JPH03501321A - 抗体遺伝子のモジュールの会合、それによって製造される抗体およびその用途 - Google Patents

抗体遺伝子のモジュールの会合、それによって製造される抗体およびその用途

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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の名称 抗体遺伝子のモジュールの会合、それによって製造される抗体およびその用途 発明の背景 本出願は、１９８５年１１月１日出願の出願番号７９３．９８０の一部継続出願 である１９８６年１０月２７日出願のＰＣＴ出願ＷＯ３７１０２６７１の一部継 続出願であり、その記載内容は引用によって本明細書に完全に含まれる。
Ｒ里（２）公！ 本発明は、免疫グロブリンの組換えＤ　Ｎ　Ａ　’ＪＡ造法、それをコードして いる遺伝子配列およびその様な配列を得るための方法に関するものである。
背景技術 ］−ラーおよびミルシ二タイン（Ｋｏｈｌｅｒ　ａｎｄ　Ｍｉｌｓｔｅｉｎ）に よるモノクローナル抗体の製造のための細胞−細胞融合の適用（Ｎａｔｕｒｅ（ Ｌｏｎｄｏｎ）、２５６：４９５，１９７５）は生物学に革命を起こし、組換え Ｄ　Ｎ　Ａクローニングの発明に影響を与えた。ハイブリドーマによって産生さ れたモノクローナル抗体は、臨床診断および基礎的科学研究において既に広範に 使用されている。ヒトＢ細胞ハイブリドーマ産生性モノクローナル抗体の適用は 、癌、ウィルスおよび微生物感染症、抗体産生の低下したＢ細胞免疫不全、およ び免疫系のその他の疾患および障害の臨床治療のために非常に有望である。
残念ながら、ヒトハイブリドーマセルラインからのモノクローナル抗体の収量は 比較的低く（マウスハイブリドーマでは１００μｇ／村であるのに比較し、ヒト Ｘヒトでは１μｇ／ｚ１り、大量ヒト組織培養で製造される抗体の製造コストは 高い。一方、マウスＸマウスハイブリドーマは大量のタンパクを産生じ、これら のセルラインはヒトセルラインより安定なので、これらは有用である。しかしな がら、マウス抗体の様な“外来の”抗体をヒトに繰り返して注入すると、有害な 過敏性反応を生じることがある。
そのため、最近では、マウス−マウスハイブリドーマからのモノクローナルの利 点を有し、更にヒトモノクローナル抗体の種特異性を有する抗体の産生の可能性 が探求されている。
免疫学者が直面するその他の問題は、細胞培養で得られるほとんどのヒトモノク ローナル抗体（即ち、ヒト認識特性を有する抗体）が１ｇＭタイプであるという ことである。しかしながら、ＩｇＧタイプのヒトモノクローナルを得るのが望ま しい場合、１ｇＭタイプの主要な産生抗体からＩｇＧまたはその他のタイプの産 生抗体にスイッチした少数の細胞を分離するために、細胞選別の様な方法を使用 することが必要であった。従って、予め決定されているかまたは所望の抗原特異 性を有する一定の抗体を得るために、抗体のクラスをスイッチするためのより容 易な方法が必要である。
本発明は、ハイブリドーマおよびモノクローナル抗体技術の両者を橋渡しし、キ メラヒト／非ヒト抗体または“クラススイッチされた”抗体の産生を高めるため の迅速かつ効率的な方法、およびそれから誘導される産物を提供するものである 。
情報開示申告　注）この情報開示申告は、３７Ｃ，Ｆ、Ｒ，１，９７（ｂ）の規 定に従うものである。また、出願人らは、出願人らの発明が１またはそれ以上の 記載された出版物より前になされたことを証明する権利を保有している。
キメラ抗体産生の問題へのアプローチは、種々の著者によって発表されている。
モリンン等（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ、　Ｓ、　Ｌ、　ｅｔ　ａｌ、）のＰ　ｒｏｅ、 　Ｎ　ａｔ　１．　Ａ　ｃａｄ、　Ｓ　ｃｉ、＋　ｕ　Ｓ　Ａ　＋胆：　６８５ １−６８５５（１９８４年１１月）は、既知の抗原結合特異性を有するマウス抗 体産生骨髄腫セルラインの可変部遺伝子を組換えＤＮＡ法を使用してヒト免疫グ ロブリン不変部遺伝子に結合させることによって製造された、一定の抗原結合特 異性を有するマウス−ヒト抗体分子の製造を記載している。骨髄腫セルライン８ １０７由来の重鎮可変部エクソンがヒトＩｇＧ１またはＩ　ｇＧ２重鎖不変部エ クソンに好適に結合され、同じ骨髄腫由来の軽鎖可変部エクソンがヒトカッパ軽 鎖エクソンに好適に結合されたキメラ遺伝子が構築された。これらの遺伝子はマ ウス骨髄腫セルラインにトランスフェクトされ、キメラマウス−ヒト抗ホスホコ リン抗体を産生ずる形質転換細胞が生育された。
モリソン等（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ＋　Ｓ、　Ｌ、　ｅｔ　ａｌ）のヨーＯｙ／ｆ特 許公開第１７３４９４号（１９８６年３月５日公開）は、１つの種由来の可変部 とその他の種由来の不変部を有するキメラ“レセプター”（例えば抗体）を開示 している。遺伝子を構築するためのｃ　Ｄ　Ｎ　、ｈ、クローニングの利用につ いて記載されているが、ｃＤＮＡクローニングまたはプライミングの詳細な説明 はない。（５，７および８頁参照）。
ブリアンヌ等（Ｂｏｕｌｉａｎｎｅ＋Ｇ、Ｌ、　ｅｔ　ａｌ）のＮａｔｕｒｅ＋ 　３１２　：　６４３（１９８４年１２月１３日）も、ヒト不変部にマウス可変 部が結合してなる抗体を製造した。彼らは、ハブテンであるトリニトロフェニル （ＴＮＰ）に特異的なマウス可変部をコードしているＤＮＡセグメントが、ヒト ミニーおよびカッバネ変部をコードしているセグメントに結合している免疫グロ ブリン遺伝子を構築した。これらのキメラ遺伝子は機能的ＴＮＰ結合キメラＩｇ Ｍとして発現された。
ブリアンヌ等（Ｂｏｕｌｉａｎｎｅ　ｅｔ　ａｌ、）およびモリソン等（Ｍｏｒ ｒｉｓｏｎｅｔａｌ、）の研究に関する解説については、マンロー（Ｍｕｎｒｏ ）のＮ　ａｔｕｒｅ、３１２：５９７（１９８４年１２月１３日）、ディクソン （Ｄｉｅｋｓｏｎ）のＧｅｎｅｔｉｃ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　Ｎｅ５ｓ、５ ＋　Ｎｏ、　３（１９８５年３月）、またはマルクス（Ｍａｒｘ）の５ｃｉｅｎ ｃｅ、２２９　：　４５５（１９８５年８月）を参照されたい。
二ニーバーガー等（Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ、Ｍ、　Ｓ、　ｅｔ　ａｌ、）のＮａｔ ｕｒｅ、旦」２４　：　２６８（１９８６年３月２５日）も、ノ＼ブテン、４− ヒドロキシ−３−二トロフェナセチル（ＮＰ）に特異的なマウス可変部をコード しているＤＮＡセグメントが、ヒトイプシロン領域をコードしているセグメント に結合しているキメラ重鎖免疫グロブリン遺伝子を構築した。このキメラ遺伝子 がＪ　５５８Ｌセルラインにトランスフェクトされた時、ＮＰハプテンに結合し 、ヒトＩｇＥ特性を有する抗体が産生された。
二ニーバーガー等（Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ　ｅｔ　ａｌ、）は更に、Ｆｃ部分が活 性酵素部分（ウィリアムスおよび二ニーバーガー（Ｗｉｌｌｉａｍｓ、Ｇ、　ａ ｎｄＮｅｕｂｅｒｇｅｒ、Ｍ、Ｓ、　Ｇｅｎｅ　４３　：　３１９．１９８６） ）またはｃ　−ｍｙｃ抗原決定基を表わすポリペプチド（Ｎａｔｕｒｅ、３１２ 　：　６０４゜１９８４）で置き換えられた、ノーブテン特異的抗体を分泌する セルラインの製造を示す研究を発表している。
二ニーバーガー等（Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ、Ｍ、　ａｔ　ａｌ、）のＰＣＴ公開Ｗ Ｏ３６１０’１５３３（１９８６年３月１３日公開）も、キメラ抗体の製造（５ 頁参照）を開示し、この方法の多数の用途の中で、リラススイ。
チ”の概念を示唆している（６頁参照）。
タニグチ（Ｔ　ａｎｉｇｕｃｈｉ、　Ｍ、　）は、ヨーロッパ特許公開第１７１ 　４９６号（１９８５年２月１９日公開）に、試験動物由来の腸瘍特異性を持っ た可変部、およびヒト由来の不変部を有するキメラ抗体の製造を開示している。
対応する重鎮および軽鎖遺伝子はゲノム形態で作成され、哺乳動物細胞中で発現 される。
タケダ等（Ｔａｋｅｄａ、　Ｓ、　ｅｔ　ａｌ）のＮａｔｕｒｅ、３１４　：　 ４５２（１９８５年４月４日）は、レトロウィルスベクターの使用によって除去 されるイントロン配列を有するキメラ免疫グロブリン遺伝子を構築し得る方法を 記載している。しかしながら、予想外のスプライス供与部位によって、■領域リ ーダーへ列の欠失を生じた。即ち、このアプローチでは、完全なキメラ抗体分子 が得られなかった。
カビリー等（Ｃａｂｉｌｌｙ、　Ｓ、　ｅｔ　ａｌ、）のＰｒｏｃ、Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、。
ＵＳＡ、８１　：３２７３−３２７７（１９８４年６月）は、抗−癌胎児性抗原 （ＣＥＡ）抗体の重鎖および／または軽鎖のＥ、コリでの合成を導くプラスミド を記載している。重＆Ａ（Ｆｄ’）フラグメントの先端を切り取った形態をＥ、 コリ中で発現させるために、他のプラスミドが構築された。機能的ＣＥＡ−結合 活性は、Ｅ、フリ抽出物中、重鎮の一部分と軽鎖のイン・ビトロでの再構成によ って得られた。
カビリー等（Ｃａｂｉｌｌｙ、Ｓ、、　ｅｔ　ａｌ、）のヨーＯ−１／＜特許公 開１２５０２３（１９８４年１１月１４日公開）は、キメラ免疫グロブリン遺伝 子およびその予定産物、およびその他の修飾形態を記載している。
これは、２１．２８および３３頁でｃＤＮＡクローニングおよびプライミングを 議論している。
ボス（Ｂ　ｏｓｓ、　Ｍ、　Ａ、　）のヨー０　ツバ特許出願１２０６９４（１ ９８４年１０月３日公開）は、４−ニトロフェニル特異性を有する非キメラ免疫 グロブリン鎖のＥ、コリでの発現を示している。キメラ抗体について広範に記載 されているが、詳細な記載はない（９頁参照）。
ウッド等（Ｗｏｏｄ、Ｃ，Ｒ，ｅｔ　ａｌ、）のＮ　ａｔｕｒｅ＋　３ユＡ：４ ４６（ｉ９８５年４月）は、酵母中でマウス抗−ＮＰ抗体タンパクの合成を導く プラスミドを記載している。３７１１ミ、−抗体タンパクは、酵母細胞中でグリ コジル化されるらしかった。重鎮および軽鎖の両者が同一細胞中で合成された時 、幾らかのタンパクは、酵母細胞から製造される可溶性タンパク中、抗−ＮＰ結 合活性によって検出される機能的抗体分子に組み立てられた。
アレキサンダー等（Ａｌｅｘａｎｄｅｒ、Ａ、　ｅｔ　ａｌ、）のＰ　ｒｏｅ、 　Ｎ　ａｔ、　Ａ　ｃａｄ。
Ｓｃｉ、ＵＳＡ、７９：３２６０　３２６４（１９８２）は、１９−アミノ酸リ ーダー、次いで、■領域の最初の１５残基を含有している、異常に短いヒト１ｇ ガンマ重鎖（０ＭＭガンマ”　ＨＣＤＣＤ血清タンク）をコードしているｃＤＮ Ａ配列の製造を記載している。長い内部欠失によって、■領域の残部および全Ｃ Ｒ１ドメインが除去される。これは、内部欠失している分子をコードしているｃ ＤＮＡである。
ドルビー等（Ｄｏｌｂｙ、Ｔ、Ｗ、　ｅｔ　ａｌ、）のＰ　ｒｏｅ、　Ｎ　ａｔ ｌ、　Ａ　ｃａｄ、　Ｓ　ｃｉ、　。
ｔ、ＩｓＡ、ニア　：　６０２７−６０３１（１９８０）は、ミューおよびカッ パヒト免疫グロブリンポリペプチドをフードしているｃＤＮＡ配列およびそれを 含有している組換えプラスミドの製造を記載している。
組換えＤＮＡ分子の１つはＣＨ，不変部ドメインおよび全３゛非フ一ド配列の一 部分のためのコドンを含有していた。
七ノ等（Ｓｅｎｏ、Ｍ、　ｅｔ　ａｌ、）のＮｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ ５ｅａｒｃｈ、ｌ　ｌ　ニア　１９−７２６（１９８３）は、ヒトＩｇＥ重鎮（ イプシロン鎖）の可変部の一部分および不変部の全てをフードしているｃＤＮＡ 配列およびそれを含有している組換えプラスミドの製造を記載している。
クロカワ等（Ｋｕｒｏｋａｖａ、Ｔ、　ｅｔ　ａｌ、）、前掲、Ｌ上：　３０７ ７−３０８５（１９８３）ｉｔ、ＣＤＮＡを使用する、１１：　）　Ｉ　ｇ　Ｅ 　重鎮（Ｄ不変部をコードしている３種類、の発現プラスミドの構築を示してい る。
リウ等（Ｌｉｕ、Ｆ、Ｔ、　ｅｔ　ａｌ、）のＰｒｏｃ、Ｎａｔ、Ａｅａｄ、Ｓ ｅｉ、、ＵＳＡ。
８１：５３６９−５３７３（１９８４年９月）は、ヒトＩｇＥ重鎖のＣＨ，ドメ インの約３分の２およびＣ，３およびＣＨ４ドメインの全てをコードしているｃ ＤＮＡ配列およびそれを含有している組換えプラスミドの製造を記載している・ ツジモト等（Ｔｓｕｊｉｍｏｔｏ＋Ｙ、　ｅｔ　ａｌ、）のＮｕｃｌｅｉｃ　Ａ ｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、＋１２：８４０７−８４１４（１９８４年１１月）ｌｔ、り Ｏ＝：／フサれた不変部遺伝子をｃＤＮＡ合成のためのプライマーとして利用す ることによる、１ｇラムダ−産生ヒトバーキットリンパ腫セルラインからのヒ） ＶラムダｃＤＮＡ配列の製造を記載している。
マーフィー　（Ｍ　ｕｒｐｈｙ、　Ｊ　、）のＰＣＴ公開ｗ０８３１０３９７１ （１９８３年１１月２４日公開）は、毒素および細胞特異的リガンド（抗体であ るかもしれないと示唆されている）を含有しているフラグメントからなるハイブ リッドタンパクを開示している。
タン等（Ｔａｎ、　ｅｔ　ａｌ、）のＪ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　１３５　：　８ ５６４（１９８５年１１月）は、マウス骨髄腫細胞にトランスフェクトした後、 キメラヒト−マウス免疫グロブリンゲノム遺伝子の発現を得た。
ジ璽−ンズ等（Ｊ　ｏｎｅｓ、　Ｐ、Ｔ、、　ｅｔ　ａｌ、）のＮａｔｕｒｅ　 ３λ上：５５２（１９８６年５月）は、ヒト抗体中の対応するドメインを置き換 えるためにマウスモノクローナル抗体からの可変部のＣＤＲドメインが使用され たゲノム構築物を構築し、発現させた。
サン等（Ｓｕｎ、Ｌ、に、　ｅｔ　ａｌ、）のＨｙｂｒｉｄｏｌｌｌａ　５５ｕ ｐｐ１．　Ｉ　Ｓ　１７　（１９８６）は、腫瘍特異性を有する可能性のあるキ メラヒト／マウス抗体を記載している。キメラミ重鎖および軽鎖遺伝子はゲノム 構築物であり、哺乳動物細胞で発現される。
サバガン等（Ｓ　ａｈａｇａｎ　ｅｔ　ａｌ、）のＪ、Ｉｍｍｕｎ、１３７　： 　１０６６−１０７４（１９８６年８月）は、ヒト腫瘍関連抗原に対する特異性 を有するキメラ抗体、ゲノム配列から構築された遺伝子を記載している。
この分野の最近の評論については、モリソン（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ、　Ｓ　、　Ｌ 　、　）の５ｃｉｅｎｃｅ２２９：１２０２　１２０７（１９８５年９月２０日 ）およびオイ等（Ｏｉ、Ｖ、Ｔ、　ｅｔ　ａｌ、）のＢ　１ｏＴｅｃｈｎｉｑｕ ｅｓ　４　：　２１４　（１９８６）も参照されたい。
オイ等（Ｏｉ、　ｅｔ　ａｌ、）の論文は、酵母および／または細菌中のＣＤ　 Ｎ　Ａ構築物からのキメラ抗体の製造が必ずしも有利ではないことを論議してい るので、関連がある。
本発明は、軽鎖および重鎮の遺伝子クローニングおよび発現による、所望の可変 部特異性および不変部特性を有する遺伝子操作された抗体を製造するための新規 なアプローチを提供する。クローニングされた免疫グロブリン遺伝子産物は、遺 伝子操作された生物中での発現によって製造することができる。
化学的遺伝子合成、組換えＤ　Ｎ　Ａクローニング、および種々の生物中での特 異的免疫グロブリン鎖の製造の適用は、ヒトモノクローナル抗体の効率的大量生 産のための有効な解決を提供する。本発明はさらに、一定のクラスのある種の結 合特異性を有する免疫グロブリンを容易に製造するための、クラススイッチ抗体 分子の問題に対する解決を提供する。
本発明は、ヒトの不変部、およびヒトまたは非ヒトの可変部を含有する免疫グロ ブリン鎖をコードしているｃＤＮＡ配列を提供する。
免疫グロブリン鎖は重鎮であっても軽鎖であってもよい。
本発明はまた、ヒトまたは非ヒト由来のｃＤＮＡ可変領域およびヒト由来のゲノ ム不変領域を含有する、免疫グロブリン鎖をコードしている遺伝子配列を提供す る。
本発明はまた、原核生物または真核生物由来の分泌シグナル配列を有する、免疫 グロブリン鎖をコードしている遺伝子配列を提供する。
本発明はまた、所望の原核生物または真核生物宿主中で発現し得る組換えＤＮＡ 分子、とりわけプラスミドベクターの様なビヒクルに存在する、上記の様な配列 を提供する。
本発明はまた、複数の重鎮および軽鎖の発現のためのジシストロンメッセージを コードしている１個の細菌性プロモーターを有する遺伝子配列を提供する。
本発明はまた、所望の特異性を有する可変部をコードしているハイブリドーマｍ 　ＲＮ　ＡのハイブリダイゼーションおよびｃＤＮＡ、合成をプライミングする ためのプローブとして有用なコンセンサスな配列および特異的オリゴヌクレオチ ド配列を提供する。
本発明は、培養によってキメラ抗体を産生じ得る宿主およびこれらの宿主の使用 方法を提供する。
本発明はまた、ヒト不変部および非ヒト可変部を有するキメラ免疫グロブリン各 鎖、全てが集合した分子、および免疫グロブリンフラグメント（例えばＦ　ａｂ ）を提供する。ここで、両者の可変部は同じ結合特異性を有している。
その他の免疫グロブリン鎖および／または分子の内、本発明は：（ａＸｉ）非ヒ ト可変部およびヒト不変部を含有する２本の同一キメラ重鎖および （ｉｉ　）　２本の同−全（即ち、非キメラ性）ヒト軽鎖を含有する完全な機能 的免疫グロブリン分子、（ｂＸｉ）非ヒト可変部およびヒト不変部を含有する２ 本の同一キメラ重鎖および （ｉｉ　）　２本の同−全（即ち、非エメラ性）非ヒト軽鎖を含有する完全な機 能的免疫グロブリン分子、（ｃＸｉ）非ヒト可変部およびヒト不変部を含有して いる２本の同一キメラ重鎖および （ｉｉ）一方のみが重鎮の可変部と同じ特異性を有する２本の異なる軽鎖 を含有する１価の抗体、即ち完全な機能的免疫グロブリン分子（得みれた抗体分 子は、その一方の末端にのみ結合し、２価結合し得有し、第２０キメラ重鎖が別 の非ヒト可変部およびヒト不変部を含有する２本の異なるキメラ重鎖および（ｉ ｉ）第１０牛メラ軽鎖が、第１のＭ鎖可変部と同じ特異性を有する非ヒト可変部 、およびヒト不変部を含有し、第２０キメラ軽鎖が、第２の重鎮可変部と同じ特 異性を有する非ヒト可変部、およびヒト不変部を含有している２本の異なるキメ ラ軽鎖 を含有する、２種類の特異性を有する抗体、即ち、完全な機能的免疫グロブリン 分子（得ちれた抗体分子は、２種類の抗原に結合する）、 を提供する。
本発明はまた、原核生物または真核生物宿主によって分泌される機能的に活性な キメラ免疫グロブリンフラグメントまたは完全に折り畳まれているかまたは再集 合したキメラ免疫グロブリン鎖の製造法を提供する。
本発明は、キメラ鎖または非キメラ鎖の上記組合わせをコードしている遺伝子配 列、とりわけｃＤＮＡ配列をも提供する。
