ｂ　Ｒ３２２プ
ラスミドはＰｓｔ　■の位置として以後に述べる位置に
おいて制限酵素によって開裂されてお９、プラスミノー
ゲンアクチペーターをコードするＤＮＡセグメントがそ
こに組入れられている。一つのストランド上の配列が相
補的に直接向き合って存在するため結合が起こる。その
相補性はそれぞれヌクレオチド類シトシンおよびグアニ
ンまたはアデニンおよびチミンの間の化学的親和性に依
存する。

ストランドの長さにそってくりかえされるこれらの結合
の合計はストランド同志を保持する。２つのＤＮＡ断片
を結合する別法はリガーゼを使用するプラント末端の連
結（ｂｌｕｎｔ　ｅｎｄｌｉｇａｔｉｏｎ）による方法
である。第１図に示す数値はそこに示す位置の間の塩基
ペアの数（実際には近似値）である。たとえば、ｐＢＲ
３２２プラスミドのもとのＰｓｔ　■位置の間に組入れ
られた塩基ペアの数は約４．２００である。第１図の直
径にそった場所もしくは位置は特定配列のヌクレオチド
が生じ且つ特定の制限エンドヌクレアーゼ酵素によって
開裂しうる場所を示す。第１図中の記号はそれぞれの位
置の大体の場所ならびにヌクレオチドの特定配列におい
てＤＮＡストランドを切断する特定の制限酵素を示す。

第１図は本発明の一態様を示すものであり、ウロキナー
ゼ様物質をコードするＤＮＡを組入れたＥ、　Ｃｏ１１
プラスミドを例示するものである。組換えＤＮＡ、すな
わちウロキナーゼ様物質をコードするＤＮＡを含む再構
成されたプラスミドはＥ、　Ｃｏ１１　Ｋ−１２菌株Ｘ
１７７Ｂとして例示されているような適当な宿主有機体
すなわち単一細胞宿主にもどされる。そこではその有機
体はそれ自身の自然の配列のみならず組入れた配列をも
転写しつつ複製を始める。

他の適当な有機体はニジエリシア属、サツカロマイセス
属、バチルス属、ニューロスポラ属またはストレプトマ
イセス属からえらぶことができ・る。このように単一細
胞宿主を使うことができる。適当な微生物の種を例示す
れば、エシエリシアコリイ（Ｅ、　Ｃｏ１１）　、サツ
カロマイセスセレピシアエ、／＜チルスサブチリスおよ
びニューロスポラクラサである。

本発明は、免疫学的および化学的性質においてウロキナ
ーゼに関連するプラスミノーゲンアクチベーター蛋白質
を生産する適当なプラスミドを含有させたニジエリレア
属からのバクテリアを特に提供するものである。Ｅ、　
Ｃｏ１１　Ｘ１？７８ｐＡＢ８２Ｂの培養物は米国イリ
ノイ州ペオリアの米国農務省のＡＲＳカルチュアーコレ
クシヲンに寄託され、寄託番号Ｂ　１２１２２が付せら
れな。

本発明のプラスミノーゲンアクチペーター蛋白質をコー
ドするポリデオキシリボヌクレオチドセグメントによっ
て発現され且つ実質的にウロキナーゼの特性を有するプ
ラスミノーゲンアクチペーター蛋白質生成物は、天然由
来のウロキナーゼと同様に血栓溶解剤として有用である
ことが見出された。

本発明の血栓溶解剤は、治療上有効量の上記プラスミノ
ーゲンアクチペーター蛋白質生成物に加えて、薬学上許
容しうる担体を混合して含有しているものであってよい
。

このような担体としては通常の蛋白質製剤で（重用、し
得るものであれば特に限定されない。この担体としては
注射剤に通常用いられろものが挙げられ、例えば無菌蒸
留水、生理食塩水、リンゲル液及びその他の適当な水性
溶液があげられる。

これらの担体には必要に応じて更に緩衝剤、等張化剤、
安定剤、溶解補助剤、懸濁化剤、乳化剤、保存剤等を加
えることができろ。

上記緩衝剤としては例えばクエン酸塩、酢酸塩、リン酸
塩等があげられろ。

上記安定剤としては、ピロ亜硫酸ナトリウム、！−アス
コルビン酸等の抗酸化剤、ＥＤＴＡ１チオグリコール酸
、チオ乳酸等のキレ−１・他剤、水溶性有機溶剤等があ
げられ、上記懸濁化剤としては有機酸、有機塩基、界面
活性剤、多価アルコール、アミノ酸等があげられる。上
記保存剤としてはアルキルパラベン類、ベンジルアルコ
ール、フェノール、クレゾール等があげられる。

本発明の血栓溶解剤は、好ましくはその処置を必要とさ
れる患者に非経口的に投与されろことができる。このよ
うな方法としては具体的には静脈内あるいは動脈内に投
与することによって行われるが、場合によっては直接患
部に投与することも好ましい。本発明の血栓溶解剤は注
射剤とされて静脈内に投与することが特に好ましい。

