JPH02799A - 遺伝子工学的手法による抗体の製造法 - Google Patents
遺伝子工学的手法による抗体の製造法Info
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- JPH02799A JPH02799A JP63335695A JP33569588A JPH02799A JP H02799 A JPH02799 A JP H02799A JP 63335695 A JP63335695 A JP 63335695A JP 33569588 A JP33569588 A JP 33569588A JP H02799 A JPH02799 A JP H02799A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
酵母における抗体の発現については記述があるが（Ｃ，
Ｒ，Ｗｏｏｄ、 Ｍ、 Ａ、 Ｂｏｓｓ、 Ｊ、 Ｉ１
、 Ｋｅｎｔｅｎ、 Ｊ。
Ｒ，Ｗｏｏｄ、 Ｍ、 Ａ、 Ｂｏｓｓ、 Ｊ、 Ｉ１
、 Ｋｅｎｔｅｎ、 Ｊ。
Ｅ、 Ｃａ１ｖｅｒｔ、 Ｎ、 Ａ、 Ｒｏｂｅｒｔｓ
およびＪ、 Ｓ。
およびＪ、 Ｓ。
Ｅｍｔａｇｅ： Ｎａｔｕｒｅ ３１４．４４６ （１
９８５））、発現されたタンパク質のうちのごく一部が
機能することが証明されているにすぎない。大腸菌（［
：、 ｃｏｌｉ）においては、今までのところ、抗体タ
ンパク質は変性したかたちでしか得ることができていな
い（Ｍ、 Ａ。
９８５））、発現されたタンパク質のうちのごく一部が
機能することが証明されているにすぎない。大腸菌（［
：、 ｃｏｌｉ）においては、今までのところ、抗体タ
ンパク質は変性したかたちでしか得ることができていな
い（Ｍ、 Ａ。
Ｂｏｓｓ、 Ｊ、 Ｈ，にｅｎｔｅｎ、 Ｃ，Ｒ，Ｗｏ
ｏｄおよびＪ、 Ｓ。
ｏｄおよびＪ、 Ｓ。
Ｅｍｔａｇｅ： Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ
、 １２．３７９１ （１９８４）、Ｓ、 Ｃａｂｉｌ
ｌｙ、 Ａ、 Ｄ、 Ｒｉｎｇｓ、 Ｈ，Ｐａｎｄｅ、
Ｊ、 Ｅ。
、 １２．３７９１ （１９８４）、Ｓ、 Ｃａｂｉｌ
ｌｙ、 Ａ、 Ｄ、 Ｒｉｎｇｓ、 Ｈ，Ｐａｎｄｅ、
Ｊ、 Ｅ。
５ｈｉｖｅｌｙ、 ＩＪ、 Ｅ、 Ｈｏｌｍｅｓ、 Ｍ
、 Ｒｅｙ、 Ｌ、 Ｊ、 Ｐｅｒｒｙ。
、 Ｒｅｙ、 Ｌ、 Ｊ、 Ｐｅｒｒｙ。
Ｒ，Ｗｅｔｚｅｌ およびＨ，Ｌ、 Ｈｅｙｎｅｋｅ
ｒ： Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ。
ｒ： Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ。
Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 ｕ、ｓ、Ａ、 ８１．３２７３
（１９８４））。酵母または池の微生物からの活性抗
体または抗体断片の精製については、開示されていなか
った。今日までに、タンパク質の折りたたみについての
試みによって、正しく折りたたまれた組換え抗体タンパ
ク質のごく僅かが得られたにすぎない。さらに、所望の
機能性タンパク質を不要の非機能性タンパク質から分離
することは難しい。これは、結合定数、折りたたみ率、
スペクトル的性質などの正確な測定、および治療や産業
における使用を妨げる。とくに、再折りたたみのための
確実な工程および測定方法がないことから、折りたたみ
条件を最適にすることはしたがってきわめて難しい。
（１９８４））。酵母または池の微生物からの活性抗
体または抗体断片の精製については、開示されていなか
った。今日までに、タンパク質の折りたたみについての
試みによって、正しく折りたたまれた組換え抗体タンパ
ク質のごく僅かが得られたにすぎない。さらに、所望の
機能性タンパク質を不要の非機能性タンパク質から分離
することは難しい。これは、結合定数、折りたたみ率、
スペクトル的性質などの正確な測定、および治療や産業
における使用を妨げる。とくに、再折りたたみのための
確実な工程および測定方法がないことから、折りたたみ
条件を最適にすることはしたがってきわめて難しい。
完全な機能性抗体または抗体の機能性結合領域をｍ菌の
発現系において発現させることは、今日までに開示され
ておらず、その実施の見通しについての評価は悲観的で
ある（Ｓ、 Ｌ、 Ｍｏｒｒｉｓｏｎ：５ｃｉｅｎｃｅ
２２９．１２０２ （１９８５）、Ｍ、 Ａ、 Ｂｏ
ｓｓおよびＣ，Ｒ，Ｗｏｏｄ、 １ｍｍｕｎｏ１． Ｔ
ｏｄａｙ ６．１２ （１９８５））。
発現系において発現させることは、今日までに開示され
ておらず、その実施の見通しについての評価は悲観的で
ある（Ｓ、 Ｌ、 Ｍｏｒｒｉｓｏｎ：５ｃｉｅｎｃｅ
２２９．１２０２ （１９８５）、Ｍ、 Ａ、 Ｂｏ
ｓｓおよびＣ，Ｒ，Ｗｏｏｄ、 １ｍｍｕｎｏ１． Ｔ
ｏｄａｙ ６．１２ （１９８５））。
遺伝子工学的工程が、とくに大腸菌において、完全に確
立されていることから、そのような系は非常に望ましい
。迅速な増殖によって大量生産が促進され、これは、経
済面からきわめて重要なことである。
立されていることから、そのような系は非常に望ましい
。迅速な増殖によって大量生産が促進され、これは、経
済面からきわめて重要なことである。
ゆえに、本発明は、機能性抗体、それらの機能性フラグ
メントまたは抗体領域と他のタンパク質とからなる融合
タンパク質を、細筒中、好ましくはグラム陰性細箇、と
くに大腸菌、中で製造することに間する。本発明による
製造法は、抗体分子またはフラグメントの個々の鎖をコ
ードする遺伝子と、細胞膜を通してポリペプチド鎖を輸
送し、かつ切り離し可能なシグナル配列とをそれぞれ連
結させること、遺伝子構造物を発現させること、および
ペリプラズム空間（ｐｅｒｉｐｌａｓｍｉｃ ５ｐａｃ
ｅ）またはメジウム（ｍｅｄｉｕｍ）から機能性タンパ
ク質を単離することからなる。本発明の好ましい態様は
