JPH0279979A - 自己不和合性遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、広範囲にわたる自己不和合性植物（特に、ナ
ス科（Ｓｏｌａｎａｃｅａｅ）の植物が例として挙げら
れる）の自己不和合性を制御するＳ遺伝子のｃＤＮＡお
よびゲノムＤＮＡコード配列の同定および単離に関する
。Ｓ遺伝子の産物であるＳタンパクの研究結果は、Ｓタ
ンパクが、自己不和合性遺伝子型を有する上記の自己不
和合性植物の発現と関連があることを示している。

Ｓタンパクは、花粉管成長の制御に有用であり。

例えば自己不和合性および異種間の不和合性を制御、誘
発もしくは促進する天然の殺配偶子剤（ｇａｍｅ　ｔｏ
ｃ　ｉｄｅ　）として有用である。またＳ遺伝子および
その産物は、植物の遺伝子操作に利用され。

自己不和合性の栽培変種植物を生産することができる。

このようにして作り出された植物は、ハイブリッド種子
を経済的に生産するのに価値の高いものである。

本願は、米国特許出願第７９２．４３５号（１９８５年
１０月２９日付で出願され、現在は放棄されている）の
一部継続出願である米国特許出願第８５４．１３９号（
１９８６年４月２１日付で出願）の一部継続出願に対応
している。

（従来の技術） ニチコアナ・アラタ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ　　ａｌａｔ
ａ）およびリコペルシコン・ベルビアヌム（ｍ■１ｃｏ
ｎ匹皿虹且叩）を含めて多くの植物種が自己不和合性で
ある。すなわち、これらの植物は９　自らの花粉、また
は同じＳ（もしくは自己不和合性）遺伝子型の植物の花
粉では受精できない。自己不和合性に関する分子論的な
基礎は、植物の成熟した花柱にＳタンパクが存在するす
ることから生じると考えられる。特に、Ｌ阻互垣および
り、匹ユ旦憇憇によって例示されるように、現在のとこ
ろ、Ｓタンパクは、花弁の色を最初に示すつぼみの発育
段階と、この段階に続く、開いてはいるが未成熟の花の
成熟段階とにおける植物の花柱の抽出物中や。

成熟したきらきら輝く花柱を有する花の抽出物中に存在
することが知られている。他方、Ｓタンパクは、未成熟
のつぼみや細長いつぼみの初期の発育段階には存在しな
い。

自己不和合性の総説については、　ｄｅ　Ｎｅｔｔａｎ
ｃｏｕｒｔ。

（１９７７）　Ｉｎｃｏｍ　ａｔｉｂｉｌｉｔ　　ｉｎ
　Ａｎ　ｉｏｓ　ｅｒｍｓ、　Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅ
ｒｌａｇ、　ＢｅｒｌｉｎＨＨｅｓｌｏｐ−Ｈａｒｒｉ
ｓｏｎ　、　　（１９７８）　Ｐｒｏｃ。

Ｒｏｙ、　Ｓｏｃ、　Ｌｏｎｄｏｎ　Ｂ、　２０２　：
　７３　；　Ｌｅｗｉｓ、　　（１９７９）Ｎ、　Ｚ、
　Ｊ、　Ｂｏｔ、　１７：６３７；Ｐａｎｄｅｙ、　　
（１９７９）　Ｎ、　Ｚ。

Ｊ、Ｂｏｔ、、１７　：　６４５およびＭｕｌｃａｈｙ
、　　（１９８３）　５ｃｉｅｎｃｅ。

２２０　　：１２４７．を参照されたい。自己不和合性
は。

自己受粉後、雌の両性孔種子植物が接合体を産生できな
い性質として定義される。２種の不和合性（すなわち、
配偶体不和合性および胞子体不和金性）が知られている
。配偶体不和合性は最も一般的なものであり、多くの場
合、複対立遺伝子を有する単一の核遺伝子座（Ｓ遺伝子
座）により制御されている。花粉は、その半数体Ｓ遺伝
子型を発現する。発現したＳ対立遺伝子が、＃Ｒずいの
２培体組織で発現されたＳ対立遺伝子のいずれかと同じ
場合、交配は不和合性である。不和合性交配および和合
性交配の両方の間に、花粉管は柱頭から発生して成長し
、花柱の伝達組織になる。不和合性交配粒からの筒状部
の成長は、花柱の上部１／３で阻止される。

胞子体不和合性の場合、花粉の挙動は、花粉を産生ずる
植物の遺伝子型により決定される。花粉状中の２つのＳ
対立遺伝子のいずれかが花柱内に存在していると、花粉
管の成長は阻止される。配偶体系とは異なり１通常、柱
頭面で阻止が起こり。

花柱内では起こらない。胞子体不和合性の場合。

Ｓタンパクは、柱頭面かその近傍に集中する。配偶体の
多対型遺伝子系は、顕花植物の自己不和合性の原始形態
であって、胞子体系は、配偶体由来のものであると考え
られる（ｄｅ　Ｎｅｔｔａｎｃｏｕｒｔ）　。

１９７７、前出）。これら２つの系における遺伝子の産
物は、構造的に関連していると考えられる。

５種類の配偶体不和合性植物と、２種類の胞子体不和合
性植物とが存在する。Ｓ遺伝子型に明らかに関連がある
これらの種の花柱もしくは柱頭のタンパクは、電気泳動
法もしくは免疫学的方法で検出されている。Ｌａ１ａｔ
ａについては、花柱抽出物を等電点電気泳動法に供する
ことにより、特定のタンパクバンドと、３つのＳ対立遺
伝子グループとの関係が示された（　Ｂｒｅｄｅｍｅｉ
ｊｅｒ　ａｎｄＢｌａａｓ、　　（１９８１）　Ｔｈｅ
ｏｒ、　Ａｐｐｌ、　Ｇｅｎｅｔ、＋５９　：　１８５
）　＊２つの主要抗体成分が、３３３４遺伝子型のプル
ヌス・アビウム（Ｐｒｕｎｕｓ　　ａｖｉｕｍ　）の栽
培変種植物の成熟花柱内に同定されている。その中の１
つ（Ｓ抗原）は、特定のＳ対立遺伝子グループに対して
特異的であった（Ｒａｆｆら、　　（１９８１）　Ｐｌ
ａｎｔａ１５３　：　１２５　；およびＭａｕら、　　
（１９８２）　Ｐｌａｎｔａ　　１５６　：５０５）。

上記のＳ抗原（すなわち、Ｉ！タンパク）は、５ｉＳ４
栽培変栽培物由来の花粉管のインビトロ成長の強力な阻
害物質であった（Ｗｉｌｌｉａｍｓら。

（１９８２）　ＰｌａｎＬａ　　１５６　　：５７７　
）　、　　この糖タンパクは、２成分に分割されたが、
これらの２成分はＳ。

Ｓ４遺伝子型のＳ３産物およびＳ４産物のようである。

Ｓ対立遺伝子グループもしくは自己不和合性遺伝子型と
関連がある花柱タンパク成分は、ペチュニア・ハイブリ
ダ（Ｐｅｔｕｎｉａ　　ｈｙ加１動−）（Ｌｉｎｓｋｅ
ｎｓ、　　（１９６０）　Ｚ、　Ｂｏｔ、、４８　：　
１２６　）およびリリウム・ロンギフロルム（Ｌｉｌｉ
ｕｍ　Ｉｏｎ　ｉ−ｆｌｏｒｕｍ）とトリホリウム・プ
ラテンス（Ｔｒｉｆｏｌｉｕｍ　　肛コ且時）（Ｈｅｓ
ｌｏｐ−Ｈａｒｒｉｓｏｎ、　　（１９Ｂ２）＾ｎｎ、
Ｂｏｔ、、４９　：　７２９）とについて報告されてい
る。

ブラシカ・キャンペストリス（Ｂｒａｓｓｉｃａ　　ｃ
ａ鮭艶５ｔｒｉｓ）の遺伝子型Ｓ、に対応する糖タンパ
クが。

柱頭抽出物から、ゲル濾過法と、これに続いてアフィニ
ティクロマトグラフィーおよび等電点電気泳動とを実施
することにより、単離されている（Ｎｉｓｈｉｏおよび
旧ｎａｔａ、　　（１９７９）　Ｊａｐ、Ｊ、Ｇｅｎｅ
ｔ、。

５４：３０？）。類似の方法を用いて、Ｓ対立遺伝子Ｓ
３９＋　　Ｓ、、およびＳ、に対する同型接合体のブラ
シカ９オレラシエ（Ｂｒａｓｓｉｃａ　　ｏｌｅｒａｃ
ｅａ）植物の柱頭抽出物からＳ特異的槽タンパクが単離
された（Ｎｉｓｈｉｏおよび旧ｎａｔａ、　　（１９８
２）　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、　１００：６４１）。単離さ
れたＳ特異的なブラシカ・オレラシェの各糖タンパクに
対する抗血清は、その相同糖タンパクを沈澱させただけ
ではなく、ビー・オレラシェの他の２つのＳ特異的槽タ
ンパクおよびビイ・キャンペストリスのＳ、特異的糖タ
ンパク（Ｈｉｎａｔａら、　　（１９８２）　Ｇｅｎｅ
ｔｉｃｓ、　１００　：６４９　）と反応した。Ｓ特異
的槽タンパクは、ビイ・オレラシエの柱頭抽出物から、
ショ糖勾配沈降法と、タンパクがクーマシーブルーによ
る染色で同定されるゲル中での二重拡散法とを用いて単
離された（Ｆｅｒｒａｒｉら、　　（１９８１）　Ｐｌ
ａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ、、　６７　：　２７０）。

この調製物は、生物学的に活性であることが示された。

何故なら、Ｓ、Ｓ、花粉を該糖タンパクで前処理すると
、この花粉が１通常は和合性の柱頭上で発芽するのを阻
害されたからである。ビイ・オレラシエの柱頭に由来す
るＳ遺伝子座特異的槽タンパクの一部をコードするｃＤ
ＮＡクローンが最近報告された（Ｎａｓｒａｌｌａｈら
、　　（１９８５）　Ｎａｔｕｒｅ、　３１８：２６３
−２６７　　）。

Ｃ１ａｒｋｅらの米国特許出願第６１５．０７９号（１
９８４年５月２４日付で出願）および米国特許出願第０
５０，７４７号に（１９８７年５月１５日付で出願）に
詳述されている研究では、ニコチアナ・アラタおよびリ
コペルシコン・ベルビアヌムの両方に由来する数種の自
己不和合性遺伝子型の花柱抽出物が、Ｓ遺伝子関連タン
パクの存在について調べられた。糖タンパク物質は、遺
伝子型がＳ＋Ｓｚ、５ｚＳａ、５ｚＳｚおよびＳ、Ｓ、
のエヌ・アラタと、遺伝子型がＳ、Ｓ２゜Ｓ　ｔ　Ｓ　
３．　Ｓ　＋　Ｓ　３．　Ｓ　ｚ　Ｓ　ｚ、　Ｓ　３　
Ｓ　３．およびＳ、Ｓ。

のエル・ベルビアヌムとの花柱抽出物における分子量３
０．０００の領域で同定された。異なる遺伝子型の花柱
抽出物を２次元ゲル電気泳動法に供して比較したところ
、近縁ではあるが異なる糖タンパクは２個々のＳ対立遺
伝子で分離されることが見出された。例えば、エヌ・ア
ラタのＳ！タンパクは。

Ｓ２対立遺伝子（Ｓｔ　Ｓ３およびＳｔ　Ｓｔ　）を有
する遺伝子型の花柱抽出物のみに見出された。各遺伝子
型について、遺伝子型に特異的な糖タンパクは、花が成
熟した際にのみ出現し、花弁色を初めて示した際と、成
熟の後期段階とにおけるつぼみの花柱抽出物にのみ検出
されたが、初期のつぼみ段階では検出されなかった。そ
れ故、これら糖タンパクの出現は、自己不和合性表現型
の出現と時期が一致している。エヌ・アラタのＳ２糖タ
ンパクと、エル・ベルビアヌムのＳ！およびＳ３タンパ
クとは、花柱上部に一層高濃度で存在していることが示
された。この部分は、花粉管阻止力５起こる領域である
。従って、これらネ唐タンパクの出現は、自己不和合性
反応の出現と場所が一致している。さらに、エヌ・アラ
タの３２タンパクの生物学的活性が、インビトロ分析法
において花粉管の成長が阻止されることにより示された
（Ｗｉｌｌｉａｍｓら、　１９８２．前出）。

米国特許出願第６１５．０７９号および第０５０，７４
７号に開示された研究の重要な点は２個々のＳタンパク
もしくは花柱抽出物に対するウサギ抗血清およびモノク
ローナル抗体が、同じ種の異なる遺伝子型のＳタンパク
間、異なる種のＳタンパク間、および配偶体不和合性お
よび胞子体不和合性を有する種間の免疫交差反応を示す
という発見であった。

そして、上記の特許出願では、Ｓタンパク間には構造的
な相同性があり１分子量およびｐｔに明らかな差異があ
るにもかかわらず、これらのタンパクは９機能が類似し
ているのに加えて、認識可能な構造を有すると結論され
た。

また、上記の特許出願には、数種の成熟エヌ・アラタ（
ｓｚ　、ｓ、、Ｓ？　、およびＳｒ＋＋　）タンパクお
よびエル・ベルビアヌム（Ｓ＋およびＳ３）タンパクの
Ｎ末端の配列決定の結果も報告されている。これらの配
偶体Ｓタンパク間に、アミノ酸配列の有意な相同性が見
出された。配列決定がなされた領域（アミノ酸１〜１５
）において、エヌ・アラタＳｔタンパクは、エヌ・アク
タＳ６タンパクに対して８０％の相同性を、エル・ベル
ビアタムＳ１タンパクに対して６７％の相同性を、そし
てエル・ベルビアタムＳ３タンパクに対して５３％の相
同性を有する。

また、米国特許出願第６１５，０７９号および第０５０
゜７４７号には、花柱抽出物をイオン交換クロマトグラ
フィーで分画し１次いでアフィニティクロマトグラフィ
ーで第２の分画を行うことを包含するＳタンパクの精製
方法が開示されている。この精製方法は、ニコチアナ・
アラタの花柱から３２にのＳ２糖タンパクを単離するこ
とにより例示された。

ブラシカ・キャンペストリスの３１１．３９およびＳ＋
Ｚタンパクの単離およびアミノ酸配列に樽最近の報告は
、これらの配偶体Ｓタンパク間に広範囲にわたる相同性
が存在することを示している（Ｔａｋａｙａｍａら、　
　（１９８６）＾ｇｒｉｃ、　Ｂｉｏｌ、　ＣｈｅＩｌ
ｌ、、　５０：１３６５−１３６７　　；　Ｔａｋａｙ
ａｍａら、　　（１９８６）同上、　１６７３−１６７
６　；　Ｔａｋａｙａｍａら（１９８７）　、　Ｎａｔ
ｕｒｅ、　３２６　　：　１０２１０５）、Ｓ６遺伝子
ｃＤＮＡクローンのＤＮＡ配列（Ｎａｓｒａｌｌａｈら
、　１９８５．前出）に基づいて予想された。

ビイ・オレラシェの８６タンパクのアミノ酸配列（Ｔａ
ｋａｙａｍａら、　１９８７．前出）は、ビイ・キャン
ペストリスのＳタンパクに対して約７５％の相同性を有
することが知られている。エヌ・アラタおよびエル・ベ
ルビアヌムのＳタンパク配列（米国特許出願第６１５．
０７９号および第０５０，７４７号；　　（Ａｎｄｅｒ
ｓｏｎら、　　（１９８６）　Ｎａｔｕｒｅ、　３２１
　　：３８−４４　）と、ブラシカ属植物のＳタンパク
配列とを比較すると、配偶子体および胞子体のＳタンパ
ク間には、有意な相同性が存在しないことを示している
。

同定されたＳタンパクは糖タンパクである。糖タンパク
は、１つまたはそれ以上のＩ！類の共有結合により修飾
されたタンパクである。Ｓタンパクの糖部分の組成およ
び構造については、はとんど知られていない。Ｓタンパ
クの糖部分が不和合性反応の生物学的活性に何らかの寄
与をしているとしても、どのような寄与をしているのか
、現時点では明らかではない。ペチュニア・ハイプリダ
の花柱ｍＲＮＡは、キセノプス・リビス（ワが１時１ａ
ｅｖｉｓ）（カエル）の卵細胞内で翻訳されて、不和合
性及産生誘発する活性タンパクを生産する。植物内で産
生されるＳタンパクのグリコシド化に対する。

カエルの卵細胞内で産生されるＳタンパクの相対的なグ
リコジル化は知られていない。しかし、外来の系におけ
る転写後プロセッシングは、生物学的に活性なタンパク
を生産するのに適している（Ｄｏｎｋ、　ｖａｎ　ｄｅ
ｒ　Ｊ、　Ａ、　Ｗ、　Ｍ、＋　（１９７５）　Ｎａｔ
ｕｒｅ、　２５６　：６７４−６７５　）。

Ｓタンパクのような大部分のタンパクは、細胞から放出
されるか、もしくは細胞内に輸送される。

これらのタンパクは、移行する場合に機能するシグナル
配列またはトランシット配列（ｔｒａｎｓｉｔｓｅｑｕ
ｅｎｃｅ）を有する（例えば、以下の文献を参照された
い：　Ｐｅｒｌｍａｎ、　Ｄ、およびＨａｌｖｅｒｓｏ
ｎ。