本発明の血栓溶解剤は、その有効成分である蛋白質生成
物の凍結乾燥物を、何も含まない無菌水に溶解するかあ
るい；よアニトール、グルコース、デキストロース、ゼ
ラチン及び／又はポリビニルピロリドンを含有する無菌
水に溶解し、次に生理的に等張化することにより実際の
投与形態にすることができる。

本発明の血栓溶解剤は適当な用量で患者に投与されるこ
とができろ。

本発明の血栓溶解剤はその酵素活性を基準にして相当す
る天然型のウロキナーゼと同様にして用いろこともでき
る。

本発明の血栓溶解剤は、投与対象者の種類、年齢、体重
等の諸条件や、本薬剤に対する応答性、投与目的等に応
じて適宜その用量及び投与回数を選択することができる
。

本発明の血栓溶解剤はその１回投与量としてウロキナー
ゼ換算で１．０００単位から２．０００．０００単位ま
でを含むようにして用いることができる。

本発明の血栓溶解剤は５％のヒトアルブミンを含有する
生理食塩水中に溶解し、１回投与量としてウロキナーゼ
換算で好ましくは２０．０００単位〜ａｏ、　ｏｏｏ単
位を含む１０ｍＮ注射液として用いろことができる。

また本発明の血栓溶解剤による治療は必要に応じて長期
間おこなうこともでき、例えば１日〜３０日間治療を加
える乙ともできる。

本発明の血栓溶解剤の投与法としては、さらに初回に４
０．０００単位〜３００．０００単位を投与して後、以
後投与量を漸減して約１週間程投与するということによ
って行う乙ともできる。

参考例　１ 間の胎生腎臓細胞からのｍＲＮＡの分離ウロキナーゼ生
産細胞から全ｍＲＮＡを次のとおり分離した。１０％の
胎生子牛血清を含むイーグル媒質（Ｅ　１９９）中で人
間の胎生腎１＠（ＨＥＫ）細胞を合計７〜１０日間組織
培養により生育させた。収集前に更に７日間この細胞を
血清なしで蛋白質加水分解物質中に保持した。ＨＥＫ細
胞をローラボトルからこすり取り、ヘパリン（１０単位
／■Ｉ）含有塩水中で洗い、グアニジン塩による抽出を
リン酸塩で緩衝した塩水（ＰＢＳ）緩衝液中でｐＨ７，
０で行った以外はウルリッヒらのグアニジンチオシアネ
ート法（Ｓｃｉｅｎｃｅ、　　１９６．　　第１３１３
頁、　−１９７７年）により全ＲＮＡを分離した。この
ＲＮＡをエタノールによす沈澱させ、３３ｍＭのＮ−２
−ヒドロキシ−エチルピペラジン−Ｎ′−２−エタンス
ルホン酸（ＨＥ　Ｐ　Ｅ　Ｓ）緩ｔ［ｉに溶解した。デ
ーレイらの（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、　２５２．
第８３１Ｏ頁、　１９７７年）記述のようにポリウリジ
ル酸（Ｐｏｌｙ　Ｕ）セファデックスＧ−１０カラム上
の親和クロマトグラフにより全ＲＮＡからｍＲＮＡを含
有するポリアデニル酸（Ｐｏｌｙ　Ａ）を分離した。カ
ラム物質はニアフィンらの方法（Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉ
ｏｌ、　８８．第３７３頁、　１９７４年）に従い合成
した。ＲＮＡをカラム中に２回通して全ｍＲＮＡをえた
（全ＲＮＡ３９■から１．１■）。ウロキナーゼｍＲＮ
Ａを更にａ縮し、レユクロース密度傾斜遠心分離により
全ｍ　ＲＮ　Ａから分離した。全ＲＮＡｊｅＴＥＳ−Ｚ
ＩＩＩ衝液　（ｌＯｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、　ＰＨ
７，４；　２０ｍＭ　　Ｍａｉｌ；　０．５ｄ　　ＥＤ
Ｔ人；０．４％のすｌ・リウムドデシルサルフエート）
に約１０Ａ２６゜／　ｍ　ｌの濃度でとかした。乙のＲ
ＮＡを６５℃で１５分間加熱し、ペックマンＬ５−６５
超遠心分離器中で２５．　ＯＯＯｒｗ＋ｐにおいて２０
℃で１２時間５Ｗ２７０−タ中で線状（１０〜３０％）
シュクロース傾斜および遠心分離に付した。次いで傾斜
物を各フラクション（０，５鵬ｌ／フラクシ璽ン）に分
け、Ａ２．。の読みを決定した。２８３より大きいＲＮ
Ａをプールし、エタノールで沈澱させ、７０％エタノー
ル中の３３ｍＭ　　ＮａＣｌで洗い、次いで９５％エタ
ノールで洗つｔこ。これを乾燥し、ｐＨ７，０の３３＋
ａＭのＨＥＰＥＳにとかした。傾斜に付したＲＮＡの１
ｍｇから、２８３より大きいＲＮＡ７３ｕｇｅえｔこ。