、以下に詳記され、特許請求の範囲に定義される通りで
ある。
メントまたは抗体領域と他のタンパク質とからなる融合
タンパク質を、細筒中、好ましくはグラム陰性細箇、と
くに大腸菌、中で製造することに間する。本発明による
製造法は、抗体分子またはフラグメントの個々の鎖をコ
ードする遺伝子と、細胞膜を通してポリペプチド鎖を輸
送し、かつ切り離し可能なシグナル配列とをそれぞれ連
結させること、遺伝子構造物を発現させること、および
ペリプラズム空間（ｐｅｒｉｐｌａｓｍｉｃ ５ｐａｃ
ｅ）またはメジウム（ｍｅｄｉｕｍ）から機能性タンパ
ク質を単離することからなる。本発明の好ましい態様は
、以下に詳記され、特許請求の範囲に定義される通りで
ある。
シグナル配列を備えた個々の鎖のための遺伝子の連結は
、好ましくは、共通の調節領域によって同時発現をもた
らす可調節オペロン系のかたちで起きる。このようにし
て、個々のタンパク質鎖はほぼ化学量論的比率で一緒に
発現されて、ペリプラズム空間内に輸送され、ここで結
合されて機能性分子の形成がなされる。タンパク質を、
公知の方法、例えは欧州特許明細書第０．００６．６９
４号に記載の方法などによって、細胞質から取り出す。
、好ましくは、共通の調節領域によって同時発現をもた
らす可調節オペロン系のかたちで起きる。このようにし
て、個々のタンパク質鎖はほぼ化学量論的比率で一緒に
発現されて、ペリプラズム空間内に輸送され、ここで結
合されて機能性分子の形成がなされる。タンパク質を、
公知の方法、例えは欧州特許明細書第０．００６．６９
４号に記載の方法などによって、細胞質から取り出す。
適当な調節領域としては、適当な調節可能な遺伝子調節
領域、例えば、Ｉａｃ、ｔａｃ、ｔｒｐまたは合成配列
物（５ｅｑｕｅｎｃｅｓ）などのいかなるものでもよい
。特に好ましいものは確実に止めることができる調節領
域である。
領域、例えば、Ｉａｃ、ｔａｃ、ｔｒｐまたは合成配列
物（５ｅｑｕｅｎｃｅｓ）などのいかなるものでもよい
。特に好ましいものは確実に止めることができる調節領
域である。
集めた細胞に軽い浸透圧ショックを与えて、これによっ
て得られた液相を限外濾過または硫安などの塩による沈
澱によってｖＩＡｙａすることによって、タンパク質を
ペリプラズム空間から好ましくは単離する。
て得られた液相を限外濾過または硫安などの塩による沈
澱によってｖＩＡｙａすることによって、タンパク質を
ペリプラズム空間から好ましくは単離する。
「軽い」浸透圧ショックによって、細胞膜はそのままで
ペリプラズム（ｐｅ口ρＩａｓｍ）からの溢出が生じる
。
ペリプラズム（ｐｅ口ρＩａｓｍ）からの溢出が生じる
。
タンパク質濃縮物を、便宜的に透析した後、適当な抗原
またはハプテンを装填した吸着剤、有利にはアフィニテ
ｆ−カラムにしたもの、に供する。
またはハプテンを装填した吸着剤、有利にはアフィニテ
ｆ−カラムにしたもの、に供する。
次いで、抗体または機能性抗体フラグメントを、適当な
溶出によって、有利には抗原またはハプテンとともに、
得る。
溶出によって、有利には抗原またはハプテンとともに、
得る。
真核細胞においては、抗体は、小胞体の内腔において、
おそらくはジスルフィドイソメラーゼ、プロリンシス−
トランス−イソメラーゼおよび可能な他の酵素またはタ
ンパク質との共同作用によって、形成される。細菌細胞
もまた、二つの鎖をほぼ同じ化学量論的な量でつくり、
二つの前駆タンパク質をペリプラズム空間またはそれを
囲むメジウムに輸送し、シグナル配列を正しく除去し、
球状および可溶性領域を正しく折りたたみ、分子間のジ
スルフィド結合を形成し、さらに二つの鎖を合わせてヘ
テロダイマー（ｈｅｔｅｒｏｄ ｉｍｅｒ）をつくると
いう能力を有することは、驚きであった。というのは、
＊ｉ細胞がこのような性質を有するまたは同じ効果をも
たらす酵素を具１省していることは有り得ないとみなさ
れるからである。このように、グラム陰性細菌の場合に
は、細菌ペリプラズムはこの点で機能的には真核細胞小
胞体の内腔と同等であることが驚いたことに明らかにな
った。
おそらくはジスルフィドイソメラーゼ、プロリンシス−
トランス−イソメラーゼおよび可能な他の酵素またはタ
ンパク質との共同作用によって、形成される。細菌細胞
もまた、二つの鎖をほぼ同じ化学量論的な量でつくり、
二つの前駆タンパク質をペリプラズム空間またはそれを
囲むメジウムに輸送し、シグナル配列を正しく除去し、
球状および可溶性領域を正しく折りたたみ、分子間のジ
スルフィド結合を形成し、さらに二つの鎖を合わせてヘ
テロダイマー（ｈｅｔｅｒｏｄ ｉｍｅｒ）をつくると
いう能力を有することは、驚きであった。というのは、
＊ｉ細胞がこのような性質を有するまたは同じ効果をも
たらす酵素を具１省していることは有り得ないとみなさ
れるからである。このように、グラム陰性細菌の場合に
は、細菌ペリプラズムはこの点で機能的には真核細胞小
胞体の内腔と同等であることが驚いたことに明らかにな
った。
本発明による方法は、次のような多くの利点を有する。
既述したように簡単で低コストの大規模の細菌発酵が可
能であるということの他に、機能性タンパク質の直接形
成がある。これは、融合タンパク質の切断、それに続く
目的タンパク質またはタンパク質フラグメントの単離、
その酸化またはインビトロ両折りたたみの諸工程が避け
られることを意味する。
能であるということの他に、機能性タンパク質の直接形
成がある。これは、融合タンパク質の切断、それに続く
目的タンパク質またはタンパク質フラグメントの単離、
その酸化またはインビトロ両折りたたみの諸工程が避け
られることを意味する。
また、本発明の方法によると、細胞性プロテアーゼに間
する問題も見出されなかった。つまり、通常は細菌細胞
中では、これら細胞性プロテアーゼのためにタンパク質
は融合タンパク質のかたちで、とくに不溶性の封入体（
１ｎｃｌｕｓｉｏｎ ｂｏｄｙ）として発現され、その
ために上記の複雑な諸工程が必要となることが知られて
いる。これに対して、本発明の製造法によると、均質物