本発明はまた、免疫グロブリン鎖とは異なるポリペプチド（例えば酵素）をコー ドしている配列に操作可能に結合している抗体分子重鎖および／または軽鎖の可 変部をコードしている遺伝子配列、とりわけｃＤＮＡ配列を提供するものである 。これらの配列を本発明の方法によって糾み立て、発現させて、混合された機能 の分子を製造することができる。
ｃＤＮＡ配列の使用は、ｃＤＮＡ配列が、ＲＮＡスプライス系のない細菌または その他の宿主中で発現され得るという点で、（イントロンを含む）ゲノム配列よ りも好都合である。
とりわけ好ましい特異抗体は、癌−関連抗原に対する特異性を有する抗体である 。
図面の簡単な説明 第１図は、免疫グロブリンミニ−およびガンマ重鎖遺伝子のＤＮＡ再配列および 発現を示す。これは、ヒト重鎮遺伝子フンプレックスの図式的表示であるが、一 定圧で描かれていない。重鎮可変Ｖ領域は、ＶＨ，ＤおよびＪ）！遺伝子セグメ ントの連結によって生成される。これによって、活性なミニ−遺伝子が生成され る。′クラススイッチ”と呼ばれる異なった種類のＤＮＡの再配列によって、連 結されたＶ）Ｉ、ＤおよびＪ、領域がミニ−不変Ｃ領域からその他の重鎖Ｃ領域 （この図ではガンマへの変更が図示されている）へ再配置される。この図式は、 Ｊ領域が、発現された重鎮遺伝千金ての共通の特徴であることを強調している。
Ｊ領域は、発現された軽鎖遺伝子の共通の特徴でもある。
第２図は、ヒトおよびマウスＪ領域の既知のヌクレオチド配列を示す。Ｊ領域に ついてのコンセンサスな配列は、実際の配列の下に示されている。マウスカッパ Ｊ領域コンセンサス配列の下のオリゴヌクレオチド配列は、本発明で使用したユ ニバーサルイムノブ。プリンジー７（１，’ｎ１ｖｅｒｓａｌ　Ｉ　ｍｍｕｎｏ ｇｌｏｂｕｌｉｎ　Ｇｅｎｅ）（Ｕ　Ｉ　Ｇ）オリゴヌクレオチドである。
第３図は、免疫グロブリンメツセンジャーＲＮＡの可変部に相補的なｃＤＮＡの 合成のためのしＩＧオリゴヌクレオチドブライマーの使用、またはｃＤＮ、Ａ合 成のためのプライマーとしてのオリゴ−ｄＴの使用、次いでイン・ビトロ突然変 異誘発を示す図である。
第４図は、その内の１個（ｐＧＭＨ−６）がクローニングベクター（Ｂ）として 使用される３個の単離されたクローン（Ａ、ｂ）を含んでいるヒトＩｇＧ１遺伝 子の合成および分析を示す。ＢａｍＨＩとＰｖｕＩＩ間にｐＢＲ３２２配列の１ 　、５　ｋｂ欠失が印されている。一定比で描かれていない。
第５図は、Ｋｐｎ１部位でのｃＤＮＡクローニングに有用な、修飾されたｐＢＲ ３２２であるクローニングベクターｐＱ２３を示す。このベクターも有用な制限 酵素部位ＢｄｌｌおよびＳ　ａ１２１を含有している。一定比で描かれていない 。
第６図のＡは、ヒト軽鎖カッパ遺伝子の合成および分析を示す。
この図は更にＢにおいて（一定比で描かれていない）ヒトＣＫ領域クローニング ベクターｐｌ：Ｇ２００１の構築を示す。
第７図は、免疫グロブリンＶ領域合成のためにデザインされたプライマーを示す 。（Ａ）は、重鎖Ｊ−Ｃ領域およびプライマーを示す。
各マウスＪ重鎖領域のＤＮＡ形は、この配列からデザインされたプライマーのす ぐ上に直接示されている。マウスＪ領域は左から右へ５”から３°であるが、プ ライマーは左から右へ３°から５°である。
プライマーの名称は括弧内に入れられ、ヌクレオチドの数（Ｎ）および各ＪＩ４ 領域との不対合の数は右に挙げられている。ＢｓｔＥｎ部位を導入するプライマ ーには下線を記す。（Ｂ）は、軽鎖Ｊ領域およびプライマーを示す。軽鎖である こと以外は（Ａ）と同じである。Ｂｇ１２■部位を導入するためにデザインされ たプライマーには下線を付し、ｐｌＮＧ２０１６Ｈに存在するＢｃｆｆ１部位も 同様である。（Ｃ）は、マウス可変部コンセンサスＬ７１Ｇプライマーを示す。
実際のプライマー配列は、このコンセンサス配列の下に示されている。ヒトＣに Ｈ５ｎｄＩＩ［ベクターｐＧＭＬ６０は下に示されている。（Ｄ）は、マウスガ ンマ２ａＪ／Ｃ連結プライマーを示す。
第８図は、オリゴヌクレオチドを鋳型としたｃＤＮＡ合成による、重鎖Ｖ領域モ ジュール遺伝子の合成を示す。一定比で描かれていない。
第９図は、ハイブリッドマウス−ヒト免疫グロブリン遺伝子の構築を示す。パネ ルＡは、重鎮遺伝子の構築を示す。点描された領域はＣ領域モジュールを示し、 平行線または黒の領域はＶ領域モジュールを示す。一定比で描かれていない。
第１０図は、哺乳動物細胞のためのｃ　Ｄ　Ｎ　Ａクローニング発現シャトルベ クターの構築を示す。ベクターｐｌＮＧ２００３およびｐｌＮＧ２００３Ｅは、 ｐＬ　１．　ｐｌｊｃ　１２、ｐＳ　Ｖ　２−ｎｅｏおよびＭ８−アルファＲＸ １２由来である。点描された領域はマウス重鎖エンノ）ンｆ　−Ｄ　Ｎ　Ａ　ヲ 示し、平行線の領域は、ｐＬ１由来の５Ｖ−４０ＤＮＡを示し、交差平行線の領 域はｐｓＶ２−ｎｅｏ由来の５Ｖ−４０を示す。ベクターｐｌＮＧ２００３およ びｐｌＮＧ２００３Ｅでは、濃い線はＰＳＶ２　ｎｅｏ由来のＰＢＲ３２２ＤＮ Ａを示し、薄い線はｐｔＪｃ１２ＤＮＡを示す。矢印は５Ｖ−４Ｑ初期領域プロ モーターの位置および方向を示し、完全な５Ｖ−４０イントロン配列を示す。一 定比で描かれていない。
第１１図は、重鎮発現プラスミドｐＩＮＧ２００６Ｈの構築を示す。矢印は、Ｓ ’Ｖ−４０プロモーターの位置および転写の方向を示す。平行線および黒の範囲 はマウスＶ領域モジュールを示し、点描された範囲はヒトＣ領域モジーールを示 す。一定比で描かれていない。
第１２図は、発現ブ５スミＶｐｌＮＧ２００６ＥおよびｐｌＮＧ２０１２Ｅにお けるキメラ抗肝炎重鎖遺伝子の構築を示す。パネルＡはマウス−ヒトキメラ抗肝 炎重鎮遺伝子の構築を示す。ヒトＩｇＧ］ｍＲＮＡおよびｃＤＮＡの構築は−Ａ 、ａ、に示される。ヒト重鎮不変部ｃＤＮＡクローンｐＧＭＨ−６およびマウス 重鎖可変部ｃＤＮＡクローンｐＢｓ１３−１およびｐｌ３−１１は、ｐｌＮＧ２ ００６Ｅで使用されるハイブリッド遺伝子を作成するために使用された。平行線 の遺伝子プ０．７りはマウス可変部配列を示し、白の遺伝子ブロックはヒトＩｇ Ｇ１不変部配列を示す。パネルＢは、ｐｌＮＧ２００６Ｅおよびｐｉ　ＮＧ２０ １２Ｈにおける抗肝炎Ｂ重鎖可変部のヌクレオチド配列を示す。ｐｌＮＧ２０１ ２Ｅは、最初に、ｐｌＮＧ１２０２のＳ　Ｃ１２Ｔ部位にＢｄＩ［部位を挿入し てｐＩＮＧ１２０２Ｂｇρ■を作成することによって構築された（第１６図参照 ）。このプラスミド由来のキメラ重鎖遺伝子を発現ベクターｐ　Ｉ　Ｎ　Ｇ　２ ００３　Ｈに挿入し、ｐＩＮＧ２０１２Ｅを得た。ｐｌＮＧ２０１２Ｅは、イニ シェーク−ＡＴＧのすぐ上流の領域でｐＩＮＧ２００６Ｅと異なる。下線を引い たヌクレオチドはｃＤＮＡクローンｐＧＭＨ−６由来のヒトＪ領域配列を意味す る。星印のアミノ酸１１７は、キメラ遺伝子Ｊ領域に導入された、マウスからヒ ト配列へのこの部位での１個の変更（Ａ　ｌａからＳ　ｅｒ）を示す。配列決定 は、プラスミド（白丸）および：〜１１３　（Ｍ、）鋳型について、サンガー法 によった。
第１３図のパネルＡは、ｐｌＮＧ２００１由来の軽鎖クローン（ｐ？司ＡＣＫ− ３、ｐｌＮＧ２０１３ＥＳｐｌＮＧ２００７Ｅ、ｐｌＮＧ２０１０Ｅ−ｇｐｔオ ヨヒｐｌ　ＮＧ２０１４　Ｅ−ｇｐｔ）ｉ：：おけるＪ−Ｃ連結領域ヌクレオチ ド配列を示すｃ　ｐ　Ｋ　２−３起源のＪ領域配列はヒトＪＫ４で示す。ゲノム 配列決定によって予想されなかったＧヌクレオチドには星印を付す。この配列を 修飾するために使用されたオリゴヌクレオチドブライマー（Ｋ２−４ＢＣＬ］） を、ヒト、ＴＫ４配列の下に示す。パネルＢは、ｐｌ　ＮＧ２０１６Ｅ−ｇｐｔ を作成するために使用された部位導入突然変異誘発の方法を図示する。一定圧で 描かれていない。
第１４図は、２種の形質転換体中のトランスフェクトされた配列の遺伝子コピー 数である。２ＡＥ９．２ＢＨ１０由来のｎＤＮＡを、記載の酵素で消化した。Ｄ ＮＡの濃度は、レーンを横切り、その上に記載した量で下方向に摘定した。プロ ーブはヒトＣガンマ１配列（ｐｍｖＨｃ２４　Ａｐａｌ　−ＢａｍＨＩ）を含有 する。対照はＡｐａｌで消化した生殖系列または０Ｍ２１４６ｎＤＮＡである。
３’Ａｐａ１部位は、ポリ（Ａ）付加（３）の２ｂｐ先である。
第１５図は、Ｌ６ＶＭｃＩ）ＮＡクローンｐＨ３−６ａのＶ領域のヌクレオチド 配列を示す。この配列は、遺伝子フラグメントの＼４１３サブクローン（下記） を使用し、ジデオキシターミ不−シラン法ｌ二よって決定した。白丸は、ペプチ ド配列によって確認されたアミノ酸残基を示す。ＣＤＲ３領域においてＤ　ｓｐ 、！にホモローガスな配列に下線を付す。
第１６図は、Ｌ６ＶＫｃＤＮＡりｏ−ンｐＬ３　１２ａのＶ領域のヌクレオチド 配列を示す。部位導入突然変異のために使用したオリゴヌクレオチドブライマー をＪに５セグメントの下に示す。白丸は、ペプチド配列によって確認されたアミ ノ酸残基を示す。
第１７図ＩＬキメラＬ６　ＶＭ２ラスヒトＣガンマ１発現プラスミドの構築を示 す。パネル（ａ）は、ＢＡＬ−３１欠失クロ一ンＭ１３ｍｐ１９−Ｃ１−デルタ ４（Ｃ１−デルタ４）およびＭ１３ｍｐ１９−Ｃ１−デルタ２１（Ｃ１−デルタ ２１）の配列を示す。ｅＤＮＡクローン、ｐＨ３−６ａの５°末端を矢印で示す 。＼り１３配列に下線を付す。
この試験のために使用したオリゴヌクレオチドブライマーは、成熟Ｎ末端付近の ＦＲＩを鋳型とするＲ３　６ａ（５’　−ＧＡＣＴＧＣＡＣＣＡＡＣＴＧＧ−３ °）である。パネル（ｂ）は、それぞれ、３１−マーのオリゴヌクレオチドＭＪ Ｔ（２−Ａｐａｌ　２０ｎｇにアニーリングしているクローン、Ｃ１−デルタ４ およびＣ１−デルタ２１１Ｈｇの部位導入突然変異誘発のための方法を示す。Ｄ ＮＡポリメラーゼのフレノウフラグメントと相補的な鎖の合成は、室温にて３０ 分間、次いで１５°Ｃで７２時間である。トランスフェクトされたファージプラ ークをニトロセルロースに吸着させ、ＮａＯＨで固定し、３！Ｐで標識されたＭ ＪＨ２−Ａｐａｌルミｌオリゴヌクレオチド、４ｘＴＢＳ（０，６Ｍ　ＮａＣｆ ！、０．０４Ｍ　）リス−ＨＣＣ（ｐＨ７，４）、０．００４Ｍ　ＥＤＴＡ）プ ラス１０％デキストランサルフェート中、６５°Ｃで１８時間ハイブリダイズさ せた。フィルターの最終洗浄を６５℃、４ＸＳＳＰＥ％０．１％ＳＤＳで１５分 間行うた。（マニアテイス等（Ｍａｎｉａｔｉｓ、Ｔ、、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｍ ｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａ ｌ、ｌ　９　Ｆ３２）。陽性のプラークを、コダックＸＡＲフィルムに一夜接触 させることによって検出し、増殖およびＲＦＤＮＡの制限酵素分析について直接 、選択した。マウスＣ詐１に対するＭＪＨ２−Ａｐａｌルミｌオリゴヌクレオチ ドマツチが示されており、オリゴヌクレオチドの下に示されたコード化の変化と して現される。パネル（ｃ）は、ｐｌＮＧ２１１１およびｐｌＮＧ２１１２を製 造するための、キメラ発現プラスミドｐｌＮＧ２０１２の固有のｖ８に代って突 然変異誘発されたＬ５−ＶＨモジニール各々を置換する方法を示す。
第１８図は、キメラし６発現プラスミドルｌＮＧ２１１９の構築を示す。ｐＩＮ Ｇ２１００由来の５ａ１２１〜ＢａｍＨＩフラグメントは、ｐｌＮＧ２０１２Ｅ 由来の５ａ１２１−ＢａｍＨＩ　Ａフラグメントと同一である。
第１９図は、軽鎖および重鎖プラス軽鎖発現プラスミドの構築におけるＶに遺伝 子の修飾およびその用途を示す。
（ａ）Ｌ６のＶにのオリゴｄ［ＧＣ］セグメント５゛の欠失。このオリゴヌクレ オチドは２２−マーであり、５ａ１１部位を含んでいる。３個のミスマツチが示 される。突然変異誘発後のＶに遺伝子を、ヒトＣにモジニールに、５ａｊｌ−Ｈ ｉｎｄＩ［Ｉフラグメントとして連結させる。この様にして製造される発現プラ スミドはｐｌＮＧ２１１９である。
（ｂ）ｐｌ　ＮＧ２１１４は、重鎮プラスｉ鎖発現プラスミドである。
この発現プラスミドｐｌＮＧ２１１４は、ｐＩ　ＮＧ２１１１由来のし６重鎖キ メラ遺伝子およびｐｌ　ＮＧ２１１９（太線）由来のキメラ軽鎖を含有している 。
第２０図は、Ｌ６キメラ抗体発現プラスミドの構築において行なわれた配列変更 の概略を示す。５°非翻訳領域における下線の残基は、クローニングされたマウ スカッパおよび重鎮遺伝子から誘導される。Ｖ／Ｃ境界において丸で囲まれた残 基は、この領域における制限酵素部位を設けるための突然変異誘発操作に由来す る。Ｌ６重鎖キメラにおいてその上に小さな丸を付された残基も、突然変異誘発 に由来する。これらはサイレントな変化である。
第２１図は、２Ｈ７Ｖ）ｌ配列を示す。■お遺伝子は、Ｊ）１１配列およびＤＳ Ｐ、２配列エレメントを含有する。アミノ酸残基の上の小さな丸は、ペプチド配 列にマツチしたアミノ酸残基である。
第２２図は、２Ｈ７ＶＬ配列を示す。Ｖに遺伝子は、Ｊに５配列を含有する。２ ２−マーのオリゴヌクレオチドは、ＡＴＧイニシェークーフドンの５゛にＳａρ Ｌ部位を位置させるために使用された。
アミノ酸残基の上の小さな丸は、ペプチド配列にマツチしたアミノ酸残基を示す 。
第２３図は、２Ｈ７特異性を有するキメラ免疫グロブリン遺伝子発現プラスミド を示す。１遺伝子プラスミドはｐｌ　ＮＧ２１０１　（Ｖ　＊＋　ｎｅｏ）、ｐ ｉ　ＮＧ２１０６（Ｖ、ｃ、ｎｅｏ）およびｐＩＮＧ２１０７（Ｖに、　ｇｐｔ ）である。その他は、２遺伝子プラスミドである。これらの構築は、ｐＩ　ＮＧ ２１０１およびｐｌＮＧ２１０７の大きい方のＮｄｅｌフラグメントを、Ｎｄｅ ｌで部分消化した直線化ｐｌＮＧ２１０６にライゲートすることを含む。ｐｉ　 ＮＧ２１０１およびｐｌＮＧ２１０６からｐＨＬ２−１１およびｐＨＬ　２−２ ６が得られ、ｐＩＮＧ２１０７およびｐｉ　ＮＧ２１０６からｐＬＬ２−２５が 得らレタ。
第２４図は、キメラプラスミドの構築においてＶ、およびＶにに導入されたヌク レオチド変更の概略を示す。５°末端における同系のｖＨおよび〜Ｔにヌクレオ チド残基に下線を付す。Ｊ−Ｃ結合における丸を付された残基は、ヒトＣモジニ ール由来である。
第２５図は、成熟し６キメラ軽鎖配列を酵母インベルターゼシグナル配列および 短縮ＰＧＫプロモーターに融合させるために使用した方法を示す。不連続の二重 線は、酵母インベルターゼシグナル配列Ｄ　Ｎ　Ａを示す。連続した二重線は、 酵母ＰＧＫ　ＤＮＡを示し：→はＰＧＫプロモーターを示し；ＨはＰＧＫターミ ネータ−を示し、ＲＦ＝複製型である。ｐＩＮＧ１２２５は、ヒトＣｐｃ　ＤＮ ＡをＰＧＫプロモーターに融合させることによって誘導された。ｐｌ　ＮＧ１１ ４９は、酵母インベルターゼシグナル配列を酵母ＰＧＫプロモーターに融合させ ることによって誘導された。（Ａ）は、イン・ピト口突然変異誘発によって、シ グナル配列プロセラシングミ位にＡａｔ■部位を導入するための方法を示す。（ Ｂ）は、１本鎖突然変異誘発プライマーのＤＮＡ配列および対応する非突然変異 誘発ＤＮＡ配列を示す。（Ｃ）は、インベルターゼシグナル配列および短縮ＰＧ Ｋプロモーターに融合された成熟軽鎖配列を含有しているプラスミドを構築する ために使用された方法を示す。
第２６図は、成熟Ｌ６牛メラ重鎖配列を、酵母インベルターゼシグナル配列およ び短縮ＰＧＫプロモーターに融合させる１こめに使用した方法を示す。ｐｌＮＧ １２８８は、２Ｈ７マウスモノクローナル抗体由来の可変部を有するキメラ重鎖 遺伝子を含有する（実施例■参照）。全ての記号は、第２５図についての記号と 同意義である。
（Ａ）は、イン・ビトロ突然変異誘発によって、シグナル配列プロセッシング部 位に５ｓｔｌを導入するための方法を示す。（Ｂ）は、１本鎖突然変異誘発性プ ライマーのＤＮＡ配列および対応する非突然変異誘発ＤＮＡ配列を示す。（Ｃ） は、インベルターゼシグナル配列および短縮ＰＧＫプロモーターに融合された成 熟重鎮配列を含有するプラスミドを構築するために使用された方法を示す。
第２７図は、Ｌ６キメラ軽鎖遺伝子から非酵母３′非翻訳Ｄ　Ｎ　Ａ配列を除去 し、全ての配列がＤＮＡ配列分析によって既知であるか、または機能的であるこ とが判明しているインベルターゼシグナル配列および短縮ＰＧＫプロモーターに 融合された軽鎖遺伝子を含有するプラスミドを構築するために使用された方法を 示す。ｐＢＲ３２２Ｎ　Ａは、Ｎｄｅｌ−ＡｕａＪのＤ　Ｎ　Ａの欠失によって 、ｐＢＲ３２２から誘導される。記号は第２５図のための記号と同意義である。
第２８図は、Ｌ６キメラ重鎖遺伝子から非酵母３′非翻訳ＤＮＡ配列を除去し、 全ての配列がＤ　Ｎ　Ａ配列分析によって既知であるか、または機能的であるこ とが判明しているインベルターゼシグナル配列および短縮ＰＧＫプロモーターに 融合された重鎮遺伝子を含有するプラスミドを構築するために使用された方法を 示す。記号は第２５図のための記号と同意義である。
第２９図は、インベルターゼシグナル配列および短縮ＰＧＫプロモーターに融合 されたし６キメラ軽鎖遺伝子を、ＰＧＫ転写終止−ポリアデニル化シグナル、酵 母複製配列および形質転換体の選択のための遺伝子を含有する酵母−Ｅ、コリシ ャトルベクターにクローニングするために使用された方法を示す。記号は、第２ ５図のための記号と同意義である。
１３０図は、インベルターゼシグナル配列および短縮ＰＧＫプロモーターに融合 されたＬ６キメラ重鎖遺伝子を、ＰＧＫ転写終止−ポリアデニル化シグナル、酵 母複製配列および形質転換体の選択のための遺伝子を含有する酵母−Ｅ、コリシ ャトルベクターにクローニングするために使用された方法を示す。記号は、第２ ５図のための記号と同意義である。
第３１図は、ヒ）ＩｇＧ１の構造の図式表示を示す。
第３２（Ａ）図は、ヒトガンマ１のヒンジ領域に終止コドンおよびＢｃＱ１部位 を導入するために使用した方法を示す。（Ｂ）は、ガンマ−１ヒンジ領域のイン ・ビトロ突然変異誘発のために使用した１本鎖プライマーのＤＮＡ配列および対 応する非突然変異誘発配列を示す。垂直の矢印は、鎖内部のジスルフィド結合を 示す。記号は、第２５図のための記号と同意義である。
第３３図は、ヒンジ領域（Ｆｄｆｆｌ）における終止コドンを含有しているし６ キメラ重鎖遺伝子を、酵母インベルターゼシグナル配列および短縮ＰＧＫプロモ ーターに融合するために使用した方法を示す。
記号は、第２５図のだめの記号と同意義である。
第３４図は、Ｌ６キメラＦｄ鎖から非酵母３°非翻訳配列を除去し、全ての配列 がＤＮＡ配列分析によって既知であるかまたは機能的であることが判明している インベルターゼシグナル配列および短縮ＰＧＫプロモーターに融合されたＦｄ鎖 を含有しているプラスミドを構築するために使用した方法を示す。記号は、第２ ５図のための記号と同意義である。
第３５図は、インベルターゼシグナル配列および短縮ＰＧＫプロモーターに融合 されたＬ６キメラＦｄ鎖遺伝子を、ＰＧＫ転写終止−ポリアデニル化シグナル、 酵母複製配列および突然変異体の選択のための遺伝子を含有している酵母−Ｅ、 コリシャトルベクターにクローニングするために使用した方法を示す。記号は、 第２５図のだめの記号と同意義である。