このＲＮＡを使用して無細胞蛋白質合成でウロキナーゼ
ｍＲＮＡの存在を実証しモしてｃＤＮＡの合成を行った
。

参考例　２ ウサギの網内皮細胞からの無細胞蛋白質合成系をペルヘ
ムおよびジャクマンの方法（Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｂｉｏｅ
ｈｅｓ、、　６７、第２４２頁。

１９７６年）によりヌクレアーゼ処理して内生のｍＲＮ
Ａを消化処理した。無細胞での蛋白質の合成および免疫
沈澱をローデスらの方法（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ
、　２４８．第２０３１頁、　１９７３年）に従し１実
施した。２０％（Ｖｏｌ／Ｖｏｌ）の網内皮細胞溶解物
、２ｍＭのアデノシントリホスフェート（Ａ　Ｔ　Ｐ）
、０．２Ｍのグアニジントリホスフェ−）（ＧＴＰ）、
ＩＱｍＭのクレアチンホスフェート、２Ｍｇのクレアチ
ンキナーゼ、３膳Ｍのジチオスレイトール、７５ｍＭの
ＫＣＩ、３ｍＭのＭｇＣｌ２．３０ｍＭの）ＩＥＰＥｓ
ｌｐｔ［？、６．２０ＭＭのアミノ酸混合物（メチオニ
ンなし）、５ｕＣｉ　　　Ｓ−メチオニンおよびｌｕｇ
の精製メツセンジャーＲＮＡを含む最終容量４５ｕ１中
で培養を行った。混合物を２５℃で１時間培養し、次い
で冷却および０．１Ｍメチオニン、１０％トリトンＸ−
１００および１０％ナトリウムデオキシコレートからな
る液２５ｕ１の添加により停止した。Ｓｕｌづつの分別
量を０．３ＭＭフィルターペーパーディスク上にピペッ
トで移し、０．２％のり。

Ｌ−メチオニンを含むトリクロル酢酸（ＴＣＡ）中で洗
うことにより、とり込まれたもの全体のトリクロル酢酸
不溶解カウントをえた。次いでこのペーパーディスクを
同じＴＣＡ−メチオニン溶液中で９０℃で１５分−加熱
し、シンチレーシ。

ンカウンターでカウントする荊に乾燥した。

合成した３ＳＳ−ペプチドの免疫沈澱をローデスらの方
法（上記文献参照）により行った。ただし、それぞれの
抗原−抗体沈澱物を０．５Ｍシュクロース、１％トリト
ンＸ−１００，１％ナトリウムデオキシコレートおよび
０２ＭのＤＬ−メチオニンからなる液２００ｕｌからな
るシュクロースクツション中を沈降させるという変形を
用いた。精製ウロキナーゼ（０，５Ｍｇ）をキャリヤー
として反応混合物に加え、ウサギの抗ウロキナーゼ（Ｉ
ｇＧ　フラクシ曹ン）の５〜１０Ｍｇを加えることによ
って免疫沈澱を行った。第二抗体（ヤギの抗ウサギＩｇ
Ｇ、１００〜２００　ｕｇ）を加え、反応混合物を更に
４℃で１８時間培養した。最終の沈澱物を洗い、１０Ｍ
の尿素、５％ＳＤＳおよび５％メルカプトエタノール中
で再懸濁させて６０℃で３０゛分間加熱した。分別量を
シンチレーシ璽ンカウンター中でカウントして３″≦と
り込み量を求めた。ウロキナーゼ特異ｍＲＮＡのカウン
トをＴＣＡにより沈澱された全カウント分の免疫沈澱カ
ウントのパーセントとして表示した。この反応条件にお
いて、精製ウサギのグロビンのメツセンジャーＲＮＡの
ｌｕｇを反応混合物中に使用するときに反応混合物１ｕ
ｌ当たりｌＸ１０’ｅｐ−がＴＣＡにより沈澱しうる。

１％以下の放射能がウサギのヘモグロビンｍＲＮＡコン
トロール中でつｐキナーゼ抗体によって免疫沈澱された
。一方、人間の胎生腎臓（ＨＥＫ）細胞からのＰｏ１ｙ
　Ａを含むｍＲＮＡは免疫沈澱しうるカウントとして１
０％のＴＣＡ不溶性放射能を与えた。シュクロース密度
傾斜遠心分離による２８８より大きいメツセンジャーＲ
ＮＡはウロキナーゼ抗体によ＃）４０〜６０％のＴＣＡ
不溶性放射能が免疫沈澱したことを示した。

加えたｍＲＮＡに依存する無細胞での蛋白質の合成はま
たロパーツおよびビーターマン（ＰＮＡＳ、７０．第２
３３０頁、１９７３年）によって述べられている小麦発
芽系中で行った。ウサギの網内皮細胞系中で上述の如（
免疫沈澱を行った。シュクロース密度傾斜からの２８３
より大きいメツセンジャーＲＮＡは免疫沈澱しうるカウ
ントとしてＴＣＡ不溶性カウントの９０％をも与えた。

