JPS62201581A - 新規プラスミド、微生物細胞及びヒト免疫グロブリンＧ Ｆｃ領域蛋白質の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （１）技術分野 本発明はヒト免疫グロブリンＧ（以下“ＩｇＧ”と略す
ことがある）ＦｃＴｉＥ域蛍白質をコードするＤＮＡ断
片を有する新規組換えプラスミド、該プラスミドにより
形質転換された新規組換え微生物細胞及び該微生物を用
いたヒトＩｇＧ　　Ｆｃ領域蛋白質の分泌による製造方
法に関する。

（２）発明の背景 すべてのを椎動物の体液中に存在し、抗原と特異的に結
合する能力を有する蛋白質が抗体であり、抗体蛋白質と
構造的、機能的関連をもつ蛋白質は総称して免疫グロブ
リンといわれている。免疫グロブリン（以下“Ｉｇ”と
略すことがある）は、物理化学的あるいは免疫学的な性
状から、ＩｇＧ、ｒｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＤ（７
）５つのクラスに分類される。

なかでもＩｇＧは細菌やウィルスに対する生体防御に重
要な役割を持っており、従来より、ヒトＩｇＧを多量に
含むγ−グロブリン画分をヒトの血液より分離し、−都
度性することにより重症患者のための免疫製剤として用
いられてきた。しかしながら、これは原料を人血に依存
しており、その大量の安定した人手が困難であること、
またそのために均質で安全なものを常時得にくいという
難点があった。そこでヒト免疫グロブリンを遺伝子操作
技術によって産出することができれば、医薬品製造のた
めに極めて有利であることは論を待たない。

さて、ヒトｒｇＧは２本のＨ鎖（ｈｅａｖｙ　ｃｈａｉ
ｎ）と２本のＬ鎖（ｌｉｇｈｔ　ｃｈａｉｎ）がジスル
フィド結合で結ばれた形をとる。ヒトＩｇＧ分子にパパ
インなどの蛋白質分解酵素を作用させると分子中央で切
断され、抗原結合活性のある断片（ＦａｂＳｌ域蛋白質
）と、抗原結合活性はなく条件により結晶化しやすい断
片（Ｆｃ領域蛋白質）とに分かれる。

Ｆａｂ領域蛋白質はＬ鎖全体とＨ鎖のアミノ末端側の半
分を含み、１分子のＩｇＧから２分子のＦａｂｊＪ域蛋
白質が生じる。一方、Ｈ鎖のカルボキシル末端側の半分
であるＦｃ領域蛋白質は、ヒンジ（ｈ）　、ＣＭ　２．
０．３の３つの部位より成り、ヒンジ部位において２木
の鎖がジスルフィド結合によって結ばれている。そして
、ＦｃｇＩ域蛋白質はエフェクター（ｅｆｆｅｃｔｏｒ
）機能を有している。

従来、γ−グロブリン製剤は、無（低）Ｔ−グロブリン
血症への補充、ウィルス感染症の予防と治療投与、等に
適用されてきた。近年、γ−グロブリン製剤が特発性血
小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）治療に有効でありＣＰ、　
Ｉｍｂａｃｈら、ＬａｎｃｅＬ上。

１２２８（１９８１））　、特にそのＦｃ領域が重要で
あることが示唆されている〔朴ら、臨床免疫、　１５　
（Ｓｕｐｐｌ、７　）　７６（１９８３））。また、全
身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）等における腎糸球体沈
着免疫複合体が、ヒトＩｇＧ　　Ｆｃ＋ｆＪｆ域蛋白質
の域別白質り融解したという報告もある〔河住ら、臨床
免疫、１６゜２４０（１９８４）　）。以上のように、
Ｆｃ領域蛍白質は、ＩＴＰやＳＬＥのような自己免疫疾
患の治療薬として用いることができる可能性があるが、
作用機序などを含めて不明な点が多い。十分な量のＦｃ
領域蛋白質を供給できないことが、この理由の１つとな
っている。

近年の遺伝子操作技術の発達により、種々の有用蛋白質
の微生物等を用いた生産が可能になった。

しかしながら、通常、有用蛋白質は主として菌体内の細
胞質に蓄積されるものであり、所望の有用蛋白質を分泌
する微生物は限られたものしか知られていない。有用蛋
白質を微生物菌体内の細胞質で過剰生産させた場合、フ
ィードバック機構により生産が抑制されるような事が起
こり得るが、分泌により生合成系から外λ移行させるこ
とにより、フィードバックの解除が可能になる。また、
宿主微生物に対してｔｏｘｉｃな有用蛋白質の生産にお
いても、分泌生産が有用である。さらに、一般に分泌性
蛋白質の種類はそれほど多くないため、有用蛋白質を分
泌させればその精製工程の簡略化が期待でき、工業的に
みてコストダウンがはかれる。

以上の理由により、所望の有用蛋白質を分泌生産するよ
うな微生物を任意に創製することができれば、その産業
上の利用性は極めて大きい。

一般に分泌性の蛋白質は、アミノ末端に２０〜４０残基
程度のアミノ酸からなるシグナルペプチドといわれるも
のがついた状態で産生され、細胞膜を透過し分泌される
ときにシグナルペプチダーゼという酵素によってシグナ
ル領域が切断されて、シグナルペプチドを含まない蛍白
質が分泌される。

この機構は基本的に高等生物でも微生物でも同様に考え
られ、本来分泌されない蛋白質にシグナルペプチドをつ
けてやることによって、細胞膜を透過させることも可能
なわけである。

一方、遺伝子操作において最もよく用いられる微生物で
ある大腸菌〔エシェリヒア・コリ　（Ｅｓｃｈｅｒｉｃ
ｈｉａ　ｃｏｌｉ）　）は、その周囲を内膜・外膜とい
う二つの膜で囲まれており、内膜と外膜との間にはべり
ブラズムと呼ばれる空間が存在する。従って、シグナル
ペプチドを用いることにより内膜を通過した蛋白質は、
外膜を通過できないためペリプラズムに蓄積することに
なるわけであるが、ペリプラズムの蛋白質はオスモティ
ック・ショック法により容易に他の細胞蛋白質から分離
することができる。従って産生された蛋白質をペリプラ
ズムに蓄積させることができれば、これより容易に高純
度の目的蛋白質を得ることができるので、その工業的価
値は大きい。

近年、本発明者らの一部は、ペプチダ−ゼを菌体外に分
泌する能力を有する好アルカリ性バチルス（Ｂａｃｉｌ
ｌｕｓ）　Ｎｕ　１７０株（ＦＥＲＭ　　ＢＰ−４６７
）由来の染色体ＤＮＡより、プラスミドベクターｐＭＢ
９（Ｒル、Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ　ら、Ｍｏ１ｅｃｕｌａ
ｒ　Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　Ｃｏｎｔｒ
ｏｌ　ｏｆ　Ｇｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ、　ＩＣ
Ｎ−ＵＣＬＡ、　ｓｙｍｐ、Ｍｏ１．ｃｅｌｌ、Ｂｉｏ
ｌ、（ｅｄ、Ｄ、Ｐ、Ｎ１ｅｒｌｉｃｈら）、茎、　４
７１．＾ｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ　Ｉｎｃ、　　、
Ｎｅｗ　Ｙ。

ｒｋ　（１９７６）　）を用いて、ペプチダ−ゼ遺伝子
の大腸菌によるクローン化に成功した（Ｔ、Ｋｕｄｏら
、Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｔｏｌ、、１５６，９４９（１９８
３）　）　、このペプチダ−ゼ遺伝子には、プロモータ
ー領域、シグナルペプチドをコードする領域、及び成熟
ペプチダ−ゼ蛋白質をコードする領域が含まれており、
このプロモーター領域及びシグナルペプチド領域を利用
することにより、有用蛋白質を大腸菌のペリプラズムへ
分泌させることが可能と考えられる。

そこで、本発明者らは、この菌体外分泌に関する研究を
更に進めた結果、ヒ）ＩｇＧ　　Ｆｃ領域蛋白質のペリ
プラズムへの分泌発現に成功し、本発明を完成するに至
ったものである。

（３）発明の目的 本発明の目的は、ヒ）ＩｇＧ　　Ｆｃ領域蛋白質をコー
ドするＤＮＡを含むＤＮＡ断片、及びその断片が組み込
まれた新規組換えプラスミドを提供することにある。

本発明の他の目的は、上記新規組換えプラスミドによっ
て形質転換され、目的とするヒトＩｇＧＦｃ領域蛋白質
を、ペリプラズムに産生じ得る新規組換え微生物細胞を
提供することにある。本発明の更に他の目的は該微生物
細胞を用いてヒトＩｇＧＦｃ領域蛋白質をペリプラズム
に分泌生産させる方法を提供することにある。

本発明の更に他の目的は、以下の説明から一層明らかと
なるであろう。

（４）発明の構成 本発明者の研究によれば、前記本発明の目的は、ヒトＩ
ｇＧ　　Ｆｃ領域蛋白質をコードするＤＮＡ領域、該蛋
白質の発現調節を行なうプロモーター機能を有するＤ　
Ｎ　Ａ　領域およびシグナルペプチドをコードするＤ　
Ｎ　Ａ　領域を有する新規プラスミドを提供し、また該
新規プラスミドによって形質転換された組換え微生物細
胞を提供し、更に該組換え微生物細胞を用いて目的とす
るヒ）ＩｇＧ　　ＦＣＳＩ域蛋白質を微生物のペリプラ
ズムへ分泌する方法を提供することにより達成されるこ
とが分った。

以下本発明について更に詳細に説明する。

（ヒト免疫グロブリンＧＦｃ領域遺伝子のクローン化） ヒ）ＴｇＧを産生ずる細胞、たとえばヒト骨髄腫細胞Ａ
ＲＨ７７株（Ｋ、Ｈ，Ｂｕｒｋら、Ｊ、Ｃａｎｃｅｒ　
Ｒｅｓ、　３Ｌ、２５０８　（１９７８）　）を、適当
な条件下、たとえば３７℃、炭酸ガス濃度５％で培養増
殖させ、得られた細胞を遠心分離によって集める。この
細胞を、たとえばラウリル硫酸ナトリウム（Ｓ　Ｄ　Ｓ
）のような界面活性剤存在下で、たとえばプロテアーゼ
にのような蛋白質分解酵素を用いて溶解させる。さらに
、たとえばフェノールによる抽出によって除蛋白質を行
ない、ヒト染色体ＤＮＡを得る。

こうして得られたＤＮＡを、たとえばＥｃｏＲＩのよう
な制限酵素で切断し、適当なファージ・ベクター、たと
えばシャロン４Ａベクター（Ｆ、Ｒ。

Ｂｌａｔｔｎｅｒら、５ｃｉｅｎｃｅ＋旦６．１６Ｈ１
９７７））と連結した後、イン・ビトロ・パフケージン
グ（Ａ、Ｂｅｃｋｅｒら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａ
ｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　、７２，５８Ｈ１９７５）　）を
行ない、ヒトの遺伝子ライブラリーを得る。Ｅｃ。