Ｈ，Ｗ、、　（１９８３）　Ｊ、　Ｍａｔ、　Ｂｉｏｌ
、、肛：３９１−４０９　　；Ｅｄｅｎｓ　、　Ｌ、ら
、　　（１９８４）　Ｃｅ１１．３７：６２９−６３３
　　；およびＭｅｓｓｉｎｇ、　Ｊ、　　らＧｅｎｅｔ
ｉｃ　Ｅｎ　１ｎｅｅｒｉｎ　　ｏｆ　Ｐｌａｎｔｓ＋
Ｘｏｓｕｇｅ、　Ｔ、ら＆ｉ　（１９８３）　Ｐ１ｅｎ
ｕｏ＋　Ｐｒｅｓｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ。

ｐｐ、２１１−２２７）。シグナルＤＮＡ配列またはト
ランシットＤＮＡ配列は、一般に、成熟タンパクをコー
ドするＤＮＡの５゛末端に隣接しており、成熟タンパク
ＤＮＡ配列と同時にｍＲＮＡに転写され、また同時に翻
訳されて、シグナルペプチドまたはトランシットペプチ
ドが結合した未成熟のタンパクを与える。

移行の過程で、上記のシグナルペプチドまたはトランシ
ットペプチドは９分解されて成熟タンパクを生産する。

自己不和合性植物内のＳ遺伝子の発現は、極めて複雑な
調節を示しており、Ｓ遺伝子の産物は所定の時期に所定
の組織にのみ出現する。この調節の機構は、まだ詳しく
は知られていないが、ＳタンパクをコードするゲノムＤ
ＮＡに近接して特異的な調節ＤＮＡ配列が存在している
はずである。構造遺伝子と、シグナル配列またはトラン
シット配列に隣接して、転写の開始を制御し、タンパク
の発現レベルを制御するプロモーター配列が存在する。

（以下余白） （発明の要旨） 本発明の目的は、配偶体自己不和合性植物のＳ遺伝子を
単離し、特徴付けることにある。この目的のために、Ｓ
遺伝子のｃＤＮＡクローンを単離する方法について述べ
る。この方法は、ニコチアナ属の植物のＳ遺伝子の、全
長に近いｃＤＮＡクローンおよび全長のｃＤＮＡクロー
ンの単離（特に、　Ｎ、　ａｌａｔａのＳｔ、Ｓ３．お
よびＳ、遺伝子のｃＤＮＡクローンの単離）に適用する
ことにより例示された。記載された方法は、特にニコチ
アナ属およびリコペルシコン属の植物を包含するナス科
の植物を含めて、配偶体自己不和合性植物のｃＤＮＡク
ローンの単離に広く利用することができる。

本発明のＳ遺伝子ｃＤＮＡクローンは、雌の分泌組織お
よび花粉を含む植物の生殖組織において、Ｓ遺伝子産物
を発現させる調節配列を有するゲノムＳ遺伝子配列を同
定するためのプローブとして有用である。このような方
法として、　Ｎ、　ａｌａｔａのＳｔ遺伝子のゲノム配
列を単離するのに、上記のクローンを適用した実施例を
示した。このような方法は、一般に、配偶体自己不和合
性植物のＳ遺伝子のゲノム配列の単離に適用することが
できる。ここに記載の方法で単離できる全長のＳ遺伝子
ｃＤＮＡクローンは、Ｓ遺伝子タンパクの完全なシグナ
ル配列またはトランシット配列を含む、Ｓ遺伝子タンパ
クをコードするＤＮＡ配列を有する。このシグナル配列
は、成熟Ｓタンパクが輸送路細胞（ｔｒａ−ｎｓｍｉｔ
ｔｉｎｇ　ｔｒａｃｔ　ｃｅｌｌ）から細胞外に移行す
る際に機能する。この輸送路は、花粉管が成長して子房
に至るときに通過する組織である。

ＳタンパクのＤＮＡコード配列は１例えば非相同のイン
ビトロ発現系に用いて、Ｓタンパクの合成を行わせ、そ
のことによりＳタンパクを２例えば天然の殺配偶子剤し
て利用される生物学的に活性な形態で、多量に生産する
ことができる。成熟ＳタンパクをコードするＤＮＡ配列
は、上記のように。

単独で、またはこれに付随するシグナル配列および／ま
たは調節配列と組合わせて利用できる。

シグナル配列またはトランシット配列は、非相同発現系
における成熟タンパクの放出または移行に影響を与える
場合に、成熟タンパクの隣接ＤＮＡ配列と組合わせて用
いるのに有用である。また。

シグナル配列またはトランシット配列は、タンパクの発
現レベルを増大させる。シグナル配列またはトランク・
ット配列は１例えば組換え体ベクター中に、非相同タン
パクのコード配列と融合させてキメラ遺伝子を構築し、
該非相同タンパクを移行させるのに有用である。植物の
シグナル配列またはトランシット配列は、それらのＤＮ
Ａ配列と組合わせて用いるか、または非相同コード配列
と融合し、キメラ遺伝子として用いて、成熟タンパクを
植物細胞内の特定の細胞小器官に向かわせるか。

または細胞から放出させるのに特に重要である。

はぼ全長のｃＤＮＡクローンは、完全なコード配列とシ
グナル配列とを有する全長ｃＤＮＡクローンを単離する
のに利用できる。

ここに記載されているようにして単離された盈遺伝子の
調節配列は、　ＤＮＡコード配列の転写を行い、非相同
発現系内のタンパク発現レベルの制御を行う際に、タン
パクをコードするＤＮＡ配列（すなわち、構造遺伝子）
と組合わせて用いるのに有用である。特に、Ｓ遺伝子の
調節配列は、植物の生殖組織において非相同タンパクを
発現させるのに有用である０例えば、Ｓ遺伝子の調節配
列は。

植物の生殖組織（特に、花粉組織）中に有毒タンパクを
発現させるのに利用することができる。特異的に発現さ
せた毒物は、天然の殺配偶子剤として機能する。

本発明は、配偶体自己不和合性植物のＳタンパクをコー
ドするＤＮＡ配列を有する新規な遺伝子構築物（＆ｌｌ
換え体ＤＮＡ分子およびベクター）を提供するものであ
る。Ｓ遺伝子調節配列のみからなるＳ遺伝子シグナル配
列、またはＳ遺伝子コード配列もしくは非相同コード配
列を併せ持ったＳ遺伝子シグナル配列を有する構築物に
ついても述べる。

Ｓ遺伝子調節配列は、ニコチアナ・アラタのＳ。

遺伝子を実施例として挙げたが、ミトコンドリアＤＮＡ
に対して非常に高い相同性を有する領域を持っているこ
とが見出された。これら領域の高い保存性と、Ｓ遺伝子
の５゛側隣接領域におけるこれら領域の位置とは、これ
らの領域がＳ遺伝子の組織特異的調節を行うことを示し
ている。

本発明の特定の局面では、配偶体自己不和合性植物のＳ
遺伝子ｃＤＮＡの新規な同定単離法が提供される。この
方法には、適当なＳ遺伝子型（すなわち、単離すべきＳ
遺伝子を発現するＳ遺伝子型）の自己不和合性植物から
ｃＤＮＡライブラリーを調製する工程と、こめｃＤＮＡ
ライブラリーを分別的ハイブリダイゼーションに供する
工程とが包含される。

このｃＤＮＡライブラリーは、クローン化されるべきＳ
遺伝子を発現するＳ遺伝子型の植物の成熟花柱ＲＮ＾か
ら調製した第１のｃＤＮＡプローブと、このｃＤＮＡラ
イブラリーを調製するのに用いたＳ遺伝子型とは異なり
、かつクローン化されるべき旦遺伝子を発現しないＳ遺
伝子型の植物の成熟花柱ＲＮＡから調製した第２のｃＤ
ＮＡプローブとを用いてスクリーニングされる。第２の
プローブとよりも、第１のプローブと、より強くハイブ
リダイズするクローンが選別される。次いで１選別した
クローンは。

数種のＳ遺伝子型由来の花柱ＲＮＡのノーザンブロット
ハイブリダイゼーションにおけるプローブとして利用さ
れる。目的のＳ遺伝子を発現しないＳ遺伝子型由来のＲ
ＮＡ　ｌ製物とよりも、目的のＳ遺伝子を発現するＳ遺
伝子型由来のＲＮＡ　調製物と。

より強くハイブリダイズするクローンが、目的のＳ遺伝
子のｃＤＮＡクローンとして選択される。全長クローン
ではないｃＤＮＡクローンはいずれも、全長クローンを
単離するために、　ｃＤＮＡライブラリーを従来のハイ
ブリダイゼーションによりスクリーニングするのに利用
できる。

上記の方法では２分別的スクリーニングに用いられるｃ
ＤＮＡライブラリーおよびｃＤＮＡプローブは。

同型接合体のＳ遺伝子型の成熟花柱ＲＮＡから調製する
ことが好ましい。このような場合、第１のｃＤＮＡプロ
ーブは、　ｃＤＮＡライブラリーと同じ同型接合体のＳ
遺伝子型の花柱から調製され、第２のｃＤＮＡプローブ
は、異なる同型接合体のＳ遺伝子型の花柱から調製され
る。異型接合体のＳ遺伝子型も。

この方法に利用できることは明らかである。異型接合体
のＳ遺伝子型由来のプローブを、同型接合体のＳ遺伝子
型ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするのに利用
する場合、第１のプローブのＳ遺伝子型は目的のＳ遺伝
子を発現しなければならないが、第２のプローブのＳ遺
伝子型は目的のＳ遺伝子を発現してはならない。

異型接合体のＳ遺伝子型をｃＤＮＡライブラリーの調製
に用い、同型接合体のＳ遺伝子型をプローブの調製に用
いた場合、第２のｃＤＮＡプローブのＳ遺伝子型は、　
ｃＤＮＡライブラリーの調製に用いた花柱により発現さ
れたＳ遺伝子のいずれも発現してはならない。さらに、
異型接合体のＳ遺伝子型のｃＤＮＡプローブを用いて、
異型接合体のＳ遺伝子型ライブラリーをスクリーニング
した場合、第１のプローブのＳ遺伝子型は目的のＳ遺伝
子を発現しなければならないが、第２のプローブのＳ遺
伝子型は目的のＳ遺伝子を発現してはならない。さらに
。

プローブの調製に用いた両方のＳ遺伝子型はいずれもｃ
ＤＮＡライブラリーのＳ遺伝子型の目的ではないＳ遺伝
子を発現しなければならないか、またはｃＤＮＡプロー
ブのＳ遺伝子型のいずれもｃＤＮＡライブラリーのＳ遺
伝子型の目的ではないＳ遺伝子を発現してはならない。

配偶体自己不和合性植物のＳ遺伝子のｃＤＮＡクローン
を単離して同定する本発明の方法は、以下の工程を包含
する： ａ）既知のＳ遺伝子型を有する該配偶体自己不和合性植
物の成熟花柱からｃＤＮＡクローンライブラリーを調製
する工程であって、既知のＳ遺伝子型を有する該植物が
該Ｓ遺伝子を発現する。工程；ｂ）該Ｓ遺伝子を発現す
るＳ遺伝子型の配偶体自己不和合性植物の成熟花柱ＲＮ
Ａがら調製されたｃＤＮＡを包含する第１のハイブリダ
イゼーションプローブと、　該ｃＤＮＡライブラリーの
調製に使用したＳ遺伝子型の植物とは異なる。該Ｓ遺伝
子を発現しないＳ遺伝子型の配偶体自己不和合性植物の
成熟花柱ＲＮＡから調製されたｃＤＮＡを包含する第２
のハイブリダイゼーションプローブとを用いて、該ｃＤ
ＮＡクローンライブラリーを分別的にスクリーニングす
る工程； Ｃ）ｔ！第２のハイフ゛リダイゼーションブローフ。

とよりも、該第１のハイブリダイゼーションプローブと
、より強くハイブリダイズするクローンを該ｃＤＮＡラ
イブラリーから選択する工程；ｄ）該工程Ｃ）において
選択された該クローンを、異なるＳ遺伝子型を有する該
自己不和合性植物由来の少なくとも２つの花柱ＲＮＡ調
製物とのハイブリダイゼーションについて、再度スクリ
ーニングする工程であって、該花柱ＲＮＡ調製物の少な
くとも１つが、該Ｓ遺伝子を発現するＳ遺伝子型由来で
あり、かつ該花柱ＲＮＡ調製物の少な（とも１つが、該
Ｓ遺伝子を発現しないＳ遺伝子型由来である。工程；そ
して ｅ〕該Ｓ遺伝子を発現しないＳ遺伝子型由来の花柱ＲＮ
Ａ　調製物とよりも、該Ｓ遺伝子を発現するＳ遺伝子型
由来の花柱ＲＮＡ調製物と、より強くハイブリダイズす
るクローンを選択して単離し、それにより該配偶体自己
不和合性植物の該Ｓ遺伝子のｃＤＮＡクローンを同定し
て単離する工程。

（以下余白） （発明の構成） Ｓ遺伝子タンパクは、Ｓ遺伝子またはＳ対立遺伝子の産
物である。タンパクという用語には、ここで用いられて
いるように、Ｉ！タンパクが含まれる。自己不和合性反
応の生化学的機構は、充分には理解されていないが、Ｓ
タンパクは自己不和合性の存在に関連がある。従って、
Ｓタンパクは。

（１）Ｓ対立遺伝子により分離され、（２）不和合性反
応が局在している組織内に局在しており、そして（３）
自己不和合性の発現と同時に適切な植物組織に生じるは
ずである。さらに、インビトロ分析において、Ｓタンパ
クが生物学的に活性であるということは、Ｓタンパク自
体が、花粉阻害に対して活性の機能を有する確証を与え
ることが理解される。

しかし、活性成分が、修飾されたタンパクまたは２次産
物であることもある。このような場合、Ｓタンパクの生
物学的活性を生物分析系で証明するためには、他の成分
の活性が必要であるかもしれない、成熟Ｓタンパクは、
シグナルペプチドまたはトランシットペプチドが切断さ
れたＳタンパクの処理された形態である。これは、花柱
組織から単離されるタンパクの形態である。

Ｓ遺伝子またはＳ対立遺伝子は、上記定義の成熟Ｓタン
パクのＤＮＡコード配列を有する。さらに。

Ｓ遺伝子は、Ｓタンパクの翻訳およびプロセッシングに
必要なシグナルペプチドまたはトランシットペプチドな
どの情報のコード領域を有する。さらに、Ｓ遺伝子は、
Ｓタンパクの転写と発現とプロセッシングとに関与する
調節配列およびプロモーター配列を有する。植物のゲノ
ム配列はイントロンを有しうる。全長ｃＤＮＡクローン
は、成熟タンパクをコードするＤＮＡ配列と、全シグナ
ル配列または全トランシット配列とを有する。

自己不和合性植物は、２つの異なるＳ対立遺伝子が発現
される異型接合体のＳ遺伝子型（すなわち、　５ＩＳ３
）または２つの対立遺伝子が同じである同型接合体のＳ
遺伝子型（すなわち、Ｓ＋Ｓ＋）を持っている。

調節配列という用語は、ここで用いる場合、植物の生殖
組織内でＳタンパク（Ｓ遺伝子産物）の４）−組織特異
的発現を調節する機能を有するＳ遺伝子と関連するＤＮ
Ａ配列を意味する。植物の生殖組織には、雌の分泌組織
（柱頭、花柱輸送組織、および胎座の表皮）および花粉
が含まれる。構造遺伝子の発現を調節する機能を有する
配列は、転写開始部位から約１〜２ｋｂ上流にまで延び
る遺伝子の５°側隣接領域に存在する場合が最も多い。

この５°側の調節配列には、特に転写の開始を行うプロ
モーターと呼ばれる領域が含まれる。プロモーター配列
は、下流の遺伝子を発現させるのに必要であるが、必ず
しも充分ではない。真核系のプロモーターは、一般に、
転写開始部位に対して約１０〜３５ｂｐだけ５°側にあ
るコンセンサス配列５゛−ＴＡＴＡＡＴ−３°　（ｒＴ
ＡＴＡＪボックス）と相同の配列を有する。ｒ　ＴＡＴ
Ａ　Ｊボックスの約３０〜７０ｂｐだけ５゛側には、標
準形の５°−ＣＣＡＡＴ−３’　に相同の他のプロモー
ター要素が存在することが多い。この要素は。

植物中では、塩基トリプレット「Ｇ（またはＴ）　ＮＧ
　Ｊに対して対称的に隣接するアデニン残基を有する領
域であるｒ　ＡＧＧＡ　Ｊボックスにより時々置換され
る。嫌気生活や光のような刺激に応答した発現や組織特
異的発現を含む発現の調節に関連する配列要素がプロモ
ーター領域のさらに上流に見い出されることが多く、こ
の要素にはプロモーター要素が点在して見い出される。

遺伝子が発現する時と場所とをＵ８ｍする機能を有する
配列は、非機能配列で隔てられた１つまたはそれ以上の
配列要素を有し得る。このような場合１機能配列要素を
隔てる距離は、正しい調節を行うためには重要であり得
る。ある種の配列要素は１例えばある組織内では発現を
誘発し、他の組織では発現をほとんど誘発しないか、も
しくは全く誘発しない、オン／オフスイッチとして機能
し得る。このような配列要素は１発現のレベルを調節す
る他の配列要素と協奏的に機能させ得る。

構造遺伝子をプロモーターもしくは調節配列の調節制御
下に置くということは、構造遺伝子を。

その発現がこれらの配列で制御されるように位置させる
ことを意味する。プロモーターおよび調節配列要素は、
一般に、これらが制御する遺伝子の上流に位置している
。非相同の構造遺伝子が調節配列の制御下に配置されて
いるキメラ遺伝子を構築する場合には、ｖ４節配列と、
これが自然環境で制御する相同遺伝子（すなわち、調節
配列の起源となる遺伝子）との間の距離とほぼ同じ距離
だけ。