参考例　３ ｍ　ＲＮ　Ａから相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）の合成フリー
トマンおよびロスバラシュの方法（Ｎｕｅｌｅｉｅ　Ａ
ｃ１ｄｓＲｅｓ、、　４＊第３４５５頁、　１９７７年
）に従いｍＲＮＡの逆転写によって単一ストランドｃＤ
ＮＡを合成した。ただし次の変形を用いた。ｍＲＮＡで
オリゴｄＴプライマーを１ニール化するための反応混合
物（５００ｕｌ）は２０鵬ＭのＴｒｉｓ−ＨＣＩ、　ｐ
Ｈ８，５，２０ｍＭのＫＣＩ、４ｓ＊ＭのＭｇＣｌ□、
２０すのＰｏ１ｙ　Ａ含有のｍＲＮＡおよび１．５Ｍｇ
のｄＴ、。を含んでいた。ｃＤＮＡ合成のための最終反
応混合物（１ｔｍｌ　）は５０−のＴｒｉｓ−ＨＣＩ、
　ｐＨ８，５，５０１ＭのＫＣＩ、１０ｍＭのＭｇＣ１
，，１０■Ｍのジチオスレイトール（ＤＴＴ）、１０Ｍ
ｇの１クチノマイシンＤ１各１−Ｍのデオキシアデノシ
ントリホスフェ−）（ｄＡＴＰ）、デオキシグアニジン
トリホスフェ−）（ｄＧＴＰ）、チミジントリホスフェ
ート（ＴＴＰ）、８００ＭＭ　［ａ−３２ｐｌ　ｄＣＴ
Ｐおよび３２５単位のＡＭＶ逆転写酵素を含んでいた。

４２℃で３０分間培養後、酵素３２５単位を別に加又た
。２時間の培養後、０．５Ｍのエチレンジアミン四酢酸
（Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａ）の５０ｕ１を加えることによっ１反
応を停止した。この溶液にＩＯＭのＮａＯＨの４０ｕｌ
を加メ次いで室温で１８〜２０時間培養した。次いで、
ゆっくり力きまぜながらＨＥＰＥＳを加えることによっ
て溶液をｐＨ８，５に中和した。次いでこの溶液をフェ
ノールｔ［ｔｌＬセフアクＬルＳ−３００ゲル濾過およ
び高分子量のｃＤＮＡを含有する排除フラクションをメ
タノール沈澱に付した。収率は１５へ２５％であった。

ｃＤＮＡ生成物を７Ｍ尿素中の３５％ポリフクリルアミ
ド〜スラブゲル（２０Ｘ４０ＸＯ，３ｃｍ）中の電気泳
動（２付した。長さのマーカーとしてラムダＤＮＡのＨ
ｉｎｄｌ［エキソヌクレアーセ消化を使用しな。ゲルの
放射線写真後、主ｔ、る種として３．０００〜６．００
０のヌクレオチド残基を有する単一２トランドｃＤＮＡ
を検出した。

ジャコブセンらによって述べられた反応条件（Ｅｕｒ、
　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｔ、　４５．第６２３頁、　１９
７４年）に類似して、イーコリイからのＤＮＡポリメラ
ーゼの大きな断片を使用することによ１で、ｃＤＮＡの
第二のストランドを合成した。反応は反応容量２００ｕ
ｌ中に１．４ｎモルのｃＤＮＡ、０．１ＭのＨＥ　Ｐ　
Ｅ　Ｓ、、ｐｉ（７，０それぞれ４０ＱｕＭのｄＡＴＰ
、デオキシシトシントリホスフェート（ｄｃＴＰ）、ｄ
　Ｇ　Ｔ　Ｐ　オヨＵ　Ｔ　Ｔ　Ｐ　１１０ｍＭ　ノＭ
　ｇ　Ｃ１２，１０ｍＭのジチオスレイトールならびに
７０ｍＭのＫＣＩを含んでいた。

−１１５℃で１５時間培養を行った。次いで０．５Ｍの
ＥＤＴＡの２゜ｕｌを加え、そしてＤＮＡをフェノール
抽出およびエタノール沈澱によって精製した。

１　　　　次いで上述の二重ストランドｅＤＮＡを、３
０ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ４，６，１ｍＭ（ＤＺｎ
Ｓ０４．２５０ｍＭ）ＮａＣ１オヨヒｌ００＝　　　　
ｕｇ／＠ｊのイーコリイｔＲＮＡの存在下において、１
５℃で３’　　　　時ｇｓ、メクメターゼ（１２５０年
位）により処理した。ＤＮＡ二　　　の約５８％（ｉｆ
＋ｆ０．５Ｍｇ）が処理後に回収された。ベックマンＬ
５−７５超遠心分離器中＋７）４０．０００ｒｐｓｌｉ
ｌ動／＜　’ｙ　ッＳ？１Ｉ４０　ｏ　−コ　　　タ中
の線状シュクロース密°度傾斜［１０＋ａＭのＮａＣｌ
、１０ａ＋ＭのＴｒｉｓ　　ｐＨ８，ｏ、１−のＥＤＴ
Ａからなる塩水−Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ（ＳＴＥ）中１５
〜３０％］　中１’２０℃で１６９ｅ間ＤＮＡを−遠心
分離した。２．０００個の塩基ペアより大きいＤＮＡを
プールし、エタノール沈澱して、組換えＤＮＡ合成のた
めＰｏ１ｙ・　　　０束をつけるのに使用した。