の＠離および精製は迅速で簡単である。
する問題も見出されなかった。つまり、通常は細菌細胞
中では、これら細胞性プロテアーゼのためにタンパク質
は融合タンパク質のかたちで、とくに不溶性の封入体（
１ｎｃｌｕｓｉｏｎ ｂｏｄｙ）として発現され、その
ために上記の複雑な諸工程が必要となることが知られて
いる。これに対して、本発明の製造法によると、均質物
の＠離および精製は迅速で簡単である。
このように、本発明によると、抗体、それらの機能性フ
ラグメントならびに挿入、除去および／またはアミノ酸
の交換によって天然型抗体とは異なる修飾抗体、の調製
が容易である。したがって、例えは、不都合な折りたた
みを抑制するために、システィンの除去または他のアミ
ノ酸による置換などを行うことができる。全く同様にし
て、ネズミの抗体をヒトの抗体に変換したり、他の突然
変異を導入することも可能である。このように、可能な
薬理学的および産業的応用の他に、抗体の構造や機能の
研究および酵素的触媒の原理の研究が容易になる（Ｖ、
Ｒａ５ｏおよびＢ、 Ｄ、 ５ｔｏｌｌａｒ：Ｂｉｏ
ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １４．５８４ （１９７５）、Ｖ
、 Ｒａ５ｏおよびＢ、 Ｄ、 ５ｔｏｌｌａｒ： Ｂ
ｉｏｃｂｅｍｉｓｔｒｙ １４．５９１ （１９７５）
、Ａ、 Ｔｒａｍｏｎｔａｎｏ、に、 Ｄ、 Ｊａｎｄ
ａおよびＲ，Ａ。
ラグメントならびに挿入、除去および／またはアミノ酸
の交換によって天然型抗体とは異なる修飾抗体、の調製
が容易である。したがって、例えは、不都合な折りたた
みを抑制するために、システィンの除去または他のアミ
ノ酸による置換などを行うことができる。全く同様にし
て、ネズミの抗体をヒトの抗体に変換したり、他の突然
変異を導入することも可能である。このように、可能な
薬理学的および産業的応用の他に、抗体の構造や機能の
研究および酵素的触媒の原理の研究が容易になる（Ｖ、
Ｒａ５ｏおよびＢ、 Ｄ、 ５ｔｏｌｌａｒ：Ｂｉｏ
ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １４．５８４ （１９７５）、Ｖ
、 Ｒａ５ｏおよびＢ、 Ｄ、 ５ｔｏｌｌａｒ： Ｂ
ｉｏｃｂｅｍｉｓｔｒｙ １４．５９１ （１９７５）
、Ａ、 Ｔｒａｍｏｎｔａｎｏ、に、 Ｄ、 Ｊａｎｄ
ａおよびＲ，Ａ。
Ｌｅｒｎｅｒ： ５ｃｉｅｎｃｅ ２３４、＋５６６
（１９８６）、Ｓ、 Ｊ。
（１９８６）、Ｓ、 Ｊ。
Ｐｏ１ｌａｃｋ、 Ｊ、 Ｗ、 ＪａｃｏｂｓおよびＰ
、 Ｇ、 ５ｃｈｕｌｔｚ：５ｃｉｅｎｃｅ ２３４．
１５７０ （１９８６）、Ｊ、 Ｊａｃｏｂｓ、 Ｐ、
Ｇ。
、 Ｇ、 ５ｃｈｕｌｔｚ：５ｃｉｅｎｃｅ ２３４．
１５７０ （１９８６）、Ｊ、 Ｊａｃｏｂｓ、 Ｐ、
Ｇ。
５ｃｈｕｌｔｓ、 Ｒ，ＳｕｇａｓａｗａｒａおよびＭ
、 Ｐｏｗｅｌｌ： Ｊ。
、 Ｐｏｗｅｌｌ： Ｊ。
Ａｍ、 Ｃｈｅｍ、 Ｓｏｃ、 ＋０９．２１？４ （
１９８７））。
１９８７））。
さらに、本発明は、試験系（分析）の適用を機能性抗体
を形成した細菌細胞に対して直接的に行うことができ、
その結果、ｏＪ能な突然変異抗体の迅速な研究を可能に
する。
を形成した細菌細胞に対して直接的に行うことができ、
その結果、ｏＪ能な突然変異抗体の迅速な研究を可能に
する。
さらに、個々の、または二、三個の、アミノ酸の代替よ
る抗体分子の上記の変換の他に、他の遺伝子領域を抗体
遺伝子に挿入すること、または重要でない遺伝子領域を
部分的に交換することも可能である。この方法でマーカ
ー酵素（Ｍ、 Ｓ。
る抗体分子の上記の変換の他に、他の遺伝子領域を抗体
遺伝子に挿入すること、または重要でない遺伝子領域を
部分的に交換することも可能である。この方法でマーカ
ー酵素（Ｍ、 Ｓ。
Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ、Ｇ、 Ｔ、 Ｗｉｌｌｉａｍｓお
よびＲ０帆Ｆｏｘ ：Ｎａｔｕｒｅ ３１２．６０４
（１９８４））、トキシン（Ｇ。
よびＲ０帆Ｆｏｘ ：Ｎａｔｕｒｅ ３１２．６０４
（１９８４））、トキシン（Ｇ。
Ｍｏｅｌｌｅｒ （編集）： ｒＡｎｔｉｂｏｄｙ
ｃａｒｒｉｅｒｓ ｏｆ ｄｒｕｇｓａｎｄ
ｔｏｘｉｎｓ ｉｎ ｔｕｍｏｒ ｔｈｅｒａｐｙＪ
、Ｉｍｍｕｎｏｌ。
ｃａｒｒｉｅｒｓ ｏｆ ｄｒｕｇｓａｎｄ
ｔｏｘｉｎｓ ｉｎ ｔｕｍｏｒ ｔｈｅｒａｐｙＪ
、Ｉｍｍｕｎｏｌ。
Ｒｅｖ、 ６２、Ｍｕｎｋｓｇａａｒｄ、 Ｃｏｐｅｎ
ｈａｇｅｎ （１９８２））または他のクラスの免疫グ
ロブリン領域（Ｍ、 Ｓ。
ｈａｇｅｎ （１９８２））または他のクラスの免疫グ
ロブリン領域（Ｍ、 Ｓ。
Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ、Ｇ、 Ｔ、 Ｗｉｌｌｉａｍｓ、
Ｅ、 Ｂ＋Ｍｉｔｃｈｅｌ１、Ｓ、 Ｓ、 Ｊｏｕｈ
ａ１、ｊ、 Ｇ、 ＦＩａｎａ３ａｎおよびＴ、 Ｈ。
Ｅ、 Ｂ＋Ｍｉｔｃｈｅｌ１、Ｓ、 Ｓ、 Ｊｏｕｈ
ａ１、ｊ、 Ｇ、 ＦＩａｎａ３ａｎおよびＴ、 Ｈ。
Ｒａｂｂｉｔｔｓ： Ｎａｔｕｒｅ ３１４．２６８
（１９８５））または池の種の免疫グロブリン領域（Ｐ
、 Ｔ、 Ｊｏｎｅｓ、 Ｐ、 Ｈ。
（１９８５））または池の種の免疫グロブリン領域（Ｐ
、 Ｔ、 Ｊｏｎｅｓ、 Ｐ、 Ｈ。
Ｄｅａｒ、 Ｊ、 Ｆｏｏｔｅ、 Ｍ、 Ｓ、 Ｎｅｕ
ｂｅｒｇｅｒおよびＧ。
ｂｅｒｇｅｒおよびＧ。
Ｗｉｎｔｅｒ： Ｎａｔｕｒｅ ３２１．５２２ （１
９８６））を抗体分子に連結させることが可能である。
９８６））を抗体分子に連結させることが可能である。
本発明による製造法は、フォスフォリルコリン結合性抗
体骨髄腫タンパク質Ｍ ｃ Ｐ Ｃ６０３の可変領域を
例にとって以下に説明する通りである。
体骨髄腫タンパク質Ｍ ｃ Ｐ Ｃ６０３の可変領域を
例にとって以下に説明する通りである。
このマウス免疫グロブリンへの三次構造は公知である（
Ｄ、 Ｍ、 Ｓｅｇａ１、Ｅ、 Ａ、 Ｐａｄｌａｎ、