Ｒ１以外の制限酵素を用いる場合や、クローニングサイ
トとしてＥｃ　ｏＲＩをもたないような他のファージ・
ベクターを使用する場合には、適当なリンカ−ＤＮＡを
用いれば遺伝子ライブラリーの作成が可能になる。

この遺伝子ライブラリーのファージを、たとえばエシェ
リヒア・コリＬＥ３９２株（ＡＴＣＣ３３５７２）に感
染、プラークを形成させ、たとえばプラーク・ハイブリ
ダイゼーション法（１１，［１，Ｂｅｎｔｏｎ　ラ、５
ｃｉｅｎｃｅ　５１９６．１８０（１９７７）　）によ
って目的クローンの選択を行なう。プローブとしては、
たとえば二ツクトランスレーション法ＣＰ、Ｗ、Ｊ、Ｒ
ｉｇｂｙ　ら、Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、＋旦３，２３７
（１９７７）　）により″′Ｐ標識を行なったヒト免疫
グロブリンＨ鎖Ｊ　６１域（Ｆａｂｗｉ域の中の一部で
あり、抗原結合活性を有する可変部とエフェクター機能
を有する定常部との境界に存在）遺伝子や、あるいはヒ
ｌ−１ｇＧ　　Ｆｃｆｆｆｆ域蛋白質のアミノ酸配列に
対応すると考えられる塩基配列をもつオリゴヌクレオチ
ドを化学合成した後、これを３２ｐ標識したものを用い
ることができる。

このプラーク・ハイブリダイゼーションによって陽性を
示したクローンの制限酵素切断点地図を作成し、ヒト染
色体由来のＤＮＡ断片を、たとえばｐＢ　Ｒ３２２（Ｆ
、Ｂｏｌｉｖａｒ　ら、Ｇｅｎｅ、　　２．９５（１９
７７）〕のようなプラスミド・ベクターにサブクローニ
ングする。得られたサブクローンの挿入部分のＤＮＡ塩
基配列を、例えばマキサム−・ギルバート法　〔八１Ｍ
、Ｍａｘａｍ　　ら、Ｍｅｔｈｏｄｓ　　Ｅｎｚｙｍｏ
ｌ、、６５＋４９９（１９８０）　）あるいはＭ１３フ
ァージを用いたジデオキシ・チェーン・ターミネーショ
ン法（Ｊ、Ｍｅｓｓｉｎｇら、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１
ｄｓ　Ｒｅｓ、＋　　９．３０９（１９８１）　）の方
法により決定し、ヒトｒｇＧＦｃ領域遺伝子の存在を確
認する。第１図に、ヒＩ−１ｇＧ　　Ｆｃ領域蛋白質の
アミノ酸配列及びそれをコードするＤＮＡ塩基配列の一
例を示す。

こうして得られたヒ）ＩｇＧＦｃｅＩ域遺伝子は、ヒト
染色体のものであるから、実際にアミノ酸をコードしな
いイントロン（ｉｎｔｒｏｎ）を含んでおり、このまま
では微生物中で発現させることはできない。そこで、こ
のＦｃ領域遺伝子を適当な制限酵素で切断し、イントロ
ンの部分を完全に除去する。この制限酵素切断の際に、
実際にアミノ酸をコードするエクソン（ｅｘｏｎ）の部
分も削り取られてしまうことがありうるが、その場合に
は化学合成したオリゴヌクレオチドのジヨイントを用い
て削られた部分を修復させると共に、隣り合ったエクソ
ン同志を連結させる。同時に合成オリゴヌクレオチドを
用いた同様な手法により、ＦｃｊＪ域遺伝子の３′末端
に読みとりフレームを一致させるように翻訳終止コドン
（ＴＧＡ、ＴＡＧ、ＴＡＡ）を２つ以上タンデムに連結
し、発現効率の向上をはかることもできる。ここで得ら
れたイントロンのないＦ　ｃ　ｊＪ域遺伝子は、やはり
合成オリゴヌクレオチドを用いた手法を用い、その上流
に読みとりフレームを一致させるように翻訳開始コトン
を付与することができる。さらにこのＦｃ領域遺伝子は
、適当なプロモーター、ＳＤ（シャイン・ダルガーノ）
配列の下流につなぐことにより、菌体内発現型遺伝子と
することができる。使用可能なプロモーターとして、ト
リプトファン・オペロン・プロモーター（ｔｒｐプロモ
ーター）、ラクトース・オペロン・プロモーター（ｌａ
ｃプロモーター）、ｔａｃプロモーター、ＰＬプロモー
ター、ＩＦＦプロモーター等かあげられるが、とりわけ
ｔｒｐプロモーターやｔａｃプロモーターが好適である
。ＦｃＳｉ域遺伝子を効率良く発現させるためには、プ
ロモーター、ＳＤ配列、翻訳開始コドン、翻訳終止コド
ンのすべてを連結したものが好ましく、プロモーター、
ＳＤ配列、翻訳開始コドン、Ｆｃ領域遺伝子及び翻訳終
止コドンが、この順序で連結したものがとりわけ好まし
い。

本発明の菌体内発現型ヒ）ＩｇＧ　　Ｆｃ領域遺伝子を
、適当なプラスミド・ベクター、たとえばｐ　Ｂ　Ｒ３
２２に挿入することにより、発現型プラスミドが作成で
きる閑体内発現型プラスミドとして、好ましくは、ｐ　
Ｆｅ２Ｏ２、ｐ　ＦＣ２１１、ｐ　ＦＣ３６１、ｐＦＣ
３６２が用いられる。

（好アルカリ性バチルス魚１７０株ペニシリナーゼ遺伝
子のクローン化） ペニシリナーゼ生産能を存する好アルカリ性バチルス魚
１７０株（ＦＥＲＭ　　ＢＰ−４６７）を適当な条件下
、たとえば３０℃で振とう培養し、得られた菌体を遠心
分離によって集める。この菌体から、公知の方法、たと
えばフェノール法によってＤＮＡを抽出し、染色体ＤＮ
Ａを得る。

こうして得られたＤＮＡを、例えばＥＣ０ＲＩのような
制限酵素で部分的に切断し、適当なプラスミドベクター
、たとえばｐＭＢ９プラスミドのＥＣ０ＲＩサイトへの
挿入を行ない、好アルカリ性バチルスＮＣＬ　１７０株
染包体ＤＮＡを組み込んだ組換えプラスミドを得る。こ
の組換えプラスミドを、たとえばエシェリヒア・コリＨ
８１０１株（ＡＴＣＣ３３６９４）に公知の方法、たと
えばＣａＣｊｌｚ法団。

Ｖ、Ｎｏｒｇａｒｄら、　Ｇｅｎｅ、　３．２７９（１
９７８）　）を用いて導入、アンピシリン及びテトラサ
イクリンに耐性の形質転換株をスクリーニングすること
により、好アルカリ性バチルス隘１７０株ペニシリナー
ゼ遺伝子を有する組換えプラスミド、たとえばｐＥＡＰ
Ｉを得る。

得られた組換えプラスミドのＤＮＡ塩基配列を、たとえ
ば前記マキサム−ギルバート法あるいは前記Ｍ１３ファ
ージを用いたジデオキシ・チェーン・ターミネーション
法により決定し、ペニシリナーゼ遺伝子プロモーター領
域、シグナルペプチド領域及び成熟ペプチド領域の構造
を明らかにする。

第１図に、好アルカリ性バチルス魚１７０株ペニシリナ
ーゼ遺伝子プロモーター領域とシグナルペプチド領域の
ＤＮＡ塩基配列を示す。また、シグナルペプチド領域に
ついては、対応するアミノ酸配列も合わせて示す。

このペニシリナーゼ遺伝子を有する組換えプラスミドを
出発材料として、自然欠失を利用した方法、あるいはＳ
ｌ−ヌクレアーゼ、ＤＮＡ−ポリメラーゼ等の修飾酵素
や合成オリゴヌクレオチドを用いる人為的方法により、
ペニシリナーゼ遺伝子の全域あるいは一部を含む、組換
えプラスミドが得られる。このようなプラスミドとして
、好ましくはｐＥＡＰ３が用いられる。

また、上述のベニシリナーゼ遺伝子を有する組換えプラ
スミドを、適当な制限酵素で切断し、ベニシリナーゼ遺
伝子プロモーター領域及びシグナルペプチド領域を含む
ＤＮＡ断片を得る。このＤＮＡ断片を、必要なら適当な
合成オリゴヌクレオチド・リンカ−を介して、適当なプ
ラスミドベクター、例えばｐＣＭ　１　（Ｔ、Ｊ、Ｃ１
ｏｓｅとＲ，Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ＋Ｇｅｎｅ、　２０．
３０５（１９８２））　　とｐＣＭ　７　（Ｔ、Ｊ、Ｃ
１ｏｓｅとＲｏＲｏｄｒｉｇｕｅｚ、Ｇｅｎｅ、　２０
，３０５（１９Ｂ２））とのハイブリッド・プラスミド
ｐｃＭ７１にクローン化し、ペニシリナーゼ遺伝子プロ
モーター領域及びシグナルペプチド領域を有するプラス
ミドが得られる。ペニシリナーゼ遺伝子プロモーター領
域及びシグナルペプチド領域を有するプラスミドとして
、好ましくはｐＰｓｌが用いられる。

（分泌型プラスミドの作成） 前に得られたヒ）ＩｇＧ　　Ｆｃ領域菌体内発現型プラ
スミド、たとえばｐＦＣ３６２を、適当な制限酵素で切
断することにより、菌体内発現のためのプロモーター領
域を削減し、その部分に適当なプロモーター領域及びシ
グナルペプチド領域、例えば好アルカリ性バチルスＩ’
＆１１７０株ペニシリナーゼ遺伝子シグナルペプチド領
域との連結用の合成オリゴヌクレオチド・ジヨイントを
挿入した形のプラスミドを得る。このようなプラスミド
として、好ましくはｐＳＥＣ−ＦＣが用いられる次にこ
のプラスミドに、適当なプロモーター領域及びシグナル
ペプチド領域を有するプラスミドを適当な制限酵素で切
断することにより得られる適当なプロモーター領域を有
するＤＮＡ断片及びシグナルペプチド領域を有するＤＮ
Ａ断片を挿入し、適当なプロモーター領域及びシグナル
ペプチド領域下流にヒ）ＩｇＧ　　Ｆｃ領域遺伝子が連
結した形のプラスミドが得られる。このようなプロモー
ター領域・シグナルペプチド領域を有する遺伝子として
は、大腸菌β−ラクタマーゼ遺伝子、大腸菌アルカリ性
ホスファターゼ遺伝子、大腸菌リポプロティン遺伝子、
枯草菌ペニシリナーゼ遺伝子、枯草菌プロテアーゼ遺伝
子、酵母α因子遺伝子、好アルカリ性バチルス魚１７０
株ベニシリナーゼ遺伝子、好アルカリ性エアロモナス（
＾ｅｒｏｍｏｎａｓ）　Ｎ［Ｌ２１２株キシラナーゼ遺
伝子、好アルカリ性バチルスｌ１ｈＮ−４株セルラーゼ
遺伝子、好アルカリ性バチルスｔｋｌ１３９株セルラー
ゼ遺伝子等があげられるが、好ましくは好アルカリ性バ
チルス磁１７０株ペニシリナーゼ遺伝子が用いられる。