第３６（Ａ）図は、エルウィニア・カラトボラ（Ｅｒ＊１ｎｉａ　ｃａｒａｔｏ ｖ。
ｒａ）　ｐｅｌＢ遺伝子のＮ−末端周辺のヌクレオチド配列を示す（レイ等（Ｌ ｅｉ、　Ｓ、Ｐ、、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、（１９８７、 印刷中））。クローニングに使用したＮｄｅｌおよびＨａｅｍ部位を示す。矢印 は、ペクチン酸リアーゼのためのリーダーペプチダーゼ切断部位を示す。（Ｂ） は、ｐｅｌＢリーダーカートリッジの構築のためのクローニング法を示す。ｐｓ ｓ１００４は、ｐＵｃ８の５ＩＩｌａ１部位にクローニングされた１、９ｋｂＤ ｒａｌフラグメントを含有する。記号は、第３９図のための記号と同意義である 。
第３７図は、軽鎖発現プラスミドｐＲＲ１７７８、ｐＲＲ１８０、ｐＲＲ１９０ およびｐＲＲ１９１の構築を示す。このテキストに記載したプラスミド以外に、 Ｍ１３ｓ＋ｐ１８およびｐｌ　Ｔ　１８１を使用した。ｐＩ７１８１は、ｐｌＴ ２におけるａｒａＢ遺伝子のＡＴＧ開始コドンのすぐ後に融合された成熟軽鎖遺 伝子を含有する（第４０図参照）。
第３８図は、Ｆｄ発現プラスミドｐＲＲ１７８−５、ｐ’ＲＲ１８６およびｐＲ Ｒ１９６の構築を示す。
第３９図は、軽鎖およびｐＦ　Ｋ　１００、ｐＦＫ１０］、ｐＦＫ］。
２、ｐＦＫ１０３およびｐＦＫ１０４におけるＦｄ遺伝子カセットの制限地図を 示す。これらのプラスミドは、第３７図および３８図に概略を示したプラスミド を使用し、テキストの記載の様にして構築した。矢印は、ｌａｃプロモーターか らの転写の方向を示す、Ｅ、カラトボラおよび真核生物の非コード配７１＋ｉを 白い部分で示す。ｐｅｌＢリーダー配列は、交差平行線であり、黒い部分は、抗 体遺伝子Ｆｄおよび軽鎖（に）を示す。
第４０（Ａ）図は、アラビ／−ス誘導性Ｆａｂ発現のためのベクターの構築を示 す。プラスミドｐｌＴ２（メイソンおよびレイ（Ｍａｓｏｎ　ａｎｄ　Ｒａｙ、 　Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、１４　：　５６９３（１９８６））は、ｐＢ Ｒ３２２の誘導体におけるｐｌＮＧ１由来のａｒａＣ遺伝子、ａｒａＢプロモー ターおよびａｒａＢ遺伝子の一部分をコードしている６４３１ｂｐプラスミドで ある（ジ璽ンストン等（Ｊｏｈｎｓｔｏｎ＋Ｓ、、　ｅｔ　ａｌ、＋　Ｇｅｎｅ 　３４　：　１３４（１９８５））。Ｎｃｏ１部位は、ａｒａＢ遺伝子のＡＴＧ 開始コドン中に設けられた。（Ｂ）は、ｐＦＫ１０２への１ａｅｉ遺伝子の導入 を示す。
（以下余白） 好ましい態様の説明 庄−一勝 一般に、抗体は２つのＬ鎖および２つのＨ鎖分子から構成される。
Ｈ鎖およびＬ鎖は構造的および機能的な相同関係にあるドメインに分かれている 。ＬｆｉおよびＨ鎖の可変領域（それぞれｖＬおよびＶＷ）は、認識能および特 異性を決定する。し鎖およびＨ鎖の定常領域（それぞれＣＬおよびＣ，）は、抗 体鎖の会合、分泌、胎盤経由の挙動、補体結合性などの重要な生物学的性質を付 与する。
複雑な一連の事象によって、Ｂ細胞において免疫グロブリン遺伝子の発現が導か れる。抗原特異性および結合性を付与するＶ領域遺伝子配列は、Ｖａ、Ｄおよび ＪＨｓまたはｖＬおよびＪＬと呼ばれる異なる生殖系列遺伝子セグメントに局在 している。これらの遺伝子セグメントは、Ｉ）ＮＡの再配列によって結合し、そ れぞれＨ鎖およびＬ鎖で発現される完全なり領域を形成する（第１図）。そして 、この再配列し、結合した（ＶＬ−ＪＬおよびＶヨーＤ−Ｊ、）Ｖセグメントは 、完全な可変領域、すなわちそれぞれＬ鎖およびＨ鎖の抗原結合性ドメインをコ ードしている。
定　義 本明細書および請求の範囲では、特定の用語および成句を使用している・以下に 定義を与えることにより、明瞭化および統一性を図る。
１、発現ベクター：ベクターに挿入することが可能な、遺伝子配列由来のＩＨＲ Ｎ　、Ａの合成に必須の調節シグナルを含有しているプラスミドＤ　Ｎ　、Ａ　 ０ ２、モジュールベクター（ｍｏｄｕｌｅ　ｖｅｃｔｏｒ）　：定常または可変領 域遺伝子モジニールを含有するプラスミドＤＮＡ。
３、発現プラスミド：キメラ性免疫グロブリンなどの挿入遺伝子を含有する発現 ベクター。
４、遺伝子クローニング：遺伝子の合成、ＤＮＡベクターへの挿入、およびハイ ブリダイゼーションなどによる同定。
５、トランスフェクション：哺乳類細胞へのＤＮＡの移入。
６、プロモーター領域：操作的に連結されたシストロンまたはオペロンを発現す るために必要とされる調節配列を細胞に付与するヌクレオチド配列。
７、分泌シグナル：宿主の外にキメラ性免疫グロブリンの鎖を分泌するのに役立 つ、該キメラ性免疫グロブリン鎖のＮ−末端に存在するポリペプチド。「先導ペ プチド」または「リーダー」とも呼ばれる。
遺伝子操作および産物 本発明は、所望の特異性を有するヒト抗体をクローニングおよび生産するための 新規な方法を提供するものである。一般には、この方法は、以下の５つの工程か らなる： （１）４！定の抗原に対するモノクローナル抗体を産生ずるＢ細胞ハイプリドー マ系統から、メソセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を単離し、それをクローニング してｃＤＮＡｆｅ調製し、（２）特定のヒトまたは非−ヒトハイブゾドーマ細胞 系統由来のＬ鎖およびＨ鎖ｍＲＮＡ内の可変領域遺伝子セグメントをクローニン グするためのプライマーおよび／またはプローブとして有用である全免疫グロブ リン遺伝子（ＤＩＧ）オリゴヌクレオチドを調製し、それからｃＤＮＡを調製し 、 （３）ｃＤＮＡの調製およびクローニング、またはゲノム遺伝子の調製およびク ローニングによって定常領域遺伝子セグメントのモジニールを調製し、 （４）上記（２）のクローニングした特異的免疫グロブリン可変領域遺伝子セグ メントを、クローニングしたヒト定常領域遺伝子セグメントのモジュールと連結 することによって、完全なＨ鎖またはＬ鎖コード化領域を構築し、 （５）白血球および赤血球宿主などの選択した宿主においてし鎖およびＨ鎖を、 別々に発酵させた後にインビトロで抗体分子を組み合わせるか、またはそれら両 方の鎖を同じ細胞で産生させ、発現、生産する。
本発明は、ｅＤＮＡのクローニング用にｍＲＮＡを単離するため、規定された特 異性を有するモノクローナル抗体を産生ずるクローニングしたハイプリドーマＢ 細胞系統を使用する。多くのリンパ球細胞系統は、単離時にｍＲＮＡを分解する 高度な活性ヌクレアーゼを含有しているので、本発明では、活性ヌクレアーゼを 含有する細胞および組織か；）無傷のｍＲＮＡを単離するために特別に開発され たｍＲＮＡ調製法を利用する。細胞または組織の破壊物から全ＲＮＡ調製物が得 られるこのような方法は、ヌクレアーゼ作用を減退させるエタノール−過塩素酸 塩ドライアイス混合物法である［リザード（Ｌｉｚａｒｄｉ、　Ｐ、　Ｌ　）　 ；）のＡｎａｌ、ｂｉｏｃｈｅｍ、９８：１１６（１９７９）ｇ　。この方法に より、翻訳され得る無傷のｍＲＮＡが得られる。
本発明に使用される他の方法としては、細胞を、尿素を加えた塩化リチウム〔ア フレイら（Ａｕｆ　ｆ　ｒａｙ、　Ｃ，およびＲｏｕｇｅｏｎ、　Ｆ、　）のＥ ｕｒ、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｂｅｍ、、Ｉｎ２：３Ｄ３Ｃ１９８０＞’Ｊ　、または グアニジン・チオシアネート［チルウィン（Ｃｈｉｒｇｖｉｎ、　Ｊ、　Ｍ、　 ）らのＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　１８：５２９４（１９７９）］で抽出して 全ＲＮＡを調製することがある。
発現される免疫グロブリンＬ鎖およびＨ鎖遺伝子、ならびにメツセンジャーＲＮ Ａのすべてに統一的な１つの特徴は、いわゆるＪ領域（すわなち、結合領域、第 １図参照）である。Ｈ鎖およびＬ鎖のＪ領域は別々の配列を有しているが、Ｈ鎖 Ｊ、領域または７Ｃ（力、、／−ｅ）ｌ鎖Ｊ領域内には高い程度の配列相同性が 存在する（８０％以上）。
本発明は、免疫グロブリンのＬ鎖またはＨ鎖ｍＲＮＡまたは遺伝子をクローニン グするためのプライマーまたはプローブとして使用できるオリゴヌクレオチド（ 本明細書ではＵＩＧと命名する）を設計する上で有用なＬ鎖およびＨ鎖ＪＦＡ域 の一定配列（コンセンサス配列）を提供するものである（第２図または第７図） 。設計する個々のＵｒＧの特性に応じてそれを、１つの特異的Ｊ領域、たとえば マクスＪ、３配列のみを検出するＬ）ＩＧ−ＭＪＨ３を含有する遺伝子または全 免疫グロブリンｍＲＮＡにハイブリダイズすることができる（第７図）。
具体的なＵＩＧプローブのもう１つの有用性として、マウスＪｘを含有する配列 すべてを検出するＵ　Ｉ　Ｇ−ＭＪ　Ｋなどの特定の定常領域のＬ鎖またはＨ鎖 ｍＲＮＡとハイブリダイゼーションさせることが挙げられる（第７図）。ｔＪＩ Ｇの設計物はさらに、免疫グロブリン遺伝子のｃＤＮＡ複製物に制限酵素部位を 挿入するための配列を含有させることができる（第７面参照）。たとえば、本発 明は、キメラ遺伝子の合成に利用すれば、所望の抗原特異性を有するモノクロー ナル抗体を産生ずるハイブリドーマ細胞由来の免疫グロブリン鵬ＲＮＡにおける Ｖ領域をクローニングするためのＩＪＩＧプローブを作成することができる。
ハイプリドーマ細胞のＬ鎖およびＨ鎖ｍ　ＲＮ　Ａから完全なＶ÷Ｃ領域のｃＤ ＮＡクローンを作成するには、多段階操作を行う。第１段階では、本発明は、ｔ ＪＩＧプローブを、Ｈ鎖およびＬｆＪＩｍＲＮＡの完全なＶ領域および先導コー ド化配列を逆転写酵素で複製するための「プライマー」として使用する（第３図 ）。次いで、このプライマー延長化ｃＤＮＡの相補性値を合成し、得られた２重 鎖ｃＤＮＡを適当なｃＤＮＡクローニングベクター、たとえばｐＢＲ３２２［ガ ブラーら（ＧｕｂｌｅｒおよびＢｏｆｆｍａｎ）、　Ｇｅｎｅ、　２５：２６３ （１９８３）］　ｓまたはｐＱ２３［第５図、マニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ、 　Ｔ、　）らのモレキユラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉ ｎｇ）：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ＭａｎｕａＬコールド０スプリング・ハー バ−・ラボラトリ−・パブリケーシ１ンズ、二ニーヨーク、２２４頁（１９８２ ）］にクローンする。ＩＪＩＧオリゴヌクレオチドプローブとの特異的なハイブ リダイゼーシヨンについて、クローンをスクリーニングする。このスクリーニン グ操作によって同定される陽性Ｈ鎖およびＬ鎖りローンをマツピングして配列決 定し、■領域および先導コード化配列を含有するクローンを選択する。
別の方法では、オリゴ−ｄＴをプライマーとして使用してｃＤＮ、Ａクローンを 作成し、次いでｍｓ的なハイブリダイゼーシ５ン法によってＬＭおよびＨ鎖りロ ーンを選択する。
第２段階では、Ｃ領域遺伝子セグメントのクローニングを利用し、Ｈ鎖およびＬ 鎖モジニールベクターを作成する。１つの方法では、ヒトのＨ鎖およびし超免疫 グロブリンｍＲＮＡのｃＤＮＡクローンを調製する。次いで、これらのｃＤＮＡ クローンを、部位特異的突然変異によってＣ領域モジュー、ルベクターに変換し 、定常領域の境界近（の所望の位置に制限部位を配置させる。別の方法では、Ｃ 領域モジュールベクターの供給源としてゲノムＣ領域クローンを利用する。
ｃＤＮＡのクローニングにおける第３段階は、連結したＶおよびＣ領域を有する 配列をコードしている完全なＬ鎖およびＨ鎖を作成する。上記のようにして生成 させたクローン化Ｖｌ域セグメントを切除し、Ｌ鎖またはＨ鎖Ｃ領域モジニール ベクターに連結する。たとえば、完全なヒトにＬ鎖Ｃｔａ域および完全なヒトγ ｌ（ガンマ、）Ｃ領域をクローンすることができる。さらに、ヒトγ１領域を修 飾して終止コドンを導入することができ、それにより、Ｆａｂ分子のＨ鎖部分を フードしている遺伝子配列が得られる。
次いで、機能的に連結したＶおよびＣ領域を有するコード化配列を適当な発現系 に移入し、原核生物または真核生物などの適当な宿主で発現させる。「機能的に 連結」とは、トリプレットの解読フレームを変化または妨害することなく、連続 的に翻訳され得る遺伝子配列を誘導するためのコード化配列のイン・フレーム連 結を意味する。
本発明においてｃＤＮＡ遺伝子配列を使用する１つの具体的な利点は、それらが ＨまたはＬの免疫グロブリン鎖を連続的にコードしているということである。「 連続的に」とは、配列がイントロンを含有しないこと（すなわち、ゲノム配列で はないが、逆転写酵素によってｍＲＮ、Ａから誘導されることより、むしろ、隣 接のエフ・ノンの配列であること）を意味する。本発明によって提供されるｃ　 Ｄ　ＮＡ配列のこの特性により、細菌などの原核生物内、すなわち酵母などの真 核生物よりも下等な生物宿主内において発現が可能となる。
このｃ　Ｄ　Ｎ　Ａクローニング法のもう１つの利点は、■領域遺伝子モジュー ルが容易かつ簡単に得られることである。
本明細書中で使用している「非−ヒト」なる用語は、免疫応答を惹起してウィル スの形質転換などにより生成される対応するハイブリドーマまたはＢ細胞クロー ンになる使用され得るＢ細胞を導き得る、ヒト以外のあらゆる動物が包含される ことを意味する。このような動物としては、通常、マウスまたはラットなどのげ つ歯頚が挙げられる。今日では、調製の容易性または広範な入手可能性の理由か ら、マウスが好ましい非−ヒト動物である。したがって、ＨｉｌｌおよびＬ鎖可 変領域の好ましい供給源として、マウスーマウスハイブリドーマを利用する。
好ましいことに、本発明は全Ｖおよび／またはＣ領域ｃＤＮＡ配列を提供するも のである。このことは、その配列が、主要な構造部分を欠くことなく、実質的に 操作可能なＶおよび／またはＣ領域をコードしていることを意味する。
「定常」および「可変」なる用語は、天然の非キメラ抗体における可変および定 常”領域により保持されている性質および特徴をコードしている、Ｈ鎖またはＩ ＪＪ４いずれか゛の免疫グロブリン鎖のそれらの領域を表すため、機能的に使用 される用語である。既述のように、機能的に操作可能な領域が存在し、利用可能 である限り、可変または定常領域に係る完全なフード化領域が存在するＺ・要性 はＺ・ずしもない。
ｍＲＮＡを調製するための供給源ハイブリドーマは広範囲で入手可能である。た とえば、ＡＴＣＣセルラインとハイブリドーマ（ＡＴＣＣＣＥＬＬ　ＬＩＮＥＳ 　ＡＮＤ　ｌ（ＹＢＲＩＤＯＭＡＳ）のカタログ［１９８４年１２月、アローン ・ドライブ、ロックビレ、メリーランド、アメリカ合寒国２０８５２．５−９頁 コ、およびＥＣＡＣＣのカタログ［２版：ＰＨＬＳＣＡＭＲ、ボートン・ダウン 、サリスブリー、ウィルス；５Ｐ４０ＪＧ、英国、３０−３５頁および４０−４ ６頁］を参照のこと。非常に多種の抗原に反応するモノクローナル抗体を分泌す るハイブリドーマを本明細書中で一覧にするが、これらは上記フレクションかろ 入手可能であり、本発明で使用することができる。特に興味深いものは、たとえ ばＤ　ｅｒ＋ｇｕｅコンプレックス特異的（ＡＴＣＣＨＢ　１１４）　、Ｄｅｎ ｇｕｅタイプ１ウィルス（ＡＴＣＣ）（Ｂ４７）　、Ｄｅｎｇｕｅタイプ２ウィ ルス（ＡＴＣＣＨＢ４６）　、Ｄｅｎｇｕｅタイプ３ウィルｘ　（ＡＴＣＣＨＢ ４９）　、Ｄｅｎｇｕｅタイプ４ウィルス（ＡＴＣＣＨＢ４８）　、エプスタイ ン−バール（Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ）レセプター（ＡＴＣＣＨＢ　１３５） 、フラビウイルス（Ｆｌａｖｉｖｉｒｕｓ）群（ＡＴＣＣＨＢＩ　１２）　、Ｂ 型肝炎表面抗原（ＡＴＣＣＣＲＬ　８０１７および８０１８）、単純ヘルペス１ 型（ＡＴＣＣＨＢ８０６８）、単純ヘルペスＩ［型（ＡＴＣＣＨＢ８０６７）　 、インフルエンザウィルス（ＡＴＣＣＣＬ１８９）　、インフルエンザＡ型マト リックスプロティン（ＡＴＣＣＨＢ６４）　、インフルエンザＡ型ウィルス・ヌ クレオプロティン（ＡＴＣＣＨＢ６５）　、インフルエンザＡパンコク／１／７ ９ＨＡ　（ＡＴＣＣＨＢ６６）　、インフルエンザＡＷＳＮ　ＮＰ　（ＡＴＣＣ ＨＢ６７）　、ＳＶ４０巨犬Ｔ抗原（ＡＴＣＣＴＵＢ］、１５）　、ＳＶ４０巨 犬Ｔ抗原、Ｃ−末端（ＡＴＣＣＴ］Ｂ１１７）、および５Ｖ４Ｑ非ウイルスＴ抗 原（ＡＴＣＣＴＩＢ１１６）などのウィルス抗原と反応する抗体を分泌する／％ イブリドーマである。他のハイブリドーマとしては、腫瘍関連抗原、またはヒト リンパ球抗原に対する抗体、たとえば高分子量のヒト腫瘍関連ＣＥＡ　（ＡＴＣ ＣＣＲＬ８０１９）　、ヒト腫瘍関連α−フェトプロティン、ＴｇＧ＋Ｋ　（Ａ ＴＣＣＨＢ　１３４）　、ヒトＢリンパ球ＨＬＡ−ＤＲ，単一形１ｇＧｔ−（Ａ ＴＣＣＨＢ１０４）　、ヒトＴリンパ球Ｔ細胞前駆体ＩｇＧ、（ＡＴＣＣＣＲＬ ８０２２）　、ヒトＴリンパ球Ｔ細胞サブセットのヘルパー１ｇＧ＊ｂ　（ＡＴ ＣＣＣＲＬ８００２）、Ｔサブセ、ｙｌ）抑制／ｆａ胞ｉｔ性ｔ：　）　Ｉ　ｇ Ｇ　、　（Ａ　Ｔ　ＣＣＣＲＬ８０１３）、Ｔ細胞サブセットの抑制／細胞毒性 ヒトＩｇＧ□（ＡＴＣＣＣＲＬ８０１４）　、末梢Ｔ細胞のヒト１．Ｇ。
（ＡＴＣＣＣＲＬ８０００）、末梢Ｔ細胞０　ヒ）　Ｉ　ｇＧ　ｔ−（Ａ　Ｔ　 ＣＣＣＲＬ８００１）、胸腺細胞の「共通」ヒトＩｇＧ、（ＡＴＣＣＣＲＬ８０ ２０）などに対する抗体を分泌するハイブリドーマを例示することができる。
これらの系統、および他の類似の性質を有する系統は、Ｌ、’ＩＧプローブを使 用することにより、可変領域をコードしているｍＲＮＡを複製するために使用す ることができる。特に興味深いものは、ヒト腫瘍抗原に対する特異性を有する抗 体である。
発現ビヒクルには、プラスミドまたは他のベクターがある。これらの中で好まし いものは、適当な粘着末端を有する可変Ｈ鎖またはＬ鎖配列を容易に挿入するこ とができるように操作された適当な制限部位を有する機能的に完全なヒト定常Ｈ 鎖またはＬ鎖配列を担うビヒクルである。したがって、ヒト定常Ｈ鎖またはＬ鎖 配列を含有するビヒクルは、本発明の重要な一態様である。これらのビヒクルは 、所望の完全Ｈ鎖またはＬ鎖を迩−当な宿主内で発現させるための中間体として 使用することができる。
好ましい宿主は、酵母である。酵母は、免疫グロブリンＬ鎖およびＨ鎖を生産す る上で実質的な利点を提供する。酵母は、グリコジル化などの翻訳後のペプチド 修飾を行う。現在、所望のタンパク質を酵母において公然と生産させるのに使用 することができる強いプロモーター配列および高いコピー数のプラスミドを利用 する多くの組換えＤＮＡの計画が存在している。酵母は、クローン化哺乳類遺伝 子産物におけるリーダー配列を認識し、リーダー配列を担うペプチド（すなわち プレペプチド）を分泌する［ヒ・ノツマン（Ｈｉｔｚｍｅｎ、　）らの１１版Ｉ ｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｏｒ＋４ｅｒｅｎｅｅ　ｏｎ　Ｙｅａｓｔ、　Ｇ ｅｎｅｔｉｃｓ　ａｎｄ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、モントペリエ ー（Ｍｏｎｔｐｅｌｉｅｒ）、フランス、９月１３−１７．１９８２年コ　。