Ｇ、 Ｈ。
Ｄ、 Ｍ、 Ｓｅｇａ１、Ｅ、 Ａ、 Ｐａｄｌａｎ、
Ｇ、 Ｈ。
Ｃｏｈｅｎ、 Ｓ、 Ｒｕｄｉｋｏｆｆ、 Ｍ、 Ｐｏ
ｔｔｅｒおよびり、 Ｒ。
ｔｔｅｒおよびり、 Ｒ。
Ｄａｖｉｅｓ： Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔ１、 Ａｃａｄ、
Ｓｃｉ、 ７Ｌ ４２９Ｂ（１９７４））。可変軽鎖
■Ｌおよび可変重鎖■Ｈの合成遺伝子を用いた。このよ
うな合成遺伝子は独国特許公開第３，７１５，０３３号
明細書および公開された欧州特許出願第０．２９０，０
０５号明細書および公開されたオーストラリア特許出願
第１５６３１／８８号明細書（その表１および２）に提
示されている。そのような合成遺伝子のうちのとくに適
切な遺伝子を表１に例示する。これには、完全な発現プ
ラスミドのＤＮＡ配列が示されており、二つの鎖のため
の遺伝子がアミノ酸を示すことによって強調して表わさ
れている。これらのＤＮＡ配列の構築においては、大腸
菌によつ゛Ｃ利用されるだけのコードンを除いた。さら
に、それぞれ唯一の制限酵素切断部位を取り入れ、ざら
にＲＮＡの二次構造を考慮した。
Ｓｃｉ、 ７Ｌ ４２９Ｂ（１９７４））。可変軽鎖
■Ｌおよび可変重鎖■Ｈの合成遺伝子を用いた。このよ
うな合成遺伝子は独国特許公開第３，７１５，０３３号
明細書および公開された欧州特許出願第０．２９０，０
０５号明細書および公開されたオーストラリア特許出願
第１５６３１／８８号明細書（その表１および２）に提
示されている。そのような合成遺伝子のうちのとくに適
切な遺伝子を表１に例示する。これには、完全な発現プ
ラスミドのＤＮＡ配列が示されており、二つの鎖のため
の遺伝子がアミノ酸を示すことによって強調して表わさ
れている。これらのＤＮＡ配列の構築においては、大腸
菌によつ゛Ｃ利用されるだけのコードンを除いた。さら
に、それぞれ唯一の制限酵素切断部位を取り入れ、ざら
にＲＮＡの二次構造を考慮した。
モデルとした機能性抗体フラグメントにおいて、それぞ
れの領域は分子内ジスルフィドブリッジ（ＶＬ内のＣｙ
ｓ２３からＣｙｓ９４までおよびＶ、内のＣｙｓ２２か
らＣｙｓ９Ｂまで）を有する。
れの領域は分子内ジスルフィドブリッジ（ＶＬ内のＣｙ
ｓ２３からＣｙｓ９４までおよびＶ、内のＣｙｓ２２か
らＣｙｓ９Ｂまで）を有する。
鎖の間にはジスルフィドブリッジはなく、また遊離のシ
スティンも存在しない。
スティンも存在しない。
用いた発現ベクター ｐ Ａ Ｓ Ｋ ２２、は模式的
に次に示す通りである。
に次に示す通りである。
この中で、ＶしおよびｖＨ領領域合成遺伝子は、一方を
外膜タンパク質Ａ（ｏｔｎｐＡ）の細菌シグナル配列の
遺伝子断片に、他方を同じ断片のアルカリホスファター
ゼ（ｐｈｏＡ）に連結されている。二つの前駆タンパク
質の遺伝子は、ｌａｃプロモーターの下流の合成オペロ
ン様構造内に位置している。これによって、両遺伝子の
同時誘導、同時発現および同時分泌が確実になる。
外膜タンパク質Ａ（ｏｔｎｐＡ）の細菌シグナル配列の
遺伝子断片に、他方を同じ断片のアルカリホスファター
ゼ（ｐｈｏＡ）に連結されている。二つの前駆タンパク
質の遺伝子は、ｌａｃプロモーターの下流の合成オペロ
ン様構造内に位置している。これによって、両遺伝子の
同時誘導、同時発現および同時分泌が確実になる。
遺伝子発現の誘導の後、細胞を集めて軽い浸透圧ショッ
クを与える。このようにして得られたペリプラズムタン
パク質を含む液相を限外濾過で濃縮して、透析して、ア
フィニティージーガンドとしてフォスフォリルコリン誘
導体（Ｂ、 （１１ｅｓｅｂｒ。
クを与える。このようにして得られたペリプラズムタン
パク質を含む液相を限外濾過で濃縮して、透析して、ア
フィニティージーガンドとしてフォスフォリルコリン誘
導体（Ｂ、 （１１ｅｓｅｂｒ。
およびＨ，Ｍｅｔｚｇｅｒ： Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ
ｙ １１．７６６（１９７２））を含むアフィニティー
カラムに直接に供する。フォスフォリルコリンによる溶
出の結果、均質なＦｖフラグメントが得られた。このフ
ラグメントは、ゲル電気泳動的には均質である。ＳＤＳ
ポリアクリルアミドゲルから、Ｍ製されたＦｖフラグメ
ントの二つの鎖は、分子比でｌ＝ １で存在し、成熟タ
ンパク質の期待された分子Ｉ！： （ｖＨ：１３．６０
０ダルトン、ＶＬ： １２，４００ダルトン）を有す
ることが推定された。二つのシグナル配列が正しく除去
されたことを証明するために、開鎖の６個のＮ−末端ア
ミノ酸の配列決定を行った。
ｙ １１．７６６（１９７２））を含むアフィニティー
カラムに直接に供する。フォスフォリルコリンによる溶
出の結果、均質なＦｖフラグメントが得られた。このフ
ラグメントは、ゲル電気泳動的には均質である。ＳＤＳ
ポリアクリルアミドゲルから、Ｍ製されたＦｖフラグメ
ントの二つの鎖は、分子比でｌ＝ １で存在し、成熟タ
ンパク質の期待された分子Ｉ！： （ｖＨ：１３．６０
０ダルトン、ＶＬ： １２，４００ダルトン）を有す
ることが推定された。二つのシグナル配列が正しく除去
されたことを証明するために、開鎖の６個のＮ−末端ア
ミノ酸の配列決定を行った。
その結果、開鎖は、成熟タンパク質の正しいＮ−末端配
列をそれぞれ有していることが明らかになった。このよ
うに、両方の異種構造のプレタンパク質（ｐｒｅｐｒｏ
ｔｅｉｎｓ）は、細菌シグナルペプチダーゼによって正
しく切断された。不正確なプロセシングやＮ−末端崩壊
反応が起きたという明らかな証明は認められない。
列をそれぞれ有していることが明らかになった。このよ
うに、両方の異種構造のプレタンパク質（ｐｒｅｐｒｏ
ｔｅｉｎｓ）は、細菌シグナルペプチダーゼによって正
しく切断された。不正確なプロセシングやＮ−末端崩壊
反応が起きたという明らかな証明は認められない。
Ｍ ｃ Ｐ Ｃ６０３の組換えＦｖフラグメントのアフ
ィニティーコンスタントを平衡透析によって測定した。