参考例　４ 、　　組換えＤＮＡの合成 二重ストランドｅＤＮＡへのホモポリマー束の添加をロ
イコウドハリイら（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｒｅｓ
、、　３．第８６３頁、　１９７［ｉ年）によって述べ
られているようにエキソヌクレアーゼを使用することな
しに行った。反応混合物（３００ｕｌ）は１００ｍＭの
カリウ’Ａ　ｔ）　：Ｉ　’）　レ−）　ｐＨ８，９，
３０ｕＭノＴｒ＋ｓ塩基、１　ｍＭノＣｏＣ１２，２０
０ｕＭのｒ）　’ｐ　Ｔ、　６　ｎモルの二重ｅＤＮＡ
（全ヌクレオチド残基中）　、１００ｕ１００ｕ　［ａ
−３２ｐ］　ｄＣＴ　ＰオＪ：ヒ２４０単位ノターミナ
ルトランスフ工ラーゼを含んでいた。２０分後に０．５
ＭのＥＤＴＡの３０ｕ　Ｉおよび中和したフェノール３
００ｕ　Ｉを添加して反応を停止した。十分に混合した
後、内容物を１５００ｘｇで１゜分間遠心分離して水性
層を除いた。１００ｄのＮ　ａＣｌ　（ｐＨ８，０）の
ｌ０ｕｌにょリフエノール層を二回抽出し、また集めた
水性層をエーテル抽出し、エタノール沈澱した。

二重ストランドｃＤＮＡ中に３　’−ＯＨ端部のほぼ２
０ｐモルから、Ｉ　４００ｐモル、ｔｔ’（７）　Ｃ３
２ｐｌ　ｄｃＭＰ’カド’）込マした。これはＤＮＡス
トランド当たり７０個のｄＣＭＰ残基が添加されること
を示すものであった。線状プラスミドを次の如＜　ｔ、
ｒ、ｔた。反応混合物（１００ｕｌ）　ｌｅｔ　１０ｍ
Ｍ（７）　Ｔ　ｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７、８，１０℃ｍ
Ｍｔ）’）ＭｇＣＩ。、１０ｍＭノＤ　Ｔ　Ｔ　、　５
０ｍＭ（７）　Ｎ　ａ　Ｃｌ、１０ｕｇのｐＢＲ３２２
ＤＮＡおよび５単位のＰｓｔ　Ｉを含んでいた。反応混
合物の一分別量（５ｕｌ）をアガロースゲル電気泳動に
ょ秒分析して消化の完全なことを調べた。次いで線状Ｄ
ＮＡをフェノール抽出し、エタノール沈澱により分離し
た。

コノＤＮＡヲｌｏｎ＋Ｍ（７）、Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、ｐ
Ｈ８，ｏオＪ：　ヒ０．５ｍＭ（７）　ＥＤＴＡからな
る液ノ１００ｕｌ中に懸濁させ、ＩＱＯｕＭｆ）　［３
Ｈ］　ｄＴＴＰおよび２４０単位のターミナルトランス
フェラーゼを含む上述のターミナルトランスフ鳳ラーゼ
緩衝液中で培養した。

４２℃で０分、１分、２分、３分、４分および５分の間
隔で分別物（各５ｕ１）を酸不溶性放射能についてモニ
ターした。

培養５分後の残りの溶液をフェノール抽出しそしてエタ
ノール沈澱した。この期間中、全１３０ｐモルのｄＧＭ
Ｐ残基がとり込まれた。３　’−ＯＨ末端の５．４ｐモ
ルを含むこのＤＮＡサンプルに、ｐＢＲ３２２ＤＮＡの
ストランド当たり平均２４個の残基を付加した。

ポリデオキシシチジル酸（ｐｏｌｙ　ｄＣ）　（約０．
１５ｐモル）をつけた大きな二重ストランドｃＤＮＡを
容量１００ｕｌの０．１ＭのＮａＣｌ中で当量のポリデ
オキシグアニリジン酸（ｐｏｌｙ　ｄＧ）をティル付加
したｐＢ　Ｒ３２２Ｄ　Ｎ　Ａにアニール化した。混合
物を６５℃で３時間加熱して４２℃で１６時間放置して
このＤＮＡ調製物をアニール化した。