調節配列が遺伝子転写開始部位から隔てられて位置して
いるのが一般に好ましい。当該技術分野で知られている
ように、この距離がいくらか変動しても調節制御を損な
うことなく適応することができる。実際、ある種の変動
によって制御が改善されたり、あるいはより高い発現レ
ベルがもたらされることがある。

構造遺伝子は、タンパク、ポリペプチド、もしくはその
一部をコードするＤＮＡセグメントを有する遺伝子部分
である。構造遺伝子は、シグナル配列またはトランシッ
ト配列を含み、植物細胞内に天然に見い出される遺伝子
であるが、それが本発明の組織特異的調節配列の制御下
に置かれているキメラ構築物の一部として、特に人工的
に導入された遺伝子であってもよい、構造遺伝子として
は全体もしくは一部が、細菌のゲノムもしくはエピソー
ム、真核生物のゲノムもしくはプラスチドのＤＮＡ、　
ｃＤＮＡ、ウィルスＤＮＡ　、または化学的に合成され
たＤＮＡ由来のものであってもよい。このような構造遺
伝子は９発現産物の生物学的活性もしくは化学構造１発
現速度または発現制御の様式に影響する。コード領域も
しくは非翻訳領域中に修飾部分（変異部分、挿入部分、
欠失部分、および置換部分を含む）を有していてもよい
、構造遺伝子は。

連続したコード配列を構成するか、または１つまたはそ
れ以上のイントロンを含んでいてもよい。

構造遺伝子は、コード配列の連結で機能が保持される限
り、融合タンパクをコードすることができる。構造遺伝
子は、複数の起源由来のセグメントの複合体であり得る
。構造遺伝子は、ある遺伝子由来のシグナル配列または
トランシット配列と。

他の遺伝子由来の成熟タンパクをコードする配列とを有
する複合体であり得る。例えば、構造遺伝子は、Ｓ遺伝
子のシグナル配列またはトランシット配列と、他の遺伝
子のコード領域とを有する複合体であり得る。

ｃＤＮＡという用語は、　ｍＲＮＡ鋳型に対する逆転写
酵素の作用で形成される一本鎖の相補的ＤＮＡコピーを
意味するものと、当該技術分野では理解されている。ま
た、ここではｃＤＮＡという用語は、この最初の相補的
コピーから複製される一本鎖もしくは二本鎖のＤＮＡを
表すのに用いられる。ｃＤＮＡコード配列は、ゲノムＤ
ＮＡ内に存在することがあるイントロンをコードしない
配列によって、ゲノムＤＮＡ配列と区別される。インビ
ボにおいてイントロンは、成熟ｍＲＮＡを産生するスプ
ライシングにより。

ｍＲＮＡから除去される。逆転写により＋　ｃＤＮＡを
最初に調製する場合に用いられるのは成熟ｍＲＮＡであ
る。

組換え体ＤＮＡ分子という用語は、ここでは、非相同の
ＤＮＡ配列どうしを、遺伝子工学の技術により３例えば
ＤＮＮクリガーゼ用いてインビトロで連結させることに
より１人為的に連結されてなるＤＮＡ分子を区別するた
めに用いられる（Ｍａｎｉａｔｉｓ、　Ｔ。

ら＋　　（１９８２）　ｒＭｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏ
ｎｉｎｇ　Ｊ　、　Ｃｏ１ｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏ
ｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ＋　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ
　Ｈａｒｂｏｒ＋　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）。非相同のＤＮ
Ａ配列は、異なる遺伝的要素に由来するものである。

ＤＮＡ断片のクローニング法には、自然の起源からのＤ
ＮＡ断片の切除と分離、得られたＤＮＡ断片の組換え体
ベクターへの挿入、および得られたベクターの微生物も
しくは細胞−・の組込みが包含される。ベクターと挿入
されたＤＮＡ断片とは、微生物もしくは細胞が増殖する
間に複製される。クローンという用語は、特定のＤＮＡ
断片の正確なコピーを表すのに用いられる。また、この
用語は、非相同のＤＮＡ断片が最初に挿入された微生物
もしくは細胞と、これらの微生物もしくは細胞に由来す
る遺伝的に同一の生物もしくは細胞の系統との両方を表
すのにも用いられる。

組換え体ベクターという用語は、ここでは、宿主の真核
細胞もしくは原核細胞内で自己複製を行うことができる
ＤＮＡ分子を表すのに用いられる。

この宿主には、非相同のＤＮＡ配列を挿入することがで
きるので、非相同配列は該宿主細胞内で複製される。当
該技術分野の当業者に知られている従来の方法を用いて
、ベクターがその宿主細胞に導入される（Ｍａｎｉａｔ
ｉｓら、　１９８２．前出）。岨換え体ベクターは、形
質転換された細胞の選択が可能になる。抗生物質に対す
る耐性のような選択可能な表現型を示す標識を有するこ
とが多い。

実質的に純粋なりＮＡ分子が、　Ｍａｎｉａｔｉｓら（
１９８２）に記載され、かつその第４図、第６図、およ
び第７図に例示された従来の方法を用いた。アガロース
またはポリアクリルアミドゲルでの電気泳動において単
一のバンドとして移動する。

相同性という用語は、当該技術分野では、ポリペプチド
間もしくはポリヌクレオチド間における。

アミノ酸配列もしくはヌクレオチド配列の同一性の度合
を記述するのに用いられる。配列における相同性の存在
は、ポリペプチド間もしくはヌクレオチド配列間の遺伝
的もしくは機能的な関係を裏付けるのに用いられること
が多い。ポリペプチド間にアミノ酸配列の相同性が存在
することは３個々のポリペプチドをコードするＤＮＡ配
列間に相同性があることを意味する。遺伝コードは、縮
重しているので、ポリペプチド間もしくはタンパク間に
おける相同性の度合は、これらをコードするＤＮＡ配列
間の相同性の度合とは必ずしも同じではない。

ポリペプチド間もしくはポリヌクレオチド間における相
同性の度合は、配列が知られている場合には、相同率と
して定量することができる。比較のための配列情報が存
在しない場合には、相同性の存在は９通常、実験操作に
より決定される。ＤＮＡもしくはＲＮＡ配列の場合には
、ハイブリダイゼーション実験が、相同性の有無を決定
するのに用いられる。特定のハイブリダイゼーションシ
グナルの強度は、用いられる実験条件と相同性の度合と
に依存するので、用いられる実験条件に対して相同性を
定義するのが便利である。ここに記載されているハイブ
リダイゼーション実験を用いて、バックダウランドの望
ましくない配列から目的の配列を選択するために、ハイ
ブリダイゼーションプローブと、目的のＲＮＡ配列もし
くはＤＮＡ配列との間に存在していなくてはならない相
同性の程度を表すのに実質的に相同という用語を用いる
。

以下に記載するものを除いて、クローニング；ＤＮＡの
単離、増幅、および精製、　ＤＮＡリガーゼ。

ＤＮＡポリメラーゼ、制限エンドヌクレアーゼなどが関
与する酵素反応；ならびに各種の分離技術に関する標準
的な方法は、当該技術分野の当業者に知られ通常用いら
れている方法である。多数の標準的な方法が次の文献に
記載されている：　Ｍａｎｉａｔｉｓら、　（１９８２
）前出；ＷｕらｋＬ　（１９７９）　Ｍｅｔｈ、　Ｅｎ
ｚｙｍｏｌ。

皿；向ら１ｍ、（１９８３）Ｍｅｔｈ、　Ｅｎｚｙｍｏ
ｌ、、　　１００および１０１　；　Ｇｒｏｓｓｍａｎ
およびＭｏ１ｄａｖｅ　ｌｉ、　Ｍｅｔｈ、　Ｅｎｚｙ
ｍｏｌ、。

６５　；Ｍｉｌｌｅｒ編、　（１９７２）　Ｅｘ　ｅｒ
ｉｍｅｎｔｓ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒＧｅｎｅｔｉ
ｃｓ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ、　ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂ
ｏｒ＋　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ：ＯｌｄおよびＰｒｉｍｒｏ
ｓｅ、　（１９８１）　　Ｐｒ１ｎｃｉ　　ｌｅｓ　　
ｏｆ　　Ｇｅｎｅ　　Ｍａｎｉ　　ｕｌａｔｉｏｎ＋　
　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ
　Ｐｒｅｓｓ、　ＢｅｒｋｅｌｅｙＨ５ｃｈｌｅｉｆお
よびＷｅｎｓｉｎｋ＋　（１９８２）　Ｐｒａｃｔｉｃ
ａｌ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉ
ｏｌｏｇｙ　　；　Ｇｌｏｖｅｒ鳩、　　（１９８５）
　ＤＮＡ　ＣＩｏｎｉｎ第１巻および第■巻＋　ＩＲＬ
　Ｐｒｅｓｓ＋　０ｘｆｏｒｄ、　ＵＫＨＨａｍｅｓお
よび旧ｇｇｉｎｓ　ｉ＋（１９８５）　Ｎｕｃｌｅｉｃ
　Ａｃ１ｄ　ＨｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎＩＲＬ　Ｐｒｅ
ｓｓ、　０ｘｆｏｒｄ　ＵＫ　；　５ｅｌｌｏ−および
Ｈｏ１ｌａｅｎｄｅｒ。

（１９７９）Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｅｎ　　１ｎｅｅｒｉｎ
　　：Ｐｒ１ｎｃｉ　　Ｉｅｓ　ａｎｄＭｅ　ｔｈｏｄ
ｓ　、第１〜４巻＋　Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｒｅｓｓ＋　Ｎ
ｅｗ　Ｙｏｒｋ。

使用する略語および専門用語は、当該技術分野で標準の
ものであり、上記のような専門誌で一般的に用いられて
いる。

本願では、配偶体自己不和合性植物のＳ遺伝子タンパク
をコードするｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡ　、特にニコ
チアナ・アラタのＳ遺伝子をコードするｃＤＮＡおよび
ゲノムＤＮＡの単離および同定について述べる。Ｓ遺伝
子のｃＤＮＡを単離するには、ニコチアナ・アラタの８
２遺伝子に適用されているように、まず成熟花柱のポリ
（Ａ”）　ＲＮＡからｃＤＮＡライブラリーが調製され
た。該ｃＤＮＡライブラリーは２次いで子房と未熟蕾花
柱とに由来する放射標＠　ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａを用いて分別
的にスクリーニングされ、非成熟花柱に特異的なｃＤＮ
Ａが除去された。得られた成熟花柱に特異的なりローン
は、所望のＳ遺伝子に対して特異的なオリゴヌクレオチ
ドプローブを用いて調べられた。この特異的なプローブ
は、Ｓタンパクのアミノ酸配列によるか、またはＳタン
パクのアミノ酸配列に基づく混合ヌクレオチドプライマ
ーで特異的にブライミングを行うことにより花柱ｍＲＮ
Ａから生成したｃＤＮＡ断片のヌクレオチド配列による
ものである。あるいは、この特異的にプライムされたｃ
ＤＮＡ断片は、成熟花柱クローンのプローブとして直接
使用できる。成熟花柱クローンを、Ｓ遺伝子に特異的な
プローブでスクリーニングすることより、全長であって
、かつ全Ｓタンパクをコードする配列を含むＳ遺伝子コ
ード配列と、これに付随するシグナル配列またはトラン
シット配列を含むｃＤＮＡクローンが単離される。一般
に、上述の方法は、いずれの配偶体Ｓ遺伝子ｃＤＮＡの
単離にも利用できる。

成熟花柱に特異的なりローンライブラリーをスクリーニ
ングしてＳ遺伝子ｃＤＮＡを得る他の方法には、Ｓタン
パクのアミノ酸配列の知識が必要である。Ｓタンパクは
、限られた組織内で限られた回数だけ、ごく少量産生さ
れる。微量アミノ酸の配列を決定するのに充分な純粋Ｓ
タンパクを得るには、数百もの花柱を花から切り取らね
ばならない。

従って、Ｓタンパクのアミノ酸配列を決定するには、多
大の時間と労力とを要する。それ故、Ｓ遺伝子ｃＤＮＡ
クローンを単離する他のスクリーニング方法が望ましい
。ハイブリダイゼーション実験とＮ末端のアミノ酸配列
決定とにより示したように。

Ｓ遺伝子コード領域間には充分な構造類偵性があるので
、あるＳ遺伝子のｃＤＮＡクローンをプローブとして直
接利用し、他のＳ遺伝子のｃＤＮＡクローンを単離し得
ると、当所は考えられていた。このことは、特に、同じ
植物かまたは近縁の植物のＳ対立遺伝子に当てはまると
期待された。実際には。

この直接スクリーニング法は、すべての場合について不
成功に終わった。例えば、　Ｎ、　　ａｌａｔａのＳ！
のｃＤＮＡクローンを用いてニコチアナ・アラタの５３
Ｓ３ＣＤＮＡライブラリーをスクリーニングすると、Ｓ
。

のｃＤＮＡクローンが単離された。これに対し、この方
法では、　Ｎ、　　ａｌａｔａのＳ、もしくはＳｌのｃ
ＤＮＡクローンの単離には成功しなかった。

ニコチアナ・アラタの各種Ｓ対立遺伝子を単離する新し
いスクリーニング法が開発された。この方法は、成熟花
柱ｃＤＮＡライブラリーを、このライブラリーと同じ遺
伝子型の花柱から調製されたｃＤＮＡと、他の遺伝子型
の花柱ＲＮＡから調製されたｃＤＮＡとを用いて１分別
的にスクリーニングする方法である。Ｓ糖タンパクをコ
ードするＲＮＡは非常に豊富であるから、この方法は特
に有効である。Ｓクローンは、同じ遺伝子型のＲＮＡか
ら調製されたｃＤＮＡと非常に強くハイブリダイズする
が、他の遺伝子型由来のｃＤＮＡとのハイブリダイゼー
ションは弱い。この方法は、　Ｎ、ａｌａｔａのＳ、お
よびＳ、のｃＤＮＡクローンを単離するのに利用される
。一般的には。

いずれのＮ、　　ａｌａｔａのＳ遺伝子ｃＤＮＡの単離
にも利用できる。さらに、この方法は、一般に、他の配
偶体種のＳ対立遺伝子間におけるＤＮＡ配列の変化が、
ニコチアナ・アラタのＳ対立遺伝子間におけるＤＮＡ配
列の差異と同等であれば、他の配偶体種のＳ遺伝子ｃＤ
ＮＡクローンの単離に利用できる。この方法は、胞子体
系のＳ対立遺伝子をスクリーニングするのに成功すると
は考えられない、その理由は、ブラシカ゛°属植物の各
種Ｓ対立遺伝子間に極めて高い相同性（７０〜７５％）
が認められるからである。

Ｓ遺伝子ｃＤＮＡクローンは、いったん単離されれば、
ゲノムＤＮＡのハイブリダイゼーションプローブとして
利用し、ゲノムＳ遺伝子クローンを探知して単離するこ
とができる。この方法は、特にニコチア・アラタの８２
遺伝子（Ｓ！タンパクをコードする配列と、この遺伝子
の５°側および３゛側に隣接する領域とを含む）を単離
するのに用いた。

Ｓ！遺伝子の上流隣接領域内には、配偶体自己不和合性
植物のミトコンドリアＤＮＡに対して高い相同性を有す
る領域が同定された。この領域は、Ｓ遺伝子の組織特異
的発現を調節する。

（以下余白） Ｎ、　ａｌａｔａの３２Ｋ　Ｓ　　　　　　ンバク　コ
ード　るｃＤ成熟花柱から＋　Ｓ、遺伝子に関連する糖
タンパクを分離・精製する方法は、イオン交換クロマト
グラフィとアフィニティクロマトグラフィを組合わせて
用いて確立された（米国特許出願第６１５，０７９号と
同第０５０．７４７号）。この方法は、　Ｎ、ａｌａｔ
ａのＳ２タンパクの分離と精製に適用された。さらに最
近では、精製タンパクの収量が、アフィニティクロマト
グラフィでアルカリ性の低い緩衝液（ｐＨ７，８ではな
くてｐＨ７，ｏ　）を用いることによって改善されたゆ
Ｓタンパクは、　ｐｔｔが低い方が安定性がよいようで
ある。第１図に示すように、　Ｎｉｃｏｔｉａｎａ　ａ
ｌａｔａのＳ２対立遺伝子と関連するＭＷ３２にの単一
要素を分離することができた。この要素を化学的に脱グ
リコジル化することによって、第２図ａに示すように１
分子量が約２６ｋｄの単一生成物を得た。成熟花柱、未
熟蕾花柱および子房由来のｍＲＮＡのインビトロでの翻
訳の結果を第２図すに示す。全ＲＮＡを通常の方法で分
離した。はとんどのｍＲＮＡが、ポリアデニル化されて
いるので、　ｍＲＮ＾をポリ（Ａ”）　ＲＮＡとして分
離するのに、ポリ（ｄＴ）セルロースクロマトグラフィ
を用いた。アミノ酸が枯渇したウサギ網状赤血球の溶解
物のキット〔アマ−ジャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）Ｎ、１
５０号等、米国、イリノイ州、アーリントンハイツ）を
用いて、トリチウム標識アミノ酸の存在下で、各種のポ
リＣＡａ　ＲＮＡ画分が翻訳された。約２７ｋｄの分子
量の生体外の翻訳生成物は、成熟花柱ｍＲＮＡからしか
検出されなかった。この生成物は。

化学的に脱グリコジル化されたタンパクよりわずかに大
きかった。それ故、この生成物は、完全な長さの未成熟
Ｓ２タンパクであると同定された。またこのタンパクは
、成熟Ｓ！タンパクとそのシグナルペプチドとで構成さ
れている。