ィニティーコンスタントを平衡透析によって測定した。
これに用いた条件は、マウス腹水から単離した天然抗体
Ｍ ｃ Ｐ Ｃ６０３のアフィニティーコンスタントの
測定において用いられたものと同じであった。Ｆｖフラ
グメントについて得られた１ 、２１±０．０６Ｘ１０
５Ｍ−１は、実験精度の範囲内で、天然の抗体について
報告されている値の１．６±０．４Ｘ１０５Ｍ’と一致
している。
Ｍ ｃ Ｐ Ｃ６０３のアフィニティーコンスタントの
測定において用いられたものと同じであった。Ｆｖフラ
グメントについて得られた１ 、２１±０．０６Ｘ１０
５Ｍ−１は、実験精度の範囲内で、天然の抗体について
報告されている値の１．６±０．４Ｘ１０５Ｍ’と一致
している。
５ｃａｔｃｈａｒｄ結合プロット（Ａｎｎ、 Ｎ、 Ｙ
、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ。
、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ。
５１．６６０ （１９４９））は線状であって、外挿法
（ｅｘｔｒａｐｏｌａｔｉｏｎ）によって約１ｍｏｌの
ハプテンがｎｏｔ当りのＦｖフラグメントと結合してい
ることが示される。このことから、Ｆｖフラグメント当
り唯一のタイプの結合部位しか存在しないこと、および
単離されたタンパク質には非活性の成分は存在しないこ
とが確認される。
（ｅｘｔｒａｐｏｌａｔｉｏｎ）によって約１ｍｏｌの
ハプテンがｎｏｔ当りのＦｖフラグメントと結合してい
ることが示される。このことから、Ｆｖフラグメント当
り唯一のタイプの結合部位しか存在しないこと、および
単離されたタンパク質には非活性の成分は存在しないこ
とが確認される。
このように、驚いたことに、完全に機能的で安定なタン
パク質として、抗体Ｍ ｃ Ｐ Ｃ６０３のＦｖフラグ
メントを大腸菌において調製することが可能であること
が明らかになった。これは、細菌細胞のペリプラズムへ
の輸送が真核細胞の小胞体の内腔への輸送と機能的に対
等であることを示している。この対等性については、今
までに開示されておらず、示唆すらもない。というのは
、これまでにもっともよく特徴づけられており、かつペ
リプラズムにおいて可溶なヘテロダイマー（１＋ｅｔｅ
ｒｏｄ ｉｍｅｒｉｃ）のタンパク質と定義することが
できる細菌タンパク質−大腸菌ペニジリンアシラーゼ−
は、タンパク質分解的プロセシングによって単鎖前駆体
からペリプラズムにおいて産生される（Ｇ、 Ｓｃｈｕ
ｍａｃｈｅｒ、 Ｄ、 Ｓｉｚｍａｎｎ、 Ｈ，＋Ｉａ
ｎｚ、Ｐ。
パク質として、抗体Ｍ ｃ Ｐ Ｃ６０３のＦｖフラグ
メントを大腸菌において調製することが可能であること
が明らかになった。これは、細菌細胞のペリプラズムへ
の輸送が真核細胞の小胞体の内腔への輸送と機能的に対
等であることを示している。この対等性については、今
までに開示されておらず、示唆すらもない。というのは
、これまでにもっともよく特徴づけられており、かつペ
リプラズムにおいて可溶なヘテロダイマー（１＋ｅｔｅ
ｒｏｄ ｉｍｅｒｉｃ）のタンパク質と定義することが
できる細菌タンパク質−大腸菌ペニジリンアシラーゼ−
は、タンパク質分解的プロセシングによって単鎖前駆体
からペリプラズムにおいて産生される（Ｇ、 Ｓｃｈｕ
ｍａｃｈｅｒ、 Ｄ、 Ｓｉｚｍａｎｎ、 Ｈ，＋Ｉａ
ｎｚ、Ｐ。
Ｂｕｃｋｅ ｌおよびＡ、 Ｂｏｅｃｋ： Ｎｕｃｌｅ
ｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ。
ｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ。
１４．５７１３ （１９８６））。さらに、今日の知識
では、真核細胞において折りたたみに関与すると思われ
る酵素またはタンパク質を細菌は有しないことが既に指
摘されている。
では、真核細胞において折りたたみに関与すると思われ
る酵素またはタンパク質を細菌は有しないことが既に指
摘されている。
また、Ｍ ｃ Ｐ Ｃ６０３のＦｖフラグメントが、も
とのままの抗体Ｍ ｃ Ｐ Ｃ６０３と実質的に同じフ
ォスフォリルコリンとのアフィニティーコンスタントを
有していることも驚くべきことである。
とのままの抗体Ｍ ｃ Ｐ Ｃ６０３と実質的に同じフ
ォスフォリルコリンとのアフィニティーコンスタントを
有していることも驚くべきことである。
Ｆｖフラグメントの機能性については文献的に論争があ
ることから（Ｊ、ＳｅｎおよびＳ、 Ｂｅｙｃｈｏｋ：
Ｐｒｏｔｅｉｎｓ １．２５６ （１９８６））、この
知見は予期外のものである。このことから、機能性は定
常領域（ｃｏｎｓｔａｎｔ ｄｏｍａｉｎｓ）の修飾ま
たは完全な欠失によっても保持できることが明らかであ
る。
ることから（Ｊ、ＳｅｎおよびＳ、 Ｂｅｙｃｈｏｋ：
Ｐｒｏｔｅｉｎｓ １．２５６ （１９８６））、この
知見は予期外のものである。このことから、機能性は定
常領域（ｃｏｎｓｔａｎｔ ｄｏｍａｉｎｓ）の修飾ま
たは完全な欠失によっても保持できることが明らかであ
る。
Ｆｖフラグメントの調製に用いられたこれまでの唯一の
方法、すなわち抗体のタンパク質分解、とは対照的に、
本発明の方法においては、非機能性で、間違って折りた
たまれた、間違って再結合されたまたは化学的に修飾さ
れたタンパク質に間して問題はない。さらに、抗原また
はハプテンを装填した吸着剤を用いる好ましい単離工程
は、公知の諸工程によって得られたＦｖフラグメントの
精製にも適している。というのは、そのような不純物は
結合されないかまたは溶出されないかのいずれかである
からである。
方法、すなわち抗体のタンパク質分解、とは対照的に、
本発明の方法においては、非機能性で、間違って折りた
たまれた、間違って再結合されたまたは化学的に修飾さ
れたタンパク質に間して問題はない。さらに、抗原また
はハプテンを装填した吸着剤を用いる好ましい単離工程
は、公知の諸工程によって得られたＦｖフラグメントの