参考例　５ イーコリイの形質転換 カーチスらの方法（ＣＲＣプレス発行、　１９７８年、
　Ｃｈａｒｋｒａ−。

ｂａｒｔｙ、　ｋ、Ｍ、ｆＱ集のｒＧｅｎｅｔｉｅ　Ｅ
ｎｇｉｎｅｅｒｉｎ（ＪのＷ　　５ａｌｓｅｒ（こよる
第３章、第３頁に記載の方法）を使用してアニール化し
たＤＮＡ混合物によりＸ　１７７６　（Ｆ−ｔｏｎ　Ａ
　５３　ｄａｐ　Ｄ８　ｗｉｎ　Ａｌｗｉｎ　　Ｂ２　
　Ｓｕｐ　　Ｅ４２　　ｇａｌΔ４０−　　　ｒｆｂ−
２ｎａｌ　　Ａ２５　　ｏｍ＄−２ｔｈｙ　　Ａ３７ｎ
ｅｔ　Ｃ６５ｏｓｓ−１［ｂｉｏＨ−ａｓｄ］Δ２９　
ｅｙｅ　Ｂ２　ｅｙｅ　Ａｌ　ｈｓｄ　Ｒ２）を形質転
換した。補充し液（ジアミノピメリン酸１１００ｕ／ｍ
ｊ、ナリジキシン酸２５ｕｇ／ＩＩｌおよびチミン４０
ｕｇ／　ｒａ　ｌ　）中で細胞を３７℃でＱ、　３Ａ６
゜。にまで生育し、室温で１０分間１７００ｘｇで遠心
分離してペレットを集めた。

細胞を１０−ＭのＮａｃｌ（Ｖ２容量）中に懸濁させ、
遠心分離し、再び馳容量のＣａ１ｌｌ！衝液（７５ｍｌ
ＪのＣａＣ１゜、　１４０＋ａＭのＮａＣ１゜１０−Ｍ
のＴｒｉｓ−ＨＣｌ、　ｐＨ７，０）中に懸濁させた。

室温で３０分後、細胞を遠心分離し、再び１／１０容量
のＣａ緩衝液ζこ懸濁し、そして０℃に冷却した。２容
量の細胞を１容量のＤＮＡと混合し、０℃で３０分間保
ち、４２℃で１分間加熱し、そして室温で十分量放置し
、１０容量の補充り液と混合し・、そして３７℃で１０
０分間培養した。培養物を少しづつピペット１こより２
ｗｒ１のソフトＬ−カンテン（０，６％）中に移しその
プレート上に敷くことによって、細胞を１２．５Ｍｇの
テトラサイクリンを含有する補充し一カンテン上にプレ
ート状においた。このプレートを３７℃で・２日間培養
した。全３２種類のテトラサイクリン耐性形質転換体を
えた。これらのうち、４種類はアンピシリン感受性（Ａ
ＭＰ’）であり、そのプラスミド中に組換え体をもって
いた。３＠類は約４．２キロの塩基ベアの類似組換え体
をもっていた。これらのプラスミドの一つの制限地図を
第１図に示す。

実施例　１ 組換えＤＮＡを含有する゛アンピシリン感受性、テトラ
サイクリン耐性イーコリイ形質転換体をえらんで免疫学
的検知方法を使用してウロキナーゼ様物質の可能な発現
をスクリーニングした。プラスチックミクロタイタープ
レートを使用する固相放射性免疫試験（ＲＩ　Ａ）をに
ツツエマンらの方法（Ｍｅ−ｔｈｏむｉｎ　Ｅｎｚｙｍ
ｏｌｏｇｙ　　Ｓ　Ｒｅｅｏｓｉｂｉｎａｎｔ　ＤＮＡ
、　１（１７９年）に従い、ただしやや変形して行った
。シアノーゲンブロマイドにより活性化したペーパーを
使用する直接ＲＩＡ法において、ウロキナーゼもしくは
ウロキナーゼ様物質をレアノーゲンブロマイドにより活
性化したペーパーと直接反応させ、次ｂ）で１２５Ｉで
４１１！識した抗ウロキナーゼ抗体の結合によって検出
した。

細胞溶解物はスイーバーグらの方法（Ｎａｔｕｒｅ、　
２７Ｂ、第７９５頁、　１９７８年）により調製した。

イーコリイ形質転換体の５００ｍ１を一夜生育し、１０
．０００ｘｇで１０分間遠心分離することにより細胞を
集めた。細胞を１０＋ａＭのＴｒｉｓ　（ｐＨ８，０）
および１ｍＭのＥＤＴＡで洗い、同じ緩衝液５．Ｏｍｊ
中に再び懸濁させた。リゾチーム（５＋＋＋ｇ／ｍｊ）
の０．５ｍｌを添加した後、混合物を氷上に３０分間保
った。ＭｇＣｌ２を加えて最縮濃度１０■Ｍ［それぞれ
０．１ｍｌのＤＮアーゼ（１＋１ｇ／−１）　、ＲＮア
ーゼ（５ｇ／ｍ＃）およびＮＰ−４０（５％）〕にした
。培養を４℃で１時間進行させ、混合物を遠心分離（１
０，０００ｘｇ、　２０分、０℃）により清澄にした。

上澄み液を使用してウロキナーゼ様物質のスクリーニン
グを行ったＯ ａ　　溶解物の分別物をシアノーゲンブロマイドペーパ
ー（直接ＲＩＡ法）上に滴下してヒツツエマンらの方法
（上記参照）により前述の如　１２Ｊ−ウロキナーゼと
反応させた。