適当なプロモーター領域、適当なシグナルペプチド領域
及びヒ）ＩｇＧ　　Ｆｃ領域遺伝子が、この順序に連結
された形のプラスミドが最も好ましく、このプラスミド
を用いることにより、ヒトＩｇＧ　　Ｆｃ領域蛋白質の
ペリプラズムまでの分泌が可能になる。このようなペリ
プラズム分泌発現型プラスミドとして、好ましくはｐ　
ＰＳ−ＦＣが用いられる。

なお、本発明において適当なプロモーター領域、シグナ
ルペプチド領域、ヒトＩｇＧＦｃ領域遺伝子は、これら
と生物学的機能において同等なりＮ　Ａ　ｖＪ域、すな
わち該Ｄ　Ｎ　Ａ　８Ｎ域に対してヌクレオチドの置換
、ヌクレオチドの欠失、ヌクレオチドの挿入及びヌクレ
オチド配列の逆位その他の突然変異によって関連づけら
れているＤ　Ｎ　Ａ　９領域でもよいことはいうまでも
ない。

（ヒト免疫グロブリンＧＦｃＮ域蛋白質の生産）かくし
て得られた、ヒト■ｇＧ　Ｆｃ領域遺伝子菌体内発現型
プラスミド及びペリプラズム分泌発現型プラスミドを常
法により適当な宿主に導入して組換え微生物を得、これ
を培養することにより、ヒトＩｇＧ　Ｆｃ領域蛋白質を
生産させることができる。このような宿主としてはエシ
ェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属に属する微生物
を有利に使用することができる。宿主としては、前記の
エシェリヒア・コリＨＢ　１０１株、同０６００株、同
ＤＰ−ｓｕｐＦ株、同ｘ　１７７６株、同Ｌ２３９２株
等、通常この種の技術分野で用いられる微生物が有利に
用いられる。なかでも、エシェリヒア・コリＨ８１０１
株及び同０６００株がとりわけ好ましい。

このようにして得られた組換え微生物を、それ自体は公
知の方法で培養する。培地としては、ヒ）ＩｇＧ　　Ｆ
ｃ領域蛋白質の生産に適した培地であって、かつ宿主微
生物の生育に適した培地を用い得るが、たとえばＭ９培
地（Ｔ、Ｍａｎｉａｔｉｓら編、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　
Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｐ４４０（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　
Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒ
ｋ　１９Ｂ２））　、Ｌ　Ｂ培地（Ｔ、Ｍａｎｉａｔｉ
ｓら編、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、　Ｐ４
４０（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　１９８２））　、
Ｂ　Ｐ　Ｂ培地（［）ｉｆｃｏ製）　、Ｎｕｔｒｉｅｎ
ｔ寒天培地等を基本培地として調製したものを用いれば
よい。その他、必要に応じて、炭素源窒素源の他にアミ
ノ酸、ビタミン等の栄養素を添加してもよいし、発現型
プラスミドの宿主内安定化のために適当量の抗生物質等
を添加してもよい。

培養は、ｐＨ１温度、酸素供給量を目的の組換え微生物
に適した条件で行なう。菌体内発現型プラスミドを有す
る組換え微生物の培養においては、プロモーターを効率
良く機能させるも目的で、イソプロピル−β−Ｄ−チオ
ガラクトシド等の薬剤を加えることもできる。ペリプラ
ズム分泌発現型プラスミドを有する組換え微生物の培養
においては、該微生物が生育してその菌体量が最大に達
したとき、部ち対数増殖後期からペリプラズムにＦＣ領
域蛋白質が生成、蓄積するまでの時間中、同一培地で培
養をそのまま継続するのがよい。なお、ｐＨ条件は特に
影響されないが、ｐＨ５〜８の範囲、特にｐＨ７が適当
である。

培養後、たとえばオスモティック、ショック法（Ｃ，Ｋ
ａｔｏら、Ｅ、Ｊ、Ａｐｐｌ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、Ｂ
ｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、。

■、　３３９（１９８３）　）を用いて、培養物を菌体
内画分、ペリプラズム画分とに分画する。両両分におけ
るヒトｒｇＧＦｃ領域蛋白質の有無は、たとえば市販の
ウサギ抗ヒ）ＩｇＧ−Ｆｃ成分抗血清及び酵素標識抗つ
サギＩｇ抗体を用いたエンザイム・イムノアッセイ　（
ＥＩＡ）により確認できる。

本発明において、アミノ酸、ペプチド、核酸、その他に
関し略号で表示する場合、それらはＩＵＰＡＣ−Ｉ　Ｕ
Ｂ生化学命名委員会（ＣＢ　Ｎ）による略号あるいは当
該分野における慣用略号に基づいて表示され、例えば下
記の略号が使用される。

なお、アミノ酸などに関して光学異性体があり得る場合
は、特に明示しなければ５体を示すものとする。

Ｃｙｓニジスティン Ｍｅｔ：メチオニン Ｇｌｕ：グルタミン酸 Ａｓｐ：アスパラギン酸 Ｌｙｓ　：リジン Ａｌｇ：アルギニン Ｈｉｓ　：ヒスチジン Ｐｈｅ　：フエニールアラニン Ｔｙｒ：チロシン Ｔｒｐ：）リブトファン Ｐｒｏニブロリン Ａｓｎ：アスパラギン Ｇｉｎ：グルタミン Ｇｌｙニゲリシン Ａｌａ　：アラニン Ｖａｔ：バリン Ｌｅｕ　：ロイシン １１ｅ：イソロイシン Ｓｅｔ：セリン Ｔｈｒ：スレオニン ＤＮＡ　：デオキシリポ核酸 Ａ　：アデニン Ｔ　：チミン Ｇ　ニゲアニン Ｃ：シトシン ＥＤＴＡ：エチレンジアミン四酢酸 ＳＤＳ　ニドデシル硫酸ナトリウム 以下実施例を掲げて本発明について詳細に説明するが、
本発明は何らこれにより限定されるものではない。

実施例１　（ヒト染色体ＤＮＡ０単離）ヒト骨髄腫細胞
ＡＲＨ７７株３Ｘ１０”個をガラス棒でつぶし、２％Ｓ
ＤＳ存在下、プロテアーゼＫ（シグマ）で処理した後、
ＴＥバッファー〔１０ｍＭ　　Ｔｒ　１ｓ−ＨＣｌ　（
ｐＨ８，０）、１ｍＭ　　ＥＤＴＡ）で飽和したフェノ
ールを加えた。遠心分離により水相とフェノール相を分
離しくフェノール抽出）、水相をＴＢＳバフフｙ−Ｃ２
０ｍＭＴｒｉ　５−ＨＣｊ２　（ｐＨ７，５）、１００
ｍＭ　　ＮａＣ１，５ｍＭ　　ＥＤＴＡ）に対して透析
した。リボヌクレアーゼＡ（シグマ）処理をし、再度フ
ェノール抽出を行なった後、ＴＥバッファーに対して透
析し、ヒト染色体ＤＮＡ約１．２ｍｇを取得した。（Ｎ
。

Ｂ１１ｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、
主、２３０３　（１９７６）参照〕。

実施例２（ヒト遺伝子ライブラリーの作成）実施例１で
得られたヒト染色体Ｄ　Ｎ　Ａ　１５０μｇを後述する
実施例４に示した方法に準じて制限酵素ＥＣ０ＲＩ　　
（宝酒造）で部分分解した後、蔗糖密度勾配遠心〔蔗糖
１０〜４０％（ｗｔ／ｖｏｌ）、２８０００ｒｐｍｘ１
５時間、２０℃〕を行ない、１５　Ｋ　ｂｐ〜２３　Ｋ
ｂｐに相当するＤＮＡ断片４．３μｇを得た。次にこの
ＤＮＡ断片０．８μｇとシャロン４Ａベクターとの連結
を行い、シャロン４Ａベクターの右のアームと左のアー
ムの間にヒト由来のＤＮＡが挿入されたハイブリッドＤ
ＮＡを得た。連結にはＴ４−ＤＮＡリガーゼ（ベセスダ
・リサーチ・ラボラトリーズ）を用い、連結反応は６６
ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　（ｐＨ７，６）−６，６ｍ
Ｍ　　ＭｇＣｆｚ　−１０ｍＭジチオスレイトール−１
ｍＭ　　ＡＴＰ水溶液中で、１１℃、１２時間行なった
。得られたハイブリッドＤＮＡについて、イン・ビトロ
・パフケージングを行ない、ヒト遺伝子ライブラリー（
１，８Ｘ　１０”ＰＦＵ／μｇ１ヒト染色体ＤＮＡの９
９％以上を含む）とした。

実施例３　（ヒト免疫グロブリンＧ遺伝子のスクリーニ
ング） 前記実施例２で得られたヒト由来のＤＮＡを含むシャロ
ン４Ａフアージの集合（遺伝子ライブラリー）をエシェ
リヒア・コリＬＥ３９２株に怒染させ、プラークを形成
させた。ヒト抗体遺伝子を含むクローンは、プラーク・
ハイブリダイゼーション法により、（”Ｐ）−標識ヒト
免疫グロブリンＧＨ鎖Ｊ遺伝子で選択した。ヒト１ピＧ
遺伝子を含むシャロン４ＡフアージからのＤＮＡの調製
は、Ｔｈｏｍａｓらの方法ＣＭ、Ｔｈｏｍａｓら＋　Ｊ
、Ｍｏ１．Ｂｔｏｌ、。

９１、３１５（１９７４）参照〕により行なった。

実施例４（制限酵素切断点地図の作成）実施例３で得ら
れたヒｌ−１ｇＧ遺伝子を含むシャロン４Ａ　　ＤＮＡ
Ｉμｇを制限酵素切断用バッファ　−（ＥｃｏＲＩ、Ｈ
ｐａ　Ｉ、Ｈｉｎｆ　Ｉ、ＴａｑＩ、ＸｂａＩＳＸｈｏ
Ｉ切断では５０ｍＭ　　Ｔｒ　ｉ　５−ＨＣＥ　（ｐＨ
７，４）　−１００ｍＭ　　ＮａＣ１−１０ｍＭ　　Ｍ
ｇＳＯ４水溶液を、ＡｃｃＩＩ、Ｂａｍ　　Ｈｌ、Ｃｊ
２ａｌ、Ｈｉｎｄｌｌ［、ｐｓｔｉ。