精製にも適している。というのは、そのような不純物は
結合されないかまたは溶出されないかのいずれかである
からである。
例１ニブラスミドｐ Ａ Ｓ Ｋ ２２の調製：発現プ
ラスミドｐ Ａ Ｓ Ｋ ２２を、ｐＵｃ１２の大きい
方のＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄｌＩＩフラグメント（Ｃ，Ｖ
ａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ、 Ｊ、 Ｖ＋ｅｉｒａお
よびＪ。
ラスミドｐ Ａ Ｓ Ｋ ２２を、ｐＵｃ１２の大きい
方のＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄｌＩＩフラグメント（Ｃ，Ｖ
ａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ、 Ｊ、 Ｖ＋ｅｉｒａお
よびＪ。
Ｍｅｓｓｉｎｇ： Ｇｅｎｅ ３３．１０３ （１９８
５））から、ベクターｐ Ｉ ＮＩＩ［−０ｍｐＡ １
のフラグメント（Ｙ、 Ｍａｓｕｉ、Ｊ、 Ｃｏｌｅｍ
ａｎおよびＭ、 １ｎｏｕｙｅ： ｒＥｘｐｅｒｉｍ
ｅｎｔａｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅ
ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎＪ 、 Ｍ。
５））から、ベクターｐ Ｉ ＮＩＩ［−０ｍｐＡ １
のフラグメント（Ｙ、 Ｍａｓｕｉ、Ｊ、 Ｃｏｌｅｍ
ａｎおよびＭ、 １ｎｏｕｙｅ： ｒＥｘｐｅｒｉｍ
ｅｎｔａｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅ
ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎＪ 、 Ｍ。
１ｎｏｕｙｅ編集、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １
９８３）から、およびｐ ＨＩ ６１ （Ｈ，１ｎｏｕ
ｙｅ、Ｗ、 Ｂａｒｎｅｓおよび、ｊ。
９８３）から、およびｐ ＨＩ ６１ （Ｈ，１ｎｏｕ
ｙｅ、Ｗ、 Ｂａｒｎｅｓおよび、ｊ。
Ｂｅｃｋｗｉｔｈ： Ｊ、 Ｂａｃｔｅｒｉｏ１、 １
４９．４３４ （１９８２））から、さらに種々の合成
りＮＡフラグメントから、公知の方法（Ｔ、 Ｍａｎｉ
ａｔｉｓ、 Ｅ、 Ｆ、 Ｆｒ１ｔｓｃｔ１およびＪ、
Ｓａｍｂｒｏｏｋ： Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎ
ｉｎｇ、 Ｃｏ１ｄ ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ １９
８２）を用いていくつかの工程によって構築する。得ら
れるベクターｐ Ａ Ｓ Ｋ ２２の完全なりＮＡ配列
が表１に示されている。
４９．４３４ （１９８２））から、さらに種々の合成
りＮＡフラグメントから、公知の方法（Ｔ、 Ｍａｎｉ
ａｔｉｓ、 Ｅ、 Ｆ、 Ｆｒ１ｔｓｃｔ１およびＪ、
Ｓａｍｂｒｏｏｋ： Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎ
ｉｎｇ、 Ｃｏ１ｄ ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ １９
８２）を用いていくつかの工程によって構築する。得ら
れるベクターｐ Ａ Ｓ Ｋ ２２の完全なりＮＡ配列
が表１に示されている。
ライゲーション混合液を用いて、コンピテントにした大
腸菌細胞を形質転換させる。後者を、アンピシリン耐性
を指標にして選択する。所望の遺伝子構造を有するプラ
スミドを、制限酵素分析および重要な接合部位の配列決
定によって特徴づけする。
腸菌細胞を形質転換させる。後者を、アンピシリン耐性
を指標にして選択する。所望の遺伝子構造を有するプラ
スミドを、制限酵素分析および重要な接合部位の配列決
定によって特徴づけする。
例２： Ｆｖフラグメントの調製：
ｐ Ａ Ｓ Ｋ ２２で形質転換させた大腸菌Ｗ３１１
０株の培養物を１００ｍｇ／リットルのアンピシリンを
含むＬＢ培地で培養して、０Ｄｓｓｏを０．５にする。
０株の培養物を１００ｍｇ／リットルのアンピシリンを
含むＬＢ培地で培養して、０Ｄｓｓｏを０．５にする。
ＩＰＴＣ；を最終濃度１ｍＭになるように加えて、発現
を誘導する。４５分の後、４．０００Ｘｇの遠心外１ｄ
（１０分間、４℃）によって細胞を集める。細胞ペレッ
トを原培養液１ リッ）ＩＸ当り１０ｍ１のＴＥＳ緩？
ｔｉｔ＆（０，２Ｍ）リスー塩故（ｐｌ（８，０）、０
．５ｍＭＥＤＴＡ、０．５Ｍシュークロース）に再懸濁
させて細胞の分画な行う。
を誘導する。４５分の後、４．０００Ｘｇの遠心外１ｄ
（１０分間、４℃）によって細胞を集める。細胞ペレッ
トを原培養液１ リッ）ＩＸ当り１０ｍ１のＴＥＳ緩？
ｔｉｔ＆（０，２Ｍ）リスー塩故（ｐｌ（８，０）、０
．５ｍＭＥＤＴＡ、０．５Ｍシュークロース）に再懸濁
させて細胞の分画な行う。
水でｌ：４に希釈して２ｍＭのフォスフォリルコリンを
含むＴＥＳ緩衝液を原培養液１リヴ）１１当り１５ｍ１
の１度になるように加えることによって、細胞に軽い浸
透圧ショックを与える。懸濁液を氷上で３０分間インキ
ュベーションした後に、５．０００Ｘｇで１０分間遠心
分離して、上清液を今度は４８，０００Ｘｇで１５分間
遠心分離する。
含むＴＥＳ緩衝液を原培養液１リヴ）１１当り１５ｍ１
の１度になるように加えることによって、細胞に軽い浸
透圧ショックを与える。懸濁液を氷上で３０分間インキ
ュベーションした後に、５．０００Ｘｇで１０分間遠心
分離して、上清液を今度は４８，０００Ｘｇで１５分間
遠心分離する。
全可溶性ペリプラズムタンパク質を含む得られた１清液
を、限外濾過（ＲアミコンＹＭ５膜）によって原培養液
１１７ツ）１１当り約２．５ｍｌの容量にまで濃縮して
、ＢＢＳ緩衝ｊｆｆｌ（０，２Ｍホウ酸／ Ｎ ａ Ｏ