この知見に基づいて１分別スクリーニングのプロトコル
が、Ｓ２タンパクをコードするｃＤＮＡを分離する最初
の方策として採用された。ｃＤＮＡライブラリーがＮ、
ａｌａｔａ遺伝子型５ｚｓｓの成熟花柱ポリ（八゛）Ｒ
ＮＡを用いて、　ｇｔｌｏファージ内に作製された。成
熟花柱ボＩＪ　（Ａａ　ＲＮＡを１通常の方法で転写し
て二重鎖ｃＤＮＡとした（マニアティスら上記文献、　
１９８２年）。末端修復の、　　ＥｃｏＲＩメチル化反
応とＥｃｏＲＩリンカ一連結反応を行い２次いで得られ
たｃＤＮＡを。

ｇｔベクターのＥｃｏＲ１部位中にクローン化した〔フ
ィン、ティら（）Ｉｕｙｎｈ、　Ｔ、　ｅｔ　ａｌ）＋
　　”ＰｒａｃｔｉｃａｌＡｐｐｒｏａｃｈｅｓ　ｉｎ
　Ｂｉｏｃｈｅｎ＋１ｓｔｒｙ　、　ＤＮＡ　Ｃｌｏｎ
ｉｎｇ第１巻、グローバー、デイ（Ｇｌｏｖｅｒ＋　Ｄ
、）［集、　ＩＲＬＯｘｆｏｒｄ、　４９　７８真、　
１９８５年］。このライブラリーを、成熟花柱および未
熟蕾花柱由来の３２ｐで標識したｃＤＮＡを用いて分別
スクリーニングに付した。

λファージを用いて、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅ
−ｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｔ　）　Ｃ６００細胞に感染さ
せた。成熟花柱ｃＤＮＡとのみ強くハイブリッド形成す
るプラークを選択し、成熟花柱もしくは子房のｍＲＮ＾
から作製した３！Ｐ標１１ｃＤＮＡを用いて２回目の分
別スクリーニングを行った。成熟花柱ｃＤＮＡとのみ強
くハイブリッド形成するプラークを再度選別した。この
２回目の選別には子房のｃＤＮＡを用いた。なぜならば
。

５ＯＳ−ゲル電気泳動法によると、成熟花柱と子房の抽
出物が、未熟蕾花柱には発現されていないいくつかの共
通のタンパクを含有していることを示したからである（
第３図）。予想外のことであるが。

子房と未熟蕾以外の組織は１分別スクリーニング用のｃ
ＤＮＡの起源としては不適切であることが見出された。

その理由は、その他の器官のタンパクのプロフィルは、
成熟花柱のタンパクのプロフィルとは余りに異なってお
り利用できないことが分かったからである。それ故に、
子房と未熟蕾のｃＤＮＡによる分別スクリーニングは、
かなり不便であるが、成熟花柱特異ｃＤＮＡを識別する
のに必要であった。得られたｃＤＮＡクローンは成熟花
柱に特異的であった。

ｃＤＮＡ成熟花柱ライブラリーが分別スクリーニングさ
れると、クローンライブラリーを最終的にスクリーニン
グするために８２タンパク特異ＤＮＡプローブが必要で
あった。このプローブ調製の第１段階は、　Ｎ、ａｌａ
ｔａのＳ！タンパクのＮ末端アミノ酸配列の決定であっ
た（表１）。通常の微細配列決定法を用いた〔ピーウィ
ック。アール・エムら（Ｈｅｔｍｉｃｋ。

Ｒ，Ｍ、　ｅｔ　ａｌ）、　Ｊ、　Ｒｉｏｔ、　Ｃｈｅ
１１＋　２５６巻、　７９９０−７９９７頁、　１９８
１年〕。Ｓタンパクの入手が限定されているので１通常
の微細配列決定法を用いた場合Ｎ末端配列のごく短いセ
グメントしか決定できなかった。あいに＜、Ｓ２タンパ
クのＮ末端アミノ酸配列は、非常に余分のコーディング
ヌクレオチドをもっている可能性がある巳とが証明され
た。それにもかかわらず１部分長のｃＤＮＡが下記の方
法で分離された。−組の１合成混合オリゴヌクレオチド
プライマーを１部分アミノ酸配列に基づいて作製した。

アミノ酸４〜８におけるすべてのコドンのアンビギュイ
ティ（ａｍｂｉｇｕｉｔｙ　）をカバーする２４個の１
４量体からなる１セツトを合成した。次いでこれらの合
成混合オリゴヌクレオ子ドを、各々８個の１４量体から
なる３回のバッチ処理に用いて。

Ｎ、　ａｌａｔａ（ＳｚＳｓ）成熟花柱ポリ（Ａ”）　
ＲＮＡからのｃＤＮＡの合成をプライムした。

第４図に示すように、■バッチのみ（１６５号）が。

ブライミング反応に対して特異的であった。驚くべきこ
とには、１００ヌクレオチド長の単一ｃＤＮＡバンドが
、この反応で同定された。プールされた１４量体を、成
熟花柱由来のポリ（Ａ＋）　ＲＮＡをプライムするのに
用いた時にもｔｏｏ　ｂｐのヌクレオチドバンドが観察
されたが、子房もしくは未熟蕾花柱のｍＲＮＡからプラ
イムした時には、上記の断片は痕跡しか検出されなかっ
た。

１００ヌクレオチド長のバンドをアクリルアミドゲルか
ら溶出させ、配列を決定し、シグナル配列中のアミノ酸
−１２から成熟タンパクのアミノ酸２までの８２タンパ
クのコーディング配列を得た（第２表）、この配列から
、−９までのシグナル配列の部分を包含し、そのコーデ
ィング配列の最初のアミノ酸コドンを有する単一３０量
体を合成した（表２）。合成プローブが、シグナル配列
コドンに延びるｃＤＮＡクローンを確実に同定するため
にこのアミノ酸領域を選択した。この対策は便宜上採用
した。というのは、十分に多量の合成プローブを一回の
合成で調製できるからである。代わりに。

前記の１ｏｏｂｐの断片を、クローン化し、増幅し。

精製して、放射能で標識してプローブとして利用するこ
ともできる。

以前に分別スクリーニングによって同定した成熟花柱特
異的クローンをスクリーニングするために、　３０量体
を３２タンパク特異的プローブとして使用した。得られ
たクローンの１つをさらに試験するために選択した。Ｎ
Ａ−２−１と称するこのクローンは、　ＥｃｏＲＩ消化
によりλベクターから１断片として切除されうる８７７
ｂｐのｃＤＮＡ挿入物を含有していた。８７７ｂｐ挿入
物をＭ１３ファージ（Ｍ１３ｍｐ８）内にクローン化し
、　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃ
ｏ１１ｅｃｔｉｏｎ＋１２３０１　ＰａｒｋＬａｗｎ叶
ｉｖｅ、　Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、　Ｍａｒｙｌａｎｄ　
２０８５２に寄託した（加入番号４０２０１　）。

ＮＡ−２−１挿入物の配列決定において、この挿入物は
５゛方向にＡＴＧ開始コドンまで伸びておらず、従って
完全なシグナル配列を有していないことが認められた。

完全な長さのクローンを効率的に回収する方法（Ｏｋａ
ｙａｍａら（１９８２）　Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉ
ｏｌ。

２：１６１〜１７０）によって調製した第二次ｃＤＮＡ
ライブラリーから、完全な長さのクローンを得た。

このライブラリーを、３０量体プローブならびにクロー
ンＮＡ−２−１（上述）由来のｃＤＮＡ挿入物を用いて
スクリーニングした。両方のプローブとハイブリッドす
る。　ＮＡ−２−２と称するクローンを得た。表３は、
　ＮＡ−２−２由来のｃＤＮＡ挿入物のヌクレオチド配
列を示す。ＮＡ−２−２クローン挿入物をＭ１３ファー
ジ（Ｍ１３ｍｐ８）にサブクローニングして、これをｐ
ＡＥＣ９と称し、　１９８６年４月１６日にＡｍｅｒｉ
ｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏ
ｎ＋　　１２３０１　　Ｐａｒｋｌａｗｎ　　Ｄｒｉｖ
ｅ、　　Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ。

Ｍａｒｙｌａｎｄ　２０８５２に寄託した（加入番号４
０２３３）。

クローンＮＡ−２−２の完全な長さのｃＤＮＡ挿入物の
配列（表３）は、５゛末端に潜在的な開始コドンである
ＡＴＧを含んでいる。この配列は、推定上の２２アミノ
酸のシグナル配列を含む、推定分子量２４．８４７のタ
ンパクをコードする６４２ｂｐのオープンリーディング
フレームを有する。表８は、配列の表の中で使用するア
ミノ酸の略語を示す。表３の配列は。

伝達路細胞からのＳ！糖タンパクの細胞外移動を指令す
るシグナル配列を持つ成熟Ｓ２タンパク（１９２アミノ
酸）をコード化する。完全な長さのシグナル配列は、真
核細胞のシグナル配列について述べられている典型的な
特徴を有する（ｖｏｎ　Ｈｅ１ｊｎｅ（１９８３）　Ｅ
ｕｒ、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ　１３３　：　１７〜２
１　；およびｖａｎｌ（ｅｉｊｎｅ（１９８５）　Ｊ、
　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、１８４　：　９９〜１０５）。

最初に分離したＮＡ−２−１のＳ、ｃＤＮＡクローンは
、完全なＳ２タンパクコード領域、シグナル配列の一部
。

および１８残基の長さのポリ（Ａ゛）尾部を含む。ＮＡ
−２−１のｃＤＮＡクローンの配列と完全な長さのクロ
ーンの配列における相違が表３に示されている。５゜末
端の相違以外に、クローンＮＡ−２−１とＮＡ−２−２
はその３゛末端の非翻訳配列の長さも異なっている。そ
れらは、クローンＮＡ−２−２におけるポリアデニル化
部位である。ヌクレオチド６８２と同じである。ＮＡ−
２−１由来のクローン挿入物は、非翻訳ｍＲＮへの付加
的な５０ヌクレオチドおよび１８残基のポリＡ尾部を持
つ。この３”末端の相違は、　Ｓ！ＲＮＡ転写産物に代
替的なポリアデニル化部位が存在することを示唆する。

ここで提供されたＯＮ＾配列情報が、ここで述べたハイ
ブリダイゼーション・スクリーニングに使用しうるオリ
ゴヌクレオチドプローブの化学合成に使用できることは
、当業者に明白であろう、たとえば、　Ｃａｒｕｔｈｅ
ｒｓ、　Ｍ、　）！、（１９８４）　Ｃｏｎｔｅｍｐ、
　Ｔｏｐ。

Ｐｏｌｙｍ、　Ｓｃｉ、　　５　：　５５〜７１　；　
Ｅｉｓｅｎｂｅｉｓ、　Ｓ、　Ｊ、ら（１９８５）　Ｐ
ｒｏｃ、　　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　　Ｓｃｉ、　　
ＵＳＡ　　８２　：　１０８４〜１０８８参照。

Ｓｔタンパクのコード領域を含むＮＡ−２−１クローン
由来のｃＤＮＡ挿入物の３２Ｐ標識コピーを以下のポリ
（Ａ”）　ＲＮＡを用いたノーザンプロットハイプリダ
イゼーション実験に使用した。そのポリ（Ａ”）　ＲＮ
ＡはＮ、　ａｌａｔａの遺伝子型Ｓ＋Ｓｉ、Ｓｚｈ、Ｓ
！ＳｔおよびＳ３Ｓ。

の成熟花柱、ならびにり、　Ｈ皿虹並斐の遺伝子型ＳＩ
Ｓ、の成熟花柱、およびＬａ１ａｔａ遺伝子型５２Ｓ３
の未熟蕾花柱と子房から調製した。それらを第５図に示
す。Ｓ２対立遺伝子を持つ成熟花柱における主要転写産
物の大きさは、５°末端標識したＨｉｎｄｌｌｌ−シ剣
ＲＩマーカとの比較に基づいて９４０塩基であり、　１
５００および３５００ｂｐに２つの小さな転写産物を有
する。

９４０塩基の転写産物はＳ３Ｓ！およびＳ、Ｓ、花柱由
来のＲＮＡにも存在するが１発現頻度はずっと低く、５
２８２あるいは５ｚＳｘ花柱のレベルの１％か、それよ
り低い。未熟蕾ＲＮＡにおいては優勢な転写産物は存在
しなかったが、成熟孔の子房からのＲＮＡでは検出され
、やはり成熟花柱よりもはるかに低い濃度（１％未満）
であった。

は９肚悶旦匹　Ｌ匹社並印遺伝子型Ｓ＋Ｓｉは、　ＮＡ
−２−１ｃＤＮＡ挿入物とハイブリッドする。容易に検
出可能なレベルの２．５ｋｂ　ｍＲＮＡを含む。Ｌ、　
赳ユ旦並朋由来のＳｌおよびＳ、タンパクはどちらも２
８ｋｄの推定分子量を持つｉ　ＲＮＡプロット分析は、
これらのタンパクをコードするｎ＋ＲＮＡ転写産物の大
きさが同じであることを示している。Ｂｒａｓｓｉｃａ
　　ｏｌｅｒａｃｅａの成熟花柱ｍＲＮＡとのハイブリ
ダイゼーションは、使用した条件下で極めて弱かった。

これらの結果は、　Ｎ、　ａｌａｔａのＳ、およびＳ、
タンパクと、　Ｌａ１ａｔａの８２タンパクのＤＮＡコ
ード配列の間の相同性を示唆している。さらにまた、　
Ｎ、　ａｌａｔａＳｔタンパクのコード配列と、　Ｌ　
ｃｏ　ｅｒｓｉｃｏｎ　ｅｒｕｖｉａｎｕｍＳｌおよび
Ｓ、タンパクのコード配列との間に相同性が存在するこ
とも示している。Ｎ１ｃｏｉａｎａａｌ　　ａｔａとＢ
ｒａｓｓｉｃａのクローン化したＳ対立遺伝子の間には
相同性がないことから、ＳｔタンパクｃＤＮＡプローブ
と、　ＢＬｏｌｅｒａｃｅａからのポリ（Ａ”）　ＲＮ
Ａとのハイブリダイゼーションが弱いことの由来は明ら
かではない。

ハイブリダイゼーション実験は当初Ｎ１ｃｏｔｔａｎａ
ａｌａｔａ　　Ｓ、遺伝子ｃＤＮＡが、　Ｎ、　　ａｌ
ａｔａの他のＳ対立遺伝子のｃＤＮＡクローンを得るた
めの直接ハイブリダイゼーション・スクリーニングに使
用しうることを示唆したが、この方法は一般的に成功し
ないことが判明した。ノーザン分析は、　５ｔｃＤＮＡ
クローン挿入物（ＮＡ−２−１またはＮＡ−２−２）が
５３ｗＲＮＡとクロスハイブリダイゼーションすること
を示したが。

ハイブリダイゼーションの程度はＳ！ａ＋ＲＮＡに関し
てＳ、ｃＤＮＡプローブで得られるよりも約１００倍低
かった。Ｓ、ｃＤＮＡクローンは、Ｓ２プローブを用い
た成熟花柱特異的Ｓ、Ｓ、ｃＤＮＡライブラリーの直接
スクリーニングによって得られたが１強いハイブリッド
形成プラークではなかった。他のＮ、　　ａｌａｔａ　
Ｓ遺伝子のＳ　ｃＤＮＡクローンを分離すると（以下参
照）。

各種のＳ対立遺伝子はＤＮＡ　レベルでの全体的相同性
が約５５％しかないことが認められた。Ｎ、　ａｌａｔ
ａＳタンパク間での実質的な相同性は、タンパクのＮ末
端領域に限られていた（表１）。

Ｎ、　　ａｌ且ｔａ　Ｓ対立遺伝子のｃＤＮＡを分離す
るために３次にＮ、　　ａｌａｔａ　Ｓ対立遺伝子間の
構造的相違に基づく別のスクリーニングアプローチを考
案し。

Ｎ、　　ａｌａｔａ　Ｓ、およびＳ、ｃＤＮＡの分離に
特異的に適用した。

遺伝子型Ｓ：＋Ｓｔの成熟花柱由来のｍＲＮＡを用いて
ｇｔｌｏにｃＤＮＡライブラリーを作製した。放射能標
識したｃＤＮＡを、　Ｓ、Ｓ３遺伝子型およびＳ、Ｓ、
遺伝子型の成熟花柱から調製した。そのあと異なる遺伝
子型由来の標識ｃＤＮＡを使用して、　ｃＤＮＡライブ
ラリーを分別的にスクリーニングした。Ｓ、Ｓ、ｃＤＮ
Ａと強くハイブリダイズし、　５４Ｓ４ＣＤＮＡとはわ
ずかじかハイブリダイズしないプラークを選択し、　Ｓ
、ｃＤＮＡクローンによって再びスクリーニングした。

次に、得られたクローンをノーザンプロット法における
。いくつかのＳ遺伝子型由来のＲＮＡを含むプローブと
して使用した。Ｓ、ｃＤＮＡクローンが＋　Ｓ３対立遺
伝子を持つ花柱由来のＲＮＡと最も強くハイブリダイズ
した。Ｓ、対立遺伝子を持たない遺伝子型のＲＮＡへの
Ｓ＋クローンのハイブリダイゼーションは有意に弱かっ
り（１０〜１００倍ｇい）。Ｓ、クローンの１つを配列
決定のために選択した。その配列を表４に示す、このク
ローンはほぼ完全な長さであった；しかしながら、クロ
ーンの５゛末端の短いサブ断片が。

クローンを配列決定した時に偶発的に切断された。

ＥｃｏＲ１部位の５゛側の配列（表４に示す）はＲＮＡ
配列決定法によって決定した。成熟Ｓ３タンパクのＮ末
端アミノ酸配列は、微細配列決定分析法によって得られ
た。シグナル配列はまだ得られていない。