ＲｓａＩ、５ａｕ３ＡＩ切断ではＩＱｍＭ　　Ｔｒｉｓ
−ＨＣＩ　（ｐＨ７，５）　−６０ｍＭ　　ＮａＣｊ２
−７ｍＭ　　ＭｇＣ１ｚ水溶液を、Ｂａ　ｌ　Ｉ、　Ｂ
ｓ　ｔＮｌ　ｓ　Ｎ　ａ　ｅ　Ｉ　ＳＳ　ｓ　ｔ　ｎ切
断では１０ｍＭＴ　ｒ　ｉ　５−ＨＣｌ（ｐＨ７，４）
−１０ｍＭ　　Ｍｇ５Ｏａ　−１ｍＭ　　ジチオスレイ
トール水溶液を、そしてＳｍａｌ切断では１０ｍＭ　　
Ｔｒ　ｉ　５−ＨＣＩｌ　（ｐＨ８゜０）−２０ｍＭ　
　ＫＣｊ？−７ｍＭ　　ＭｇＣｊ２．−７ｍＭ　　２−
メルカプトエタノール水溶液を、それぞれ用いた。〕２
０μｌに溶解させ、制限酵素（ＢｓＬＮ　Ｉ％　Ｃｆｆ
１ａ　Ｉ、　Ｎａ　ｅ　１はニュー・イングランド・バ
イオラブズ製、５ｓｔＩｒはペセスダ・リサーチ・ラボ
ラトリーズ製、Ｒｓａ　Ｉｓ　５ａｕ３Ａｔ、Ｔａｑｌ
はニラポン・ジーン製、それ以外は宝酒造製を用いた。

）２〜４ユニツトを添加して、３７℃、１時間以上切断
を行なった。制限酵素Ｂｓ　ｔＮｌ及びＴａｑＩによる
切断は、６０℃で１時間以上切断を行なった。なお、二
種類の制限酵素による切断を行なう場合には、まず低塩
濃度で作用する制限酵素で処理し、次に所定濃度まで塩
濃度を上げてから、より高塩濃度で作用する制限酵素で
処理した。

制限酵素による切断後、４μｌの０．２５％ブロモフェ
ノールブルー−５０％グリセロール水溶液を加え、アガ
ロースゲル電気泳動（ゲル濃度０．８％〜２．５％）を
行なった。アガロースはシグマ社のタイプ■電気泳動用
を使用した。電気泳動バッファーとして、４０ｍＭ　　
Ｔ　ｒ　ｉ　Ｓ−ＣＨ３Ｃ００Ｈ（ｐＨ８，０）−１ｍ
Ｍ　　ＥＤＴＡ水溶液を用いた。

厚さ２ｍｍの垂直ゲルにて、６〜９ｖ／ｃ１１の電圧で
１．５〜３時間電気泳動を行なった。この電気泳動の際
、ＤＮＡ断片の分子量マーカーとして、λファージのＤ
ＮＡを制限酵素）１　ｉ　ｎｄｌ［Ｉで切断したもの（
ベーリンガー・マンハイム）を用いた。電気泳動終了後
、アガロースゲル中のＤＮＡを２μｇ　／　ｍ　１エチ
ジウムブロマイド水溶液で染色し、このゲルに対して長
波長紫外線を照射して、切断パターンの観察を行なった
。各種制限酵素単独による切断、及び二種の制限酵素の
組合せによる切断、これらの切断パターンを解析するこ
とにより、第２図（Ａ）に示すような各制限酵素切断点
の相対位置関係を決定した。第２図（Ａ）はｘｇａ遺伝
子を含むヒト染色体ＤＮＡの制限酵素切断点地図を示す
。

実施例５（ヒト免疫グロブリンＧ遺伝子断片のサブクロ
ーニング） ヒ）ＩｇＧ遺伝子を含むシャロン４Ａ　　ＤＮＡ３μｇ
を実施例４の方法に準じて制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで切
断し、アガロースゲル電気泳動（ゲル濃度０．８％）を
行なった。ヒ）ＩｇＧ　　Ｆｃ領域遺伝子を含む約８．
２　ＫｂｐのＤＮＡの部分に相当するバンドを切出し、
そのアガロースゲル断片を３倍ｆＪ　（ｖｏｌ　７ｗｔ
）の８　Ｍ　　Ｎ　ａ　ＣＩ　Ｏａ水溶液に溶解させた
。Ｃｈｅｎらのグラスフィルター法（ｃ、ｔ＋、ｃｈｅ
ｎら、八ｎａ１．Ｂｉｏｃｈｅｍ、＋　１０１．３３９
（１９８０）　）により、約８．２　ＫｂｐのＤＮＡ断
片をアガロースゲルにより回収した。一方、大腸菌用プ
ラスミドｐ　Ｂ　Ｒ３２２１μｇを実施例４に準じて制
限酵素Ｈｉ　ｎｄｌｌで切断したものに対して、アルカ
リ性ホスファターゼ（Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｃ７５）　　（宝
酒造）を０．５ユニット加えて、３７℃で１時間反応さ
せた。反応終了後、反応液中のアルカリ性ホスファター
ゼを失活・除去するために、フェノール抽出を３回繰返
した。このようにして得られたｐ　Ｂ　Ｒ３２２のＨｉ
ｎｄｍ−アルカリ性ホスファターゼ処理液を、ゲルより
回収した約８．２Ｋｂｐ　　Ｈｉｎｄｌ［Ｉ　　断片水
溶液と混ぜ、エタノール沈澱の後、連結反応用バッファ
ー（実施例２を参照）５０μ２に溶解させる。２ユニツ
トの７４−ＤＮＡリガーゼを加え、１１℃、１２時間反
応させて、連結反応を行なった。

エシェリヒア・コリ０６００株（ＡＴＣＣ３３５２５）
の形質転換は、通常のＣａＣｊ！ｚ法（Ｍ、Ｖ、Ｎ。

ｒｇａｒｄらの方法、前記）の改良法で行なった。すな
わち、５　ｍ　ｌのし培地（１％　トリプトン、０゜５
％　酵母エキス、０．５％　ＮａＣｆ、　ｐＨ７，２）
に大腸菌Ｃ６００株の１８時間培養基を接種し、菌体を
含む培養液の６００ｎｍにおける濁度（ＯＤ、。。）０
．３まで生育させる。菌体を冷たいマグネシウム・バッ
フｙ−（０，Ｉ　Ｍ　　ＮａＣ１，５ｍＭ　　ＭｇＣ１
，，５ｍＭ　　Ｔｒ　ｉ　５−ＨＣｌ　（ｐＨ７，６，
０℃）〕中で２回洗い、２ｍｌの冷やしたカルシウム・
バッフｙ　−（１００ｍＭ　　Ｃａ　Ｃ１ｚ　、２５０
ｍＭ　　ＫＣＩＩ、５ｍＭ　　ＭｇＣ１ｚ　、５ｍＭ　
　Ｔｒ　ｉ　５−ＨＣｌ　（ｐＨ７，６，０℃）〕中に
再懸濁させ、０℃で２５分間放置する。次に菌体をこの
容量の１／１０にカルシウム・バフファーの中で濃縮し
、連結後のＤＮＡ水溶液と２　：　１　　（ｖｏｌ、：
ｖｏｌ、）混合する。この混合物を６０分間、０℃で保
った後、１ｍｊ２のＬＢＧ培地（１％　トリプトン、０
．５％酵母エキス、１％　ＮａＣ１１０，０８％　グル
コース、ｐ　Ｈ７，２）を添加し、３７℃で１時間振と
う培養する。培養液を、選択培地（アンピシリン３０μ
ｇ／ｍｌを含むし培地プレート）に１００μｌ／プレー
トの割合で接種する。プレートを３７℃で１晩培養して
、形質転換株を生育させる。得られたアンピシリン耐性
のコロニーより、公知の方法を用いてＤＮＡを調製し、
アガロースゲル電気泳動により、目的のサブクローンｐ
ＴＪＩＢ（約１２．６Ｋｂｐ）を確認した。

前記実施例４の方法により作成した、このサブクローン
の制限酵素切断点地図を第２図（Ｂ）に示した。この第
２図（Ｂ）においてＰｓｔｌ　−（３）からＨｉｎｄｌ
ｌｌ−（３）の間に、ＰｓｔＩサイトが３〜４個存在す
ることは確認したが、その位置についての確認は行なっ
ていない。

さらに、前記プラスミドｐＴＪＩＢのＰｓｔＩ−（２１
Ｐ　ｓ　ｔ　Ｉ−（３）のＤＮＡ断片（約１．７　Ｋｂ
ｐ）を、ｐＴＪ　Ｉ　Ｂの場合とほぼ同様の手法により
、プラスミドｐＢＲ３２２のＰｓｔｌサイトに挿入し、
プラスミドｐＴＪ５　　（約６゜Ｉ　Ｋｂｐ）を作成し
た。目的のクローンは、テトラサイクリン耐性の形質転
換株の中から選択した。得られたサブクローンの制限酵
素切断点地図を、第２図（Ｃ）に示した。

実施例６（ヒト免疫グロブリンＧ　　Ｆｃ領域遺伝子Ｄ
ＮＡ塩基配列の決定） ヒ）ＩｇＧＦｃ領域遺伝子のＤＮＡ塩基配列は、マキサ
ム・ギルバート法により決定した。

たとえば、前記実施例５において作成されたサブクロー
ンｐＴＪ５　　ＤＮＡ約５０μｇを実施例４　　　゛の
方法に準じてＳｍａ　Ｉで切断する。得られたＤＮＡ断
片をアルカリ性ホスファターゼで脱ホスホリル化し、ポ
リヌクレオチドキナーゼ（Ｐ−Ｌバイオケミカルズ）−
５ユニツトを用いて〔γ−３２Ｐ）ＡＴＰで標識した。

ポリヌクレオチドキナーゼ反応は５０ｍＭ　　Ｔｒ　１
ｓ−ＨＣｊ２　（ＰＨ７，５）　−１０ｍＭ　　ＭｇＣ
ｆｚ　−５ｍＭ　　ジチオスレイトール水溶液中で行な
い〔γ−”Ｐ）−ＡＴＰはアマージャム製を１００ｐＣ
ｉ分用いた。″′Ｐ標識ＤＮＡ断片をＰＳｔｌで切断し
た後、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ゲル濃度５％
）により目的のＤＮＡ断片を分離し、後述の実施例７の
方法に従ってゲルからの抽出を行なった。得られた３ｔ
ｐ標識−Ｓｍａｌ　　　Ｐｓｔ！断片について、各塩基
特異的な部分分解反応を行ない、７Ｍ尿素を含むポリア
クリルアミドゲル電気泳動（ゲル濃度８％〜２３％）で
分離した。２〜７日間、−８０℃でオートラジオグラフ
ィーを行なった後、分解パターンの解析を行ない、ＦＣ
６Ｎ域遺伝子の塩基配列決定のための資料とした。