酵母遺伝子の発現系は、Ｈ鎖とＬ鎖の産生レベル、タンパク質安定性、および分 泌について、常法により評価することができる。酵母をグルコースが豊富な媒質 中で増殖させた場合に大量に産生される解糖系酵素群をコードしている活動的に 発現される遺伝子由来のプロモーターおよび終止要素を組み込む一連の酵母遺伝 子発現系を利用することができる。既知の解糖系酵素群はさらに、非常に効率的 な転写制御シグナルを提供することができる。たとえば、イソ−１−チトクロー ムＣ（ＣＹＣ−１）遺伝子のプロモーターおよびターミナーターのシグナルを利 用することができる。
クローンした免疫グロブリンのｃＤＮＡを酵母内で発現させるために最良の発現 プラスミドを評価するには、以下の方法を採用すれば良い： （１）■およびＣ領域を結合しているクローンした免疫グロブリンＤ　Ｎ　Ａを 別の転写プロモーターおよびターミナーターＤＮＡフラグメントに結合する； （２）このキメラ遺伝子を、タンパク質を過剰生産するのに使用される酵母プラ スミド上に配置する［たとえば、ベッグス（Ｂｅｇｇｓ、　Ｊ、　Ｄ。
）のＭｏ１ｅｃｕｌａｒ　（ｉｅｎｅｔｉｃｓ　ａｎｄ　Ｙｅａｓｔ、アルフレ ッド・ベンゾン・シンポジウム、１６．コペンハーゲン（１９８１）を参照のこ とコ　：（３）抗体を分泌させるには、酵母リーダーペプチドなどの付加的な遺 伝子単位を免疫グロブリンＤＮＡ構築物に含有させればよい。
（４）配列の一部（これはしばしば遺伝子配列の最初の６−２０コドンである） を、好ましい酵母のコドン・ユーセイジになるように修飾すればよい。
（５）酵母染色体に組込むために使用するプラスミドに、得られたキメラ遺伝子 を配置する。
酵母内でＬ鎖およびＨ鎖の両者を同時に発現させるためには、以下の方法を採用 すればよい。
（１）ＬｆｆｌおよびＨ鎖遺伝子を各々酵母プロモーオーおよびターミナーター 配列に結合し、同一プラスミド上に配置する。このプラスミドを、酵母における 自律的な複製、または酵母染色体内の特定部位における組込みのいずれかのため に設計すればよい。
（２）異なる選択マーカーを含有する別々のプラスミドにおける酵母プロモータ ーおよびターミナーター配列にＬ鎖およびＨ鎖遺伝子をそれぞれ結合する。たと えば、Ｌ鎖遺伝子は、選択マーカーとしてｔｒｐｌ遺伝子を含有するプラスミド に入れ、他方）（ｆｉｌ遺伝子は、選択マーカーとしてｕｒａ　３を含有するプ ラスミドに配置すればよい。
これらプラスミドは、酵母における自律的な複製用、または酵母染色体内の特定 部位における組込み用のいずれかのために設計することができる。これら両選択 マーカーを欠いている酵母株を、Ｌ鎖遺伝子を含有するプラスミドおよびＨｆ１ ｆｉ遺伝子を含有するプラスミドで同時に、または連続的に形質転換する。
（３）Ｌ鎖およびＨ鎖遺伝子を、（２）に記載の異なる選択マーカーをそれぞれ 含有する別々のプラスミドにおける酵母プロモーターおよびターミナーター配列 に各々結合させる。Ｌ鎖およびＨ鎖発現プラスミドに見いだされる選択マーカー （上の例ではｔｒｐｌおよびｕｒａ３）の「ある」欠損株である酵母交配型をＬ 鎖遺伝子を含有するプラスミドで形質転換し、２つの選択マーカーのうちいずれ か一方（上の例ではｔｒｐｌ）について選択する。「ある」株と同じ選択マーカ ー（すなわち、例として挙げたｔｒｐ　１およびｕｒａ３）を欠いている酵母交 配型である「α」株を、Ｈ鎖遺伝子を含有するプラスミドで形質転換し、別の選 択マーカー（すなわち、上の例ではｕｒａ３）について選択する。Ｌｆｌｌプラ スミドを含有する「ある」株（上の例では、表現型：Ｔｒｐ″Ｕｒａつ、および Ｈ鎖プラスミドを含有する株（表現型：土の例ではＴｒｐ−Ｕｒａ’）を交配し 、上記選択マーカーの両方についてプロトドローフ（ｐｒｏｔｏｔｒｏｐｈｉｃ ）である２倍体（ｄｉｐｌｏｉｄ）　（上の例ではＴ　ｒｐ’ＴＪ　ｒａ”）を 選択する。
形質転換用宿主として使用することのできる細菌宿主の中では、大腸菌（Ｅ、ｅ ｏｌｉ’＋Ｋ　１２株２９４　（ＡＴＣＣ３１４４６）が特に有用である。他の 使用可能な微生物株は、Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｘ　１７７６　（ＡＴＣＣ３１，５３７ ）である。既述の菌株、およびＥ、ｃｏｌｉ　Ｗ３１１０（、ＡＴＣＣ２７３２ ５）　、ならびにサルモネラ・チフィムリウム（Ｓａｌ＋ｎｏｎｅｌｌａ　ｔｙ ｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）またはセラチア・マルセスセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｍ ａｒｅｅｓｃｅｎｓ）　すどの他の腸内細菌、および種々のシュードモナス（Ｐ ｓｅｕｄｏｍｏｎｕｓ）種を使用することができる。
一般には、宿主細胞と適合する種由来のレプリコンおよび制御配列を含有するプ ラスミドベクターをこれらの宿主について使用する。
それらのベクターは通常、複製部位、および形質転換細胞内での表現型による選 択を付与することのできる特殊な遺伝子を含有している。たとえば、Ｅ　、　ｃ ｏｌ　ｉは、Ｅ　、　ｃｏｌ　ｉ種から誘導されたｐＢＲ３２２Ｆポリバー（Ｂ ｏｌｉｖａｒ）らのＧｅｎｅ、；：９５（１９７７））を使用すれば容易に形質 転換される。ｐＢＲ３２２は、アンピシリンおよびテトラサイクリン耐性にかか る遺伝子を含有しているので、形質転換細胞を同定するための簡便な手段を提供 することができる。ｐＢＲ３２２プラスミドまたは他の微生物プラスミドはさる に、微生物が自身のタンパク質を発現するために使用することのできるプロモー ターを含有しなければならず、またはそれを含有するよう修飾しなければならな い。組換えＤＮＡの構築で最も普通に使用されるプロモーターには、β−ラクタ マーゼ（ペニシリナーゼ）、およびラクトース（β−ガラクトシダーゼ）プロモ ーター系［チェインジ（Ｃｈａｎｇ）らのＮａｔｕｒｅ、　２７５：６１５（１ ９７ｇ）、イタクラ（ｌｔａｋｕｒａ）らの５ｃｉｅｎｃｅ、　１９８：１０５ ６（１９７７）コ、ならびにトリプトファンプロモーター系［ゴーデル（Ｇｏｅ ｄｄｅｌ）らのＮｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、３：４０５７ （１９８０）、ＥＰＯ公開公開番号００３６７彎６ ロモータ一群も発見されており、利用されている。
たとえば、あらゆるＨ鎖またはＬ鎖キメラ免疫グロブリン鎖にかかる遺伝子構築 物は、バクテリオファージλ（　Ｐ　Ｌ）の左側プロモーターの制御下に配置す ることができる。このプロモーターは、制御可能である、最も強い既知のプロモ ーターの１つである。制御は、入りブレソサーによって行われ、隣接している制 限部位が知られている。
また、この免疫グロブリン鎖配列の発現は、形質転換されていない状態における 微生物と「ホモローガス」であり得る他の調節配列の制御下にも置くことができ る。たとえば、ラクトース依存性Ｅ．ｃｏ１ｉ染色体ＤＮＡは、βーガラクトシ ダーゼ醇素を同化することによってラクトース消化を仲介するラクトースすなわ ちｌａｃオペロンを含有する。このｌａｃ制御要素は、Ｅ　、　ｃｏｌ　ｉを感 染するバクテリオファージλｐＬＡＣ５から入手することができる。］］ａＣプ ロモーターーオペレーターは、Ｉ　ＰＴＧによって誘導することができる。
同様に、他のプロモーター／オペレーター系、またはそれらの一部分も使用する ことができる。たとえば、アラビノース、コリシンＥ１、ガラクトース、アルカ リホスファターゼ、トリプトファン、牛シロース、ｔａｃなどを使用することが できる。他の細菌遺伝子発現制御要素を利用しても、免疫グロブリンタンパク質 を発現することができる。たとえば、細菌性分泌シグナルペプチドコード化領域 を有する遺伝子を細菌内で発現させれば、シグナルペプチドト通常結合している 免疫グロブリンペプチドを分泌させることができる。
他の好ましい宿主は、哺乳類細胞であり、これはインビトロでは組織培養、また はインビボでは動物内で増殖される。ｌ’ｉ＠乳類細胞は、免疫グロブリンタン パク質分子に、リーダーペプチドの除去、Ｈ鎖およびＬ鎖の正しい折り畳みと組 み合わせ、正しい部位におけるグリコジル化、ならびに機能的抗体タンパク質の Ｈ，Ｌ、分子としての細胞からの分泌など、翻訳後における修飾を行うことがで きる。
抗体タンパク質を生産するための宿主として有用であり得る哺乳類細胞には、Ｖ ｅｒｏ（ＡＴＣＣＣＲＬ８１）もしくはＣＨＯ−Ｋｌ　（ＡＴＣＣＣＲＬ６１） ？ｊどのフィブロブラスト起源の細胞、またはバイブ’Ｊ　Ｆ−ｖＳｐ２１０− Ａｇ１４　（ＡＴＣＣＣＲＬ１５８１）もしくは骨髄種Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８　（Ａ ＴＣＣＴＩＢ９）などのリンパ球起源の細胞、ならびにそれらの誘導体がある。
クローンしたＨ鎖およびＬ鎖遺伝子を哺乳類細胞内で発現させるための幾つかの 可能なベクター系が入手可能であるｅ　１つのクラスのベクターは、ウシ乳頭腫 ウィルス［サーバー（Ｓａｒｖｅｒ、　Ｎ、　）らのＰｒ。
ｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　、　１：、　Ｓ、　Ａ、　、　７９ ニア１４７（１９８２）コ、ポリオーマウィルス［ディーンズ（Ｄｅａｎｓ＋　 Ｒ，Ｊ、　）らのＰｒｏｅ、　Ｘａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　、　Ｉ）、 　Ｓ、　Ａ、　８１：１２９２（１９８４）］、またはＳＶ４０ウィルス［ルス 牛−ら（Ｌｕｓｋｙ、　Ｍ、およびＢｏｔｃｈａｎ、　Ｍ、　）のＮａｔｕｒｅ 、　２９３ニア９（１９１１１１）コなどの動物ウィルスから誘導される自律的 に複製する染色体外プラスミドを付与するＤＮＡ要素を利用するものである。第 ２のクラスのベクターは、所望の遺伝子配列の宿主細胞染色体への組込みに依存 するものである。それらの染色体に導入されるＤＮＡが安定に組み込まれている 細胞は、これｕｌｌｉｇａｎ、Ｒ，ｃ、およびＢｅｒｇ、　？、　）のＰｒｏｃ 、　１ｉａｔ１．　Ａｅａｄ、　Ｓｃｉ、　、　Ｕ、　Ｓ、　Ａ、　、　V８： ２０ ７２（１９８１）］またはＴｎ５　ｎｅｏ　［サザーンら（Ｓｏｕｔｂｅｒｎ、 　Ｐ、　Ｊ、およびＢｅｒｇ、　Ｐ、　）のＪ、　Ｍｏ１．　Ａｐｐｌ、　Ｇｅ ｎｅｔ、　、ｊ　＋３２７（１９８２）ｌに基づいて選択することができる。選 択可能なマーカー遺伝子は、発現させるべきＤＮＡ遺伝子配列に直接結合させて も、またはコトランスフエクシコン（ＣＯ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）によっ て同一細胞に導入させてもよい［ウィグラー（Ｗｉｇｌｅｒ、　Ｍ、　）　’ｌ のＣｅ１ｌ、　１６：７７（１９７９）ｌ。
免疫グロブリンｃＤＮＡは、抗体タンパク質またはその前駆体をコードしている 成熟ｍ　ＲＮ　Ａになる配列からしか構成されていないので、免疫グロブリンの ｍＲＮＡを最適に合成するには、遺伝子の転写を調節し、およびＲＮＡをプロセ ッシングする付加的な遺伝子発現要素が必要である。これらの要素としては、ス プライス・シグナル、ならびに誘導プロモーター、工ンノーンサーおよび終止シ グナルなどの転写プロモーターを挙げることができる。このような要素を含有す るｃＤＮＡ発現ベクターとして、オカヤマら（Ｏｋａｙａｍａ、　ＩＩｌ、およ びＢｅｒｇ、　Ｐ、　）のＭｏ１．Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、；：２８０（１９８３ ）、セブコ（Ｃｅｐｋｏ、　Ｃ，Ｌ、　）らのＣｅ１ｌ、　３７：１０５３（１ ９８４）、およびコウフマン（Ｋａｕｆｍａｎ、　Ｒ，Ｊ、　）のＰｒｏｃ。
が挙げられる。
免疫グロブリンｃ　Ｄ　Ｎ　Ａを哺乳類細胞内で発現させることについて最適な ベクターを評価する方法は、第１に、免疫グロブリンＤＮＡ配列を、細胞ゲノム に安定に組込むか、または染色体外プラスミドとして自律的に複製することので きるベクターに配置させる。このベクターは、異なる遺伝子発現要素を最適の免 疫グロブリン合成について評価するのに使用することができる。
宿主としての哺乳類細胞のもう１つの利点は、ゲノム配列由来のキメラ免疫グロ ブリン遺伝子を発現するそれらの能力である。したがって、哺乳類細胞は、可変 領域ｃＤＮＡモジニール、およびゲノム配列の全部、またはその一部に存在して いる定常領域から構成されるキメラ免疫グロブリン遺伝子を発現することができ る。幾つかのヒト定常領域ゲノムクローンは開示されている［エリソン（Ｅｌｌ ｉｓｏｎ。
Ｊ、　ｌｉ、　）らのＮｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　、　１０：４０７１ （１９ｇ２）、またはマックス（Ｍａｘ、　Ｅ。
）らのＣｅ１１．　輩：ａ９ｔ０９ｓ２）］。このようなゲノム配列を使用する ことは、この定常領域遺伝子セグメントと共に、免疫グロブリンエンハンサ−、 スプライスシグナル、および転写終止シグナルを同時に導入する場合に便利であ り得る。
完全なＨ＝　Ｌ　を抗体を得るために、別の方法を行うこともできる。
第１に、Ｌ鎖およびＨ鎖を別々に発現させ、次いて精製したＬ鎖およびＨ鎖をイ ンビトロで組み合わせ、完全なＨ，Ｌ、のＩＥＧ抗体とすればよい。細胞内で完 全なＨｔ　Ｌ　ｔの１ｇ０分子を生成させるために使用する組み合わせ経路は、 広範に研究されている［たとえば、シャルフ（Ｓｃｈａｒｆｆ、　Ｍ、　）のＨ ａｒｖｅｙ　Ｌｅｃｔｕｒｅｓ、　６９：１２５（１９７４）コ。リディース（ ｒｅｄｕｃｅｄ）　Ｌ、単離し７こＬ鎖およびＨ鎖からＩｇＧ抗体を作成するた めのインビトロ反応パラメーターは、ペイチヲック（Ｂｅｙｃｈｏｋ、　Ｓ。
）のＣｅ１ｌｓ　ｏｆ　１ｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ、 アカデミツク・プレス、二ニーヨーク、６９頁、　１９７９に規定されている。
第２に、細胞内会合（ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ　ａｓｓｏｃｉａｔａｉｏｎ ）させ、Ｈ鎖とＬ鎖とを結合させて完全なＨｔＬ、ＩｇＧ抗体にするために、同 一細胞においてＬ鎮およびＨ鎖を同時発現（ｃｏ−ｅｘｐｒｅｓｓ）することが 可能である。同時発現は、同一の宿主における同一または異なるプラスミドを使 用して起こすことができるＣ 好ましい態様では、酵母または細菌内で有用である分泌シグナルを利用して同時 発現を行う。このような条件下で、完全に折り畳まれ、組み合わされたＨ　ｔ　 Ｌ　２免疫グロブリンを得ることができる。
さろに、本発明の方法によって、キメラＦａｂフラグメントを調製することがで きる。
本明細書に記載している方法はさらに、ある特定の特異性の抗体クラスを、これ と同じ特異性を有しているが、ヒトまたは非−ヒトのいずれか異なるクラスの抗 体に切り換えるために使用することができる。たとえば、ヒトＩｇＭ抗体は、そ のＩｇＭ抗体を産生じている細胞から入手した可変ヒ）　ｃ　Ｄ　Ｎ　、Ａ配列 を連結したヒト定常１ｇＧｃ　Ｄ　Ｎ　Ａまたはゲノム配列を含有する構築物を 調製することによって、ヒトＴｇＧ抗体に変換することができる。次いで、これ らの構築物を適当な宿主に導入し、発現させる。
ポリペプチド産物 本発明は“キメラ”免疫グロブリン鎖、即ち重鎮または軽鎖を提供するものであ る。キメラ鎖は天然のヒト免疫グロブリン重鎮に存在する不変部と実質上同様の 不変部と、所望の任意の抗原特異性を有する可変部とを含有している。可変部の 供給源はヒトまたはヒト以外のいずれであってもよい。
本発明はまた、全分子として所望の結合および認識特性を表す、会合（アンシェ ード）シた重鎮および軽鎖を含有する免疫グロブリン分子を提供するものである 。様々な型の免疫グロブリン分子が提供されている：キメラ重鎮と非キメラ軽鎖 を有する一価、二価、二特興性（ジスベシフィソク、異なる可変部を有する）分 子、または所望の機能を担持するペプチド部分と結合した可変の結合ドメインを 有する分子。
同一または異なる可変部結合特異性のキメラ重鎖と非−キメラ（即ち、全部ヒト か、全部ヒトでない）軽鎖を有する抗体は、必要なポリペプチド鎖が適当に会合 することによって製される。これらの鎖はそれぞれ、本発明の組み立て構築法（ モデ二う−アッセンブリー）によって調製することができる。
キメラＦａｂ断片もまた、本発明の一部である。
用途 ヒト不変部を有する本発明の抗体は血清病またはアナフィラキシ−ショックなど の負の免疫応答がなく、受動免疫、とりわけヒトでの受動免疫に有用である。勿 論この抗体を、インビトロでのイメージング用に樟識し、従来技術の免疫診断ア ッセイおよび牛、トに用いることもできる。この場合、樟識としては放射能エミ ッター、またはＣ−１３分子等のＮＭＲコントラスト物質、または重金属核のよ うなＸ−線コントラスト物質であってよい。この抗体を適当に樟識してインビト ロでの抗原の位置決定に用いることもできる。
抗体はそのままで補体−仲介溶解に、またはトキシンや他の治療用部分と結合さ せて治療目的に用いることができる。
抗体のクラス切り替え（スイッチ）は、細胞融合またはハイブリドーマ技術で得 られた抗体の会合特性、集合特性または他の特性を変更することが望まれる場合 に有用である。例えば、大多数のヒト−ヒトモノクローナルは１ｇＭクラスに属 し、それは還元および集合し易いことで知られている。従って、それらの抗体を 他の抗体タイプ、例ｔｌｆＩｇＡ、ＩｇＧ、またはＩｇＥに変更することには大 きい利点がある。
混合抗体−酵素分子はＥＬＩＳＡのような免疫診断法に用いることができる。混 合抗体−ペプチドエフェクター抱合体を用いてエフェクタ一部分を高い効率で、 かつ高い特異性で標的部位に到達させる（デリバリ−）ことができる。
このように本発明の総合的な記述がなされたので、以下の幾つがの具体的な実施 例により、本発明をよりよく理解できるであろう。
これらの実施例は例示を目的とするにすぎず、特に記載ない限り、制限的な意図 ではない。
ヒト細胞系統（セルライン）０Ｍ２１４６および０Ｍ１５００をＨｕ＋ｅａｎ　 Ｍｕｔａｎｔ　Ｃｅ１ｌ　Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ（Ｃａｍｄｅｎ、　Ｎｅｖ　Ｊ 　ｅｒｓｅｙ）から入手し、ＲＰＭ１１６４０÷１０％ウシ胎児血清（＼４．　 Ａ　、　Ｂ　１ｏｐｒｏｄｕｃｔＳ）中で培養した。　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙ ｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎから５Ｐ２１０細胞系統およびＣ ＲＬ８０１７細胞系統を得、ダルベツコの改良イーグル培地（ＤＭＥＭ）÷４． ５９／（ｌグル：’−ス（Ｍ、　Ａ、　Ｂ　１ｏｐｒｏｄｕｃｔｓ）　：　１０ ％ウシ胎児血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ、５ｔｅｒｉｌｅ　５ｙｓｔｅ＋ｎｓ、Ｌ。