Ｓ、Ｓ、遺伝子型の成熟花柱ライブラリーからＳ、ｃＤ
ＮＡクローンを分離するために類似の方法を使用シた。

最初に、　５ｂＳ６ＣＤＮＡと強くハイブリダイズし。

Ｓ、Ｓ、ｃＤＮＡとは弱くハイブリダイズするクローン
を選択した。Ｓ、クローンの１つを配列決定のために選
択した。その配列を表５に示す。このクローンは、完全
なＳｈタンパクコード配列とシグナル配列の一部を含む
、このクローンはポリ（Ａ）連部までの３°方向には伸
びていない。

一般に、　Ｎｉｃｏｔｉａｎａ　　ａｌａｔ’ａの他の
Ｓ対立遺伝子のｃＤＮＡクローンの分離には同様の分別
スクリーニング操作が適用できる。

ＤＮＡは、従来の方法により既知のＳ遺伝子型の自家不
和合性植物から分離することができる。たとえば、　Ｒ
ｉｖｉｎ、　Ｃ，Ｊ、ら（１９Ｂ２）＋　Ｍａｉｚｅ　
ｆｏｒ　Ｂｉ。

１ｏ　１ｃａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ（Ｗ、　Ｆ、Ｓｈ’
ｅｒｉｄａｎ＆Ｗ集、ｐ、１６１〜１６４＋　Ｐｌａｎ
ｔ　Ｍｏ１．　Ｒｉｏｔ、Ａｓ５ｎ、　Ｃｈａｒｌｏｔ
ｔｅｓｖｉｌｌｅ。

Ｖｉｒｇｉｎｉａ　；ならびにＭａｚｕｒｅ、　Ｂ、　
Ｊ、およびＣｈｕｉ。

Ｃ，−Ｆ、（１９８５）、　Ｂｅｒｎａｔｚｋｙおよび
Ｔａｎｋｓｌｅｙ　（１９８６）Ｔｈｅｏｒ、　Ａｐｐ
ｌ、　Ｇｅｎｅｔ、　７２　：　３１４〜３２１が述べ
ている方法である。そのあと適当なベクターにゲノムＤ
ＮＡライブラリーを構築することができる。このことは
、制限エンドヌクレアーゼによるゲノムＯＮＡの切断、
　ＤＮＡ断片の大きさの選択、および選択したベクター
のクローニング部位へのこれらの断片の挿入を含む。λ
ファージにおけるＮｉｃｏｔｉａｎａｔａｂａｃｕｍゲ
ノムライブラリーの構築についてはＭａＺｕｒｅ＋８、
　Ｊ、およびＣｈｕｉ、　Ｃ，−Ｆ、（１９８５，前述
）が記述している。

染色体Ｓ対立遺伝子クローンは、たとえばフィルターハ
イブリダイゼーションスクリーニングにおいて、放射能
標識したｃＤＮＡ　Ｓ対立遺伝子クローン挿入のハイブ
リダイゼーションプローブを用いて遺伝子型特異的なゲ
ノムライブラリーをスクリニングすることによって選択
される。適当な微生物を、ゲノムライブラリーを含有す
るλファージで感染させる。感染微生物は９数千プラー
ク形成単位／プレートの濃度でアガロースに塗布し。

ニトロセルロースフィルター上に複製することができる
。そのあと標識したプローブをフィルターに塗布してハ
イブリッド形成させる。プローブとゆっくりとハイブリ
ッド形成したプラークを選択し、再びプレートに塗布し
て、純粋なファージが分離されるまでハイブリダイゼー
ションを行う。

選択したファージからのＤＮＡを精製し、制限し。

アガロースゲル上に分離して、プロッティングによりニ
トロセルロースフィルターに転写する。次にこれらのフ
ィルターを標識ｃＤＮＡｓ対立遺伝子プローブにより再
び検索し、Ｓタンパクコード配列を含む制限断片を同定
することができる。これらのスクリーニングのための標
準的なハイブリダイゼーション条件は既に述べられてい
る（Ｍａｎｉａｔｉｓら、　１９８２．前述）。

この操作をＮｉｃｏｔｉａｎａ　　ａｌａｔａの染色体
ｓ２遺伝子の分離に特異的に適用した。Ｓ、Ｓ２遺伝子
型の植物の葉から全ＤＮＡを分離した。サザンプロット
ハイプリダイゼーション実験において、標識した５ＩＣ
ＤＮＡ７”０−プ（ＮＡ−２−１またはＮＡ−２−２）
が、　Ｓ！Ｓ、ゲノムＤＮＡのＥｃｏＲＩ消化によって
生成される単一の約３．１ｋｂ断片とハイブリッド形成
することを６ｎ認した。

この断片をｇｔｌｏにクローニングした。次にジブすキ
シ法を用いて染色体Ｓ２遺伝子を配列決定した。

ゲノムＳ２遺伝子の配列を表６に示す。これから明らか
なように＋Ｓ！コード配列（ヌクレオチド１６０３〜２
３３８　）は１つの９４ｂｐイントロンによって分断さ
れている。転写開始は９表が示すように、　ＡＴＧ開始
コドンの１９塩基上流の位置（１５８４位）に位置づけ
られた。この配列は、転写開始の上流の１５８３ｂｐに
及ぶ５゛側の調節配列を含み、生殖組織において３２遺
伝子崖物の発現調節に必要な配列を含んでいる。推定上
の“ＴＡＴＡ　”“ボックスはヌクレオチド１５４９〜
１５５９に同定される。この配列もやはり、　Ｓ、ｃＤ
ＮＡクローンの３”末端に同定される２つのポリアデニ
ル化シグナルを含む：Ｔ＋　（２４１０〜２４１５）お
よびＴ２．　（２４５６〜２４６１）。

サチンプロット法でミトコンドリアＤＮＡ　（ｍｔ　Ｄ
ＮＡ）と相同性を示すセグメントを、Ｓｔ遺伝子の上流
領域内で同定した。３．１ｋｂ　ｓｚ遺伝子のＥｃｏＲ
ｌ断片をＨ４ｎｃ／ＩＩで消化し、コード領域の上流の
３５４ｂｐから伸びる約１ｋｂ断片を分離して、サチン
プロット法におけるＮ、　　ａｌａｔａおよび打匹匣■
ｋｏ　ｎ　ｅ　ｓ　ｃ　ｕ　１　ｅ　ｎ　ｔｕｍからの
全ＤＮＡの旧ｎｄｌｌｌ消化産物のプローブとして使用
した。このプローブは、　Ｎ、　ａｌａｔａについては
約７５０ｂｐのバンドを含む高度の反復パターンを生じ
たが、　Ｌ、　ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍでは約７５０ｂｐ
の１つの主要バンドしか生じなかった（第６図Ａ）。そ
の後、１２の異なる酵素で消化しておいた。　Ｌ、　ｅ
ｓｃｕｌｅｎｔｕｍおよび類縁のり、　Ｐ坤μＵ↓月２
由来のＤＮＡとのハイブリダイゼーションは、プローブ
配列の多型性を示さなかった。このｌｋｂ断片もまた。

　Ｎ、　ａｌ工堕および以ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍのミト
コンドリアＤＮＡ　ＨｉｎｄＩＩＩ消化産物を検索する
ためにサチンプロット法に使用した（第６図Ａ）。相同
セグメントがミトコンドリアＤＮＡに存在することが両
方の種において明らかに証明された。その後の実験は、
この相同配列が、染色体外要素ではなく高分子量の染色
体ＤＮＡ内に組込まれることを示した。次に１．Ｑｋｂ
　ＨｉｎｃＩＩ断片とハイブリッド形成するＮ、　ａｌ
ａｔａの７５０ｂｐミトコンドリアＤＮＡを分離し１両
方の種の全ＩＩＮＡおよびミトコンドリアＤＮＡのＨｉ
ｎｄｌｌｌ消化産物のサチンプロット法でのプローブと
して使用した（第６図Ｂ）。ミトコンドリアＤＮＡプロ
ーブは１両方の種の全ＤＮＡおよびミトコンドリアＤＮ
Ａにおけるｌ断片とハイブリッド形成した。これは、Ｌ
ａ　ｌａ　ｔａの全ＤＮＡでの反復ハイブリダイゼーシ
ョンパターンを生じる配列（第６図Ａ）と、ミトコンド
リアＤＮＡに相同な配列とは、Ｓ２遺伝子のゲノムのク
ローンの１．０ｋｂサブ断片上の別の要素であることを
示している。Ｎ、ａｌａｔａの７５０ｂｐミトコンドリ
アＤＮＡ断片は、中程度の厳密ハイブリダイゼーション
条件下でトウモロコシのミトコンドリアＤＮＡとハイブ
リダイズしないことが認められた。

Ｎ、　ａｌａｔａ　ＤＮＡの１．ＯｋｂのＳ、遺伝子断
片に相同なＳＩ　ｂｉは、　７５０ｂｐのミトコンドリ
アＤＮＡ断片の３１５ｂｐのＨｉｎｄｌＩＩ　／Ｈｉｎ
ｃｌｌサブ断片に限られることが認められた。このサブ
断片を配列決定し、その配列を３２遺伝子の上流領域の
配列と比較した（表７）。

ミトコンドリアＤＮＡの配列と核ＤＮＡ配列を並列する
と、　５６ｂｐのセグメントが非常に高い相同性を持つ
ことが明らかになった（５３１５６ｂｐ）。Ｓ２遺伝子
配列におけるこの相同領域の位置は表６に示されている
。５６ｂｐフラグメントから３”側にさらに２つの短い
、完全に一致する配列（表６および７に下線で示す）が
あり、ミトコンドリアおよび核ＤＮＡの両方において生
じる。これら２つの配列の間隔は、核ＤＮＡとミトコン
ドリアＤＮＡの断片では異なっている。核配列はまた。

相同領域に隣接する短いａｂｐの直接反復部を含む（反
復の１つが相同配列内にある）。反復の先頭の７塩基対
は、Ｓ雄性不稔細胞質のミトコンドリアに見られるトウ
モロコシのＳ−２プラスミドの逆反復の末端部分と完全
に？７チする（Ｌｅｖｉｎｇｓおよび５ｅｄｅｒｏｆｆ
　（１９８３）Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　
Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　　８０：４０５５〜４０５９）。

核配列中に直接反復が存在することは転位因子除去の特
徴に一致する（Ｎｅｖｅｒｓら（１９８６）　Ａｄｖ、
　Ｂｏｔ。

Ｒｅｓ、１２　：　１０３〜２０３　）　、表７の核Ｄ
ＮＡセグメントミトコンドリアＤＮＡセグメントとの間
での配列の類似性、ならびに転位因子特性の存在は、細
胞器官間で相同領域が転移されたことを示唆するが。

転移の方向は不明である。５６ｂｐおよび完全な３１５
ｂｐ全体のミトコンドリアセグメントと、　　Ｇｅｎｅ
　Ｂａｎｋデータベース（υ、Ｓ、　Ｄｅｐａｒｔｍｅ
ｎｔ　ｏｆ　Ｈｅａｌｔｈ　ａｎｄＨｕｍａｎ　５ｅｒ
ｖｉｃｅｓ、　　Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ　Ｂｉｏｌｏ
ｇｙ　ａｎｄ　Ｂｉｏ−ｐｈｙｓｉｃｓ　Ｇｒｏｕｐ＋
　　Ｌｏｓ　Ａｌａｍｏｓ　Ｎａｔｌ、　　Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ。

Ｌｏｓ　Ａｌａｍｏｓ、　Ｎｅｗ　Ｍｅｘｉｃｏ）に集
積された植物、細胞器官、ウィルスおよび構造ＤＮＡ配
列との比較は。

有意の配列相同性を示さない。

Ｎ、　ａｌａｔａ、　Ｌ、　ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍおよ
びり、　朋ｙ見則ｕの全ＤＮＡ消化物のサザンプロット
を７５０ｂｐ　ミトコンドリアクローンを用いて検索す
ると、プロットをフィルムに長時間接触させた後で他の
断片とのハイブリダイゼーションが認められる（第７図
Ａ）。

これらの結果は、ミトコンドリアクローンが核ＤＮＡの
他の領域とハイブリッド形成することを示唆する。これ
はまた、　Ｌ、　ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍＸＬ、　３間で
の交雑の６つのＦ２後代の全ＤＮＡ消化産物を検索した
類似のハイブリダイゼーション実験の結果によっても裏
付けられる（第７図Ｂ）、後代はすべて同じ細胞質を持
つので１個々の後代間でのパターンの相違は核断片の分
離に起因するものと考えられる。

Ｓ２遺伝子の上流領域内にミトコンドリア相同領域が存
在することは、その領域が該遺伝子の発現調節における
機能を持つことを示唆する。ミトコンドリアＤＮＡにお
ける相同性の存在は、配偶体の自家不和合性の機構に関
連した。同様に調節される細胞質遺伝子の存在を示唆す
ると考えられる。

細胞質成分は通常自家不和合性には関連しないが。

花柱（母系）組織に最初に発現する新しい対立遺伝子的
な特異性が生じるような、ある種の系の異常が存在し、
この事実は上記のような細胞質成分によって説明され得
る。

（以下余白） の　　　　　　におけるＳタンパクの六本明細書中にそ
の分離法が述べられているＳタンパクＤＮＡコード配列
は、有意な量の活性Ｓタンパクの合成を指示するために
使用され得る。

ＳタンパクをコードするＤＮＡは、従来の組換えＤＮＡ
の手法により、それ自体の調節配列、つまりベクターの
内因性調節領域または挿入された調節領域の制御下に置
かれるように１組換えベクターに挿入され得る。組換え
ベクターの選択は極めて重要というわけではない。ベク
ターのリストの一部には、λまたはＭ１３バクテリオフ
ァージ、ガＬ吋ｂａｃｔｅｒｉｕｍのＴｉまたはＲｉプ
ラスミド、　ｐＢＲ３２２由来のプラスミド、ならびに
ブロムモザイクウィルス（ＢＭＷ　）またはタバコモザ
イクウィルス（ＴＭＶ　）のような植物ウィルスベクタ
ーが含まれる。次に。

適当な宿主微生物あるいは植物細胞が、Ｓタンパクコー
ド配列を含むベクターで形質転換される。

形質転換した微生物あるいは細胞は、従来の手段によっ
て選択され２例えば試験管内での花粉管阻害アッセイあ
るいは免疫測定法によって、活性Ｓタンパクの発現につ
いて検定される。次に活性タンパクを生産する形質転換
体を液体培地中で適当な時間増殖させてＳタンパクを合
成させ９次にそのＳタンパクを分離して、必要であれば
さらに精製する。Ｓタンパク配列は、ベクター上に維持
するか１あるいは宿主の染色体ＤＮＡに組込むことがで
き、その場合にはＳタンパク配列は宿主のＤＮＡ配列に
隣接する。

酵母発現系では、植物タンパクの翻訳後の正しいプロセ
ッシングが認められるので、この系は植物タンパクの発
現に特に有用である。酵母における植物タンパクの発現
についての詳細な記述は。

Ｒｏｔｈｓｔｅｉｎ、　Ｓ、Ｊ、ら（１９８４）Ｎａｔ
ｕｒｅ　３０８：６６２〜６６５　；Ｌａｎｇｒｉｄｇ
ｅ、　Ｐ＋ら（１９８４）、ＥＭＢＯＪ、　３：２４６
７〜２４７１　；Ｅｄｅｎｓ、　Ｌ、　ら（１９８４）
　、前出；及びＣｒａｍｅｒ、　Ｊ、Ａ、ら（１９８５
）Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ＋　　
Ｂ２：３３４〜３３Ｂにある。

あるいは、植物タンパクは、　Ｅｄｅｎｓ、　Ｌ、　　
ら（１９８２）Ｇｅｎｅ　１８：１〜１２に例示されて
いるように、同様の技法を用いて細菌において発現する
ことができる。

Ｅｄｅｎｓらは大腸菌における植物タンパクソーマチン
（ｔｈａｕｍａｔｉｎ）の発現について述べた。細菌系
を使用する時には、ＳタンパクをコードするＤＮＡは。

ｃＤＮＡの場合と同様にイントロンを含んではならない
。

酵母または細菌のいずれかにおいて活性タンパクを発現
させる上で完全なシグナル配列の存在は必須ではないが
、酵母ではシグナル配列が存在する時に、より効果的な
タンパク合成が認められた（ｔ！ｄｅｎｓ、　Ｌ、　　
ら、　１９８４．前出）。

Ｃｏｒｎ　ｉｓｈ　ら（１９Ｂ？）、　Ｎａｔｕｒｅ　
　３２６：９９〜１０２に述べられているＮ、　　ａｌ
ａｔａにおける一ｉｎ　　５ｉｔｕでのハイブリダイゼ
ーション実験により、Ｓタンパクをコードする遺伝子が
、＃性分泌組織、柱頭、花柱伝達組織、および胎座の表
皮全体に発現されることが確認された。より最近になっ
て発明者らは花粉および朽の切片についての同様のｉｎ
　　５ｉｔｕでのハイブリダイゼーション実験において
、　Ｎ、　　ａｌａｔａのＳ遺伝子が花粉中に発現され
ることを見い出した。Ｓ遺伝子の５”側非コード領域は
、従って。

自己不和合性植物の生殖組織において下流のコード配列
の発現を指示する調節配列を含む。これらの調節配列は
、植物生殖組織において所望のタンパクを選択的に発現
するために用いられ得る。選択的発現は、所望の構造遺
伝子をＳ遺伝子調節配列の調節制御下に置くキメラ遺伝
子の構築によって達成される。次に、そのようなキメラ
遺伝子を。