既知量のウロキナーゼも陽性のコントロールとして滴下
しｔこ。

組換えＤＮＡ、ｐＡＢＢ２６を内蔵している一種の形質
転換体は強い陽性反応を示した。

ｂ、　　溶解物の分別物をｌ１ｍ液（ＯＩＭのカリウム
ホスフェ−）、ｐＨ７，０および０．１ＭのＮａＣＩ）
で１０倍にうすめ、１ｘ５＠Ｉのペンツアミジン親和カ
ラム（ホルムバークら、ＢＢＡ４４５、第２１５頁、　
１９７６年）上に充てんした。このカラムをＡ２６゜の
読みがバックグラウンドに達するまで緩衝液で十分に洗
った。このカラムを溶出緩衝液（０，１Ｍの酢酸ナトリ
ウム、ｐＨ４，０および０，４ＭのＮａＣＩ）で溶出し
てフラクションを集めた。それぞれのフラクションから
の分別物を固相ＲＩＡで分析した。

形質転換体Ｘ１７７６　（ｐＡＢＢ２６）からの細胞溶
解物がベンツアミジン親和カラム中を通過するとき、溶
解物からの若干のＡ　物質がカラム中に保持され、低い
ｐＨおよび高度の塩によってのみ溶出された。これらの
保持物質はウロキナーゼの固相ＲＩＡにおいて陽性反応
を示したが、形質転換体Ｘ１７７Ｂ　（ｐＢ　Ｒ３２２
）からのコントロール溶解物は陰性であった（第２図）
。ＳＯＳポリアクリルアミドゲル電気泳動およびそれに
つづくシ１ノーゲンブロマイド活性化ペーパー上へのフ
ィルター親和性移動（Ｊ　　Ｂｉｏｌ　　Ｃｂｅｗａ、
　２５４＃第１２２４０頁、１９７９年）により、生成
物をその分子の大きさについて更に特徴づけた。１２５
■−標識のウロキナーゼ−特異抗体はおおよその分子量
３２．０００．５２．０００．８７．０００．１２４．
０００および１５４．０００の５ｍの別々の大きさのプ
ラスミノーゲンアクチベーター蛋白質を示した。

プラスミノーゲンアクチペーターの活性は、アンケレス
らの方法（Ｊ、　ＥＸＩＴ、　Ｍｅｄ、、　１３７．第
８５−１１１頁、　１９７３年）から変形した敏感な１
２５Ｉフィブリツリシス分析を使用して測定した。硬質
ミクロタイタープレートを１２５Ｉフイブリノーゲン（
２ｕｇ、　　１０’ｅｐｍ／ｗｅｌｌ）で被覆し、この
フィブリノーゲンをプラスミノーゲンのないトロンビン
（０，１単位／ｗｅ　ｌ　Ｉ　）を使用してフィブリン
クロットに転化した。０．１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ。

ｐ［（８，ｌ、　０．０２５％の人間の血清のアルブミ
ン、およびリジンセファロ、−ス上の親和クロマトグラ
フによって調製した２、　５ｕｇ／鹿！のプラスミンの
ないプラスミノーゲンを含む全容量７０ｕ１中で分析を
行っｔこ。分析の範囲は００５プロウグ（Ｐｌｏｕｇ）
単位／腸Ｉから１０単位／−一であったが、０．００２
単位まで検出することはできた。イーコリイの粗溶解物
はこの分析で阻害されているので、形質転換体調製物は
イオン交換クロマトグラフまたはベンツアミジン−セフ
ァロース上の親和クロマトグラフによって、分析前に部
分的に精製した（第１表）。

形質転換細胞Ｘ　１７７６　（ｐＡ　Ｂ　８２Ｂ）のウ
ロキナーゼ親和カラム溶出物をこの分析を使用して試験
したとき、かなりの線維素溶解活性が検出されたがｐＢ
Ｒ３２２により形質転換したＸ１７７６からの試料はこ
の・ような活性を示さなかった。更に、人間のウロキナ
ーゼに特有な抗血清による免疫沈澱はこの活性を溶液か
ら除く乙とができた。これは形質転換細胞Ｘ　１７７Ｂ
（ｐＡ　Ｂ　８２６）からのプラスミノーゲンアクチペ
ーター活性と人間のウロキナーゼとの間の免疫化学的関
連の確認を与えるものである（第１表参照）。

パックグラウンド　　　　　　　　　　　−７９８−−
Ｘ−１７７６（ｐＢＲ３２２）　　　　　　−９５２−
−Ｘ−１７７６（ｐ人Ｂ８２６）　　　　　　−１０８
８７５０１００〃　　　　　抗ＵＫ　　　　１４７９　
　　　１３　　　４．６１　　　　　　　　　　　　Ｎ
Ｒ３５１２７２３４６労済ナーゼ標準　　　　　　　　
　７５６４　　　　３５　　　　１００１１　　　　　
　抗ＵＫ　　　　１６３０　　　　　λ５７（ｃ） ／／−一−−漂％−−−Ｍ隻−−−−−−−−−−−（
ａｌ　　プラスミノーゲンアクナベーターの活性は実施
例６に記載のとおりにして測定した。