ｇａｎ、　Ｌ：ｔａｈ）中で培養した。培地にベニ゛シリン／ストレプトマイシ ン（Ｉｒｖｉｎｅ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｉ　ｒｖｉｎｅ、　Ｃａ１ｉｆｏｒ ｎｉａ）を補充した・プラスミドｐＢＲ３２２、ｐＬｌおよびｐＵｃ１２をＰ　 ｈａｒｍａｃｉａ　Ｐ−Ｌ　Ｂｉｏｃｈｅｒａｉｃａｌｓ（Ｍｉｌｓａｕｋｅｅ 、　Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）から購入した。プラスミドｐｓ　Ｖ　２　ｎｅｏおよ びｐＳ　Ｖ　２−ｇｐｔはＢ　ＲＬ　（Ｇ　ａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ＋Ｍａｒｙ ｌａｎｄ）から得、また、Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ １１ｅｃｔｉｏｎ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、　Ｍａｒｙｌａｎｄ）から入手可能で ある。ｐＨｕ−１但り　１はヒトＩｇＧ１染色体遺伝子の８．３ｋｂ　Ｈｉｎｄ ＩＩ［−ＢａｍＨＩ断片のサブクローンである。ヒトＩｇＧ１染色体遺伝子の別 々の単離はエリソンら［Ｅｌｌｉｓｏｎ、　Ｊ　、Ｗ、、Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ 　Ｒｅｓ、、ｌ　Ｏ：　４０７１（１９８２）コによって示された。Ｍ　８　ａ ｌｐｈａＲＸ　１２はＭ１３＋ｎｐｌＯに挿入されたＭ　６０３中色体遺伝子の Ｊ−Ｃイントロン領域［デイヴイスら（Ｄａｖｉｓ、Ｍ、）、Ｎａｔｕｒｅ、２ ８３　：　７３３］由来のマウス重鎮エンハンサ−を含有している。Ｇ−テイル 化ｐＵＣ９をＰ　ｈａｒｍａｃｉａ　Ｐ　。
Ｌ、かる購入した。浮遊密度遠心によるプラスミドＤＮＡの精製、制［エンドヌ クレアーゼ消化、アガロースゲル電気泳動によるＤＮＡ断片の精製、結合（ライ ゲーション）および大腸菌の形質転換等をれた。制御エンドヌクレアーゼおよび 他のＤＮＡ／ＲＮＡ修飾酵素はベーリンガーーマンハイム（Ｉ　ｎｄｉａｎａｐ ｏｌｉｓ、　Ｉｎｄｉａｎａ）、ＢＲＬ。
Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｓｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｂｅｖｅｒｌｙ、　Ｍａｓｓａｃ ｈｕｓｅｔｔｓ）およびＰ　ｈａｒｍａｃｉａ　Ｐ、Ｌ、から購入した。
オリゴヌクレオチドは、イトウら［１ｔｏ、　Ｎ　ｕｃｌ、　Ａ　ｃｉｄｓ、　 Ｒｅｓ、。
Ｅ　Ｓ　Ｅ　Ｎ（Ｌｏｓ　Ａｎｇｅｌｓ、　Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ）から購入し た。トリチル化し、脱保護したオリゴヌクレオチドをセファデックス−Ｇ５０で 精製した後、Ｃ］　８ｕＢｏｎｄａｐａｋカラム（Ｗａｔｅｒｓ　Ａｓ５ｏｃｉ ａｔｉｏｎ）を用い、１０ｍＭ）リエチルアミンー酢酸、ｐＨ７，２中、０−２ ５％アセトニトリルグラディエントを用いる逆相ＨＰＬＣにかけた。８０％酢酸 中で３０分間脱トリチル処理した後、３回蒸発させた。オリゴヌクレオチドを［ ガンマ−″′ｐコＡＴＰ＋Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼで標識した。
の方法によって組織培養細胞から全細胞ＲＮ　Ａを調製した。ポリ（Ａ）’ＲＮ Ａの調製、メチル水銀アガロースゲル電気泳動、およびニトロセルロースへの“ ノーザン”トランスファーはマニアティスラ（Ｍｇ７掲）の方法に従って行われ た。まずＲＮ　Ａをホルムアルデヒド処理することにより、全細胞ＲＮ　Ａまた はポリ（Ａ）”ＲＮＡをニトロセルロースに直接結合させた［ホワイト（Ｗｈｉ ｔｅ、　Ｂ、　Ａ、）およびバンクロフト（Ｂａｎｃｒｏｆｔ、　Ｆ、Ｃ，）、 Ｊ　、　Ｂ　ｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、、２５７　：　８５６９（１９８２）Ｅ。フ ィルターに結合したＲ　Ｎ−Ａのハイブリザイゼーシヨンは、［マーグリー：） （Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ、　Ｄ、Ｈ，）、Ｎａｔｕｒｅ、２９．５　：　１６８（ １９８２）二の条件下、ニックトランスレーションしたＤ　Ｎ　Ａ　断片と行う か、またはｓ　ｔ　ｐ　１ｇ識オリゴヌクレオチドと、４ＸＳＳＣ。
２　Ｘ　Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ、　１００　ｕ９／１（ｌサケ精子Ｄ　Ｎ　Ａを 用いて３７℃で一夜、次いで３７℃の４ｘＳＳＣ中で洗浄して行ったｃＤＮ、Ａ の調製およびクローニング オリゴ−ｄＴプライムｃ　Ｄ　Ｎ　Ａライブラリーを、ＧＭ１５００およびＧＭ ２１４６細胞由来のポリ（Ａ）”ＲＮＡから、それぞれランドら［Ｌａｎｄ、Ｈ ，、Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、　影：　２２５１（１９８１）］および ガブラーおよびホッフマン［Ｇｕｂｌｅｒ、Ｖ、　ａｎｄ　Ｈｏｆｆｍａｎ、　 Ｂ、　Ｊ、。
Ｇｅｎｅ、２５　：　２６３（１９８３）］の方法で調製した。ｅＤＮＡライブ ラリーは、上記条件を用いる５ｔｐ−標識オリゴヌクレオチドとの系中ハイブリ ザイゼーション（マニアテイスら、前掲）、またはドウ・リングら［ｄｅ　Ｌａ ｎｇｅ、　Ｃｅ１ｌ、３４　：　８９１（１９８３）］の条件を用いる、ニック トランスレージランしたＤＮＡ断片とのハイブリザイゼーションに付した。
オリゴヌクレオチドプライマー伸長およびクローニンダボ１バＡ）°ＲＮＡ（２ ｏμｇ）を６４ｍ′ＭＫＣＩ２（４０μＱ）中、プライマー１．２μ７と混合し た。９０’Ｃで５分間変性した後、水冷し、ＩＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｆｆ（ｐＨ８ ，３）３μＣ中のヒト胎盤リボヌクレアーゼインヒビター（ＢＲＬ）３単位を加 えた。４２°Ｃで１５分間、オリゴヌクレオチドをＲＮ　Ａにアニーリングさせ 、０．０５Ｍ　ＤＴＴ、０゜０ｂＭ　ＭｇＣｈ、および各１ｍＭのｄＡＴＰ、ｄ ＴＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＧＴＰを加えた。アルファー”Ｐ−ｄＡＴＰ（２μ（ ，４００Ｃ５／ｍｍｏｌ　Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ）、次いで ＡＭＶ逆転写酵素３μｆｆ（１９単位／ｕｎ、、Ｌｉｆｅ　５ｃｉｅｎｃｅ）を 加えた。
４２°Ｃで１０５分間インキニベーションした後、２μＱの０．５ＭＥＤＴＡと ５０ｔｔＱの１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ、ＬｍＭ　ＥＤＴＡ、ｐＨ７，６を加えた。取 り込まれなかったヌクレオチドをセファデックスＧ−５０スパンカラムクロマト グラフイーで除去し、ＲＮＡ−ＤＮＡノ翫イブイブリッドェノール、次いでクロ ロホルム抽出し、エタノールで沈澱させた。第２鎖合成、ｄＣＴＰまたはｄＧＴ Ｐによるホモポリマーティリング、およびホモポリマーチイル化ベクターへの挿 入はガブラーおよびホッフマン（前掲）記載の方法で行われた。
部位特異的突然変異誘発 一本鎖Ｍ１３サブクローンＤＮＡ（１μ９）をＨｉｎバッフｙ　（７ｍＭ　Ｔｒ ｉｓ−ＨＣｆｆ（ｐＨ７，６）、７ｍＭ　Ｍｇ（Ｊ！ｔ、５０ｍＭ　ＮａＣｆｆ ）１２．５μＱ中、オリゴヌクレオチドプライマー２０ｎｇと結合させた。
密封した管内で９５℃に加熱した後、７０℃から３０℃まで９０分、ゆっくりと 冷却することによりプライマーと鋳型のアニーリングを行った。ｄＮＴＰ類（各 １ｍＭ）２μｆｆＳ”Ｐ−ｄＡＴＰ（１０，ｃｚｃｉ）１μＬ　ＤＴＴ（０，１ Ｍ）１Ｍｇ１およびフレノウＤＮＡ　Ｐｏ１ｌ（０，４μρ、２ｕ１ベーリンガ ーーマンハイム）を加え、３７℃で３０分間、鎖を伸長させた。ここにＭ１３リ バースプライマー（Ｎｅｗ　ＥｎｇｌａｎｄＢ　１ｏｌａｂｓ）　１μρ（１０ ｎｇ）を加え、加熱／アニーリングと鎖伸長工程を繰り返した。０．５Ｍ　Ｅ　 ＤＴＡ（ｐＨ８）２　ｔ、ｔ（ｌ＋　１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣ（！（ｐＨ７， ６）、１ｍＭ　ＥＤＴＡ　８０μｇを加えて反応を停止した。生成物をフェノー ル抽出し、セファデックスＧ−５０スパンカラムクロマトグラフイーで精製し、 エタノールで沈澱させた後、制限酵素消化および適当なベクターとのライゲージ ジンに付した。
の変法でプロトプラスト融合を行った。Ａ６゜。＝０．７のバクテリア５０ｉＣ をサンドリーイルジンら［５ａｎｄｒｉ−Ｇｏｌｄｉｎ、Ｒ，Ｍ、、　Ｍｏｌ。
Ｃｅｌｌ、　Ｂ　ｉｏｎ、　＊ユニ７４３（１９８１）］の方法によりプロトプ ラストに変え、次いで、ＤＭＥＭ’−１０％ＦＢＳ　２０ｚρで希釈した（終審 量２５ｘ１２）。５ｐ２１０細Ｉｌｌを収穫し、２．２’ＯＯＸｇで／’ＣＬ／ 　ット化し、洗浄し、再ペレット化し、Ｄ　Ｍ　Ｅ　Ｍに２−５ｘｌＯ”／村と なるように再懸濁した。細菌のプロトプラスト（１０ｘＩ２）をｌ０ＸＩＯ・５ ｐ２１０細胞と混合し、２２°Ｃにおいて４．０ＯＯｘ９で２０分間遠心してペ レット化した。上清をピペットで除去し、管を軽く払って残存する数滴の培地に ペレットを懸濁した。混合しながら４５秒間でＤＭＥＭ中１０％ＤＭＳ０，３７ ％（ｖ／ｖ）ＰＥＧ６０００（Ｋ。
ｄａｋ）　２　ｘＱを滴下して加えた。１５秒後、ＤＭＥＭ中４２％ＰＥＧ６０ ００（２ｘｆｆ）を４５秒間で加えた。混合しながら、完全ＤＭＥＭ（４５ｘ（ １）をゆっくり加えた。２５００Ｘｙで細胞をペレット化し、３回、洗浄および ペレット化を行った。
ボッターら［Ｐｏｔｔｅｒ、Ｈ，、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　 ＬＪＳＡ。
８に７１６１（１９８４）］の電気穿孔法を用いた。トランスフェクション後、 細胞を完全ＤＭＥＭ中、４８〜７２時間で回復させた後、選択培地の存在下、９ ６ウエル培養プレートのウェルあたり１ｏ、　ｏ　ｏ　ｏから５０．００細胞を 蒔いた。Ｇ４１８（ＧＩ　ＢＣＯ）選択は０　、８　Ｒ９／１１２、マイコフェ ノール酸（Ｃａｋｂｉｏｃｈｅｍ）は６ａ９／ｘＱ＋０、２５ｒｔｔ／ｍＱキサ ンチン、およびＨＡＴ（シグマ）は標準濃度でありた。
免疫グロブリン合成と分泌の検定 分泌された免疫グロブリンは、組織培養細胞上清から、直接測定された。ｌ　Ｘ 　１０”細胞を１６０μ（！の１％ＮＰ４０．Ｏ，１５Ｍ物質を除去し、細胞質 タンパク質の抽出物を調製した。
アフィニティー精製した抗血清を雨いる二重抗体サンドイッチＥＬＩＳＡ［ボラ −ら（Ｖｏｌｌｅｒ、Ａ、）、Ｍａｎｕａｌ　ｏｒ　Ｃ１１ｎｉｃａｌ　Ｉ　ａ ＋１ｌｕｎ。
１ｏｇｙ、２ｎｄＥｄ、、Ｅｄｓ、　Ｒｏｓｅ、Ｎ、　ａｎｄ　Ｆｒ１ｅｄｅａ ｎ、Ｈ，，３５９頁〜３７１頁、１９８０コによって特異的な免疫グロブリンを 検出した。ヒトＩｇＧの検出のための、プレート−結合抗血清は１／１０００希 釈したヤギの抗ヒトＩｇＧ（ＫＰＬ、　Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ＋　Ｍａｒｙ ｌａｎｄ）であり、ペルオキシダーゼ−結合抗血清は１／４０００希釈したヤギ の抗ヒトＩｇＧ（ＫＰＬまたはＴ　ａｇｏ、　Ｂ　ｕｒｌ　ｉｎｇａ＋ａｅ）で ある。
ヒト免疫グロブリンカッパを検出するための、プレート−結合抗血清は１１５０ ０希釈したヤギの抗ヒトカッパ（Ｔ　ａｇｏ）であり、ペルオキシダーゼ−結合 抗血清は１／１０００希釈したヤギ抗ヒトカッパ（Ｃａｐｐｅｌ）である。
Ｂ型肝炎の表面抗原と結合する抗体は市販の検定法（アボット、ＡＩＪＳＡＢ） で検出された。
寒産皿 以下の実施例はヒト不変部と非−ヒト可変部とを有するキメラ抗体の調製に関す る。これらの実施例はキメラ抗体の着実な製造工程の概要を示すものである。
実施例１：ヒト抗体不変部遺伝子変更およびｃＤＮＡ発現ベクター（１）重鎮ヒ ト不変部のためのｅＤＮＡクローン、およびそれを含有するビヒクルの調製 ｒｔｒＲＮ　Ａ　ｆ：）調製およびｃＤＮＡクローニングの供給源として細胞系 統（セルライン）ＣＨ２１４６を用いた。この細胞系統はＩｇＧ１を分泌する［ シモンズら（Ｓ　１ｍｌ１ｏｎｓ、　Ｊ、Ｇ、）、Ｓ　ｃａｎｄ、　Ｊ　、　Ｉ 　ｍｍｕｎｏｌ、、と同様１ｇＡをも分泌することを示唆していた。
この細胞系統をクローニングした結果は、６個のサブクローンの内５個がＩｇＧ のみを分泌し、６個のサブクローンの内１個がＩｇＡのみを分泌することを示唆 していた。この細胞系統からポリ（Ａ）。
ＲＮＡを調製し、ガブラーおよびホフマン［Ｇｕｂｌｅｒ、ｔＪ、　ａｎｄ　Ｈ ｏｆｆｍａｎ、Ｂ、Ｊ、、Ｇｅｎｅ、２５：２６３　２６９（１９８３）Ｅの方 法でポリ（Ａ）”ＲＮＡからｃＤＮＡライブラリーを調製した。大腸菌株ＨＢ１ ０１およびＲＲＩに導入したｃＤＮＡの最初の平板培養で合計１５００のコロニ ーを得、それをヒトＩｇＧ１のゲノムクローン（ｐＨｕ−ｇａｍｍａ−１）のＨ １ｎｄＩ［ｌ　−Ｂ　ａｍＨ１断片と）〜イブリザイゼーシ璽ンさせた。４個の 陽性クローンが認められた。これらクローンの１つ、ｐＧＭＨ−３（第４図）の ＣＨ３暗号領域含有断片を用いて元のライブラリーと約５０００コロニーの新し い形質転換体とを一緒に、再度、スクリーニングした。最大クローンの内、２個 、ｐＧＭＨ−６およびｐＧＭＨ−１５を制限酵素消化して分析した（第４図）。
両クローン共に、完全なヒトＩｇＧ１の不変部を含有していたが、ｐＧＭＨ−６ は、明らかにＩｇＧｌｃＤＮ、Ａ配列に影響のない、ｐＢＲ３２２ＤＮＡの約１ ５００塩基対を欠失していることが分かった。
クローンｐＧＭＨ６は重鎮可変領域のクローニングのためのクローニングベクタ ーを構築するためのＩｇＧ１不変部変更（ｍｏｄｕｌｅ）を提供する。
（２）軽鎖ヒト不変部のためのｅＤＮＡクローン、およびそれを含有するビヒク ルの調製 初期クローニング期のためにＩｇＧ、Ｋを産生するヒト細胞系統（６Ｍ１５００ ）を選択した。６Ｍ１５００から調製したポリ（Ａ）”ＲＮＡはウサギ網状赤血 球抽出物を用いるインビトロでのトランスフェクションにおいて活性でゐる。ラ ンドる１Ｌａｎｃｌ、Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、９：２２５１　２２６ ６（１９８１）コの方法に従い、Ｋｐｎｌ消化し、ｄＧテイル化したｐＱ　２３ をクローニングベクターに用いて、このＲＮＡからｃＤＩＮＡライブラリーを調 製した（第５図）。このベクターはｐＢＲ３２２のＢａｍＨ１部位と５ａｌ１部 位との間に挿入されたＢｇｌＩＩ、Ｋｐｎｌおよび５ｓｔＩ部位を含有している 。
軽鎖ｍＲＮＡに対応する０Ｍ１３００ＲＮＡから生成したｃ　Ｄ　Ｎ　、Ａクロ ーンの同定のために、ＤＮＡプローブ、ＤＩＧ−ＨｕＫを合成して精製した。Ｕ ＩＧ−ＨｕＫオリゴヌクレオチドは式＝５“−ＡＧＣＣＡＣＡＧＴＴＣＧＴＴＴ −３’で示され、あろゆる機能的なヒトカッパｍＲＮ、Ａ種と、そのＪ−Ｃジャ ンクションでハイブリザイゼーションするように設計されている。このプローブ を用いてジデオキシヌクレオチドおよび逆転写酵素の存在下、ＧＭ１３０ＱＲＮ Ａ上でのｃＤＮＡ合成を開始（プライム゛）した。全ＧＭ１５Ｑ○ポリ（Ａ）” ＲＮＡ　１．２μりをこの実験に用い、Ｊ配列全てとＶ領域の幾ろかが読み取ら れ、（１）６Ｍ１５００は無傷である、（２）力・ソ／ｆプローブの配列は正し い、（３）ＧＭＩ　ＳＯＯ軽鎖ｍＲＮ　Ａ　ｌ；！　Ｊ　Ｋ４配列を含有してい る、ということが証明された。
軽鎖プローブとのハイブリザイゼーシジンが陽性であるｃＤＮＡクローンを選択 した。プローブはＪ−Ｃジャンクションとノ＼イプリザイゼーションしているの で、クローンがＪ領域に加えて完全な不変部を有するか否かを決定することが最 も重要な点であった。
２個の最大カッパｃＤＮＡクローンの挿入サイズは、０．６ｋｂと０゜９ｋｂで あり、制限酵素マツピングによって、両クローンに全不変部暗号配列が存在して いることが分かった（第６図）。ｐＢ　Ｒ３２５のＢｅ１１部位に、ヒトカッバ ネ変部とＪ領域とを含む５ａｕ３Ａ断片を挿入することにより、ヒトカッパｃＤ ＮＡクローンｐＫ２−３を用いて軽鎖不変部ベクターｐ１ＮＧ２００１を作成し た（第６Ｂ図）。
ｊジでンクションにＨｉｎｄＩ［１部位を配置することでヒトカッパｃＤＮＡク ローンの変異体を作成した。これはＪ、ＨＩＮＤＩ１１オリゴヌクレオチドブラ イマーを用いるインビトロ突然変異誘発によって行われた（第７Ｃ図）、得られ たプラスミドはｐＧＭＬ６０である。
ベクターｐｌＮＧ２００３はｃＤＮＡ配列の哺乳類細胞へのトランスファーおよ び発現のために構築された（第１０図）。このベクターは、ｐＵｃ１２と、５Ｖ ４Ｑ配列を含有する２個のプラスミドから構築された。ｐＬｌは５Ｖ４Ｑ早期領 域プロモーターとＳＶ４　Ｑ後期領域スプライス配列を提供する。ｐＳ　Ｖ　２ −ｎｅｏ配列は哺乳類細胞の形質転換のための選択可能マーカーと５ｖ４０ポリ アデニル化シグナル配列を提供する。ｐＵｃ１２はｃＤＮＡ挿入のための複数ク ローニング部位を提供する。
ｐＴＮＧ２００３ベクターは改良のために有用な数個の制限部位を有する。それ らにはエンハンサ−配列の挿入に有用なＨｉｎｄＩ１１部位、他のプロモーター 配列の挿入に有用なＨｉｎｄＩｌｌからＸｈｏｌ断片が含まれる。このベクター は哺乳類細胞でのｃＤＮＡ遺伝子の発現に有用である。
ｐｌＮＧ２００３へのエンハンサ−要素の付加免疫グロブリンのエンハンサ−要 素（エレメント）は、安定に形質転換されたマウス骨髄慢細胞内で、近くの遺伝 子の転写を数百倍促マウス骨髄腫細胞内での発現を容易にするためにマウス免疫 グロブリン重鎮エンハンサ−要素をｃＤＮＡ発現ベクターｐＴＮＧ２００３に加 えた（第１０図）。マウス重鎮エンハンサ−領域ＤＮＡはマウス重鎖ゲノムＤ　 Ｎ　Ａ　（Ｍ　８−アルフｙ　−ＲＸ　１２、Ｄｅａｎｓ、Ｒ，Ｊ、未公開）の λ４１３サブクローンから単離された。このサブクローンの５ａ１１＋ＥｃｏＲ Ｉ消化で単離されたＤＮＡをＨｉｎｄＩＩｌリンカ−で修飾し、ｐｌＮＧ２００ ３のＨｉｎｄＩｎ部位に挿入し、新しいｅＤＮＡ発現ベクターｐｌＮＧ２００３ Ｅを得た。このベクターは哺乳類細胞、特にマウス骨髄腫またはノーイブリドー マ細胞系統内でのｃＤＮＡ遺伝子の効率的な発現に有用である。