植物細胞あるいは植物体全体に再生されうる組織に導入
すると、所望の構造遺伝子が生殖組織中に選択的に発現
される。

夫隻■土：籠生林料■皿 Ｎ、　　ａｌａｔａの異型接合遺伝子型Ｓ、Ｓ３および
Ｓ、Ｓ３の種子は、叶、　Ｋ、に、　Ｐａｎｄｅｙ（Ｇ
ｒａｓｓＬａｎａｓ、　ＰａｌｍｅｒｓｔｏｎＮｏｒｔ
ｈ、　Ｎｅｗ　Ｚｅａｌａｎｄ）より入手し、そして、
遺伝子型ＳＯＳ？はＤｒ、　Ｇ、　Ｂｒｅｉｄｅｍｅｉ
ｊｅｒ（Ｓｔｉｃｈｔｉｎｇ　Ｉｔａｌ、。

Ｗａｇｅｎｉｎｇｅｎ、オランダ国）より提供された。

Ｌ。

：の異型接合遺伝子型５ＩＳｚおよび５ＩＳ３は。

ＶｉｃｔｏｒｉａＳｔａｔｅ　Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　
ｏｆ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ＋　Ｂｕｒｎｌｅｙ。

Ｖｉｃｔｏｒｉａ＋　オーストラリア国、から入手した
。Ｓ□Ｓ、およびＳ、対立遺伝子について同型接合の植
物は。

米国特許出願第６１５．０７９号および第０５０．７４
７号に述べられているように蕾の自家受粉によって形成
された。簡単に言うと、　Ｎ、　　ａｌａｔａの異型接
合植物から生じた蕾について、細いはさみで花冠を慎重
に裂き、未成熟な豹を静かに除去することにより、伸長
芽の段階で除雄した。除雄の２４時間後。

花弁の呈色の直前に、未成熟柱頭に他の花の成熟裂開朽
からの自家花粉で受粉させた。受粉の前に。

柱頭表面をに）成熟柱頭からの滲出液（２つの柱頭を静
かに接触させて付与）あるいは（ｉｉ　）　０．００１
％ホウ酸塩中１５％スクロース（柱頭を溶液１滴に慎重
に接触させて付与）のいずれかで被覆した。

この処理後に、柱頭を、成熟花粉の入ったガラス製ペト
リ皿に静かに接触させるか、もしくは柱頭表面上に花粉
を慎重に擦過することによって受粉させた。未熟孔の落
下を防ぐために、花輪に、１％（重量／重量）インドー
ル酢酸を含む粗ラノリン少量を塗布した。蕾受粉植物の
Ｆ１子孫の遺伝子型は、既知の自己不和合性遺伝子型の
植物に対する検定交雑によって確認した。

Ｂ、　　ｏｌｅｒａｃｅａ混合遺伝子型＊　Ｌ、　　ｅ
ｓｃｕｌｅｎｔｕ＋＋＋（ｔｏｍａｔｏ）　ｃｖ、　Ｇ
ｒｏｓｓｅ−Ｌｉｓｓｅ＋およびり、　　匹ｙｌ」■（
ＬＡ　７１６）（Ｃ，Ｍ、Ｒｉｃｋ、　Ｕｎｉｖｅｒｓ
ｉｔｙ　ｏｆ　Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ。

Ｄａｖｉｓ、　ＣＡより入手したトマトの野生類縁種）
をハイブリダイゼーション実験において使用した。

成熟非受粉花柱を、花弁呈色開始時に除雄しておいた花
から、あるいは黄色の蕾から採取した。

これらの成熟花柱を取り、ただちに使用するかもしくは
一７０°Ｃで保存した。花柱とは、−緒に切除した柱頭
と花柱とを指していう。子房を花柱から分離した。緑蕾
花柱とは、自己不和合性の発現前の未成熟花柱を指して
いう。

Ｎ、　　ａｌｌ堕の花（遺伝子型５ｚＳｓ　）を花弁の
呈色開始時に除雄した。２日後に、十分に成熟した花柱
を取り、−７０°Ｃで保存した。（ここで花柱とは。

−緒に採取した花柱と柱頭とを指していい、子房は含ま
れない。）２ｍ結花柱（３ｇ）を、乳鉢と乳棒を用いて
液体窒素中で微粉末に粉砕し、続いて５０Ｉｌｄ！の抽
出用緩衝液（５０ＩＩＩＩＩＴｒｉｓ−ＨＣｌ、　ｐＨ
８，５，１ｍＭ　ＣａＣ１ｇ、　２０ｍＭ　ＮａＣ１，
１ｏ＋Ｍ　ＤＴＴ、　１０　ｍＭ　ＥＤＴＡおよび１％
（重量／重量）不溶性ポリビニルピロリドン）中でさら
にすりつぶした。そのホモジネートを遠心分離しく１２
．０００ｇ　：　１５分間）、そして。

上澄み（ｌｌｌｄ）を採取した。

イオン交換クロマトグラフィーの前に、花柱抽出物（ｌ
ｉｄ）を、セファデックスＧ−２５（商標名。

Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｉｎｃ、、υｐｐｓａｌａ＋　ス
ウェーデン）カラム（直径１．６ｃｔａ；長さ２２１．
ボイドゝボリューム１１戚）を通過させることにより、
　ＮＨ４ＨＣＯ３（５ｍＭ、　　ｐＨ８，６）　、　　
ＮａＣ１（１＋Ｍ）　、　ＣａＣ１ｚ（１ｍＭ）、　Ｅ
ＤＴＡ（１ｍＭ）で平衡化した。ボイドボリュームで溶
出した最初の１６ｄを採取し、同様の炭酸水素アンモニ
ウム緩衝液で平衡化したＤＥＡＲ−セファロース（商標
名、　Ｐｈａｒａ＋ａｃｉａ　Ｉｎｃ、＋　Ｕｐｐｓａ
ｌａ＋スウェーデン）（ベツドボリューム２６ｄ、直径
１．６ｃｍＸ長さ１３０）にかけた。次に、カラムをこ
の緩衝液（５０ｄ）で洗浄して、そのあとにＮａＣ１勾
配（Ｏ〜０．５Ｍ）で溶出を行った。Ｓ、タンパクは非
結合分画中に存在した。これらの分画を合併し、室温で
ロータリーエバポレーターにより１６ｄの最終容量に濃
縮した。

ＣｏｎＡ−セファロース（商標名＋　Ｐｈａｒｍａｃｉ
ａ　Ｉｎｃ、。

Ｕｐｐｓａｌａ、　　スウェーデン）を使用したアフィ
ニティークロマトグラフィーによりＳ２タンパクをさら
に精製し、続いてゲルろ過を行った。　（ｏｎＡ−セフ
ァロースを、緩衝液〔酢酸ナトリウム（１０ｍＭ、　ｐ
Ｈ７）　、　０．ＩＭ　ＮａＣ１，１ａ＋Ｍ　ＭｇＣｈ
、Ｉｎ＋Ｍ　　ＣａＣ１ｚ　　１ｍＭＭｎＣ１ｚ　）中
５容のメチル−α−Ｄ−マンノシド（０，１Ｍ）で洗浄
した。洗浄したＣｏｎＡ−セファロースを１次に３重炭
酸塩緩衝液、　ＮａＨＣＯｚ（０，２５Ｍ。

ｐＨ８，８）に移し、室温で１時間置いた。この１時間
の間に重炭酸塩緩衝液を４回交換した。０．０３％（容
量／容量）グルタルアルデヒドを含む４容のＮａＨＣＯ
ｓ　（０，２５Ｍ、　ｐＨ８，８）を添加し、　０．５
　Ｍ　　ＮａＣ１を含むＮａＨＣＯ３（０，１Ｍ、　ｐ
Ｈ８，０）でＣｏｎＡ−セファロースを洗浄して、緩衝
液〔酢酸ナトリウム（１０ｍＭ　　ｐＨ７）０．Ｉ　Ｍ
　　ＮａＣ１，１ｍＭ　ＭｇＣ１ｚ、　　１ｍＭ　　Ｃ
ａＣ１！　＋　　１ａ＋ＭＭｎＣ１ｇ　）中に再懸濁し
、カラム（直径０．８ＣＩｌ、長さ１４０）に充填した
。　ＤＨＡＩ！−セファロースからの非結合画分を、　
１０ｍＭアセテート緩衝液で平衡化したＧ２５−セファ
デックスカラムを通過させることにより１０ｍＭアセテ
ート緩衝液で平衡化し、その後カラムにかけた。非結合
物質を採取し。

カラムを１０容のアセテート緩衝液で洗浄し、結合物質
を、アセテート緩衝液中の０．１　Ｍまたは０．２Ｍメ
チル−α−Ｄ−マンノシドで溶出した。Ｓ！タンパクを
含む両分をドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動（ＳＯＳ−ＰＡＧＥ）によって同定し、
採取し、ロータリーエバポレーターによって１−に濃縮
した。低いｐＨの緩衝液を使用することは、米国特許出
願第６１５．０７９号に述べられた方法の改良であって
、精製Ｓ２タンパクの収率の改善をもたらす。タンパク
は低いｐＨにおいてより安定であると思われる。

０．１Ｍメチル−α−Ｄ−マンノシドによって溶出した
貯留画分をバイオゲルＰ１５０　（商標名、　Ｂｉｏｒ
ａｄＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、
　Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ）のカラムにかけ、Ｓ！タンパ
クからメチル−α−Ｄ−マンノシドを分離した。（ボイ
ドボリューム１３ｄ、直径１．６Ｃ１１，長さ３６．５
ｃｙｏ、　ＮＨ，ＨＣＯ３（１０ｍＭ　　ｐＨ８，５）
１０ｍＭ　ＥＤＴＡ、　０．ｔＭ　ＮａＣ１，１ｍＭ　
　ＣａＣＩｚ中で平衡化し、これを用いてカラムにかけ
た）。さらに、水を用いてバイオゲルＰ２　（商標名、
　Ｂｉｏｒａｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ。

Ｒｉｃｈｍｏｒｉｄ、　Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ）中を通
過させ、痕跡量のメチル−α−Ｄ−マンノシドを除去し
た。精製したＳ！タンパクは、　５Ｏ５−ＰＡＧＥの判
定基準により実質的に均質であった（第２図ａ）。

１２．５％（重量／容量）アクリルアミドを使用し。

Ｌａｅｍｌｉ　ｔｌ、ＬおよびＦａｖｒｅ、　Ｍ、（１
９７３）　Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ。

銭：５７５〜５８３に従って５ＯＳ−ＰＡＧＥを実施し
た。試料を、煮沸水浴中で２分間加熱しながら、試料緩
衝液中１．４３Ｍの２−メルカプトエタノールを用いて
還元した。電気泳動後、ゲルをクマシーブルーで染色し
た。

Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｐｆｕｎｇｓ
ｔａｄｔ、西ドイツ）４７０Ａ型気相シーケンサ−を使
用してＮ末端の配列決定を実施した。約２００μｇの精
製ｓｚｌ！タンパクを水溶液中でグラスファイバーディ
スクに適用し。

蒸発乾固した。ディスクをシーケンサ−の反応室に置き
、タンパクを溶出し、フェニルイソチオシアネート法に
より２０サイクルの自動エドマン分解を行った。生じた
アミノ酸フェニルチオヒダントイン誘導体を１１００％
〜６５％（容量／容量）の範囲の２０ｍＭ酢酸ナトリウ
ム（ｐｌ（５〜５．６）による酢酸ナトリウム−アセト
ニトリル勾配を用いて、３０分間にわたり３２°Ｃで、
　ＩＢＭ−ＣＮカラム（ＩＢＭ、　Ｄａｎｂｕｒｙ、　
Ｃｏｎｎｅｃｔｉｃｕｔ）を用い、　ＨＰＬＣの手法に
よって同定した。誘導体を既知の標準化合物との比較に
よって同定した。

Ｎ１ｃｏｔｉａｎ−ａ　ａｌａｔａの凍結成熟花柱Ｃ３
ｚＳｓ遺伝子型）を、乳鉢と乳棒を用いて液体窒素中で
微粉末に粉砕した。この組織からタンパクを抽出し、Ｓ
２対立遺伝子結合の糖タンパクを、イオン交換とアフィ
ニティークロマトグラフィーとの組合せによって分離し
た（米国特許出願第６１５，０７９号および第０５０．
７４７号）。この物質を、少量のタンパクを用いて行う
ために、修正されたトリフルオロメタンスルホン酸（Ｔ
ＦＭＳ）法（Ｅｄｇｅら（１９８１）、　Ａｎｎａｌ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、　　月８：１３１〜１３７　）を用い
て脱グリコジル化した。

精製したＳ！結合糖タンパク（２００μｇ）をテフロン
内張りねし栓付きの１０ｄガラス管中で凍結乾燥し、乾
燥機中、ＰｔＯ，上で１８時間乾燥した。アニソール（
６０μりおよびＴＦＭＳ　（１２０μりを添加し、管を
３０秒間Ｎ２で洗浄して密封した。２５°Ｃで９０分後
、ドライアイスで前冷却したｎ−ヘキサン：ジエチルエ
ーテルの１：９混合物１０戚を添加した。溶液を６０分
間のドライアイス上に置き、遠心分離して（５００ｇ、
　　５分間、４°Ｃ）、上澄みを廃棄した。ペレットを
空気乾燥して、緩衝液（３００μ２）に再懸濁し、ピリ
ジン：Ｈ２Ｏ（１：　１）を添加して、　ｐＨを６．８
に調整した。試料を電気泳動の前に２分間煮沸した。

グアニジニウムチオシアネートをタンパク変性剤として
使用する従来の方法により、子房、未熟蕾花柱あるいは
成熟花柱から全ＲＮＡを分離した。

ポルアデニル化されたｍＲＮＡ、　ポリ　（Ａ“）ＲＮ
＾を分離するために、オリゴ（ｄｔ）−セルロースクロ
マトグラフィーを使用した。アミノ酸枯渇ウサギ網状赤
血球溶解産物キット（Ａａ＋ｅｒｓｈａｍ、　Ａｒｌｉ
Ａｒｌｌｎ　Ｈｅｉｇｈｔｓ。

１１１ｉｎｏｉｓ）を使用して＋　１５０　ｍＭ　Ｋ”
　、　１．２　ｍＭ　Ｍｇ”およびトリチウム標識化ア
ミノ酸の存在下で、このポリ（Ａ）　”　ＲＮＡ　　（
２，０または０．５μｇ）を翻訳した。ロイシン、リジ
ン、フェニルアラニン。

プロリンおよびチロシンを各々５．４．３．１．４．８
．３．８および４．ＯＴＢｑ／ｍｍｏｌの比活性で使用
した。反応容量は２５μ２であった。３０°Ｃで９０分
間培養後、ウシ膵リボヌクレアーゼ（５ｕ　１．　２ｍ
ｇ／　ａｄりで３７’Ｃ。

２０分間処理してＲＮＡを除去した。

純粋Ｓｔ対立遺伝子タンパクのグリコジル化および脱グ
リコジル化試料を、１５％アクリルアミドを用いた５Ｄ
Ｓ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＯＳ−ＰＡＧ
Ｅ）によって分析した。ゲルをクマシーブルーで染色し
た。

同様に、成熟花柱ポリ（Ａ”　）　　ＲＮＡの翻訳産物
を、１０〜１５％アクリルアミド勾配ゲルを用いた５Ｏ
５−ＰＡＧＥによって分離した。ゲルをＡｍｐｌｉｆｙ
　　（商標名、　Ａａｅｒｓｈａｍ、　ＡｒｌｉＡｒｌ
ｌｎ　Ｈｅｉｇｈｔｓ、　ｌ１ｌｉｎｏｉｓ　）および
Ｘ線フィルムへの曝露によって処理した後、生産物を視
覚化した。いずれの場合にも１分子量マーカーを隣接レ
ーンに配置し、クマシープルーで視覚化した。

ポリ（Ａ”　）　　ＲＮＡをＬ　１互堕（遺伝子型５２
Ｓ３）の成熟花柱から上記のように分離し、二本鎖ｃＤ
ＮＡに転写した（Ｍａｎｉａｔｉｓら、　１９８２．前
出）。平滑末端のｃＤＮＡを、　ＤＮ＾ポリメラーゼに
よる末端修復によって調製した。このｃＤＮＡに含まれ
るＥｃｏＲＩ部位をＥｃｏＲＩメチラーゼで処理してブ
ロックした。次に１合成影通ＲＩリンカーを二本鎖ｃＤ
ＮＡにつないだ。

そのあと、　）ｌｕｙｎｈ＋ら（１９８５，前出）が述
べたようにｃＤＮＡをｇｔｌＯのＥｃｏＲ１部位にクロ
ーン化した。このファージを使用して大腸菌Ｃ６００を
感染させ。

平板培養した。

実施例６　：　　　　　ｃＤＮＡ−イブーリーの　　ス
クリーニング ポリ（Ａ”　）　　ＲＮＡを、Ｎ、ａｌ工堕の遺伝子型
５２Ｓ３の成熟花柱、未熟蕾花柱あるいは子房から分離
した。−本鎖３２Ｐ標識ｃＤＮＡハイブリダイゼーショ
ンプローブを、各々のＲＮＡから無作為プライミングに
よって調製した。成熟花柱ライブラリーを含むλｇｔｌ
Ｏを使用して大腸菌Ｃ６００を感染させ、約１０００プ
ラーク形成単位／１５０ｍｍペトリ皿　の密度でプレー
トした。ハイブリダイゼーションのために２枚のニトロ
セルロースリフトを調製した（Ｍａｎｉａｔｉｓら、　
１９Ｂ２．前出）。最初にプラークを、成熟花柱および
未熟蕾花柱からの標ｉ１　ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａプローブでス
クリーニングした。成熟花柱プローブのみと強くハイブ
リダイズしたプラークを選択して採取し、精製し°Ｃ１
成熟花柱および子房に対するプローブを用いた二次分別
スクリーニングを実施した。得られたプラークは成熟花
柱特異的クローンである。