Ｈ（ｐＨ８，０）、０．１６Ｍ ＮａＣｌ）に対して透
析する。この濃縮溶液を、フォスフォリルコリン誘導体
を装填したアフィニティーカラム（Ｂ。
を、限外濾過（ＲアミコンＹＭ５膜）によって原培養液
１１７ツ）１１当り約２．５ｍｌの容量にまで濃縮して
、ＢＢＳ緩衝ｊｆｆｌ（０，２Ｍホウ酸／ Ｎ ａ Ｏ
Ｈ（ｐＨ８，０）、０．１６Ｍ ＮａＣｌ）に対して透
析する。この濃縮溶液を、フォスフォリルコリン誘導体
を装填したアフィニティーカラム（Ｂ。
ＣｈｅｓｅｂｒｏおよびＩ１、 Ｍｅｔｚｇｅｒ：前出
）（ベツド容積１ｍｌ当り１〜４ｍｌの溶液）に供する
。これをＢＢＳ緩衝液で洗浄して、純粋Ｆｖフラグメン
トを１ ｍＭフォスフォリルコリンのＢＢＳ緩衝液溶液
で溶出する。
）（ベツド容積１ｍｌ当り１〜４ｍｌの溶液）に供する
。これをＢＢＳ緩衝液で洗浄して、純粋Ｆｖフラグメン
トを１ ｍＭフォスフォリルコリンのＢＢＳ緩衝液溶液
で溶出する。
例３：平衡透析：
膜の両側がそれぞれ１００７１１の容量の透析チャンバ
ーにおいて、一方に５０７１１の精製したＦｖフラグメ
ントのＢＢＳ緩衝液溶液を入れ、他方に５０μｍのフオ
スフォリル（メチル−１４Ｃ）コリン（５０ｍＣ１／ｍ
ｍｏｌ）のＢＢＳ緩衝液溶液を入れた。
ーにおいて、一方に５０７１１の精製したＦｖフラグメ
ントのＢＢＳ緩衝液溶液を入れ、他方に５０μｍのフオ
スフォリル（メチル−１４Ｃ）コリン（５０ｍＣ１／ｍ
ｍｏｌ）のＢＢＳ緩衝液溶液を入れた。
ｏｆ）２ｓｓの値６．８５から決定されたＦｖフラグメ
ントの濃度は、０．２２ｍｇ／ｍｌであった（Ｒ，Ｋ。
ントの濃度は、０．２２ｍｇ／ｍｌであった（Ｒ，Ｋ。
５ｃｏｐｅｓ： Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔ
ｉｏｎ −Ｐｒ１ｎｃｉｐｌｅｓａｎｄ Ｐｒａｃｔｉ
ｃｅ、 Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ％Ｎｅｗ Ｙ
ｏｒｋ。
ｉｏｎ −Ｐｒ１ｎｃｉｐｌｅｓａｎｄ Ｐｒａｃｔｉ
ｃｅ、 Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ％Ｎｅｗ Ｙ
ｏｒｋ。
１９８２、ρ、２４１）。室温で２２時間おいた後に、
平衡に達した。各溶液の２０μｌの試料を、シンチレー
ションカウンター（ベックマンＬＳ１８０１）で測定し
て、データを５ｃａｔｃｈａｒｄブロツテイング（前出
）した。その結果得られた線の勾配から引き出されたア
フィニティーコンスタントＫａは、１．２１±０．０６
Ｘ Ｉ Ｏ” Ｍ−１である。
平衡に達した。各溶液の２０μｌの試料を、シンチレー
ションカウンター（ベックマンＬＳ１８０１）で測定し
て、データを５ｃａｔｃｈａｒｄブロツテイング（前出
）した。その結果得られた線の勾配から引き出されたア
フィニティーコンスタントＫａは、１．２１±０．０６
Ｘ Ｉ Ｏ” Ｍ−１である。
表１
ｐＡＳＫ２２のＤＮＡ１２列、およびＯｍｐＡ−ＶＨお
よびｐｈＯＡ−ＶＬのアミノ酸配列 Ｇｌｕ？ｒｐＶａｌＡｒｇＧｌｎＰｒｏＰｒｏＧ１ｙＬ
ｙｔ入！”９Ｌ＠ｕＧｌｕ〒ｒＰＸｌ龜＾ｕａＡｌａ５
ｅｒ入ｒ９＾ｓｎＬｙｍＡｓｐＴｈｒＳ＠ｒＧｌｎＳａ
ｒ
よびｐｈＯＡ−ＶＬのアミノ酸配列 Ｇｌｕ？ｒｐＶａｌＡｒｇＧｌｎＰｒｏＰｒｏＧ１ｙＬ
ｙｔ入！”９Ｌ＠ｕＧｌｕ〒ｒＰＸｌ龜＾ｕａＡｌａ５
ｅｒ入ｒ９＾ｓｎＬｙｍＡｓｐＴｈｒＳ＠ｒＧｌｎＳａ
ｒ
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、機能性（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ）抗体、抗体の機能
性フラグメントまたは抗体領域と他のタンパク質からな
る融合タンパク質の遺伝子を、シグナル配列、すなわち
細菌細胞の細胞膜を通してポリペプチドを輸送し、次い
で除去されるところのもの、に連結させること、該遺伝
子構造物を細菌中で発現させること、およびペリプラズ
ム空間 （ｐｅｒｉｐｌａｓｍｉｃ ｓｐａｃｅ）またはメジウ
ム（ｍｅｄｉｕｍ）から機能性タンパク質を単離するこ
とからなる、機能性抗体、抗体の機能性フラグメントま
たは抗体領域と他のタンパク質からなる融合タンパク質
、の製造法。 ２、細菌がグラム陰性細菌である、請求項１に記載の製
造法。 ３、細菌が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）である、請求項２に
記載の製造法。 ４、二つのプレペプチドのための遺伝子を可調節性オペ
ロン系のかたちで連結させることを特徴とする、請求項
１、２または３のいずれか１項に記載の製造法。 ５、機能性タンパク質をペリプラズム空間から単離する
ために、ペリプラズム（ｐｅｒｉｐｌａｓｍ）を溢出さ
せるが細胞質をもとのままに保持するような浸透圧ショ
ックを分離しておいた細菌に与えて、これによって得ら
れた液相を遠心分離によって濃厚富化して、さらにこの
濃縮物から所望のタンパク質を得ることを特徴とする、
請求項１〜４のいずれか１項に記載の製造法。 ６、適当な抗原またはハプテンを装填した吸着剤に機能
性タンパク質を含む溶液を供し、所望のタンパク質をこ
の抗原またはハプテンを含む溶液にて溶出して単離する
ことを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載
の製造法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19873744595 DE3744595A1 (de) | 1987-12-31 | 1987-12-31 | Verfahren zur gentechnischen herstellung von antikoerpern |
| DE3744595.2 | 1987-12-31 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02799A true JPH02799A (ja) | 1990-01-05 |