一方、ｐＴＪ５をＰｓｔＩで切断した場合には、３′末
端標識キツト（アマ−ジャム）を用いて、〔α−”Ｐ）
−ｄｄＡＴＰによる標識を行なった。

この２２ｐ、−標識ＤＮＡ断片をＳｍａｌで切断した後
、目的のＤＮＡ断片のポリアクリルアミドゲル電気泳動
（ゲル濃度５％）による分離・回収を行なった。得られ
た３！Ｐ標識−Ｐｓｔｌ−Ｓｍａｌ断片についても、上
記手順に従って解析を行ない、ＦＣＮ域遺伝子の塩基配
列決定のための資料とした。

実施例７（Ｆｃ領域ＣＩ（３部位遺伝子のクローニング
） 実施例５で得られたプラスミドｐＴＪ５を、実施例４の
方法に準じて制限酵素ＰｓｔＩで切断した後、アガロー
スゲル電気泳動（ゲル濃度０．８％）を行ない、Ｆ　ｃ
　ｊｆｌ域遺伝子を含む約１．７　ＫｂｐのＤＮＡ断片
を実施例５の方法でゲルより回収した。得られたＤＮＡ
断片を、実施例４の方法で制限酵素ＮａｅＩで切断し、
ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ゲル濃度５％）を行
なった。Ｃ，３部位遺伝子を含む約０．６　ＫｂｐのＤ
ＮＡの部分に相当するバンドを切断し、そのポリアクリ
ルアミドゲル断片を細かく破砕した後、２〜５ｍｌの溶
出用バッフｙ　−（５００ｍＭ　　ＮＨａ　ＯＡｃ、　
　１ｍＭＥＤＴＡ、０．１％　Ｓ　Ｄ　Ｓ　（ｐＨ７，
５））を加え、３７℃で一晩振とうした。遠心分離によ
り、目的のＤＮＡを含む水相の回収を行なった。さらに
得られたＤＮＡ断片を、実施例４の方法で制限酵素Ｒｓ
ａｌで切断し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動くゲル
濃度５％）の後、Ｃ１１３部位を含む約３１０ｂｐのＤ
ＮＡ断片を、上記と同様な方法により、ポリアクリルア
ミドゲルから回収した。

こうして得られたＣ）１３部位遺伝子を含む約３１０ｂ
ｐのＲｓ　ａ　Ｉ←→Ｎａ　ｅ　ｌのＤＮＡ断片を、実
施例５の方法に準じてプラスミドｐＢＲ３２２のＢａ１
ｌサイトに挿入し、ＣＭ３部位遺伝子の読みとり方向が
プラスミドｐ　Ｂ　Ｒ３２２中のテトラサイクリン耐性
遺伝子の読みとり方向と一致する方向（第３図において
時計まわりの方向）に挿入されたプラスミドｐＦｃ７０
（約４．７　Ｋｂｐ）を作成した。

ｐＦｃ７０作成の方法を第３図に示した。

実施例８（Ｆｃ領域ＣＨ２部位遺伝子とＣＭ３部位遺伝
子の連結） 実施例７で得られた、Ｆｃｗｉ域遺伝子を含む約１．７
ＫｂｐのＤＮＡ断片を、実施例４の方法に準じて制限酵
素５ａｕ３ＡＩおよびＴａｑＩで切断し、ポリアクリル
アミドゲル電気泳動（ゲル濃度５％）の後、ｃ、２部位
遺伝子を含む約２４０ｂｐのＤＮＡ断片約０．５μｇを
、実施例７の方法に準じて、ポリアクリルアミドゲルか
ら回収した。

Ｃｏ２部位とＣＨ３部位の連結部分に相当する、第４図
記載の塩基配列を存する２本鎖オリゴヌクレオチドを、
上の鎖と下の鎖とに分けて化学合成した。オリゴヌクレ
オチドの合成は全自動ＤＮＡ合成機（アプライド・バイ
オシステムズ、モデル３８０Ａ）を用いて、ホスフォア
ミダイト法により行なった。合成オリゴヌクレオチドの
精製は、アプライド・バイオシステムズ社のマニュアル
に準じて行なった。すなわち、合成オリゴヌクレオチド
を含むアンモニア水溶液を５５℃で一晩保つことにより
、ＤＮＡ塩基の保護基をはずし、セフ１デ７クスＧ−５
０フアイン・ゲル（ファルマシア）を用いたゲル濾過に
よって、高分子量の合成オリゴヌクレオチド画分を分取
する。ついで、７Ｍ尿素を含むポリアクリルアミドゲル
電気泳動（ゲル濃度２０％）の後、紫外線シャドウィン
グ法により泳動パターンの観察を行ない、目的とする大
きさのバンド部分を切出して、実施例７の方法に準じて
合成オリゴヌクレオチドをポリアクリルアミドゲルより
回収した。最後に合成オリゴヌクレオチドを含む溶液を
ゲル濾過カラム（セファデックスＧ−５０）にかけるこ
とにより、合成オリゴヌクレオチドの精製品を得た。な
お、必要に応じて、ポリアクリルアミドゲル電気泳動を
繰り返し合成オリゴヌクレオチドの純度の向上をはかっ
た。このようにして得られた合成オリゴヌクレオチド精
製物０．１〜１．０μｇを、実施例６の方法に準じて、
１ｍＭ　　ＡＴＰ存在下でポリヌクレオチドキナーゼ反
応を行ない、５′末端側をリン酸化する。５′末端をリ
ン酸化した、上の鎖と下の鎖に相当する２本の合成オリ
ゴヌクレオチドを混合し、その水溶液温度を７０℃から
室温まで徐々に冷却することにより、アニーリングを行
なった。以上のようにして、Ｃｏ２部位と０□３部位と
の連結部分に相当するＴａ　ｑ　Ｉ−ＳｍａＩのＤＮＡ
断片（約６８ｂｐ）を取得した。

一方、前記実施例７で作成したプラスミドｐＦＣ７０Ｄ
ＮＡ約５μｇを、実施例４記載の制限酵素Ｓｍａｌ切断
用バフファーに溶解し、２〜５ユニツトのＳｍａ　Ｉを
加えて２０℃で１５〜４５分反応させて部分分解を行な
う。フェノール抽出によりＳｍａＩを失活させた後、実
施例４の方法に準じて、制限酵素Ｅ３ａｍＨＩによる切
断を行なう。アガロースゲル電気泳動（ゲル濃度０．８
％）の後、Ｃ１１３部位遺伝子とベクターの大部分を含
む第４図記載のＢａｍＨＩ−Ｓｍａ　ｒ　−（１）のＤ
ＮＡ断片（約３．６　Ｋｂｐ）を、実施例５の方法に準
じてアガロースゲルより回収した。

以上のようにして得られた、ＣＨ２部位遺伝子を含む５
ａｕ３ＡＩ−Ｔａｑ　ＩのＤＮＡ断片、Ｃｓ２部位とＣ
Ｍ３部位の連結部分に相当するＴａｑ　Ｉ　−３ｍａ　
ＩのＤＮＡ断片、そして０．４３部位とベクタ一部分を
含むＢａｍＨＩ　　（Ｓａｕ３ＡＩ）　　　ＳｍａＩ−
（１）のＤＮＡ断片を混合し、実施例５の方法に準じて
、Ｃｕ２部位遺伝子とＣ）＋３部位遺伝子がイントロン
を介さずに連結された遺伝子を含むプラスミドｐＦＣ７
７（約３．９　Ｋｂｐ）を作成した。第４図にｐＦＣ７
７の作成方法を示した。

実施例９（Ｆｃ領域遺伝子とｔｒｐプロモーターとの連
結） 実施例８で得られたプラスミドｐＦＣ７７を、実施例４
の方法に準じて制限酵素Ｓｓｔ■及びＰｓｔｌで切断し
、アガロースゲル電気泳動（ゲル濃度０．８％）の後、
ＣＭ　２部位遺伝子の後半部分、ＣＮ３部位遺伝子全域
及びベクターの一部を含む、第５図記載の５ｓｔＩ［Ｐ
ｓｔＩのＤＮＡ断片（約２．７　Ｋｂｐ）を、実施例５
の方法に準じてアガロースゲルより回収した。

次に、実施例７で得られたＦｃｊｉｌ域遺伝子全遺伝子
１．７　ＫｂｐのＤＮＡ断片を、実施例４の方法に準じ
て制限酵素Ｂｓ　ｔＮＩ及び５ｓｔｎで切断し、ポリア
クリルアミドゲル電気泳動（ゲル濃度５％）の後、ｃ、
２部位遺伝子の前半部分を含む約１７１ｂｐのＢｓｔＮ
Ｉ−（５１５ｓｔｌｌのＤＮＡ断片を、実施例７の方法
に準じて、ポリアクリルアミドゲルから回収した。

さらに、プロモーターとＦｃ領域遺伝子との連結部分に
相当する、第５図記載の塩基配列を有する２本鎖オリゴ
ヌクレオチド（約３９ｂｐ）を、実施例８の方法に準じ
て作成した。このＣｊ２ａＩ−ＢｓｔＮｒ−（５）のＤ
Ｎ、〜断片中には、ｔｒｐプロモーターとの連結のため
の制限酵素ＣβａＩサイト、ＡＴＧという塩基配列で表
わされる翻訳開始コドン、ｈ部位遺伝子及びＣＭ　２部
位遺伝子の一部が連続して含まれており、このＤＮＡ断
片を用いることにより、イントロンのないＦｃｊＪ域（
ｈＣ）ｌ　２　　ＣＩ（３部位）遺伝子をトリプトファ
ン・オペロン・ＳＤ配列下流に適当な距離をへだでて連
結することが可能になった。

一方、ｔｒｐプロモーターを含むプラスミドｐｙｓ３１
Ｎ（約４．７　Ｋｂｐ）を、実施例４の方法に準じて制
限酵素Ｐ３ｔＩ及びＣｊ２ａｌで切断し、アガロースゲ
ル電気泳動（ゲル濃度０．８％）の後、ｔｒｐプロモー
ター及びベクターの一部を含む、第５図記載のＰｓｔＩ
　　　Ｃｊ！ａＩのＤＮＡ断片（約１．Ｉ　Ｋｂｐ）を
、実施例５の方法によりアガロースゲルより回収した。

以上のようにして得られた、ＣＨ２部位遺伝子後半と０
□３部位遺伝子とベクターの一部を含む５ｓｔＩ［Ｐｓ
ｔＩのＤＮＡ断片、Ｃ）１２部位前半部分を含むＢｓＬ
ＮＩ　−（５）　　　５ｓｔＩｒのＤＮＡ断片、プロモ
ーターとＦｃ　９５域遺伝子との連結部分に相当するＣ
ｊ！ａｌ　　　ＢｓｔＮＩ　−（５）のＤＮＡ断片、そ
してｔｒｐプロモーターとベクターの一部を含むＰｓｔ
ｌ　　　Ｃ１ａ■のＤＮＡ断片を混合し、実施例５の方
法に準じて、Ｆｃ領域（ｈ−ＣＨ２−ＣＭ　３部位）遺
伝子発現型プラスミドｐ　Ｆ　Ｃ２０３（約４．ＯＫｂ
ｐ）を作成した。第５図にｐ　Ｆ　Ｃ２０３の作成方法
を示した。