（以下余白） 実施例２：ヒトーマウスキメラ抗−ＨＢｓＡｇ抗体鎖（１）重鎖マウス抗−ＨＢ ｓＡｇ可変領域のｃＤＮＡクローンおよびそれを含有する媒体の調製 セルラインＣＲＬ８０１７をＡＴＣＣから入手し、サブクローンした。サブクロ ーンを増殖させ、市販の抗−ＨＢｓＡｇ検出キットを用いてマウスＩｇＧ抗−Ｂ 型肝炎結合活性について試験した。３つのポジティブなサブクローンが見い出さ れた。ポリ（Ａ）”　ＲＮＡをこれるのサブクローンの１つから調製し、メチル 水銀アガロースゲルで分画した。このＲＮＡは、にｔＪＩＧ−ＭＪＫプライマー への、およびマウス重鎖ｔ、ｌＩＧ−ＭＪＨ３プローブへの特異的なハイブリダ イゼーシヨンから推量すると、無傷の軽鎖および重鎖ｍＲＮＡを含有していた（ 第７図を参照）。さらに、ｔＪＩＧ−ＭＪＫプライマーを、ジデオキシ配列決定 反応において抗−ＨＢｓＡｇポリ（Ａ）”　ＲＮＡの特異的なプライムに用いた 。十分な配列を解読し、抗−ＨＢｓＡｇセルラインの主にＲＮＡがＪＫ２配列を 含んでいることがわかった。
抗−ＨＢｓＡｇポリ（Ａ）”ＲＮＡにおいて重鎮および軽鎖ＵＩＧプライマーを 用いることによって、可変領域ｃＤＮＡ合成の条件を最適にした。ジデオキシ鎖 延長の実験により、マウスＵＩＧ−ＭＪＫプライマーおよびｔＪＩＧ−ＪＨ３プ ライマーが正確ににおよび重鎖ＲＮＡをプライムすることが示された。ジデオキ シヌクレオチドの非存在下で逆転写を行うと、にｔＪＴＧ−ＭＪＫプライマーを 用いたときの主要な産物は４１０±２０ヌクレオチドのフラグメントであり、一 方、重鎖ＵＩＧ−ＪＨ３プライマーを用いたときの主要な産物は４３０±３０ヌ クレオチドのフラグメントであった。これらは、にの可変および５゛非翻訳化領 域、並びに重鎮免疫グロブリンｍＲＮＡの予想される長さに一致している。ＣＲ Ｌ８０１７細胞由来のポリ（Ａ）”ＲＮＡの最適プライムのための条件は、モノ クローナル抗体を産生ずるあらゆるセルラインから単離されたポリ（Ａ）”ＲＮ Ａに対してうまく適用されるはずである。　１オリゴヌクレオチドブライマーに よってハイブリドーマｍＲＮＡをプライムするための最適条件を決定した後に、 ２種類のオリゴヌクレオチドを設計し、重鎖Ｖ領域ｃＤＮＡの合成に用いた。こ れら２種類のオリゴヌクレオチドはＵＩＧ−ＭＪＨＢＳＴＥＩ　１（１３）およ びｔＪＩＧ−ＭＪＨ３である（第７図および第８図）。このプライマー配列が、 ＢｓｔＥ　Ｉ　１認識部位（ＧＧＴＧＡＣＣ）をクローン中に導入するために設 計されたものであり、従って、これをこの部位のところでヒトＩｇＧ１の不変モ ジュールと、後者のＪ領域の類似の位置で結合させることができることに注意す べきである。この場合、このプライマーは、Ｊ）＋３暗号配列を用いるマウスの ｍＲＮＡ配列とは唯１個のＧとじの誤対合を有していた。１．’ＩＣ−ＭＪＨＢ ＳＴＥ１１（１３）プライマーは１３塩基の長さであり、誤対合の残基は５゛側 の７対合と３°側の５対合にはさまれていた。これは１３−ｒａｅｒのＢｓｔＥ 　Ｉ　Ｉプライマーであったｏ１３−ｍｅｒのＢｓｔＥ　１１オリゴヌクレオチ ドのプライム効率を調べるために、マウスＪＭ３に特異的な２１−ｔａｅｒブラ イｖ−（ＩＪ　Ｉ　Ｇ−ＭＪ　Ｈ３）を用いた。このプライマーはその３゛末端 の１７ヌクレオチドについては完全な対合を有していた。
これら２種類のプライマーおよびＪＮ３暗号配列を第８図に示す。
１３−ｍｅｒＢｓｔＥ　］　１プライマーおよび２１−ｍｅｒＪ　）＋３プライ マーによって得られた第１鎖ｃＤＮＡ産物は、完全なりＨ領域である約４３０ヌ クレオチドのバンドを含んでいた。使用した標準的なプライム条件下では、１３ −ｍｅｒＢｓｔＥ　Ｉ　Ｉのプライム効率は２１−ｍｅｒＪ　）＋３の効率より もかなり劣っていた◎従って、Ｇｕｂｌｅｒおよび）Ｉｏｆｆｍａｎの方法（上 記）を用いて、これらプライマーのそれぞれかるの第１鎖合成によってｃ　Ｄ　 Ｎ　Ａライブラリーを作成した。
始めに、２１−ｍａｒＪ　８３ライブラリーを２１−ｍｅｒＪ＋４３オリゴヌク リダイゼーシジンを行った。次いで、このフィルターを５ｘＳＳＣ。
０．１％ＳＤＳ中、５１°で洗浄した。５つのコロニーを選択した。
最大のものは約４６０ｂｐの挿入を有していた。もっと重要なことは、それが既 知のＪ。３配列から予想される３つの制限部位を、プライマー配列の上流に含ん でいたことである。このクローンｐＪ　３−１１を、鎖終止法［ワレースら（Ｗ ａｌｌａｃｅ、Ｒ，Ｂ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｇｅｎｅ、　１６：　２１−２２１ −２６（１９］によりＪＨ３プライマーを用いて配列決定した。得られた配列は 残存のＪ、４Ｂ暗号セグメントを有していた。すぐ上流の１３−ヌクレオチドセ グメントは、公表されているＤセグメント配列（Ｄｓ対合していた。この領域か ら予想されるノナペプチドは、重鎮分子のＦＲ３を構成する、アミノ酸残基８６ 〜９４の公表されたマウスの重鎮％７サブグループと相同であるという特徴を示 した。プラスミドｐＪ３−１１は転位したＶ　Ｄ　Ｊ配列を示し、このセルライ ンによって産生される抗−肝炎ｖ、ｌ配列を含んでいることは明らかである。
次いで、２６５ヌクレオチドの長さの、Ａｌｕｌから５ａｕ９６１までの、Ｊ領 域中にＢｓｔＥ　Ｉ　Ｉ部位を有する■８領域のｃ　Ｄ　Ｎ　Ａクローンを単離 するために、ｐＪ　３−１１由来のプローブを用いて１３−ｍｅｒのＢｓｔＥ　 Ｉ　１プライマーから得たｃ　Ｄ　Ｎ　Ａライブラリーをスクリーニングした。
６つのポジティブなりローンを単離した。最大のｐＢｓ１３−１をさらに分析し た。挿入は２８０ヌクレオチドの長さであり、その制限地図は、導入したＢｓｔ Ｅ　Ｉ　１部位を除いてｐＪ　３−１１のものと一致していた。第９図は、これ ら２つの挿入体をどのように組み換えてｐＮｉＶＨｃａ−１３、即ちモジニール 結合のＢｓｔＥ　］　１１部を有するｖＮクローンを得たかを示すものである。
３種類の別のＶ、ｃＤＮ、Ａクローンが、ＢｓｔＥ　Ｉ　Ｔ部位を含む２１−ｍ ａｒのオリゴヌクレオチドＴ；ＩＧ−ＭＪＨ３ＢＳＴＥＩ　Ｉプライマーから得 たｃＤＮＡライブラリーかみ単離された。これろのクローンは、ヒト０．４配列 に結合させるための別のＶ　ＨｃＤ　Ｎ−Ａ配列を提供する。
（２）軽鎖マウス抗−ＨＢｓＡｇ可変領域のｃＤＮＡクローンおよびそれを含有 する媒体の調製 ＪＫ２配列は抗−肝炎ハイブリドーマセルラインから調製したｍＲＮＡ中に存在 するので、オリゴヌクレオチドｔ、ｔＩＧ−ＪＫ２ＢＧＬＩＩ（第７Ｂ図）を設 計してＢｇｌ１１部位をＪ、２領域中に導入した。
Ｂｇｌｌｌによる消化は、次に前記のヒトＣＫベクターｐｌ：Ｇ２００１のＢｅ １１部位に、ＶｘｃＤＮＡ暗号領域を直接挿入することを可能にする。この挿入 によって、マウスの可変領域セグメント（Ｊ領域を含む）がヒトに不変領域セグ メントに正確に結合することになる（それぞれが適切な暗号フレーム中にあり、 マウス可変領域またはヒト不変領域のいずれのアミノ酸配列においても変化はな い）。
Ｊ　Ｋ２ＢＧＬ　Ｉ　Ｉオリゴヌクレオチドを用いて抗−ＨＢｓＡｇｍＲＮＡを プライムし、ｐＵｃ９において、重鎮に対する（上記）ようなｅＤＮＡライブラ リーを得た。クローニングの前にポリアクリルアミドゲル電気泳動によりｃＤＮ 、Ａを大きさによって選別し、８０％のｃＤＮ、Ａ、クローンが長さ３００〜７ ５０ヌクレオチドの挿入体の大きさを有することがわかった。このライブラリー のレプリカフィルターを、２種類のオリゴヌクレオチド、即ち元のプライマーお よび元のプライマーの５°のＪｈ２配列に相補性である第２のプローブでスクリ ーニングした。
抗−Ｂ型肝炎モノクローナルセルラインＣＲＬ８０１７が少なくとも２種類の別 の軽鎖を有する免疫グロブリンを分泌することがわかった。その１つは、抗−Ｂ 型肝炎セルラインを得る際の融合相手として用いたミエローマＮ　Ｓ　−１から 導かれる。Ｎ５−１はミエローｖＭＯＰｃ２１から導かれるので、ＭＯＰＣ２１ Ｖｔ　＋ａＲＮＡが抗−肝炎モツクローナルセルライン由来のＶＫＣＤＮＡライ ブラリー中に存在する可能性を調べた。実際に、分析した１つのｃＤＮＡクロー ／（ｐ６Ｄ４Ｂ）ｉｔ、挿入サレタＢｇｌ１１部位を除いてＭｏＰＣ２１Ｖつｃ ＤＮＡの制限酵素地図と同一の地図を有している。
これらの結果から２つの結論を導（ことができる。その第１は、オリゴヌクレオ チドを用い、）１イブリドーマセルライン由来のｖ８領域をクローニングしなが ら制限酵素部位を効率的に導入することができるということである。その第２は 、多数のＶ領域配列（その１つだけが所望の配列である）の存在についてハイブ リドーマセルラインを注意深くモニターしなければならないということである。
このセルラインのｍＲＮＡ中に存在するに軽鎖Ｊ領域の特徴をさらに調べるため に、ポリ（Ａ）”　ＲＮＡを、ホワイトら［Ｗｈｉｔｅ　ａｎｄ　Ｂａｎｃｒｏ ｆｔ、　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、　２５７　：　８５６９　（１９１！２） コのホルムアルデヒド「ドツトプロット」法によってニトロセルロースに結合さ せた。ＲＮＡを、それぞれの機能的なにＪ領域に特異的なｓ！Ｐ−ラベルしたオ リゴヌクレオチドプローブにノ翫イブリダイズさせた。これらのプローブを、Ｕ ＩＧプローブ５ＪＫ１、ＭＪＫ、５ＪＫ４、および５ＪＫ５として第７Ｂ図に示 す。この結果は、ｍＲＮＡがＭＪＫおよび５ＪＫ４の両オリゴヌクレオチドプロ ーブに強くハイブリダイズすることを示し、Ｊ、２およびＪ、４０両配列が存在 していることを示した。Ｊｃ２ｍＲＮＡは、親のハイブリドーマ相手Ｎ５−１か み導かれるものとして前に同定されていたので、Ｊｘ４　ｍＲＮＡがＣＲＬ８０ １７細胞の抗−肝炎結合特異性を一一ドしているものと結論された。
２つの別のｃ　Ｄ　Ｎ　ＡライブラリーをスクリーニングしてＪ０４配列をコー ドしているＶ領域クローンを単離した。第１のものは、ＪＫ２ＢＧＬＩ　Ｉ（上 記）によってプライムされた。第２のものは、ＪＫ４　ｍＲＮＡに特異的な、ク ローンしたＶ領域のＪ領域中にＢｇｌ１１部位を導入する、オリゴヌクレオチド ブライマーＪＫ４ＢＧＬ１１を用いて作成した。このＪＫ４ＢＧＬＩＩプライマ ーを第１鎖ｃＤＮＡ合成をプライムするために用い、クローニングの前にｃＤＮ Ａを大きさによって選択しなかったこと以外はＪＫ２ＢＧＬＩＩプライムしたｃ ＤＮＡライブラリーを作成するために用いた方法と同じ方法を用いて、ｃ　Ｄ　 Ｎ　Ａライブラリーを作成した。
第７Ｂ図は、それぞれのプライマーが有している他の機能的なマウスにＪ領域配 列との誤対合を表にしたものである。Ｊｘ４はＪＫ２ＢＧＬ１１プライマーと比 較すると２１個のヌクレオチド中に５個の誤対合を有し、ＪＫ４ＢＧＬ１１プラ イマーとは２３個中に３個有していることに注意が必要である。
両ライブラリーを、Ｊ８４配列に特異的なオリゴヌクレオチドプローブ（５ＪＫ ４）とハイブリダイズさせることによって、Ｊ８４配列を含んでいるＶ領域クロ ーンについてスクリーニングした。このスクリーニングの結果を第１表に示す。
ＪＫ２ＢＧＬ１１　２％（３０／１５００）　０．１５％（２／１５００）使用 したプローブは、オリゴヌクレオチド５３に４（ＪＥ４特異性、第７図）および ｐ６Ｄ４Ｂ［ＮＳ−１（ＭＯＰＮ５−１（領域配列を含むコである。Ｎ／Ｄは測 定せず。
両ライブラリーから単離したいくつかのＪ、４Ｖ領域ｃＤＮＡクローンの特徴を 調べた。これらのクローンは、同一の制限酵素地図を有しており、オリゴヌクレ オチドプライムしたｃＤＮＡクローニング操作に由来するＢｇｌ１１部位を含ん でいる。１つのクローンｐＶ１７の配列および制限地図は、ｐＶ１７がＶ領域遺 伝子配列を含有していることを示す。
これらの結果は、ＪＫ２ＢＧＬ１１プライマーがＪｘ４１ＩＲＮＡ配列を効率的 ではないが正しくプライムすることができることを示すものである。ＪＫ２ＢＧ Ｌ１１プライマーはＪｘ４ｍＲＮＡとよりも他のあらゆるＪつ領域ｍＲＮＡとの 誤対合の方が少ないので（第７Ｂ図）、他のＪｘｍＲＮＡはＪＫ２ＢＧＬＩＩプ ライマーを用いて一層効率的に正しい位置でプライムされうろことが予想される 。即ち、あらゆる機能的なマウスにＶ領域の効率的なｃＤＮＡクローニングを、 ＪＫ２ＢＧＬＩＴおよびＪＫ４ＢＧＬＩＩプライマーの混合物を用いることによ って得ることができる。
■領域のｃＤＮＡクローニング中にＪ領域中にＢｇｌ１１部位を配置することは 、クローンしたマウスのＶＡＮ域遺伝子モジニールをヒトに不変領域遺伝子モジ ュールに結合させることを可能にする（第９Ｂ図）。
上記の実験を行った後に、ｅＤＮＡクローンｐＶ　１７が完全な５゜暗号領域を 欠いていることがわかった。ヌクレオチドの配列決定によって、開始コドンＡＴ ＧのＡがｐＶ　１７中にコピーされていないことがわかった。２つの他のｃＤＮ Ａクローンが同じ欠損を有していたので、これはランダムなｃＤＮＡクローニン グの人工産物ではなかった。２つの方法を考案し、完全な５°暗号領域を有する 軽鎖遺伝子を得た。
第１には、始めに５°末端がら１５５塩基のｐＶ　１７Ｅ列に相補的なオリゴヌ クレオチド（５’−ＡＴＡＴＴＴＧＣＴＧＡＴＧＣＴＣＴ−３°）でプライムス ルことによって新規なｃＤＮＡライブラリーを作成した。このライブラリーから 、ｐＶ１７ＤＮＡフラグメントプローブとハイブリダイズするクローンを選択し た。これろ新規なｃＤＮＡクローンのいくつかは、イニシェーターのＡＴＧと、 ５°非翻訳化領域の約２ｏヌクレオチドを有していた。これらクローンの１つｐ ２−１２は、２３ヌクレオチドの５′非翻訳化領域と完全なＡＴＧ開始コドンを 供給する。ｐ２−１２をｐＶ１７由来の配列と組合わせると、完全な５°末端を 有する可変領域が得られる（ｐｌ　ＮＧ２０１３Ｅ）。
第２には、既存の軽鎖クローンの部位指向性の突然変異誘発を用いて、同時に、 ポリー〇領域を除去し、開始ＡＴＣ，に隣接させてリポソーム認識配列を配置し た。ｐＶ　１７由来のＰｓｔｌフラグメントをＭ１３ｍｐ１８中にサブクローン した。次に、オリゴヌクレオチド１７Ｅ列を突然変異させるためのプライマーと して用いて、ｐＶ１７配列中に５ａｌＩ部位と開始ＡＴＧを含有させた。得られ たプラスミドｐＶ１７−ＴＶＭは、ヒト不変領域モジニールに連結するための別 のマウス可変領域を与えた。
次いで、ｐＶ　１７由来の可変領域の完全なヌクレオチド配列を決定した。この 配列は、ｐＶ１７がいくつかの保存アミノ酸を含む■、−Ｊ、連結領域、および Ｊつ４　ＲＮＡをｔＪＩＧ−ＪＫ２ＢＧＬＴ　Ｉオリゴヌクレオチドでプライム することによって得たハイブリッドのＪＫ２／Ｊえ４領域を含んでいることを示 した。しかし、■におよびＪに領域が同じ暗号フレーム中にないため、ｐＶ　１ ７中のｖ８領域は機能的ではない。従って、ｐＶ　ｌ　７のＶ領域が翻訳される と、Ｊ領域が正しくないフレームで翻訳される異常な免疫グロブリン軽鎖が得ら れることになる。この欠損は異常なＶ−Ｊ結合によりて引き起こされ、ケリーら ［Ｋｅｌｌｅｙ、Ｄ、Ｅ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｍｏ１．Ｃｅ１ｌ、Ｂｉｏｌ、、 　５：　１６６０−１６７５　（１９８５）］が観察したような非機能的なにｍ ＲＮＡが得られることになる。
ｐＶ　１７のＶ領域は異常な免疫グロブリンをコードしているので、この軽鎖が 機能的な抗−肝炎抗体分子の一部である可能性は極めて低い。これらの結果は、 ■領域をコードしている多数のＲＮＡ種（その１つだけが所望の配列である）の 存在についてハイブリドーマ細胞をモニターすることの重要性を示すものである 。
ＣＲＬ８０１７　ｃＤＮ、Ａライブラリーのスクリーニングをさらに行い、これ までに発見した２つのＶ　ｋｃＤ　Ｎ　Ａクラス（ＭＯＰＣ２１−ｐ６Ｄ４Ｂ、 ｐＶ　１７）のどちらから由来するものでもないＶｘｃＤＮＡクローンを探した 。始めに、ＣＲＬ８０１７　ＲＮＡから作成したオリゴ−ｄＴプライムのｃＤＮ Ａライブラリーを、に不変領域に特異的なりＮＡフラグメントプローブで、およ びそれとは別にＭＯＰＣ２１およびｐＶ１７Ｖ＊領域に特異的なプローブでスク リーニングした。に不変領域を含有しているが、ＭＯＰＣ２１またはｐＶ１７の ものとは異なるＶ、領域を有するｃＤＮＡクローン（ｐｌＥ９Ｌ−８１）を見い 出した。このオリゴ−ｄＴプライムしたｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング 法は、ニック−トランスレーションされた比活性の高いプローブを用いるので、 ｃＤＮＡライブラリーのオリゴヌクレオチドスクリーニングの別の有用な方法で ある。また、この方法は適切なプローブを選択することによって、いくつかのク ラスのＶ領域クローン、例えばすべてのｖｄクローン同時に単離することを可能 にする。第２に、ＣＲＬ８０１７　ＲＮＡから作成したＵＩＧ−ＪＫ２ＢＧＬＩ 　ＩプライムのｃＤＮＡライブラリーをＵＩＧ−５ＪＫ２オリゴヌクレオチドプ ローブ（第７図を参照）でスクリーニングした。新しいクラスのＶｘｃＤＮ、Ａ クローンを見い出した：この群のクローンはｐｌＥ９Ｌ−８１と相同であり、Ｕ 　Ｉ　Ｇ−５ＪＫ２プローブとはハイブリダイズするが、ＭＯＰ　Ｃ２１’１’ ！プローブとはしない。また、これらクローンの制限エンドヌクレアーゼ部位地 図およびヌクレオチド配列は、ＣＲＬ８０１７細胞由来のＭＯＰＣ２１相同性の ＶｘｃＤＮＡクローンとは異なっている。しかし、これらのクローンは、非機能 的なｍＲＮＡが得られることになる異常なＶ−Ｊ結合を有しており、キャビンー ら［Ｃａｂｉｌｌｙ　ａｎｄ　Ｒｉｇｇｓ＋従って、抗−Ｂ型肝炎セルラインＣ ＲＬ８０１７は、上記のｃＤＮＡ”ｏ−：／　ｐ６Ｄ４Ｂ（ＭＯＰＣ２１）、ｐ ｌＥ９Ｌ、およびｐＶ　１７に対応する少なくとも３クラスのＶＫＩＩＲＮＡを 有しているものと結論した。ｐｌＥ９ＬおよびｐＶ　１７クローンは異常に転位 したに遺伝子由来のｒａ　ＲＮ　Ａから導かれ、一方、ｐ６Ｄ４Ｂクローンは親 ハイプリドーマの融合相手Ｎ５−１から導かれる。これらクローンのいずれも所 望の抗−肝炎軽鎖をコードしていないようである。
（３）ヒト不変／マウス可変領域を含有する重鎮の調製および発現ｐＭＶＨＣａ −１３中のｖ領域配列を、ｔ：　）　Ｉ　ｚＧ　１　不変（Ｃ）ｔａ域クり−ン ｐＧＭＨ−６に連結した。ｐＧＭＨ−６のＩｇＧＩ　ＣＨｌｔ；Ｊ域内に第２０ ＢｓｔＥ　１１部位が存在することにより、多工程のライゲージ１ンが必要であ った。第１に、ｐＧＭＨ−６のＪ−ＣＨ１領域からの２２０ヌクレオチドのＢｓ ｔＥ　１１フラグメントを、ｐＧＭＨ−６の１１００ヌクレオチドのＩｇＧ領域 ＢｓｔＥ　Ｉ　１−ＢａｍＨＩフラグメントにライゲートした。別のライゲージ １ンにおいて、マウスのＶ領域を含有するｐＭＶＨＣａ−１３の４２０ヌクレオ チドのＢｓｔＥｌｌ−ＢａｍＨ１フラグメントを、ウシ腸ホスファターゼ処理し たＢａＩＩＨｌプラスミドベクターに連結した。次いで、この２つのライゲーシ ョン液を合わせ、リガーゼを加え、そしてその生成物をＨＢＩＱｌに導入して、 キメラ性のマウスＶ−ヒトＣクローンＰＭＶＨＣＩニー２４を得た（第９Ａ図） 。