これらのプラークハイブリダイゼーションにおいては、
ハイブリダイゼーションの前に（プレハイブリダイゼー
ション）２時間、およびハイブリダイゼーションの間に
１６時間、４２°Ｃで、５×デンハート溶液、　　５Ｘ
ＳＳＣ（３Ｍ　　ＮａＣ１，０，３Ｍクエン酸三ナトリ
ウム）　、　５０ｇ／ｄ音波破砕サケ精子ＤＮＡ、５０
ｍＭリン酸ナトリウム（ｐ）１６．８　）　　１ｍＭビ
ロリン酸ナトリウム、１００　μＭ　ＡＴＰおよび５０
％脱イオン化ホルムアミドによってフィルターを処理し
た。プローブは４　ＸＩＯ’　ｃｐｍ　／ｙｄｌの比活
性で使用した。フィルターを、０．１％ＳＯＳ　　（ド
デシル硫酸ナトリウム）を含む０．Ｉ　Ｘ５ＳＣ溶液中
で洗浄した。

Ｓ２タンパクのＮ末端配列のアミノ酸４〜８におけるす
べての可能なコドンのアンビギュイティー（ａｍｂｉｇ
ｕｉｔｙ）に対応する。２４の１４ｉ１体オリゴヌクレ
オチドのセットを合成した（表１）。オリゴヌクレオチ
ドは、　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｐｆ
ｕｎｇｓｔａｄｔ。

西ドイツ国）　ＡＢＩ３ＢＯＡ型ＤＮＡシンセサイザー
を使用して、固相フオスフォアミグイト法（Ｂｅａｕｃ
ａｇｅおよびＣａｒｕｔｈｅｒｓ（１９８１）、　Ｔｅ
ｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔｅｒｓ　　２２：１８５
９）によって合成した。１４量体は、　”Ｐ−ＡＴＰ　
　（５０００Ｃｉ／ｍｍｏ＋）の存在下でＴ４キナーゼ
を用いて末端標識した。これらの標識１４量体（５ｇｇ
／ｒｄ）を８個の１４１体の３バツチに使用し、成熟花
柱ポリ（Ａ”　）　　ＲＮＡを用いて選択的ｃＤＮＡ合
成を起動した。

逆転写反応容量は、４０μ！であった。反応混合物は、
　０．７５攬ｄのｄＣＴＰ、　ｄＧＴＰ、　ｄＴＴＰお
よびｄＡＴＰ、　７５μｇ／ｄのポリ（Ａ”　）　　Ｒ
ＮＡ　、　５０＋ｎＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐ）！　８
．３）、　１０　ｍＭ　ＭＣＩ、　８　ｎ＋Ｍ　ＭｇＣ
１ｇ、　０．４　ｍＭジチオスレイトール、　５００　
Ｕ／ｄ胎盤ＲＮＡａｓｅ阻害因子、ならびに５００　Ｕ
／ｄ　ＡＭＶ　　逆転写酵素を含んでいた。４２°Ｃで
９０分間インキュベートした後、　ＥＤＴＡを５０　　
ｍＭの濃度にまで添加して反応を停止し、フェノール：
クロロホルム１：１（容量／容量）で抽出し。

その生産物である標識ｃＤＮＡをエタノールで沈澱させ
た。ペレットを、　１００　ｍＭ　ＮａＯＨ，７Ｍ尿素
、および１０ａ＋Ｍ　ｔ！ＤＴＡの溶液２０μ！に再懸
濁した。試料を５分間９０°Ｃに加熱し、８％（重量／
容量）アクリルアミド／７　Ｍ尿素のゲルで電気泳動し
た。ゲルをＸ線フィルムに５分間暴露し、特異的にプラ
イムされたｃＤＮＡ産物を位置づけた。

第４図に示すように１合成１４量体のバッチの１つは、
成熟花柱に特異的な１００塩基対ヌクレオチドの合成を
プライムした。との１００塩基対ヌクレオチドｃＤＮＡ
バンドをゲルから切り出し、　０．５Ｍ　　酢酸アンモ
ニウムおよびｌ　ｍＭ　ＥＤＴＡ中３７中口７°Ｃしな
がら一晩溶出した。その溶出物をブタノール抽出によっ
て濃縮し、フェノール：クロロホルムで抽出し、エタノ
ールで沈澱させた０次にＭａｘａａ＋およびＧ１１ｂｅ
ｒｔ（１９７７）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ
、　Ｓｃｉ、　　７４：５６０の手法を用いて、この１
００塩基対ヌクレオチドの配列決定を行った。Ｓ２タン
パクの−１２から＋８までのアミノ酸に対応させたこの
ヌクレオチドの配列を表２に示す。

１００塩基対ｃＤＮＡの配列に基づき、対応するアミノ
酸配列の−８から＋１までの領域をカバーする。

３０塩基対の長さの合成オリゴヌクレオチドプローブを
、上記のように調製した。３０量体プローブを”Ｐ−Ａ
ＴＰで末端標識した０次に、このプローブを使用して、
　ｇｔｌｏライブラリーの分別スクリーニングによって
得た成熟花柱特異的クローンをスクリーニングした　３
！ｐ−標識オリゴマープローブ（４ＸＩＯ’　ｃｐｔｓ
　／ａｄ）のハイブリダイゼーションを。

ホルムアミドの濃度を２０％に低下させ、温度を３７°
Ｃに下げた点を除いて、上記のように実施した。

２ｘｓｓｃを用いて３７°Ｃでフィルターを洗浄した。

２つの別途に調製したライブラリーからの約１００゜０
００プラークをスクリーニングし、　３０量体プローブ
と強くパイプリダイズした５つのクローンを得た。ＮＡ
−２−１と命名された１つのｇｔｌｏクローンを選択し
てさらに試験した。このクローンは１つの８７７塩基対
挿入物を含むことが見い出され、これはＥｃ。

ＲＩ消化によってλベクターから切除することができた
。ＮＡ−２−１クローンの配列決定後、１００塩基対断
片の配列決定ゲルの読み取りに誤りのあったことが判明
した。表２に示した配列を用いて３０量体プローブを調
製した。スクリーニングにおいて使用した３０量体プロ
ーブの配列は、従って、　ＮＡ−２−１クローン挿入物
には正確に対応していなかった。

実施例８：ＮＡ〜２−１ｃＤＮＡ　　　　のヌクレオチ
ド切除した８７７塩基対のＤＮＡ挿入物をチェーンター
ミネーション法（Ｆ、　Ｓａｎｇｅｒら（１９７？）、
　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　７４：５４６３〜５
４６７；　Ｓａｎｇｅｒら（１９８０）　。

Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　１４３：１６１〜１７８
　）を用いて配列決定し′た。ＮＡ−２−１クローン挿
入物は完全なＳｚ遺伝子コード配列を含むことが認めら
れたが、配列は５゛末端がＡＴＧコドンにまで伸長して
いなかった。このクローン挿入物はほぼ完全な長さの３
２遺伝子ｃＤＮ八を含んでいた。ＮＡ−２−１クローン
の完全な配列は提示されていないが、この配列は米国特
許出願第７９２、４３５号および第８５４．１３９号に
示されている。

その後に単離した完全長のクローンＮＡ−２−２（後述
）の配列を表３に表し、これら２つのクローンの３゛領
域での配列の相違をそこに示す、　ＮＡ−２−１挿入物
の配列決定においては、タンパクをコードする配列であ
ると考えられるものの中央に停止コドンが同定された。

問題となるコード領域に対応するポリペプチド断片のタ
ンパク配列決定によりクローンの１７１〜１８２６Ｎ域
に余分なアデニンヌクレオチドが挿入されていることが
明らかになった。

これはおそらく、配列決定の人為的な結果による。

実施例９：ノーザンプロ・ Ｓ！対立遺伝子結合タンパクをコードするｃＤＮＡクロ
ーン（ＮＡ−２−１）挿入物から、無作為プライミング
によって、３！Ｐ−標識クローンを調製した。

ポリ（Ａ”　）　ＲＮＡの一部分を、　Ｍａｎｉａｔｉ
ｓら（１９８２゜前出）が述べているように、ホルムア
ルデヒド−１，２％（重量／容量）アガロースゲル上で
両分した。但し９画分は、緩衝液として２０　　ｍＭモ
ル承りノブロバンスルホン酸（ｐＨ７，０）　、　　５
ｍＭ酢酸ナトリウムおよび０．１　ｍＭ　ＥＤＴＡ（ｐ
Ｈ８，０）を用いて行った。

２０　Ｘ　ＳＳＣを用いてゲルを直接ニトロセルロース
フィルターにプロットした。クレノー標１１ｉ−Ｈｉｎ
ｄｌｌｌＥｃｏＲＩλ断片を分子量マーカーとして使用
した。

プレハイブリダイゼーシゴンおよびハイブリダイゼーシ
ョンは、プラークハイブリダイゼーシヨンについて述べ
た通り、４２℃で実施した。

実施例１０　：　ＮＡ−２−１”のほぼ６　な　　のＳ
　ンバクのＭ１３ｍ　　Ｂへのクローニング　お８７７
塩基対のＮＡ−２−１クローン挿入物を、４冴Ｒ１制限
エンドヌクレアーゼによってｇｔｌｏから切除した。生
成したＤＮＡ断片をエタノールで沈澱させ。

真空乾燥して水に再懸濁し、　０．２５μｇ　ＤＮＡ　
／μｌとした０次に、そのＤＮＡ断片（２，５μｇ）を
、２５μｌの緩衝液中で１時間、　３７”Ｃでインキュ
ベートして末端修復した。上記緩衝液は、各々２１１１
ＭのｄＡＴＰ。

ｄＣＴＰ、　ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ、　１０単位のＤ
ＮＡポリメラーゼｌ　（クレノー断片）　、　５０　ｍ
Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　（ｐＨ７，６）　、　１０ｍＭ
　ＭｇＣｈならびに１０ｍＭジチオスレイトールを含む
。末端修復した断片を再沈澱させ、真空乾燥し、水に再
懸濁して０．２５μｇ　ＤＮＡ　／μｌとした。

末端修復した断片をＳｍａ　！制限エンドヌクレアーゼ
で切断し、あらかじめ脱リン酸化しておいた市販のベク
ターＭ１３ｓ＋ｐ８　（Ａｍｅｒｓｈａｍ、＾ｒｌｉｎ
ｇｔｏｎ　Ｈｅｉｇｈｔｓ＋　ｌ１ｌｉｎｏｉｓ　）に
挿入した。　　ＩＵ／ｕｌＴ４１Ｊガーゼ、　　ｌ＋ｍ
Ｍ　ＡＴＰ、　６６　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ７
，６）、　５ｍＭ　ＭｇＣｈおよび５ＩＩＩＭジチオス
レイトールを含む緩衝液中で、　１．２５μｇの末端修
復断片と２０ｎｇのＭ１３ｍｐ８とを使用して平滑末端
連結を実施した。連結混合物（総容量２０μりを４°Ｃ
で一晩インキユベートした。

次に、この連結混合物（１０μりを使用して０．２−の
コンピテント大腸菌ＪＭ　１０１細胞を形質転換した（
Ｍｅｓｓｉｎｇ、　Ｊ、　　ら（１９８１）　Ｎｕｃｌ
ｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ。

■：　３０９　）　、　８７７塩基対の３２タンパクＤ
ＮＡ断片を含むクローンを無作為プライミングにより！
Ｐで標識した精製８７７塩基対Ｓ２クローン挿入物をハ
イブリダイゼーションプローブとして使用した。選択し
たクローンの１つからＤＮＡを精製し、　Ｍ１３ａ＋ｐ
８のＳｍａ１部位に挿入した８７７塩基対断片からなる
。

ｐＡＥＣ５と命名されたＤＮＡ分子を単離した。

成熟花柱ポリ　（Ａ”　）　　ＲＮＡを使用してｇｔｌ
Ｏにおける２次ｃＤＮＡライブラリーを作成した。ライ
ブラリーは、完全長のｃＤＮＡクローンの分離に最適な
ように設計された。　Ｏａｋａｙａｍａら（１９８２）
　Ｍｏ１．　Ｃｅ１ｌＢｉｏ！、　　２　：　１６１〜
１７０の方法に従って構築した。

２０．０００プラークを含むライブラリーを５μｇのポ
リ（ＡｉＲＮＡから得た。このライブラリーを。

３０塩Ｍ対の長さの合成オリゴヌクレオチドプローブ、
ならびに実施例７のＮＡ−２−１クローンからの８７７
塩基対のｃＤＮＡ挿入物を用いて、実施例６において述
べたようにスクリーニングした。両方のプローブとハイ
ブリダイズした。　ＮＡ−２−２と命名された１つのク
ローンを、今後の試験のために選択した。

ＮＡ−２−２ｃＤＮＡ挿入物を、　ＮＡ−２−１挿入物
の配列決定に使用したのと同じ方法を用いて配列決定し
た。

表３は、成熟Ｓ２タンパクについての完全な構造コード
領域を含むＮＡ−２−２ｃＤＮＡ挿入物の配列を示す。

これは、　ＮＡ−２−２クロ一ン配列においては余分な
アデニンヌクレオチドがないことを除いて、ＮＡ−２−
１の配列と同一である。ＮＡ−２−２クローンはまた。

完全なシグナル配列をコードしており、この配列は。

成熟タンパクのＮ末端上の２２アミノ酸にわたっている
。ＮＡ−２−１およびＮＡ−２−２の両方のシグナルペ
プチドの誘導アミノ酸配列は、−１８のアミノ酸まで同
一である。２つのクローンの間で５゛末端に配列の相違
がある理由は、配列決定の人為的な結果であると考えら
れる。２つのクローンは３°非翻訳配列の長さが異なっ
ている。それらは、クローンＮＡ−２−２におけるポリ
アデニル化部位と同一である。ＨＡ−２−１クローンは
、ポリ（Ａ）連部の前に余分な５０ヌクレオチドを含む
。

（以下余白） 実施例１１　：　Ｎ、ａｌａｔａのＳ、およびＳ、ｃＤ
ＮＡクローンの！阻 遺伝子型Ｓ、Ｓ、および５６ＳｂのｃＤＮＡライブラリ
ーを。

実施例４で述べたように、成熟花柱からのｍＲＮＡを用
いてｇｔｌＯにおいて作成した。−末鎖１ｚＰ−標識ｃ
ＤＮＡハイブリダイゼーションプローブを、各々のＲＮ
Ａから無作為プライミングによって調製した。

プラークハイブリダイゼーションスクリーニングを、基
本的に実施例４で述べたように実施した。

Ｓ、クローンを、　Ｓ、Ｓ、ｃＤＮＡおよびＳ、Ｓ、標
識ｃＤＮＡによる５３Ｓ１ｃＤＮＡライブラリーの分別
スクリーニングによって選択した。　Ｓ、Ｓ、ｃＯＮＡ
とは強く、そしてｓ６Ｓ、ＤＮＡとは弱くハイブリダイ
ズしたプラークを選択し、標識した５ｚｃＤＮＡクロー
ン（ＮＡ−２−１またはＮＡ−２−２）で再びスクリー
ニングした。５３Ｓ３ｃＤＮＡおよび５ＩＣＤＮＡクロ
ーンとハイブリダイズしたクローン用した。Ｓ、対立遺
伝子を持つ花柱からのＲＮＡと最も強くハイブリダイズ
し、Ｓ３対立遺伝子を持たない花柱からのＲＮＡとは弱
くしかハイブリダイズしなかったクローンを＋　５３ク
ローンとして選択した。

この操作によって選択した１つのＳ、クローンのＤＮＡ
配列を表４に示す。

このＳ、クローンはほぼ完全な長さでの配列決定のため
に選択したが、配列決定のためのｐＧＥＭベクターにサ
ブクローン化する間に、このクローンの５″末端の短い
ＥｃｏＲＩ断片が偶発的に欠失した。

５°から、指示されたＥｃｏＲＩまでの配列は、　ＲＮ
Ａ配列決定によって決定され、Ｎ末端アミノ酸配列はマ
イクロシーケンシング分析によって得られた。

５ｉｃＤＮＡクローンが同様の分別スクリーニング法を
用いて得られた。まず＋　５ａＳｉｃＤＮＡと強くハイ
ブリダイズし、　Ｓ、Ｓ、ｃＤＮＡとあまりハイブリダ
イズしなかったプラークを選択した。この方法で選択し
た１つのＳｈクローンのＤＮＡ配列を表５に示す。

このクローンはＳ、遺伝子をコードする配列全体を含ん
でいたが、５′方向のＡＴＧコドンまで伸びておらず、
従って、完全な長さではない、さらに。

この配列決定したＳ、クローンはポリ（Ａ）足部を有し
ていない。

ス崖拠■：　　　Ｓ　　　の　　および　　づしＮ、ａ
ｌａｔａｓｚｓｚ遺伝子型のゲノムＤＮＡを、基本的に
ＢｅｒｎａｔｚｋｙおよびＴａｎｋｓｌｅｙ　（１９８
６，前出）に記載されているように５葉から単離した。

５ｚｃＤＮＡクローンを放射標識し、　ＥｃｏＲＩで消
化したＳ、Ｓ、ＤＮＡのサザンプロットのハイブリダイ
ゼーシヨンプローブとして使用した。そのｓｇ遺伝子プ
ローブは約３．１　ｋｂの１つのＥｃｏＲ１断片とハイ
ブリダイズした。

この断片を分離し、　ｔｉｃ＋２ＲＩで消化したｇｔｌ
ｏをサイズ分画した（２．５　ｋｂ〜４．Ｏｋｂ）以遠
ＲＩ断片と連結した後に、　ｇｔｌＯにクローン化した
。３．Ｉ　Ｓｚ遺伝子断片を配列決定し、その配列を表
６に示す。この断片は、ヌクレオチド１６０３から２３
３８までにわたるオープンリーディングフレームを含み
、それは１つの９４塩基対イントロン（ヌクレオチド１
８３３〜１９２７）によって分断されている。この配列
は、２つのＳ、ｃＤＮＡクローンにおいて同定されてい
た。２つのポリアデニル化シグナル（Ｔ、およびｒｚ）
を含む。