実施例１０（Ｆｃ領域遺伝子翻訳終止コドンのタンデム
化） 実施例９で得られたＦ＋Ｊｉ域遺伝子発現型プラスミド
ｐ　Ｆ　Ｃ２０３を、実施例８に記載の方法に準じて、
制限酵素ＳｍａＩで部分分解した後、制限酵素ＰｓＬＩ
よる完全分解を行なう。アガロースゲル電気泳動（ゲル
濃度０．８％）の後、Ｆｃ領域遺伝子の大部分とベクタ
ーの一部を含む第６図記載のＳ　ｍ　ａ　ｒ　−（２）
−Ｐ　ｓ　ｔ　ＩのＤＮＡ断片（約１．８　Ｋｂｐ）を
、実施例５の方法に準じてアガロースゲルより回収した
。

また、ＣＭ　３部位遺伝子後部と翻訳終止コドンに相当
する、第６図記載の塩基配列を有する２本鎖オリゴヌク
レオチド（約１７ｂｐ）を、実施例８の方法に準じて作
成した。このＳｍａＩ　−（２１←→ＢａｍＨＩのＤＮ
Ａ断片中には、ＣＩ（３部位遺伝子の一部、ＴＡＡＴＡ
Ｇという塩基配列で表わされるタンデム化翻訳終止コド
ン及びベクターとの連結のための制限酵素ＢａｍＨＩサ
イトが含まれており、このＤＮＡ断片を用いることによ
りＦｃ１ｌ域遺伝子の翻訳終止コドンのタンデム化が可
能になった。

一方、プラスミドｐ　Ｂ　Ｒ３２２を、実施例４の方法
に準じて制限酵素Ｐｓｔｌ及びＢａｍＨＩで切断、アガ
ロースゲル電気泳動（ゲル濃度０．８％）の後、ベクタ
ーの大部分を含む、第６図記載のＢａｍＨＩ　　　Ｐｓ
ｔｌのＤＮＡ断片（約３．２　Ｋｂｐ）を、実施例５の
方法によりアガロースゲルより回収した。

以上のようにして得られた、Ｆ　ｃ　９５域遺伝子の大
部分とベクターの一部を含むＳ　ｍ　ａ　Ｉ　−（２１
−ＰｓｔｌのＤＮＡ断片、ｃ、＋　３部位遺伝子後部と
タンデム化翻訳終止コドンを含むＳｍａＩ　−（２）−
ＢａｍＨＩのＤＮＡ断片、そして、ベクターの大部分を
含むＢ　ａ　ｍ　ＨＩ　−Ｐ　ｓ　ｔ　ＩのＤＮＡ断片
を混合し、実施例５の方法に準じて、タンデム化翻訳終
止コドンを有するＦｃ領域遺伝子発現型プラスミドｐ　
Ｆ　Ｃ２１１（約５．ＯＫｂＰ）を作成した。第６図に
ｐ　Ｆ　Ｃ２１１の作成方法を示した。

実施例１１（Ｆｃ領域遺伝子とｔａｃプロモーターとの
連結） 実施例９で得られたＦｃ　ＳＩ域遺伝子発現型プラスミ
ドｐ　Ｆ　Ｃ２Ｑ３を、実施例４の方法に準じて制限酵
素Ｃ１ａｌで切断し、ポリメラーゼ用バッフｙ　−［５
０ｍＭ　　Ｔｒ　１ｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７，２）、　１０
ｍＭ　　Ｍ　ｇ　Ｓ　０４．０．１　ｍＭ　　ジチオス
レイトール。

５０μｇ　／　ｍ　ｊ！　　ウシ血清アルブミン］４０
μｌに溶解し、０．２５ｍＭのｄＧＴＰ及び０．２５ｍ
ＭのｄＣＴＰ存在下で、２ユニツトのＤＮＡポリメラー
ゼＩ・ラージ・フラグメント（ベセスダ・リサーチ・ラ
ボラトリーズ）を加える。３７℃で３０分間反応させて
、末端の平滑化をはかる。次に、このＤＮＡ断片を、実
施例４の方法に準じて制限酵素Ｐｓｔ■で切断し、アガ
ロースゲル電気泳動（ゲル濃度０．８％）の後、Ｆｃ５
領域遺伝子全域とベクターの大部分を含む、第７図記載
の約２．８　ＫｂｐのＤＮＡ断片を、アガロースゲルよ
り回収した。

次に、ｔａｃプロモーターを含むプラスミドｐＤＲ５４
０（約４．０　Ｋｂｐ、　　ファルマシア）ＤＮＡを、
実施例４の方法に準じて制限酵素Ｂ　ａ　ｍ　ＨＩで切
断し、ついで上記の方法に準じて、ｄＧＴＰ、ｄＡＴＰ
、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ存在下、ＤＮＡポリメラーゼ■・
ラージ・フラグメント処理により、末端の平滑化を行な
う。次にこのＤＮＡ断片を、実施例４の方法に準じて制
限酵素ＰｓｔＩで切断し、アガロースゲル電気泳動（ゲ
ル濃度０．８％）の後、ｔａｃプロモーターとベクター
の一部を含む、第７図記載の約１．Ｉ　ＫｂＰのＤＮＡ
断片を、アガロースゲルより回収した。

以上のようにして得られた、ＦＣ領域遺伝子全域とベク
ターの大部分を含む約２．８　ＫｂｐのＤＮＡ断片と、
ｔａｃプロモーターとベクターの一部を含む約１．Ｉ　
ＫｂｐのＤＮＡ断片とを混合し、実施例５の方法に準じ
て、ｔａｃプロモーターの下流にＦｃ領域遺伝子が連結
した形の発現型プラスミドｐ　Ｆ　Ｃ３６１（約３．９
　Ｋｂｐ）を作成した。第７図にｐＦＣ３６１の作成方
法を示した。

上記により得られたＦｃ領域遺伝子発現型プラスミドｐ
Ｆｃ３６１　　ＤＮＡを、実施例４の方法に準じて制限
酵素≦ｓｔＵ及びＰＳｔＩで切断し、アガロースゲル電
気泳動（ゲル濃度０．８％）の後、ベクターの一部、ｔ
ａｃプロモーター及びＦｃ　９３域遺伝子前半部分を含
む、第７図記載の５Ｓｔｎ−Ｐ　ｓ　ｔ　ＩのＤＮＡ断
片（約１．３　Ｋｂｐ）を、実施例５の方法によりアガ
ロースゲルより回収した。

また、実施例１０により得られたタンデム化翻訳終止コ
ドンを有するＦｃ領域遺伝子発現型プラスミドｐ　Ｆ　
Ｃ２１１ＤＮＡを、実施例４の方法に準じて制限酵素５
ｓｔＩＩ及びＰｓｔｌで切断した後、上記と同じ手法に
より、Ｆ　ｃ　９ｉ域遺伝子後半部分、タンデム化翻訳
終止コドン及びベクターの大部分を含む、第７図記載の
ＰｓｔＩ　　　５ｓｔＩ［のＤＮＡ断片（約３．６　Ｋ
ｂｐ）を得た。

かくして得られた、ベクターの一部、ｔａｃプロモータ
ー及びＦｃ領域遺伝子前半部分を含むＳｓ　ｔ　ＩＩ−
Ｐ　ｓ　ｔ　ＩのＤＮＡ断片と、Ｆｃ領域遺伝子後半部
分、タンデム化翻訳終止コドン及びベクターの大部分を
含むＰｓｔＩ　　　５ｓｔＩＩのＤＮＡ断片とを混合し
、実施例５の方法に準じて、ｔａｃプロモーターの下流
にＦｃ領域遺伝子が連結され、なおかつタンデム化翻訳
終止コドンを有する形の発現型プラスミドｐ　Ｆ　Ｃ３
６２（約４．９　Ｋｂｐ）を作成した。第７図にｐ　Ｆ
　Ｃ３６２の作成方法を示した。

実施例１２（好アルカリ性バチルスｌ’ｋ１７０株染色
体ＤＮＡの調製） ペニシリナーゼを菌体外に生成、蓄積する能力を有する
好アルカリ性のバチルス隘１７０株（ＦＥＲＭ　　ＢＰ
−４６７）を培地（（ｇ／ｊ２）：グリセロール　２．
０、酵母エキス　５．０５ポリペプトン５．０．、Ｋｚ
ＨＰＯｎ　　１．０、Ｍｇ５Ｏｎ　　・７Ｈ２００，２
をＮａＨＣＯ：＋　　１０でｐＨ９，０に調整したもの
〕中、３０℃で１５時間振盪培養を行ない、対数増殖後
期の菌体を集菌後、フェノール法によるＤＮＡ抽出法に
よって染色体ＤＮＡを抽出、精製し、染色体ＤＮＡ５ｍ
ｇを得た。

実施例１３（好アルカリ性バチルスＮ１１７０株染色体
ＤＮＡ断片のベクターへの挿入） 実施例１２で得られた染色体ＤＮＡｌ０μｇをとり、実
施例４の方法に準じて、制限酵素ＥｃｏＲＩを加え、３
７℃で反応させて部分的に切断した。一方、ベクターと
して用いるテトラサイクリン抵抗性（Ｔｅｔ’）のｐＭ
Ｂ９プラスミドＤＮＡ　（ベゼセスダ・リサーチ・ラボ
ラトリーズ）を制限酵素ＥｃｏＲＩで完全に切断して６
５℃、５分の熱処理後、前者と混合して、実施例２の方
法に従ってＴ４−ＤＮＡリガーゼによって１０℃、２４
時間ＤＮＡ鎖の連結反応を行ない、６５℃、５分の熱処
理後、反応液に２倍容のエタノールを加えて染色体ＤＮ
Ａを組み込んだプラスミドＤＮＡを沈澱、採取した。

実施例１４（好アルカリ性バチルス！１ｈ１７０株ペニ
シリナーゼ遺伝子のクローン化） 実施例１３で得られた好アルカリ性バチルス１７０株染
色体ＤＮＡを有するプラスミドを、通常のＣａＣ１，法
（Ｍ、Ｖ、Ｎｏｒｇａｒｄらの方法、前記）により、エ
シェリヒア・コリＨＢ　１０１株に導入した。

これらの形質転換株の中からアンピシリン及びテトラサ
イクリンに耐性の株をスクリーニングし、好アルカリ性
バチルス魚１７０株ペニシリナーゼ遺伝子を存するクロ
ーンを選択した。この菌体を培養した後第１０図のよう
に処理することにより、ベニシリナーゼ遺伝子を含む４
．５　Ｋｂｐの挿入を有する組換えプラスミドｐＥＡＰ
１が得られた。さらに、実施例４の方法に準じて制限酵
素切断点地図を作成した。第９図にｐＥＡＰｌの制限酵
素切断点地図を示す。