ｐＭＶ　ＨＣｃ−２４中のハイブリッド重鎮遺伝子の■領域を、部分配列分析に よってさらに調べた。この分析によって、クローンしたＶ領域が既知のＤ配列Ｄ ＳＰ２．２（クロサワおよびトネガワ、上記）に合致するＤ配列を含有している ことがわかった。また、この配列は、既知のマウスＶ重鎖す−ダーペプチド配列 に類似する１９アミノ酸のリーダーペプチド、および少なくとも３ヌクレオチド の５°非翻訳化領域を予想させた。
ｐＭＶＨＣｃ−２４のマウス−ヒトハイブリッド重鎮遺伝子を含有するＢａ５Ｈ ＩフラグメントをＢａｍＨＩ消化のｐｌＮＧ２００３Ｅベクター中にクローンし 、発現プラスミドＰＩＮＧ２００６Ｅを得た（第ハンサー領域の存在により、８ ９７８球におけるマウス−ヒトキメラ免疫グロブリン遺伝子の効率的な発現の蓋 然性が増加しているはずである。
ｐＭＶＨＣｃ−２４中に存在するキメラ重鎖遺伝子の修飾を行って、イニシェー ク−ＡＴＧの前のオリゴ−ｄＣ領域を欠（別の重鎮遺伝子を得た。このｐｌＮＧ ２０１２ＥとＰＩＮＧ２００６Ｅベクターは、第１２図に示すように、ＡＴＧの 直前のヌクレオチドを除いて同一である。
ｐｌＮＧ２００６ＥおよびｐＳ　Ｖ　２−ｎｅｏプラスミドを保持しテイルした 。次いで、ポリエチレングリコールで処理することによって、これらのプロトプ ラストを別々にＳＰ２１０−Ａｇ１４ハイブリドーマ細胞（ＡＴＣＣＣＲＬ　１ ５８１）に融合させた［オチら（Ｏｃｈｉ、　Ａ。
ｅｔ　ａｌ、、　Ｎａｔｕｒｅ、　３０２：　３４０．１９８３）］。この融合 細胞を完全培地中で７２時間回復させ、次いで９６ウエルの組織培養プレート中 、ウエルあたり１０．０００または５ｏ、０００細胞で蒔いた。この細胞を２週 間、０．８πｇ／　ｘ（ｌのＧ４１８で選択すると、いくつかのウェルでの増殖 が明白になった。これらの選択条件下では、５ｐ２１０細胞はＧ４１８によって ４〜７日以内に完全に死滅させられる。ベクター中に存在するｎｅｏ遺伝子が組 込まれ、それを発現した細胞だけが０４１８選択のもとで増殖する。これら組込 みトランスフェクシントによる増殖に対してポジティブなウェルの数を第２表に 示す。
株／フラスミド　１０．０００細胞／ウエル　５０．０００細胞／ウ工ルＭＣ１ ０６１／ｐｌＮＧ２００６Ｅ　３　（１３％）　１２（５０％）ＭＣ１０６１／ 　１）ＳＶ２−ｎｅｏ　７　（２９％）　４（１７％）ＭＣ１０６１／なし　Ｏ ○ ＊２４ウェルのうちポジティブな増殖を示したウェルの割合（％）ｐＩＮＧ２０ ０６Ｅおよびｐ３　Ｖ　２−ｎｅｏでトランスフェクションした細胞を、ＲＮＡ およびタンパク質レベルで免疫グロブリン遺伝子発現について試験した。全細胞 ＲＮＡをトランスフェクションした細胞から調製し、ニトロセルロースに結合さ せ、そしてマウス−ヒトバイブ１月、ド重鎖遺伝子に特異的なニック−トランス レーションしたプローブとハイブリダイズさせた。強いシグナルを有する２つの クローンが見い出され、、ＲＮＡレベルで遺伝子の発現を示した。
マウス−ヒトプローブとハイブリダイズする全細胞性ＲＮＡの量は、もとのハイ ブリドーマ細胞中の重ｆｌｌＲＮＡのレベルの約１／］Ｏのようであった。これ はおそらくトランスフェクションされた細胞の全ｍＲＮＡの約１％を示すであろ う。
また、トランスフェクションされたマウス細胞を、ＥＬＩＳＡ検定により、細胞 質ヒト重鎮タンパク質の産生について試験した。７つのｐｌＮＧ２０Ｑ５Ｅ　） ランスフエクションされたセルラインのうちの３つが、検出可能なレベルのヒト 重鎮タンノでり質を産生ずることがわかった。最大のマウス−ヒト重鎮タンパク 質を産生ずるマウス細胞形質転換体は、ＥＬＩＳＡ検定において、無傷のヒト免 疫グロブリンＩｇＧ１を産生するヒトＢセルラインの１／１００希釈のシグナル に匹敵するシグナルを与えた。この検出されたマウス−ヒト重鎮タンパク質のそ れほど多くないレベルは、ハイブリドーマ細胞中における軽鎖の非存在下での重 鎮の不安定性、またはキメラ遺伝子転写体の正しくないプロセッシングを含む、 いくつかの因子によるものであろう。
（４）組込まれたキメラ遺伝子の遺伝子増幅サザーンプロット分析は、ｐｌＮＧ ２００６Ｅ　ＤＮ、Ａ配列の多数のコピーがマウスゲノム中に直列して組込まれ ていることを示した。
制限酵素ＡｐａｌおよびＢｇｌｌ＋の両者はｐｌＮＧ２００６Ｅを１つに切断す る。形質転換体２ＡＥ９において、予想される大きさく８，２ｋｂ）のＡｐａｌ またはＢｇｌｌ＋消化からのバンドが、ヒトＣγ１配列とハイブリダイズするこ とがわかった（データは示していない）。正しい大きさく　１　、６　ｈｂ）の ＢａｍＨＴバンドは、ヒトならびに１Ｅ９ＶＨ配列とハイブリダイズすることが わかった。遺伝子コピー滴定実験（第１４図）は、２ＡＥ９ゲノム中に約５フビ ーのｐＩＮＧ２００６Ｅが存在することを示した。ＡｐａｌまたはＢｇｌｌｌレ ーンにおいて唯１つのバンドだけが検出されるという事実は、これら個々のコピ ーが直列して並んでいることを示すものである。１群の２重消化は、１１）ＩＮ Ｇ２００６Ｅ配列がマウスＤＮＡへのその導入において転位を受けないことを示 した（データは示していない）。
次いで、別の選択マーカー巳遺伝子を含有するプラスミドで２ＡＥ９細胞をトラ ンスフェクションし、ＤＭＥＭ−ＨＡＴ中で増殖するクローンを選択した。クロ ーンの１つ２ＢＨ１０は、１０’ＩＢ胞あたり約３８ｎ９の可溶性ヒト重鎮タン パク質を有している。サザーン分析によって、２ＢＨ１０が約３０コピーのｐｌ ＮＧ２００６Ｅを有していることが示された（第１４図）。これらは、ＤＮＡ配 列が転位することなく２ＡＥ９において５フビーから増幅された（２ＡＥ９の枠 を２ＢＨ１０のものと比較）。Ｓｌのデータ（示していない）は、この鋳型の増 加がさらに多量のＩｇＧ遺伝子転写体に導くことを示した。これらの配列は第２ の選択の結果として隣接の細胞性配列とともに同時増幅されたものと考えられる 。
実施例３：　癌抗原特異性を有するヒト−マウスキメラ抗体（１）抗体Ｌ６ Ｌ６％／９ｏナール抗体（ＭＡｂ）は、ヒト肺癌由来細胞でマウスを免疫した後 、その肺細胞をＮ５−１マウス骨髄腫細胞で交雑することにより得られた。その 抗体は、肺癌（腺、扁平）、乳癌、結腸癌、卵巣癌を含めて、殆んどのヒト癌由 来の細胞表面で大量に発現するが、成人宿主由来の正常細胞には微量にしか存在 しない未同定の炭水化物抗原に結合する。ＭＡｂＬ６はＩｇＧ２ａであり、抗体 依存性細胞障害ＡＤＣＣをエフェクター細胞の材料としてのヒト末梢血白血球の 存在下で惹起させることができ、また、補体の材料としてのヒト血清の存在下で Ｌ６陽性腫瘍細胞を溶解することができる。溶解は４時間のインキユベーシヨン の間における標識細胞からの６１Ｃｒの放出として検出される。ＭＡｂＬ６はヌ ードマウスに異種移植したＬ６陽性腫瘍に局在することができ、そして、そのよ うな腫瘍の成長を阻害することができる。
８６（ＭＡｂの特異性について）及びＰｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｅａｄ、　Ｓ ｅｉ、旦±７０５９−７０６３．１９８６（ＭＡｂの機能について）において記 述されている。
（２）　Ｌ６の免疫グロブリンｍＲＮＡにおけるＪ配列の同定凍結細胞を１１０ 分間氷上で、次いで室温で溶解した。懸濁液を１５ｚｆｆＰＢＳで希釈し、細胞 を遠心分離して沈下させた。ＰＢＳｏンシエア（ｐｏｌｙｔｒｏｎ　５ｈｅａｒ ）で粉砕した。　ｍＲＮＡの調製及びポリ（八〇）フラクシヨンの選択はＡｕｆ ｆｒａｙ、　Ｃ，ａｎｄ　Ｒｏｕｇｅｉｎ、　ｒ、ＩＬ６由来のポリ（Ａ”　） ＲＮＡをＮｏｂｒｅｇａ　ｅｔ　ａｌ、　Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、１３１： 　１４１，１９８３に記載の条件下で、ラベルしたＪＨｌ、ＪＨ２、ＪＨ３及び ＪＨ４オリゴヌクレオチドで個別にハイブリダイズした。生成物を次いで、１． ７％アガロース−ＴＨＥゲルで電気泳動を行った。ゲルは１０％ＴＣＡで固定し 、プロットし、放射線写真のための露光を行った。その結果、Ｌ６　ＶＨがＪＨ ２配列を含有することが示された。
ｌｏｔ　ｍｅｔｈｏｄ）を用いた。ポリ（Ａ”　）ＲＮＡをニトロセルロースフ ィルター上で固定し、４ＸＳＳＣ中、４０℃でラベルしたプローブオリゴヌクレ オチドにハイブリダイズさせた。これらの実験により、Ｌ６はＪＫ５配列を含有 することが示される。ＪＫ２に対する僅かなハイブリダイゼーシヨンがみられた 。
（３）ＶｊＪｊ域のｃＤＮＡクローン Ｌ６ボリ（Ａ”）ＲＮＡ上でオリゴ（ｄＴ）によりプライムされたライブラリー を、マウスＣＫＩ域のプローブを有するカッパクローンを得る目的でスクリーニ ングした。Ｌ６ライブラリーから、いくつかのクローンを分離した。５°ＪＫ５ 特異的プローブを用いての二度目のスクリーニングでＬ６（ＪＫ５）軽鎖クロー ンを同定した。Ｌ６の重鎮クローンは、ＪＨ２Ｈ２オリゴヌクレオチドいてスク リーニングし分離した。
ｃＤＮＡクローンからの重鎮及び軽鎖の遺伝子又は遺伝子断片、ｐＨ３−６ａ及 びｐＬ３　１２ａをヌクレオチド配列の解析のためにＭ１３バクテリオファージ ベクターに挿入した。これらのクローンの可変領域の完全ヌクレオチド配列をジ デオキシチェインターミネーシ薔ン法により（第１５図、第１６図）決定した。
これらの配列により測定した組成とよく一致したＶ領域のアミノ酸組成が予測さ れ、また、■領域部分のアミノ酸の直接シーケンスにより確証されたペプチド配 列が予測される。
ｅＤＮＡクローンのヌクレオチド配列から、それらがＶドメインを鑑別するアミ ノ酸残基を含むので、免疫グロブリンＶ領域クローンであることが示される（Ｋ ａｂａｔ□、一旦」９見目匹遣ｌ」シーＰｒｏｔｅｉｎｓ　ｏｆ　Ｉ　ｍ＋ｅｕ ｎｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｉ　ｎｔｅｒｅｓｔ；　Ｕ、　Ｓ、　Ｄｅｐｔ　ｏｆ　Ｈ ＨＳ、１９８３）。
Ｌ６　ＶＨはサブグループ旧こ属する。そのｃＤＮＡにより、２４のアミノ酸残 基のＮ末端配列が既知のＶＨ配列と一致していることが予測される（４５−１６ ５ＣＲＩ　；λ４ａｒｇｏｌｉｅｓ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｍｏ１．　１ｍｍｕｎｏ １．　１８：　１０６，５．　１９８１）。Ｌ　６　Ｖ　ＨハＪ　Ｈ２配列ヲ有 する。Ｌ６　ＶＬはＶ　Ｋ　−Ｋ　ｐｎ　］ファミリー（Ｎｉｓｈｉ　ｅｔ　ａ ｌ、、Ｐｒｏｃ。
Ｎａｔ、Ａｄｄ、Ｓ＊ｉ、”ＪＳＡ、８２：　６３９９，１９８５）に由来１４ 、ＪＫ５を用いる。クローンされたＬ６　ＶＬにより、１８−４０゜８０−９６ 残基に対応するＬ６軽鎖由来ペプチドのアミノ酸シーケンスにより確認されたア ミノ酸配列が予測される。
（４）　ヒトＣ−モジュール（Ｃ−Ｍｏｄｕｌｅ）に結合するＪ領域中の制限酵 素部位を操作し及びＶモジニール（Ｖ　Ｍｏｄｕｌｅｓ）へのオリゴ（ｄｃ）配 列５”を除去する、ｉｎ　ｖｉｔｒｏでの突然変異誘発性オリゴ（ｄＴ）Ｌ６　 ＶＫ及びＬＩ３ＶＨでのブライミングにより生じた両クローンは修飾の必要があ る。Ｌ６　ＶＫ″には、Ｊ領域突然変異誘発プライマーＪＫＨ４ｎｄＩ［Ｉを第 １７Ｂ図に示す如く、用いた。
ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａクローン由来のヒ）ＣＫモジニールは、ＨｉｎｄＩ［［配列を含 むように突然変異誘発を行った（第１７Ａ図参照）。突然変異誘発反応は、これ らの遺伝子のＭ１３サブクローンについて実施した。突然５２にクローンの生じ る頻度は得られたプラークの０．５から１％に分布した。
ＶＨキメラ遺伝子中のＡｔＪＳフドン上流のオリゴ（ｄａ）配列は、１つの特定 の遺伝子構築中における適切なスプライシングにより干渉されることが、以前か ら観察されている。ＲＮ　Ａ転写物の約７０％がミス−スプライシングを受け、 そして、リーダー配列中の隠れた３゛スプライスアクセプターが働いたものと判 断された。それ故に、イニシェータ−ＡＵＳの上流のオリゴ（ｄｃ）配列をクロ ーンの全てにおいて除去した。
１つの方法として、Ｌ６　ＶＫクローンを突然変異させる５ａｌＴ制限酵素部位 を含むオリゴヌクレオチドを用いた。このオリゴヌクレオチドによる突然変異誘 発に用いたプライマーは、オリゴ（ｄＣ）とイニシェーターのｎｅｔコドンの間 へ５ａ１１部位を挿入する２２−ｍａｒである（第１９図）。
別の方法として、ヌクレアーゼＢＡＬ−３１をＬ５　ＶＨクローン　ｐＨ３−６ ａ中のオリゴ（ｄｃ）を切断するのに用いた。得られた突然変異体のうち２つに ついて、削除したサイズをヌクレオチドシーケンシングにより決定した。第１７ 図に示す。これらの突然変異体（デルタ４及びデルタ２１）の双方とも、コーデ ィング領域へのオリゴ（ｄａ）　５　’の全てを削除した。
これらのクローンを次いで、ＭＪＨ−２Ａｐａｌプライマーを用いたオリゴヌク レオチドによる突然変異誘発により修飾した（第１７図）。この３１塩基プライ マーを、ヒトＣｇａμｎａｌ　ｃＤＮＡ遺伝子ＶＨ遺伝子モジュールをヒトＣＨ モジニールに結合させることにより得られたキメラ重鎖遺伝子は、ＶＨの全領域 にヒトのアミノ酸を含まないキメラ蛋白をコードしている。
ヒトＣｇａｍｍａ　１遺伝子モジユールは、０Ｍ２１４６細胞由来のＣＤＮＡで ある（Ｈｕｍａｎ　ＧｅｎｅｔｉｃＭｕｔａｎｔ　Ｃｅ１ｌ　Ｒｅｐｏｓｉｔｏ ｒｙ＋　Ｎｅｖ　Ｊ　ｅｒｓｅｙ）。　このＣｇａｍｍａ　ｌ遺伝子モジュール は、キメラ発現プラスミドｐｌＮＧ２０１２Ｅを構築するために、マウスＶＨ遺 伝子モジニールであらかじめ結合されていた。
（５）　Ｌ６キメラ発現プラスミド Ｌ６キメラ重鎖発現プラスミドは、発現プラスミドＰＩＮＧ２１１１及びｐＩＮ Ｇ２１１２を取得するたメニ、ＶＨ％’；ａ−ルｐｌＮＧ２０１２Ｅを突然変異 体デルタ２１及びデルタ４のＶＨモジュールで置換したものに由来した（第１７ 図）。これらのプラスミドは哺乳動物細胞にトランスフェクトされる場合に、キ メラし６重鎖の合成を命令する。
一ルに結合してｐｌＮＧ２１１９を構築した。ＰＳＶ２−ｇｐｔ由来のＥ、　ｃ ｏｌｉ　ｇｐｔ遺伝子を用いた新しい配列の置換により、Ｌ６キメラ軽鎖を発現 し、哺乳動物細胞にトランスフェクトされた場合にミコフェノール酸耐性を与え るｐｉ　ＮＧ２１２０を得た。
同一プラスミド中に重鎮及び軽鎖キメラ遺伝子の両方を含ませることにより、重 鎮と軽鎖遺伝子が１：ｌの比率でトランスフェクトされた細胞に導入してバラン スのとれた遺伝子量（ｇｅｎｅ　ｄｏｓａｇｅ）にすることができる。このこと により、発現が改善され、最適なキメラ抗体発現のためのトランスフェクトされ た細胞の操作を減することができよう。この目的で、ｐｌＮＧ２１１１及びｐｌ ＮＧ２１１９のキメラ重鎖、軽鎖遺伝子由来のＤＮＡ断片を発現プラスミドｐｌ ＮＧ２１］４に結合させた（第１９図）。この発現プラスミドは選択可能なｎｅ ｏＲマーカー及び各々がマウス重鎮のエンハンサ−を含んだ各キメラ遺伝子に対 する分離した転写ユニットを含有している。
修飾及びＬ６牛メラ遺伝子のＶ−Ｃ結合領域は第２０図に要約している。
（６）キメラ抗体産生用のマウス・リンパ様細胞の安定なトランスフェクション Ｌ６キメラ発現プラスミドＤ　Ｎ　Ａのマウス５ｐ２１０細胞への導入は、エレ クトロポレーションを用いた（Ｐｏｔｔｅｒ　ｅｔ　ａｌ、上記；Ｔｏｎｅｇｕ ｚｚｏ　ｅｔ　ａｌ、　Ｍｏ１．　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、ｓニアｏｓ、１９８６ ）。
エレクトロポレーション法により５ｐ２１０細胞に対して、１−１０ＸＩＯ−’ のトランスフェクション頻度が得られた。２つの遺伝子発現プラスミドｐｌＮＧ ２１１４は、ＡａｔＩＩ制限エンドヌクレアーゼで消化することにより直線化し 、５Ｐ２１０細胞にトランスフェクトして、ヒトｆ！鎖、軽鎖合成用にスクリー ニングされる約５０の６４１８耐性クローンを得た。２つのプロデニーサ−Ｄ７ 及び３Ｅ３から産生されたキメラ抗体鎖の合成量は表３に示す。キメラム６抗体 はＤ７）ランスフェクト細胞を２４時間、ＨＥＰＥＳ緩衝液、ペニシリン、スト レプトマイシンを付加したＳｆｆ　ＤＭＥＭ中２Ｘ１０＠細胞＝πｇで培養して 調製した。上清を１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液中、ｐＨ８，０，アミコンＹ Ｍ３０膜で濃縮した。調製物をＤＥＡＥ−セルロースカラムにかけて、免疫グロ ブリンを非結合と結合の分画に分離した。ＤＥＡＥ−非結合、ＤＥＡＥ−結合の サンプル及びｐｒｅ　−Ｄ　Ｅ　Ａ　Ｅ調製物（媒質１．６μｇから）を、プロ ティン−Ａセファロスカラムでアフィニティクロマトグラフィーにかけ、０゜１ Ｍクエン酸ナトリウムｐＨ３，５で溶出して、個別に精製した。溶出した抗体を 中和し、リン酸緩衝液生理食塩水中でアミコンセントリコン濾過（Ａｍｉｃｏｎ 　ｃｅｔｒｉｃｏｎ　ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）により濃縮した。３つの調製物の 収量は１２μ９（ＤＥＡＥ非結合）、６μ９（ＤＥＡＥ結合）、そして９μ９（ ｐｒｅ　−Ｄ　Ｅ　Ａ　Ｅカラム）であった。抗体鎖のウェスタン分析により、 天然の免疫グロブリンのようにＨ，Ｌ、テトラマー中で結合していることが示さ れた。
（７）組織培地中に分泌されたキメラム６抗体の２度目の精製ａ、５ｐ２１０． ｐｌＮＧ２１１４．１０７細胞を、１０％ウシ胎仔血清（Ｂｙｃｌｏｎｅ　：： Ａ−１１１１−Ｄ）、１０＋ｎＭ　ＨＥＰＥＳ。
ｌ　Ｘ　Ｇ　１ｕｔａｉｉｎｅ　−Ｐ　ｅｎ　−Ｓ　ｔｒｅｐ（Ｉ　ｒｖｉｎｅ 　Ｓ　ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　＃９３１６）を補充した培地中（ＤＭＥＭ　（Ｇｉ ｂｃｏ　６３２０−１９６５））でｌＸｌ０’細胞／ｌｉ２になるまで成長させ た。
５０次いで、細胞を４００ｘｇで遠心分離し、２Ｘ１０’細胞／村で１８−２４ 時間、無血清培地中で再懸濁した。
Ｃ０培地をＪＳ−４，２ｏ−ター（３０００ｘｇ）中で、１５分間、４０００Ｒ ＰＭで遠心分離した。
ｄ、　上清１．６ｇを次いで０．４５！クロンフイルターで濾過し、Ｙ　Ｍ　３ ０　（Ａ　ｍ１ｃｏｎ　Ｃｏｒｐ、　）フィルターで２５ｍ（！に濃縮した。
ｅ、　濃縮した上滑のコンダクタンスを５．７−５．６ｍｓ／ｃ＋ｅに調節し、 ｐＨを８．０に調節した。
ｆ、　上清を２０００ｘｇ、５分間、遠心分離し、次いで、１０ｍＭリン酸ナト リウムｐＨ８，０で予め平衡化した４００１ｒｌ　ＤＥＡＥカラムにかけた。
ｇ、　ワラクシ５ンへの流出物を収集し、１０ｍＭリン酸ナトリウＡｐＨ８，０ で予め平衡化した１１１ＱプロティンＡ−セファロース（Ｓｉｇ＋ｅａ）にかけ た。