従来のプライマー伸長の手法を用いて、転写開始起点を
ＡＴＧ開始コドンより１９塩基対上流の“Ｇ”塩基に位
置づけた。配列分析により、この遺伝子の５”側上流領
域に推定上の“ＴＡＴＡ”ボックス（ヌクレオチド１５
４９〜１５５９　）が同定された。

Ｓ　°ツムクローンの５１　　　コード　　の３．１　
ｋｂのＥｃｏＲＩＳｚ遺伝子断片のサブクローンをＨ４
ｎｃＩＩによって形成した。ヌクレオチド１２４９がら
５′側に伸びる約１．０　ｋｂの小断片（表６）を使用
して、　Ｈｉｎｄｌｌｌで消化したＮ、　　ａｌａｔａ
およびｋｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍからの全ＤＮＡのサザン
プロットを検索した。第６図Ａに示すように、このプロ
ーブは。

Ｎ、　　ａｌａｔａ　ＤＮＡ上に高度の反復パターンを
生じたが、　Ｌ、　　ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍＤＮＡでは
１つの主要ハント（約７５０塩基対）とのみハイブリダ
イズした。次に。

ＤＮＡ　　ｓｅ　　ｌ法（ＫａｌｏｄｎｅｒおよびＴｗ
ｅａｒｉ（１９７２）　Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　［ＩＳＡ　　６９
：１８３０〜１８３４）を用いて、　Ｎ、　　ａｌａｔ
ａおよびＬＬｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍからミトコンドリア
ＤＮＡを分離した。ミトコンドリアＤＮＡのサザンプロ
ットも、約１．０　ｋｂの核ＤＮＡ断片によってプロー
ブした（第６図Ａ）。比較すると、　１．０ｋｂ断片は
、Ｌ　阻ｌ罰およびＬエ　４匹１工胡士榎の両方のミト
コンドリアＤＮＡに相同な領域を含むことが明らかに示
されている。

Ｎ、　　ａｌ工堕のミトコンドリアＤＮＡをＨｉｎｄｌ
ｒｌで消化し、　Ｔ、ＤＮＡリガーゼを用いて細菌プラ
スミドベクターｐＧＥＭ　（Ｐｒｏｍｅｇａ　Ｂｉｏｔ
ｅｃ、　Ｍａｄｉｓｏｎ、　Ｗｉｓｃｏｎ−ｓｉｎ　）
に連結し、大腸菌ＪＭ１０９に形質転換した。

Ｓ２遺伝子の約１．Ｏｋｂ　　ＨｉｎｃｌＩ断片でコロ
ニーリフトをスクリーニングすることにより、７５ｏ塩
基対の相同断片を同定した。ミトコンドリアＤＮＡ断片
を分離して配列決定した。次に１分離した７５０塩基対
のミトコンドリアＤＮＡ断片を放射標識し、Ｌａ１ａｔ
ａおよびり、　　ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｓ＋の全ＤＮＡと
ミトコンドリアＤＮＡのサザンプロットのプローブとし
て使用した（第６図Ｂ）。ミトコンドリアＤＮＡ断片は
。

Ｌａ１ａｔａおよびり、　　ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｓ＋の
両方の全ＤＮＡ中の１断片とハイブリダイズした。第６
図ＢにおけるＮ、　　ａｌａｔａの全ＤＮＡとのパイプ
リダイゼーションの反復パターンは、明らかに、ミトコ
ンドリアＤＮＡ相同セグメントの外側のｌｋｂゲノムク
ローンの中の配列によるものである。

７５０塩基対断片を旧ｎｃＩＩで消化し、プロットして
１．０　ｋｂゲノム断片でプローブし、相同性を有する
部分の長さを推定した。相同配列は、３１５塩基対のＨ
ｉｎｄＩＩＩ／坦ｎｃｌｌ断片に生じることが認められ
、これをｐＧＨＭにクローン化して配列決定した（表７
）。ミトコンドリアおよび１．Ｏｋｂｓｚ遺伝子断片の
配列を並べると（表７）、極めて相同な５Ｇ塩基対セグ
メントが明らかになる。２つの付加的な短い、完全にマ
ツチする配列も、３°から５６塩基対セグメントまでに
見られる。ミトコンドリア配列と核配列では、マツチす
る配列の間隔が異なる。さらに、核配列は相同な５゛領
域に直接隣接する短い８塩基対の直接反復を含む。

７５０塩基対のミトコンドリアクローンでプローブした
Ｎ、　　ａｌａｔａ＋　Ｌ、　　ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ
およびり、　　Ｐ狙−ｎｅｌｌｉｉの全ＤＮＡのサザン
プロットをフィルムに長時間曝露すると（第７図Ａ）、
いくつかの他の断片がプローブとハイブリダイズするこ
とが認められる。これらの断片は核ＤＮＡであると考え
られる。

７５０塩基対プローブが核ＤＮＡとハイブリダイズする
ことの他の裏付けは、　Ｌ、　　ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ
とり、　　匣ｎ−ｎｅｌｌｉｉとの間での交雑のＦ２子
孫の分析から得られる。６つの子孫からの全ＤＮＡの試
料をＥｃｏＲＩで消化し、７５０塩基対断片でプローブ
した（第７図Ｂ）。Ｆ２子孫間で認められたハイブリダ
イゼーションパターンの相違は、子孫が同じ細胞質を有
していることから、おそらく核断片の分離によるもので
あると考えられる。

これらの実験において、サザンプロットを制限断片から
産生じ、０．９％アガロースゲルで分離して、　０．２
５Ｎ　ｌ１Ｃ１中で１２分間処理し、　０．４　Ｍ　Ｎ
ａＯＨ中でＺｅｌａｐｒｏｂｅナイロン膜（Ｂｉｏｒａ
ｄ、　Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、　Ｃａ１ｔ−ｆｏｒｎｉａ）
に移した。プローブは挿入物の無作為ブライミングによ
って作成された。フィルターを６８°Ｃで一晩ハイブリ
ダイズし、最終的に１　ｘｓｓｃ、　ｏ、１％ＳＤＳ、
　６８°Ｃという厳密さで洗浄を行った。

ここに記載された発明ならびに特定して記載された分離
および同定の方法に、特定して述べたこと以外の変化や
修正を加えうることは、当業者には容易に認識される。

本発明は、その本質および範囲内に含まれるそのような
すべての変化および修正を包含することが理解されるべ
きである。

（ｙ人工余白） コく Ｌト　　　コリ ５ヨ 表４（々／）２− ＡＴＴ　　ＣＴＡ　　ＴＴＡ　　ＴＧＡ　　ＡＡＧ　　
ＣＣＡ　　ＡＣＡ　　ＴＴＧ　　ＴＧＧ　　ＡＡＣＣＡ
Ｔ　　ＡＴＡ　　ＴＡＡ　　ＴＴＴ　　ＣＣ八へ０４ ＴＡＴ　　ＡＭ　　ＴＴＴ　　ＡＴＧ　　八人Ａ　　−
−Ｔ　　ＡＴＴ　　ＡＴＴ　　ＧＡＡ　　ＣＴＧ　　Ａ
ＣＡ　　ＣＴＴ　　ＡＴＴ　ＴＴＧ　　ＴＧＴＧＡＡ　
ＡＡＡ　ＡＡＡ　　ＡＡＡ　　ＡＡＡ　ＡＡＡ　八人Ａ
　λ入入　　ＡＡＡ　　ＡＡＡ　八人Ａ　　ＡＡＡ　　
ＡＡＡ　　ＡＡＡ　　ＡＡＡ表５（今の２） ＴＴＣＴＴＧＧＴＴＴＡＧＧＣＴＡＣＧＴＡＡＡＣＣＡ
ＡＡＡＴＣＣＡＡＡＣＣＡＣＡＣＧＡＡＴ入ＡＴＣ入Ａ
ＧＡＡＡＡＴＣＡ入Ａ表８ アミノ酸の番３乙５ｆ）。

八−八１ａ−アラニ／ Ｆ婁Ｐｈｅ−″に≦ルアラニ７ Ｇ謂Ｇｌｙ冨クツ２ン Ｈ！　）ｌｉｓ　−レスナ′−／／ Ｉ−工１ｅ“　イ／ごイ／／ Ｋ　−Ｌｙｓ　−ソジ／ Ｌ　＝　Ｌｅｕ　−ロイン／ Ｍ　−Ｍｅｔ　−メカ￥−／／ Ｒ−人ｒ９−７レキ≦ン Ｓ纏５ｅｒ−じソン Ｔ　−Ｔｈｒ　＝メｌ／／ｆ：Ｓン Ｖ寓Ｖａｌ麿バソ／ Ｗ　−Ｉ　Ｔｒｙ　＝　／−ンプＦ７！／ｙ　−Ｔｙｒ
　−＋７−ｒ：ｊシ／ （発明の要約） 配偶体自己不和合性植物においてＳタンパクをコードし
、かつ自己不和合性反応を制御する。Ｓ遺伝子のＤＮＡ
配列が同定されている。

特に、　Ｎ、　　ａｌａｔａの数種類のＳタンパクをコ
ードするＤＮＡ配列と、これらに付随するシグナル配列
とが与えられている。さらに、自己不和合性植物の生殖
組織においてＳ遺伝子を発現する調節配列が同定されて
いる。これらＳ遺伝子のｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡを
コードする配列を同定し、かつ単離する方法について述
べられている。

４、゛　の“　なヲ゛日 第１図は２選択２次元ゲル電気泳動法による。

Ｎ、　　ａｌａｔａの遺伝子型Ｓｔ　Ｓｚ、ｓ２ｓ、、
およびＳｓ　５３の花柱抽出物の分離結果を示す図であ
る。２つの対立遺伝子に関連するタンパクハンドが同定
されている。

第２図は、　Ｎ、　　ａｌａｔａの化学的に脱グリコジ
ル化された分子量が２６ｋｄの成熟Ｓ２糖タンパク（＾
）と、花柱ポリ（Ａ”）　ＲＮＡのインビトロ翻訳産物
（Ｂ）との、　ＳＯＳゲル電気泳動法による比較を示す
図である。成熟花柱ポリ（Ａ”）　ＲＮＡからの翻訳産
物にのみ分子量２７ｋｄのタンパクが存在することが分
かる。この分子量２７ｋｄの翻訳産物は、化学的に脱グ
リコジル化された成熟Ｓｚタンパクよりわずかに大きく
、２７ｋａタンパク中にシグナル配列が存在することと
矛盾しない。

第３図は、子房、花柱などのＮ、　ａｌａｔａ　　（Ｓ
！Ｓ３）組織由来のタンパク抽出物のＳＯＳポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動法による比較を示す図である。

クーマシーブルーによる染色で可視化されたタンパクの
バンドで示されているように、子房や花柱の抽出物の方
が、他の器官や花柱の抽出物よりも一層類似している。

第４図は９合成オリゴヌクレオチド１４ｍｅｒをプライ
マーとして用いることにより、成熟花柱ポリ（Ａ”）　
ＲＮＡからｔｏｏｂｐのｃＤＮＡが調製されることを示
す図である。あるバッチが、−本積の１００　ｂｐ断片
の合成をプライムした（トラック１．２．および３）。

トラック４，５．および６は、プールされた合成プライ
マーを用いた場合に、　１００　ｂｐ断片だけが、成熟
花柱ポリ（Ａ”）　ＲＮＡによって産生されることを示
している。痕跡量の１００ｂｐ断片が。

子房や未成熟の蕾花柱（ｇｒｅｅｎ　ｂｕｄ　５ｔｙｌ
ｅ　）のポリ　（Ａ”）　ＲＮＡから検出されている。

第５図は、　Ｎ、　　ａｌａｔａのインビトロ型Ｓ、Ｓ
３゜３１　Ｓ３．　Ｓ２　Ｓ２．およびＳ、Ｓ、、エル
・ベルビアヌムの遺伝子型Ｓ、Ｓ、、およびビー・オレ
ラシェ由来の混合遺伝子型にそれぞれ由来する成熟花柱
ポリ（Ａ”）　ＲＮＡのノーザンプロット分析の結果を
示す図である。Ｎ、　　ａｌａｔａ　Ｓｚ　Ｓ３の未熟
蕾花柱と子房とに由来するポリ（Ａ’）　ＲＮＡも含ま
れている。全トラックが、以下に説明する聞よａｌａｔ
ａ　Ｓ、タンパクをコードするＮ＾−２−１クローンｃ
ＤＮＡ挿入物由来の３２ｐ標識のプローブを用いて調べ
られている。

第６図は、　ＨｉｎｄｌＩＩで消化された。　Ｎ、　　
ａｌａｔａ　　（Ｎ、　ａ、　）と、エル・エスクレン
ツム（Ｌ、　ｅｓｃｕｌｅｎｔ、ｕｍ）（Ｌ、ｅ、　）
との全ＤＮＡおよびミトコンドリアＤＮＡ　　（ｍｔ　
ＤＮＡ）のサザンハイプリダイゼーションブロットのオ
ートラジオダラムを示す図である。ハイブリダイゼーシ
ョンプローブは、　　（Ａ）　１．０　ｋｂのゲノムＳ
２遺伝子断片、またはＣＢ）　Ｎ、　　ａｌａｔａ由来
の７５０ｂｐミトコンドリアクローンであった。全ＤＮ
Ａの試料は５μｇ含有し、　ｍｔＤＮＡの試料は約２０
０　ｎｇ金含有ている。パネルへのレーン５には、エル
・エスクレンツムｍｔＤＮＡの不消化試料が入っている
。

分子量はｋｂで示しである。

第７図は、　７５０ｂｐのミトコンドリアクローンでプ
ローブされた全ＤＮへのサザンハイプリダイゼーション
プロットのオートラジオダラムを示す図である。パネル
Ａは、　Ｎ、　　ａｌａｔａ　　（Ｎ、ａ、　）　、エ
ル・エスクレンツム（Ｌ、　ｅ、　）　、およびエル、
ペネリー（Ｌ、　　凹匣１旦辷）　　（Ｌ、　ｐ、　）
、の全ＤＮへを含むプロットの長時間露出オートラジオ
グラムである。Ｈｉｎｄｌ［Ｉで消化された合計５μｇ
のＤＮＡを各レーンに使用した。このプロットの強くハ
イブリダイズしている７５０ｂ９のバンドのシグナルが
変動するのは、全ＤＮＡ試料が様々な量のＤＮＡで汚染
されているためである。分子量マーカーが示されている
。パネルＢは、エル・エスクルンッムとエル・ペネリー
との交雑種由来における６つのＦ２後代に由来する全Ｄ
ＮＡ　　（ＥｃｏＲＩで消化された５μｇの試料）を含
むプロットである。矢印は分離断片を示す。

以上

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、配偶体自己不和合性植物のＳ遺伝子のｃＤＮＡクロ
   ーンを単離して同定する方法であって、該方法は、以下
   の工程を包含する： ａ）既知のＳ遺伝子型を有する該配偶体自己不和合性植
   物の成熟花柱からｃＤＮＡクローンライブラリーを調製
   する工程であって、既知のＳ遺伝子型を有する該植物が
   該Ｓ遺伝子を発現する、工程； ｂ）該Ｓ遺伝子を発現するＳ遺伝子型の配偶体自己不和
   合性植物の成熟花柱ＲＮＡから調製されたｃＤＮＡを包
   含する第１のハイブリダイゼーションプローブと、該ｃ
   ＤＮＡライブラリーの調製に使用したＳ遺伝子型の植物
   とは異なる、該Ｓ遺伝子を発現しないＳ遺伝子型の配偶
   体自己不和合性植物の成熟花柱ＲＮＡから調製されたｃ
   ＤＮＡを包含する第２のハイブリダイゼーションプロー
   ブとを用いて、該ｃＤＮＡクローンライブラリーを分別
   的にスクリーニングする工程： ｃ）該第２のハイブリダイゼーションプローブとよりも
   、該第１のハイブリダイゼーションプローブと、より強
   くハイブリダイズするクローンを該ｃＤＮＡライブラリ
   ーから選択する工程； ｄ）該工程ｃ）において選択された該クローンを、異な
   るＳ遺伝子型を有する該自己不和合性植物由来の少なく
   とも２つの花柱ＲＮＡ調製物とのハイブリダイゼーショ
   ンについて、再度スクリーニングする工程であって、該
   花柱ＲＮＡ調製物の少なくとも１つが、該Ｓ遺伝子を発
   現するＳ遺伝子型由来であり、かつ該花柱ＲＮＡ調製物
   の少なくとも１つが、該Ｓ遺伝子を発現しないＳ遺伝子
   型由来である、工程；そして ｅ）該Ｓ遺伝子を発現しないＳ遺伝子型由来の花柱ＲＮ
   Ａ調製物とよりも、該Ｓ遺伝子を発現するＳ遺伝子型由
   来の花柱ＲＮＡ調製物と、より強くハイブリダイズする
   クローンを選択して単離し、それにより該配偶体自己不
   和合性植物の該Ｓ遺伝子のｃＤＮＡクローンを同定して
   単離する工程。 ２、前記配偶体自己不和合性植物が、￥Ｎｉｃｏｔｉａ
   ｎａ￥属に属する、請求項１に記載の方法。 ３、前記配偶体自己不和合性植物が、￥Ｎｉｃｏｔｉａ
   ｎａａｌａｔａ￥である、請求項２に記載の方法。 ４、前記ｃＤＮＡライブラリーと、前記第１および第２
   のｃＤＮＡハイブリダイゼーションプローブとを調製す
   るために使用されるＳ遺伝子型が同型接合のＳ遺伝子型
   である、請求項１に記載の方法。