実施例１５（好アルカリ性バチルス１ｌｋＬ１７０株染
色体ＤＮＡを有するプラスミドのＤＮＡ塩 基配列の決定） 好アルカリ性バチルスＮ［１１７０株の染色体ＤＮＡを
含むプラスミドのＤＮＡ塩基配列の決定は、Ｍ１３シー
クエンシング・キット（アマ−ジャム）を用い、Ｍ１３
ファージによるジデオキシ・チェーン・ターミネーショ
ン法により行なった。第１図に好アルカリ性バチルス徹
１７０株ペニシリナーゼ遺伝子プロモーター領域・シグ
ナル領域のＤＮＡ塩基配列を示した。

実施例１６（好アルカリ性バチルスｌ１ｈ１７０株染色
体ＤＮＡを有する各種プラスミド誘導体 の作成） 前記実施例１４で得られたエシェリヒア・コリＨＢＩＯ
Ｉ（ｐ　Ｅ　Ａ　Ｐ　１　）株を継代していく中で、ペ
ニシリナーゼ活性の増強（ｐＥＡＰｌの約３倍）された
変異株〔アンピシリン耐性（Ａｐ’）、テトラサイクリ
ン感受性（Ｔｅｔｓ））を得た。この変異株から第１０
図の方法によりプラスミドを調製したところ、ペニシリ
ナーゼの構造遺伝子の上流約４Ｋｂｐが脱落したプラス
ミドｐＥＡＰ３　　（約５゜８　Ｋｂｐ）が得られた。

第９図にｐＥＡＰ３の制限酵素切断点地図を示す。

実施例１７（好アルカリ性バチルスＮｏ、１７０株ペニ
シリナーゼ遺伝子ブロモ−クー領域・シ グナル領域を有するプラスミドの作成）クロラムフェニ
コールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子誘
導体を含むプラスミドｐＣＭＩ（約４．Ｉ　Ｋｂｐ、フ
ァルマシア）を実施例４の方法に準じて制限酵素Ｅｃｏ
ＲＩ及び５ａｌｌで切断し、アガロースゲル電気泳動（
ゲル濃度０゜８％）の後、エレクトロエリューション法
（Ｐ、Ｊ。

Ｇｒｅｅｎｅら、”　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅ
ｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　”　ｖ。

１．７．Ｍａｒｃｅｌｌ　Ｄｅｋｋｅｒ、１９７４．Ｐ
、８７）を用いて、約０゜５ＫｂｐのＣＡＴ遺伝子後半
部分を含むＥＣ０ＲＩＳａｉ！ｌのＤＮＡ断片を回収す
る。さらに、ＣＡＴ遺伝子誘導体を含むプラスミドｐＣ
Ｍ７（約４．Ｉ　Ｋｂｐ、ファルマシア）を上記と同様
にして、制限酵素Ｅｃ　ｏＲＩ及び５ａｊ２！で切断し
、アガロースゲル電気泳動（ゲル濃度０．８％）の後、
ＣＡＴ遺伝子前半部分とベクターの大部分から成る約３
．　Ｉ　Ｋ　ｂｐのＥ　ｃ　ｏ　ＲＩ　−３ａ　ＩＩ　
ＩのＤＮＡ断片を回収する。これらのＤＮＡ断片を混合
し、実施例２の方法に準じてＴ４−ＤＮＡリガーゼで連
結し、６５℃、５分間の熱処理後、反応液に２倍容のエ
タノールを加えてプラスミドＤＮＡを沈澱・採取した。

得られたプラスミドＤＮＡを実施例１４と同様にエシェ
リヒア・コリＨＢＩＯＩ株に導入形質転換し、アンピシ
リン耐性形質転換株から第８図の方法によりプラスミド
を分離・精製し、ＣＡＴ遺伝子誘導体を含む新規プラス
ミドｐｃＭ７１（約３．６　Ｋｂｐ）を得た。第１０図
にｐｃＭ７１の作成方法を示す。

前記実施例１６で得られたプラスミドｐＥＡＰ３を実施
例４の方法に準じて制限酵素Ｒ３ａＩで切断し、ポリア
クリルアミドゲル電気泳動（ゲル濃度５％）の後、上記
の方法に準じてペニシリナーゼ遺伝子プロモーター領域
及びシグナル領域を含むＲｓａｌ←→ＲｓａｌのＤＮＡ
断片（約２００ｂｐ）を回収する。このＲｓａ　Ｉ−Ｒ
ｓａ　ＩのＤＮＡ断片を末端をリン酸化したＨｉｎｄＩ
［［リンカ−（宝酒造）と混合、実施例２の方法に準じ
てＴ４−ＤＮＡリガーゼを用いて連結した後、実施例４
の方法に準じて制限酵素Ｈ４ｎｄＩ［［で切断する。

ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ゲル濃度５％）の後
、上記の方法に準じて末端が）（ｉｎｄｌ［［サイトに
変換されたベニシリナーゼ遺伝子プロモーター領域及び
シグナルペプチド領域を含むＤＮＡ断片（約２１０ｂｐ
）を回収する。一方、プラスミドｐｃＭ７１を実施例４
の方法に準じて制限酵素ＨｉｎｄＩ［Ｉで切断し、上記
のベニシリナーゼ遺伝子プロモーター領域及びシグナル
ペプチド領域を含むＨｉｎｄｌｌｌ　　　ＨｉｎｄｌＩ
［のＤＮＡ断片と混合し、実施例２の方法に準じてＴ４
−ＤＮＡリガーゼを用いて連結させ、上記の方法に準じ
てアンピシリン耐性、クロラムフェニコール耐性の形質
転換株よりプラスミドｐＰｓ１　　（約３．７　Ｋｂｐ
）を分離・精製した。このプラスミドｐＰｓ１において
は、ベニシリナーゼ遺伝子プロモーター領域及びシグナ
ルペプチド領域が、ＣＡＴ遺伝子の上流に同じ読み取り
方向で挿入された構造を有している。第１１図にｐＰｓ
ｌの作成方法を示した。

実施例１８（ＦＣ領域遺伝子ペリプラズム分泌発現型プ
ラスミドの作成） 実施例１１で作成したＦｃ＋ｆＩ域遺伝子菌体内発現型
プラスミドｌ）　Ｆ　Ｃ３６２を、実施例４の方法に準
じて制限酵素５ｓｔｎ及びＥｃｏＲＩで切断し、アガロ
ースゲル電気泳動（ゲル濃度０．８％）の後、ｔａｃプ
ロモーター領域・ｈ部位遺伝子・Ｃｏ２部位遺伝子の前
半部分を含む約０．４　ＫｂｐのＥｃ。

ＲＩ　　　５ｓｔｎのＤＮＡ断片と、ベクターの大部分
・Ｃイ２部位遺伝子後半部分・Ｃｏ３部位遺伝子を含む
約４．５　ＫｂｐのＥ　ｃ　ｏ　ＲＩ　−３ｓ　ｔ　Ｉ
ｆのＤＮＡ断片とを、実施例５の方法に準じてゲルより
回収する。このうちのｔａｃプロモーター領域・ｈ部位
遺伝子・ＣＭ２部位遺伝子前半部位を有するＥ　ｃ　ｏ
　ＲＩ　−Ｓ　ｓ　ｔ　ＩＩのＤＮＡ断片を、実施例４
の方法により制限酵素ＢｓｔＮＩで切断し、ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動くゲル濃度５％）の後、Ｃイ２部
位遺伝子の一部を含む約１７１ｂｐのＢｓｔＮＩ　　　
５ｓｔＩＩのＤＮＡ断片を、実施例７の方法に準じてゲ
ルより回収する。さらに、ペニシリナーゼ遺伝子プロモ
ーター’ｐ領域・シグナルペプチド領域とＦＣ領域遺伝
子との連結部分に相当する、第１２図記載の塩基配列を
有する２本鎖オリゴヌクレオチド（約５１ｂｐ）を、実
施例８の方法に準じて作成した。このＥｃｏＲＩ　　　
Ｂｓ　ｔＮＩのＤＮＡ断片中には、後のサブクローニン
グに必要な制限酵素５ａｊｉ’ｌサイト、ペニシリナー
ゼ遺伝子シグナルベプヂド領域遺伝子との連結のための
制限酵素ＨｉｎｄｌＩ［サイト、アミノ酸セリンをコー
ドするＴＣＡのコドン、ｈ部位遺伝子及びＣＨ２部位遺
伝子の一部が含まれている。

このＤＮＡ断片を用いることにより、大腸菌内で正しく
シグナルペプチドが切断され、Ｆｃ領域蛋白質のアミノ
末端にアミノ酸セリンが１細糸分についた形の蛋白質の
産生が期待できる。以上のようにして得られた、ベクタ
ーの大部分・Ｃ１１２部位遺伝子後半部分・Ｃ）１３部
位遺伝子を含むＥｃｏＲＩ　　　５ｓｔＩＩのＤＮＡ断
片、ｃ、２部位遺伝子の一部を含むＢｓｔＮＩ　　　５
ｓｔＩＩのＤＮＡ断片、及びペニシリナーゼ遺伝子シグ
ナルペプチド領域とＦ　ｃ　９５域遺伝子との連結部分
に相当するＥ　ｃ　ｏ　ＲＩ　−Ｂ　ｓ　ｔ　Ｎ　Ｉの
ＤＮＡ断片とを混合し、実施例５の方法に準じて、プラ
スミドｐＳＥＣ−Ｆｃ（約４．７　Ｋｂｐ）を作成した
。第１２図にｐＳＥＣ−ＦＣの作成方法を示す。

こうして得られたプラスミドｐＳＥＣＦＣを、実施例４
の方法に準じて制限酵素ＨｉｎｄＩ［［で切断する。一
方、実施例１７で得られたベニシリナーゼ遺伝子プロモ
ーター領域・シグナルペプチド領゛域を含むプラスミド
ｐＰｓ１を、実施例４の方法に準じて制限酵素Ｈｉｎｄ
ｌＩ［で切断し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ゲ
ル濃度５％）の後、ベニシリナーゼ遺伝子プロモーター
領域・シグナル領域を含むＨｉｎｄｌｌ［Ｈｉｎｄｌ［
ＩのＤＮＡ断片（約２１０ｂｐ）をエレクトロエリュー
ション法により回収する。このＤＮＡ断片を先に調製し
たプラスミドｐＳＥＣ−ＦＣの制限酵素１（ｉｎｄｌ［
Ｉ切断物と混合し、実施例１７の方法に準じて、Ｆｃ領
域遺伝子ペリプラズム分泌発現型プラスミドｐｐＳ−Ｆ
Ｃを作成した。第１３図にｐＰＳ−ＦＣの作成方法を示
した。