（ｂｌ　　ＰＢＳの指示でウサギ抗血清の１：　１０希
釈液１０ｕ１を氷上で３０分間試料溶液２５ｕ１に加え
た。ケスターの方法（Ｊ、　　Ｉｍｕｎｏｌｏ（ｙ、　
。

１１５、第１６１７Ｊｉｉ：、　１９７！４）に従い、
ダルタールアルデヒドで固定したニスアウレウスの１０
％（Ｖ／Ｖ）　懸濁ンＦ１２５ｕｌを使用して、ＭＩ体
を）渭夜から清澄化した。えられた上澄液の３５ｕｌを
分析した。

（ｃｌＮＲ３・・・・・・ふつうのウサギの血ｊ青この
ようにして得られたプラスミノーゲンアクチベーター蛋
白質生成物は、組換ＤＮＡ技術によりその大量取得が比
較的容易であることから、容易に高純度のものとするこ
とができる。したがって、ヒトに投与する医薬として長
期間投与した９あるいは大量に投与した場合でも問題が
より少ないという利点を指摘しうる。

さらにまた天然由来のウロキナーゼは糖鎖を有している
が、この点でも本発明の生成物が同様な活性を有してい
ることは驚（べきことである。

このようにして得られたプラスミノーゲンアクチベータ
ー蛋白質生成物は、従来公知の方法でより精製すること
ができる。

上記プラスミノーゲンアクチベーター蛋白質生成物はそ
れを混合状態のままでも、あるいはより分離精製されて
、それぞれ単独であるいは混合されて用いることができ
る。

製剤例　１ 非経口投与用医薬製剤 実施例１から得られたプラスミノーゲンアクチベーター
蛋白質生成物を含有する溶液を透析後凍結乾燥する。こ
のものの６０．０００単位ウロキナーゼ活性を有するも
のを２５ｍｇマニトール及び４５ＩＩｇの塩化ナトリウ
ムと共に注射用無菌水で再構成する。

本発明の上記プラスミノーゲンアクナベ−ター蛋白質生
成物は血栓症の生体モデルで有効であることが検証しう
る。

本発明の血栓溶解剤は抗原性あるいは副作用の点からも
問題が少ない。本発明の上記プラスミノーゲンアクチペ
ーター蛋白質生成物はマウス及びラットに対する急性毒
性試験において通常用量で何ら異常を認めることがない
。

参考例　６ イー：ｌＪイ菌株Ｘ１７７６　（ｐＡＢＢ２Ｂ）　ノ生
育イーコリイ形質転換体Ｘ１７７Ｂ（ｐＡＢ８２６）ノ
細胞を、１２．５ｗｇ／ＩＩｌのテトラサイクリン塩酸
塩を含むＬ−液（Ｊ、　Ｈ，Ｍｉｌｌ　−ｅｒ、　Ｅｘ
ｐｅｒｉｍｅｎｔｓ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｇｅ
ｎｅｔｉｃｓ、　Ｃｏ１ｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ
　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　１９７２年）中で生育した
。更に、０５％カザミノ酸、０．５％グルコース、０．
５ｕｇのＤ−ビチオン、１１００ｕのＬ−ジアミノピメ
リン酸、４０ｕｇのナルジキシン酸および１２５ｕｇの
テトラサイクリン塩酸塩（すべて−４当たり）を含むＭ
９媒質（Ｊ、　Ｈ，Ｍｉｌｌｅｒ、　Ｅｘｐｅｒｉｍｅ
ｎｔｓ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ
。

Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ、　１９７２年）も生育および上記菌株からの
ブラスミノーゲンアクチペーターの製造のために使用し
た。振とうしながら細胞を３７℃で生育し、十分な生育
達成後に、プラスミノーゲンアクチペーター生産を検出
する目的で回収した。

【図面の簡単な説明】

第１図はウロキナーゼに関連したプラスミノーゲンアク
チベーター蛋白質をコードするプラスミド含有ＤＮＡの
制限地図を図式的に説明するものであり、円内の数値は
そこに示す位置の間の塩基ペアの数を示し、円外の記号
はそれぞれの位置においてＤＮＡを切断する特定の制限
酵素を示し、Ｐｓｔなる記号で示す太い円周部分はプラ
スミノーゲンアクチペーターをコードするＤＮＡ部分の
組入れられる場所である。 第２図は形質転換細胞からのウロキナーゼ様物質の親和
クロマトグラフからえられたデータを示すグラフであり
、横軸はフラクション数を示し、縦軸は毎分のカウント
数を示す。 実線のグラフは形質転換細胞からの溶解物のデータを示
し、破線のグラフはコント・ロールからの溶解物めデー
タを示す。 特許出願人　　アボット　ラボラトリーズ　７．、。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. プラスミノーゲンアクチベーター蛋白質をコードするポ
   リデオキシリボヌクレオチドセグメントによって発現さ
   れ且つ実質的にウロキナーゼの特性を有するプラスミノ
   ーゲンアクチベーター蛋白質生成物を有効成分として含
   有する血栓溶解剤。