| JP2771204B2 JP2771204B2 (ja) | 1998-07-02 |
Family
ID=6343878
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63335695A Expired - Lifetime JP2771204B2 (ja) | 1987-12-31 | 1988-12-28 | 遺伝子工学的手法による抗体の製造法 |
Country Status (12)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0324162B1 (ja) |
| JP (1) | JP2771204B2 (ja) |
| KR (1) | KR970007861B1 (ja) |
| AT (1) | ATE102651T1 (ja) |
| AU (1) | AU628310B2 (ja) |
| DE (2) | DE3744595A1 (ja) |
| DK (1) | DK732988A (ja) |
| ES (1) | ES2063022T3 (ja) |
| HU (1) | HU212592B (ja) |
| IE (1) | IE62257B1 (ja) |
| PT (1) | PT89362B (ja) |
| ZA (1) | ZA889711B (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2010515459A (ja) * | 2007-01-12 | 2010-05-13 | ダウ グローバル テクノロジーズ インコーポレイティド | 浸透圧によって細胞にショックを与えるための装置および方法 |
| US10262788B2 (en) | 2013-12-12 | 2019-04-16 | Koninklijke Philips N.V. | Method to enable standard alternating current (AC)/direct current (DC) power adapters to operate in high magnetic fields |
Families Citing this family (26)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4816567A (en) | 1983-04-08 | 1989-03-28 | Genentech, Inc. | Recombinant immunoglobin preparations |
| US5576195A (en) * | 1985-11-01 | 1996-11-19 | Xoma Corporation | Vectors with pectate lyase signal sequence |
| US5618920A (en) * | 1985-11-01 | 1997-04-08 | Xoma Corporation | Modular assembly of antibody genes, antibodies prepared thereby and use |
| GB9015198D0 (en) | 1990-07-10 | 1990-08-29 | Brien Caroline J O | Binding substance |
| US6916605B1 (en) | 1990-07-10 | 2005-07-12 | Medical Research Council | Methods for producing members of specific binding pairs |
| US6172197B1 (en) | 1991-07-10 | 2001-01-09 | Medical Research Council | Methods for producing members of specific binding pairs |
| US7063943B1 (en) | 1990-07-10 | 2006-06-20 | Cambridge Antibody Technology | Methods for producing members of specific binding pairs |
| GB9206318D0 (en) * | 1992-03-24 | 1992-05-06 | Cambridge Antibody Tech | Binding substances |
| SE9101433D0 (sv) * | 1991-05-13 | 1991-05-13 | Marianne Hansson | Recombinant dna sequence and its use |
| US5962255A (en) * | 1992-03-24 | 1999-10-05 | Cambridge Antibody Technology Limited | Methods for producing recombinant vectors |
| DE69230142T2 (de) | 1991-05-15 | 2000-03-09 | Cambridge Antibody Technology Ltd. | Verfahren zur herstellung von spezifischen bindungspaargliedern |
| US6492160B1 (en) | 1991-05-15 | 2002-12-10 | Cambridge Antibody Technology Limited | Methods for producing members of specific binding pairs |
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