実施例１９（Ｆｃ領域蛋白質の分泌発現確認）前記実施
例１１で得られたＦ　ｃ　ｐｉ域遺伝子菌体内発現型プ
ラスミドｐ　Ｆ　Ｃ３６２を有するエシェリヒア・コリ
Ｃ６００株及び実施例１８で得られたＦｃ領域遺伝子ペ
リプラズム分泌発現型プラスミドｐｐＳ−ＦＣを有する
エシェリヒア・コリＨ８１０１株を、最終濃度３０μｇ
　／　ｍ　１のアンピシリンを含むＬＢＧＧ培地〔１％
　トリプトン、０．５％　酵母エキス、１％　ＮａＣｊ
！、０．１％　グルコース、０．２％　グリセロール（
ｐＨ７，２））に接種し、３７℃で２４時間振とう培養
を行なう。培養終了後、オスモティック・ショック法（
Ｃ，Ｋａｔｏら、前出）により、培賛物をペリプラズム
画分と菌体内画分とに分画する。すなわち、遠心分離に
よって集めた菌体を生理食塩水で洗浄した後、１ｍＭ　
　ＥＤＴＡを含む２５％ショ糖水溶液に懸濁させて、３
７℃で１０分間振とうする。再び、遠心分離によって菌
体を集め、菌体を氷冷した水に懸濁させた後、４℃で１
０分間振とうする。この懸濁液に等量の０．１Ｍリン酸
バッファー（ｐＨ７，０）を加えた後、遠心分離を行な
い、菌体と分離した上清部分をペリプラズム画分と、す
る。一方、この国体を０．０５Ｍ　　リン酸バッファー
（ｐＨ７，０）に懸濁させ、超音波により菌体を破壊す
る。遠心分離によって菌体残渣を除去した上清部分を菌
体内画分とした。

得られた両両分のサンプルは、アセトン乾燥を行なった
後、Ｔｒｉｓ−Ｈ（１！バッフｙ−（ｐＨ６，８）、Ｓ
ＤＳ、２−メルカプトエタノール、グリセロールを、そ
れぞれ最終濃度５ＱｍＭ、２％、４％、１０％になるよ
うに加えて、５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
〔鉛末、遺伝、虹、４３（１９７７）　）を行なった。

分離用ゲルは１２．５％とし、泳動バッファーは５ＤＳ
−Ｔｒｉｓ−グリシン形（Ｕ、に、Ｌａｅｍｍｌｉ、Ｎ
ａｔｕｒｅ、　２２７−１６８０（１９７０）　）を用
いた。電気泳動終了後、ゲル中の蛋白質を、２５ｍＭ　
　Ｔｒｉｓ　−１９２ｍＭ　　グリシン（ｐ　Ｈ８，３
）　−２０％　メタノールのバッファー中で、電気泳動
的にニトロセルロース・フィルターに吸着させ、ウェス
タン・プロンティングを行なった。蛋白質を吸着させた
ニトロセルロース・フィルターを３％ゼ−ラチンを含む
ＴＢＳバッフｙ　−（２０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ　
　（ｐ　Ｈ７，５）、５００ｍＭ　　ＮａＣ７り中に６
０分間浸した後、−次抗体としてウサギ抗ヒトＩｇＧ−
Ｆｃ成分抗血清（カッベル）を用いた間接法で、ベルオ
キシダーセ標識抗体を用いたイミュン・プロット・アッ
セイ・キット（バイオ・ラッド）により、ヒトＩｇＧ　
　Ｆｃ領域蛋白質を特異的に染色した。結果の一部を複
写して第１４図に示した。この際に、後記参考側記載の
方法により調製した既知量の天然型ヒ）ＩｇＧ　　Ｆｃ
領域蛋白質も同一の５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで
電気泳動等を行なった。

第１４図より、Ｆｃ領域遺伝子菌体内発現型プラスミド
ｐ　Ｆ　Ｃ３６２を有するエシェリヒア・コリＣ６００
株の場合には、Ｆｃ領域蛋白質は菌体内画分にのみ局在
しているのに対して、ペリプラズム分泌発現型プラスミ
ドｐＰＳ−ＦＣを有するエシェリヒア・コリＨＢＩＯＩ
株の場合にはべりプラズムまでＦｃ領域蛋白質が分泌さ
れていることがわかる。また、天然型Ｆｃ領域蛋白質に
くらべ大腸菌産生ＦｃＮ域蛋白質の分子量が約５０００
ダルトン程度小さいという第１４図の結果から考えて、
大腸菌産生Ｆｃ領域蛋白質には糖鎖の付加がおこってお
らず、シグナルペプチドは除去されているものと思われ
る。

参考例（天然型ヒト免疫グロブリンＧＦｃｊｉＪｉ域蛋
白質の調製） ０．３ｇのヒトＩｇＧ（シグマ）　、１７．５ｍｇのシ
スティン、７．５ｍｇのＥＤＴＡ−２ＮａをＰＢＳバッ
フｙ　−（１００ｍＭ　　リン酸バッフｙ　−（ｐ　Ｈ
７，４）、１４０ｍＭ　　ＮａＣＡ）に溶解し、１５０
μｇのパパイン（シグマ、タイプ■）を添加して、３７
℃で７時間放置する。パパイン処理後のＩｇＧを、ＰＢ
Ｓパンファーで平衡化したセファデックスＧ−２００ス
ーパー・ファイン・ゲル（ファルマシア）を用いた濾過
カラムにかけ、パパイン処理によって生成したＦｃ領域
蛋白質及びＦａｂ領域蛋白質を、未反応のＩｇＧと分離
した。得られたＦｃ領域蛋白質とＦ　ａ　ｂ　領域蛋白
質とを含む溶液を水に対して透析し、凍結乾燥によって
濃縮した後、ＤＥ５２・ＤＥＡＥセルロース（ワットマ
ン）を用いたイオン交換カラムにかけた。カラムを１０
ｍＭ　　リン酸バッファー（ｐＨ７，４）で洗浄し、Ｆ
ａｂ領域蛋白質を完全に溶出させた後、ＮａＣ１濃度を
ＱｍＭから３５０ｍＭまで直接的に変化させた１０ｍＭ
リン酸バッファー（ｐＨ７，４）を用いて、Ｆｃ領域蛋
白質を溶出させた。上記と同様にして透析、凍結乾燥を
行ない、天然型ヒ）ＩｇＧＦｃ領域蛋白質を取得した。

【図面の簡単な説明】

第１図は、ヒ）ＩｇＧ　　Ｆｃ領域遺伝子ペリプラズム
分泌発現型プラスミドｐＰＳ−ＦＣのＤＮＡ塩基配列の
一部と、それに対応する好アルカリ性バチルス１ｌｈ１
７０株ペニシリナーゼ・シグナルペプチドとＦｃ領域蛋
白質のアミノ酸配列を示したものである。 第２図は、ヒトＩｇＧ遺伝子を含むファージ・クローン
制限酵素切断点地図と、ｌ”ｃ領域遺伝子を含むサク゛
クローンの制限酵素切断点地図を示したものである。 第３図は、ＣＭ３部位遺伝子を含むプラスミドｐＦｃ７
０の作成方法を示したものであり、第４図は０．２’−
ＣＭ　３部位遺伝子を含むプラスミドｐＦＣ７７の作成
方法を示したものである。 第５図、第６図、第７図はそれぞれＦＣＣ領域遺伝子菌
体内発現型プラスミドルＦｅ２Ｏ２、ｐＦＣ２１１、ｐ
　Ｆ　Ｃ３６２の作成方法を示したものである。 第８図は、プラスミドＤＮＡの大腸菌からの分離・精製
方法を示したものである。 第９図は、好アルカリ性バチルス寛１７０ペニシリナー
ゼ遺伝子のクローン化の方法及びペニシリナーゼ遺伝子
を有するプラスミドｐＥＡＰ１及びｐＥＡＰ３の作成方
法を示したものである。 第１０図は、クロラムフェニコーノυアセチルトランス
フェラーゼ構造遺伝子を含むプラスミドｐＣＭ７１の作
成方法を示したものである。 第１１図はペニシリナーゼ遺伝子プロモーター領域・シ
グナルペプチド領域を含むプラスミドｐｐＳ１の作成方
法を示したものである。 第１２図は、シグナルペプチド領域遺伝子との連結用ジ
ヨイントを有するＦＣ領域遺伝子を含むプラスミドｐ　
５ＥＣ−ＦＣの作成方法を示したものである。 第１３図は、Ｆ　Ｃ８Ｗ域遺伝子ペリプラズム分泌発現
型プラスミドｐ　ＰＳ−ＦＣの作成方法を示したもので
ある。 第１４図は、Ｆｃ領域蛋白質の分泌確認結果を示したも
のである。

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. （１）ヒト免疫グロブリンＧ　Ｆｃ領域蛋白質をコード
   するＤＮＡ領域、該蛋白質の発現調節を行なうプロモー
   ター機能を有するＤＮＡ領域及びシグナルペプチドをコ
   ードするＤＮＡ領域を有するプラスミド。
2. （２）ヒト免疫グロブリンＧ　Ｆｃ領域蛋白質をコード
   するＤＮＡ領域が、第１図に示されたアミノ酸配列の３
   ２番目（Ｔｈｒ）から２５４番目（Ｌｙｓ）までによっ
   て示されたポリペプチドをコードするＤＮＡ領域を少な
   くとも含むことを特徴とする第１項記載のプラスミド。
3. （３）プロモーター機能を有するＤＮＡ領域が、好アル
   カリ性バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）Ｎｏ．１７０株の
   染色体ＤＮＡ由来であることを特徴とする第１項記載の
   プラスミド。
4. （４）シグナルペプチドをコードするＤＮＡ領域が、好
   アルカリ性バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）Ｎｏ．１７０
   株の染色体ＤＮＡ由来であることを特徴とする第１項記
   載のプラスミド。
5. （５）プラスミドｐＰＳ−ＦＣである第１項記載のプラ
   スミド。
6. （６）ヒト免疫グロブリンＧ　Ｆｃ領域蛋白質をコード
   するＤＮＡ領域、該蛋白質の発現調節を行なうプロモー
   ター機能を有するＤＮＡ領域及びシグナルペプチドをコ
   ードするＤＮＡ領域を有するプラスミドによって形質転
   換された組換え微生物細胞。
7. （７）該微生物細胞がエシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃ
   ｈｉａ）属に属することを特徴とする第６項記載の微生
   物細胞。
8. （８）該微生物細胞がエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅ
   ｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）ＨＢ１０１株であることを特
   徴とする第６項記載の微生物細胞。
9. （９）ヒト免疫グロブリンＧ　Ｆｃ領域蛋白質をコード
   するＤＮＡ領域、該蛋白質の発現調節を行なうプロモー
   ター機能を有するＤＮＡ領域及びシグナルペプチドをコ
   ードするＤＮＡ領域を有するプラスミドによって形質転
   換された微生物を、ペリプラズムにヒト免疫グロブリン
   Ｇ　Ｆｃ領域蛋白質が生成、蓄積するまで培養を行ない
   、培養物からヒト免疫グロブリンＧ　Ｆｃ領域蛋白質を
   採取することを特徴とするヒト免疫グロブリンＧ　Ｆｃ
   領域蛋白質の製造方法。
10. （１０）該微生物がエシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈ
    ｉａ）属に属することを特徴とする第９項記載の方法。
11. （１１）該微生物がエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒ
    ｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）ＨＢ１０１株であることを特徴
    とする第９項記載の方法。