ｈ、　カラムをまず１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ８，０６ｍｇで洗浄、 次に０．１Ｍクエン酸ナトリウムｐＨ３，５８１１２で洗浄、次で０．１Ｍクエ ン酸（ｐＨ２，２）６蛙を用いて洗浄した。０．５１１２のフラクシ胃ンを２Ｍ ）リス塩基（Ｓ　ｉｇｍａ）　５０Ｍｇを含有するチューブ中に収集した。
ｉ、ＩｇＧの大部分はｐＨ３，５溶出液中にあり、プール後、セン１、す：＋ン ３Ｑ（Ａｍｉｃｏｎ　Ｃｏｒｐ、）により約０．０６Ｋ（に濃縮した。
ｊ、ＰＢＳを用いての希釈と再濃縮を繰返すことによりセントリコン３０中で、 緩衝液をＰＢＳ（１０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７゜４、Ｑ、ｌ　５Ｍ　ＮａＣ Ｑ）に変更した。
ｋ、ＩｇＧ溶液を次いで０．１０ｚＱに調整し、ウシ血清アルブミン（Ｆｒａｃ ｔｉｏｎ　Ｖ、　ＬＪ、Ｓ、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を安定剤として１． ０％添加した。
（８）腹水中に分泌されたキメラ上６抗体の産生と精製ａ、　腹水をまず２００ ０ｘｇ、１０分間遠心分離した。
ｂ、　上清のフンダクタンスを５．７　５．６ｍｓ／ａｍに調整し、そのｐＨを ８．０に調整した。
Ｃ０上清を次いで１０ｍＭ　ＮａｔＰ０４ＨｐＨ８，０で予め平衡化した４０１ ｆｆのＤＥＡＥ−セルロースカラムにかけた。
ｄ、ＤＥＡＥカラムからの流出物を収集し、ｐＨを７．４に調整し、次いで１　 、　ＯＸＱのヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）−セファロースカラムにかけた。
８、　カラムをまず６ＨＱのｌＱｍＭリン酸ナトリウム、０．５Ｍ塩化ナトリウ ムで洗浄し、更に８吋の０．５λ４　ＮＨ４ＯＨ１３Ｍチオシアン化ナトリウム で洗浄した。
ｆ、　チオシアン化ナトリウム溶出液をプールし、２ＬＰＢＳに対して一夜透析 した。
抗体は前述の手順のｊ及びに工程により、更に濃縮することができる。
表３ Ｓｐ２１０）ランスフェクタント１からのＬ６キメラ鎖の分泌量５ｐ２１０．Ｄ ７　５ｐ２１０．３Ｅ３１、２０ｘＱ、　２ｄ、　＋　１７　７７　１００　７ ００シー）’＠２Ｘ１０’／πＱ ２、２００ｚ１２．２ｄ　÷　０．９　６　８０　２１５シード＠２．５ｘｌＯ ’／好 ３、２００１１１１２．１ｄ　１．９　３．８９７　２２１シード＠２Ｘ１０” ／πａ ４、　Ｂａ１ｂ／ｃ腹水　−５，１６０１９，１７０ＮＤ　ＮＤａ、−ｐｌ　Ｎ Ｇ２１１４（ｐＬ６ＨＬ）でエレクトロポレーションによりトランスフェクトさ れた５ｐ２１０細胞す、−ヒトカッパーヒトＢ　ｅｎｃｅ　−Ｊ　ｏｎｅｓ蛋白 標準に対して特異性のあるＥＬＩＳＡによって測定されたμ９７ａＣ０−ヒトガ ンマーーヒトＩｇＧ標準に対して特異性のあるＥＬＩＳＡにより測定されたμｇ ／ＱＮＤ−測定されずＦＢＳ：ウシ胎仔血清 （９）キメラ上６抗体について実施した試験Ｌ６抗原陽性及びＬ６抗原陰性のセ ルライン双方の細胞をスタンダードマウスモノクローナル抗体Ｌ６、細胞培養の 上清由来のキメラ上６抗体及び腹水由来のキメラ上６抗体（前述の通り）ととも にインキュベートし、次いで第二試薬としてフルオレスセインーイソチオシアネ ート（ＦＩＴＣ）と結合した、ヒト（又はスタンダードとしてマウス）免疫グロ ブリンに対するヤギ抗体を用いて、まずサンプルをバインディングアッセイによ り検査した。
パインディングアッセイにより、キメラＬ６はＬ６抗原陽性セルラインに対して 強い反応を示し、陰性セルラインには全く反応を示さなかったので、次の段階は 、マウスＬ６の抗原陽性細胞に対する結合をキメラＬ６が阻害する能力を検査し た。このような阻害アツセイは２つの抗体の抗原認識を同定するのに日常的に用 いられている。これらのデータは以下（″パインディングの阻害″）で述べる。
これらの試験の一部として、抗体結合性の大ざっばな評価を行った。
最後に、抗体機能の２つの面、ヒト末梢血白血球存在下におけるＡＤＣＣ介在能 と補体の材料としてのヒト血清存在下におけるＬ６陽性腫瘍細胞破壊能を検討し た（以下の“機能的アツセイ”を参照）。
発現することが既に知られている、ヒト結腸癌ライン、３３４７由来細胞を標的 として用いた。ＴセルラインＨ５Ｂ２由来細胞は、以前の試験によるとＬ６抗原 の検出可能な量を発現しないので、ネガティブコントロールとして用いた。標的 細胞はまずキメラＬ６又はマウス腹水から精製したマウス上６スタンダードのい ずれかで３０分間、４℃でインキュベートした。更に、Ｔ　Ａ　Ｇ　Ｏ（Ｂ　ｕ ｒｌ　ｉｎｇａｍｅ。
（ＣＡ）かみ取得した、キメラ抗体に対してヤギ抗ヒト免疫グロブリンであるラ ベルされたＦＩＴＣを第二試薬としてインキュベーションし、希釈は１：５０で 行った。マウススタンダードとしては、ＴＡＧＯから取得したヤギ抗マウス免疫 グロブリンを１＝５０の割合で希釈した。細胞表面に結合する抗体はコールタ− モデル（Ｃｏｕｌｔｅｒ　Ｍｏｄｅｌ）ＥＰＩＣ−Ｃ細胞ソーターを用いて検出 した。
表４及び表４Ａに示すように、キメラ及びマウススタンダードＬ６は、Ｌ６陽性 ３３４７ラインに対し、はぼ同程度に有意に結合した。Ｌ６陰性Ｈ５Ｂ２ライン に対しては、上記の経緯にあるように結合しなかった。
表４に示した３つの異なるキメラＬ６サンプルがパインティングアッセイで同様 の挙動を示した事実から、以下に示す阻害試験を行うためにそれらをプールした 。同一の阻害試験を表４Ａに示す腹水由来のキメラＬ６について実施した。
パインディングの阻害　次の段階として、キメラム６抗体又はスタンダードマウ スＬ６のどの程度の量が３３４７結腸癌細胞陽性抗原の表面に対するＦＩＴＣで ラベルされたマウスＬ６のパインディングを阻害することができるかについて試 験を実施した。
キメラ及びマウススタンダードＬ６は共に、直接ラベルしたＬ６抗体のパインデ ィングを阻害し、パインディング曲線は平行となった。パインディングの５０％ 阻害のために、スタンダードマウスＬ６ＭＡｂが２．０ｕｔｔ／ｘ（ｌ必要であ るのに対し、プールしたキメラし６　ＭＡｂでは３．４μｙ／ｘＱが必要であっ たこと、及びパインディングの５０％阻害のために、スタンダードマウスＬ６　 ＭＡｂで２゜７μｙ／ｚＱ必要であるのに対し、キメラＬ６（腹水由来）は５． ５μ２／１１Ｑ必要であったという結果が示すように、キメラ抗体はスタンダー ドよりもやや効力が弱かった。
これらの試験の一部として、抗体結合性の大ざっばな評価を行った。スタンダー ドマウスＬ６の結合性は約４Ｘ１０”と以前から測定されていた。データにより キメラとマウスＬ６間に結合性の有意な差はないことが示された。
機能的アッセイ　キメラＬ６及びスタンダードマウスＬ６について、エフェクタ ー細胞の材料としてのヒト末梢血白血球（抗体依存性細胞障害、ＡＤＣＣ介在す る）、又は補体の材料としてのヒト血清（補体依存性細胞溶解ＣＤＣを介在する ）の存在下で、Ｌ６抗原陽性細胞に対する溶解能の比較を行った。
表５及び表５Ａ〜５Ｄに示すように、キメラＬ６は同時に試験したマウス上６サ ンプルよりも、４時間の％′Ｃｒ放出試験により測定したＡＤＣＣの惹起につい て優れていた。
表６及び６Ａ〜６Ｂは補体が介在した標的細胞溶解についての試験データを示す 。この場合には、マウス及びキメラム６抗体共に、高い細胞溶解活性がみられた 。
結論 上記した結果は、本発明のキメラム６モノクローナル抗体について多くの重要な 予期せぬ性質を示している。まず、キメラム６抗体はＬ６抗原陽性腫瘍細胞に対 して、マウス上６スタンダードとほぼ同程度に結合しほぼ同程度の結合性を有し ている。
このことは、以下の理由により重要である：Ｌ６抗体は、（ａ）表面炭水化物抗 原及び（ｂ）約２０．　ＯＯＯダルトンのタンパク質抗原を特定しており、それ らは非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、その他のある種のヒト癌の特性である。重要 なこととして、Ｌ６抗体は、線維芽細胞、内皮細胞、又は主要器官の上皮細胞の ような正常細胞に対しては検出可能な結合はしない。このように、キメラム６モ ノクローナル抗体は、癌細胞に対しては特異的であって、正常細胞に対しては特 異的でない抗原を特定する。
本発明のキメラム６モノクローナル抗体が悪性細胞に対して特異的に結合し、腫 瘍を位置決めする能力を有することに加えて、キメラＬ６は標的への結合に基づ き、腫瘍の免疫療法に対して主要な候補となるような重要な生物学的効果を発揮 する。ここで示した結果により、キメラＬ６は腫瘍細胞に結合することができ、 この結合に基づき腫瘍細物をＡ　Ｄ　ＣＣ又はＣＤＣのいずれかにより破壊する ことが証明される。そのような腫瘍破壊活性は、キメラ上６抗体の０゜０１μｙ ／　ｘＱ（１０ｎｇ／　ｘＱ）という低濃度で示された。
モノクローナル抗体を用いての膿瘍治療を試みる見込みは財力的であり、部分的 な腫瘍の縮小についていくつかの報告がなされているものの、今日までモノクロ ーナル抗体療法の成功は限られたちのマウスモノクローナル抗体の治療効果（こ れまでに試験されてきたもの）は、大概の実用目的としては低すぎるようである 。癌抗原に対する特異性を備えたキメラＬ６の重要な生物学的活性の発見により 、キメラ上６抗体はｉｎ　ｖｉｖｏでの腫瘍の治療において選択される治療剤と なる。さらに、キメラム６モノクローナル抗体がｉｎ　ｖｉｖキメラＬ６モノク ローナル抗体は、非修飾キメラ抗体での治療のみならず、適当にラベルしたキメ ラ上６抗体を用いた腫瘍のｉｎ　ｖｉｖ。
でのイメージングのような診断目的と同様、薬剤、毒素、免疫調節剤、アイソト ープなどの種々の免疫複合体の開発にとって有益に用いられるであろう。そのよ うな免疫複合体法は当業者に知られており、本発明のキメラム６抗体分子を修飾 するのに用いることができる。
キメラ上６抗体を分泌するセルラインの２例が本出願の出願日前に　Ｒｏｃｋｖ ｉｌｌｅ　ＭａｒｙｌａｎｄにあるＡＤＣＣに寄託された。これらはトランスフ エクトされたハイブリドーマＣ２５５（上記の３Ｅ３細胞に対応）、ＡＴＣＣＨ Ｂ９２４０とトランスフェクトされたハイブリドーマＣ２５６（上記の０７細胞 ）、ＡＴＣＣＨＢ９２４１である。
寄託した実例は、発明の１つの面の単一の例示として意図されたものであり、機 能的に均等な全てのセルラインは発明の範囲内にあるので、本発明は寄託したセ ルラインにより範囲が限定されるものではない。実際、前述の記載及び添付の図 面から開示された技術的事項に加えて、発明の種々の改変は添付のクレームの範 囲内にあるものと意図される。
表４ Ｌ６抗原陽性セルライン及びＬ６抗原陰性セルラインにおける牛）１３３４７細 胞（Ｌ６＋） スタンダードＬｆ３　５６．６　４．２キメラＬ５　ａ　ＩＪ　１１０．３ ｂ　ＩＪ　ｌｌ０Ｊ ｃ　１，３　１１０．３ ＨＳＢ−２細胞（Ｌ６−） スタンダードＬ６　１．１　１．１ キメラＬ６．　ａ　１．０　１．０ ＊　全てのアッセイは濃度１０μ９／ｊ！ρの抗体を用いて行った。結合率はＣ ＡＭ（Ｆ　ＩＴＣコンジ二ゲート　ヤギ抗マウス）もしくはＧＡＨ（ＦＩＴＣコ ンジニゲート　ヤギ抗ヒト）のみで処理した対照サンプルに比して、テストサン プルが何倍の明るさであるかで示す。結合率１は、テストサンプルが対照とちょ うど同じ明るさであることを意味し、結合率２はテストサンプルが対照の２倍の 明るさであることを意味する。
表４Ａ Ｌ６抗原陽性セルライン及びＬ６抗原陰性セルラインにおけるキメラム６抗体及 びマウスモノクローナル抗体のパインディングアッセイ スタンダードＬ６３０３８　４ キメラ１．５　３０　２　１０８ （腹水）　１０　２　１０８ キメラＬ５　３０　１　１０５ （細胞培養）　１０　１　８６ スタンダードＬ６　１０　１　１ キメラＬ６（腹水）　１０　１　１ キメラＬ６　１０　１　１ （細胞培養） ＊結合率は、ＧＡＭ（Ｆ　ＩＴＣコンジ二ゲート抗ヒト）のみで処理した対照サ ンプルに比して、テストサンプルが何倍の明るさであるかで示す。結合率１はテ ストサンプルが対照とちょうど同じ明るさであることを意味し、結合率２はテス トサンプルが対照の２倍の明るさであることを意味する。
表５ 結腸癌セルライン３３４７におけるキメラＬ６（マウス）Ｌ６抗体のＡＤＣＣ キメラＬ６　１０　１００　６４ スタンダードＬ６１０　１００　２４ ＊　標的細胞を”Ｃｒでラベルし、ＭＡｂ及びヒト末梢血白血球（ＰＢＬ）の配 合物に４時間さらし、次いで”Ｃｒの放出を測定した。
”Ｃｒの放出（未処理の細胞からの自然放出値の補正をしだ後）は、細胞溶解の パーセントの尺度である。
表５Ａ 結腸癌セルライン３３４７におけるキメラＬ６及びスタンダード（マウス）Ｌ６ 抗体のＡＤＣＣ キメラＬ６　２０　１００　８０ （Ｉｆ！水）　１０　１００　７４ ２．５　１００　７１ キメラＬ５　１０　１００　８４ （細胞培養）　５　１００　７４ ２．５　１００　６７ スタンダードＬ６２０　１００　３２ ＊　標的細胞を”Ｃｒでラベルし、ＭＡｂ及びヒト末梢血白血球（ＰＢＬ）の配 合物に４時間さらし、次いで”Ｃｒの放出を測定した。
”Ｃｒの放出（未処理の細胞からの自然放出値の補正をしだ後）は、細胞溶解の パーセントの尺度である。
表５Ｂ 結腸癌セルライン３３４７におけるキメラＬ６及びスタンダード（マウス）Ｌ６ 抗体のＡＤＣＣ （腹水）２．５　１００　７８ スタンダードＬ６５　１００　３２ は、細胞溶解のパーセントの尺度である。
表５０ 肺癌セルラインＨ２６６９におけるキメラＬ６及びスタンダード（マウス）Ｌ６ 抗体のＡＤＣＣ キメラＬ　６　１０　１００　３５ （腹水）　１　１００　３１ ０．００１　１００　１３ ０．０００１　０　１５ スタンダードＬ６１０　１００　９ （腹水）　１　１０　１５ ０．００１　１０　２２ ０．０００１　１０　１１ スタンダードＬ６１０　１０　７ 表５Ｄ 表５Ｃ（続き） 肺癌セルラインＨ２６６９におけるキメラＬ６及びスタンダード（マウス）Ｌ６ 抗体のＡＤＣＣ キメラＬ６　１０　０　４ （腹水） スタンダードＬ６１０　０　９ ”ｃｒの放出（未処理の細胞からの自然放出値の補正をしだ後）は、細胞溶解の パーセントの尺度である。
表６ 表６Ａ 結腸癌セルライン３３４７におけるキメラＬ６及びスタンダード（マウス）Ｌ６ 抗体の補体依存性細胞毒性効果キメラＬ５　２０　÷　２９ （腹水）　１０　＋　２３ ２０　不活化　０ １（ｌ　Ｑ　Ｑ キメラＬ６　２０　＋　２９ （細胞培養）　５　＋　２６ スタンダードＬ６　２０　＋　５５ １０　＋　３７ ２０　不活化　０ なし　０　＋Ｑ ＊　補体の介在による細胞溶解を４時間の”Ｃｒ放出アッセイによって測定した 。健常者からのヒト血清を補体の材料として用いた。
表６Ｂ 結腸癌セルライン３３４７におけるキメラＬ６及びスタンダード（マウス）Ｌ６ 抗体の補体依存性細胞毒性効果スタンダードＬ６１０　÷　９６ ＊　補体の介在による細胞溶解を４時間の”ｃｒ放　出アッセイによって測定し た。健常者からのヒト血清を補体の材料として用いた。
実施例４：　ヒトＢ−セル抗原に特異性を有するヒト−マウスキメラ抗体 ２Ｈ７マウスモノクローナル抗体（ガンマ２ｂＫ）はヒトＢ−セル表面抗原であ るＢｐ３５を認識する（Ｃ１ａｒｋ、Ｅ、Ａ＋　ｅｔ　ａｌ、＋　Ｐｒｏｃ。
Ｎａｔ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８２：　１７６６（１９８５））。　Ｂｐ ３５分子はＢ−セルの活性化に重要な働きをしている。ｍＲＡＮを２Ｈ７セルラ インから調製した。２つのｃＤＮＡライブラリーを１つは重鎖Ｕ　Ｉ　Ｇ−Ｈプ ライマを用いて、また、他の一つはオリゴ（ｄＴ）を用いて得た。１つのＶＨク ローン、ｐＨ２−１１を同一のｔＪＩＧ−Ｈオリゴヌクレオチドを用いてスクリ ーニングし分離した。軽鎖クローンを分離するために、マウスカッパ特異的ＤＮ Ａ断片を用いてオリゴ（ｄＴ）ライブラリーをスクリーニングした。候補のクロ ーンはマウスＪＫ５配列を用いて、更にスクリーニングした。１つのＶＫクロー ン、ｐＬ２−１２をこのようにして分離した。次いで、軽鎖ｔ）　Ｉ　Ｇ−Ｋを Ｊ領域中の制限酵素部位を工作するのに用いた。
２つのｃＤＮＡクローンも人工的なオリゴｄ（ｃ）配列を除去するために５°端 を修飾した。ｐＨ２−１１では、ＡＴＧ開始コドンの１つのヌクレオチド５°残 基を切断する制限酵素ΣｃｏＴを用いて行った。
ｐＬ２−１２では、２２　ｍｅｒ：ｌンテナー５ａ１１部位を用いて、１ｎｖｉ ｔｒｏでのヌクレオチドの突然変異誘発により行った。
これらの２つのクローンのＤＮＡ配列を第２１．２２図に示ス。
キメラ重鎖プラスミドの構築には、ＶＨモジュールをＪＨＢｓｔＥ■部位でヒ） Ｃガンマ１モジユールに結合し、モしてキメラ軽鎖の構築には、ＶＫモジニール をＪＫＨｉｎｄＩ［［部位でヒトＣＫモジュール（ｐＧＭＬ６０）に結合した。
発現ベクターの配列はｐｌＮＧ２０１６−ｇｐｔと同様にｐｌ　ＮＧ２０１２− ｎｅｏに由来していた。構築したプラスミドはｐＴＮＧ２１０１（ＶＨＣガンｖ ｌ　ｎｅｏ）、Ｉ）ＩＮＧ２１　Ｇ５（ＶＫ　ＣＫ−ｎｅｏ）、ｐｌ　ＮＧ２１ ０７（ＶＫ　ＣＫ　−ｇｐｔ）である。ｐＩＮＧ２１０１及びｐｌＮＧ２１０６ もまた両方の遺伝子を含有するプラスミドを作るのに用いた。それらはｐＨＬ２ −１１及びｐＨＬ２−２６である。更に、ｐＩＮＧ２１０６及びｐｌＮＧ２０１ ４は、トランスフェクトされた細胞中での軽鎖タンパク質の安定した状態での蓄 積が（重鎮と比較して）乏しいことと埋め合わせるために、２つの軽鎖のプラス ミドｐＬＬ２−２５に結合させた（第２３図参照）。
第２４図は構築中に可変領域の配列に対して行った変更を示す・プラスミドｐＨ Ｌ２−１１はＡａｔＩ［により長線化し、そして、そのＤＮＡをエレクトロポレ ーシヨンによって５ｐ２１０細胞をトランスフェクトするのに用いた。形質転換 体を０４１８−ＤＭＥＭで選択した。１つの形質転換体ＩＣ９はＥＬ　Ｉ　ＳＡ による測定で、キメラカッパ９　、３　ｎｇ／吋及びキメラガンマ１タンパク３ ３３−７２ｎ／１ｇを産生する。ｌ　Ｃ９ＤＮＡのサザン分析により、５ｐ２１ ０ゲノム中に統合されたプラスミドの１つのコピーが存在することが示され実施 例５　酵母から機能的キメラの抗体の分泌（１）マチニア−キメラのＬＳＩ［と Ｈ鎖との遺伝子の酵母インベルターゼシグナル配列と短縮されたホスホグリセレ ートキメーゼ（ＰＧＫプロモーター）への融合酵母菌体は、哺乳類の分泌・シグ ナル配列を認識し、また哺乳類の蛋白の分泌を指揮する能力を有する（ヒソラマ ン等、前掲）。しかし、ある種の未変性酵母シグナル配列は、酵母からいくらか の哺乳類の蛋白の分泌を指揮するのに、哺乳類のシグナル配列よりもより有効で あることを示唆する証拠がある（スミス等、サイエンス２２９巻１２１９頁（１ ９８５年））。−例は酵母インベルターゼ遺伝子用のシグナル配列である。Ｌ鎖 とＨ鎖の分泌の能力を改良するために、マチニアし鎖とＨ鎮の配列を、酵母イン ベルターゼシグナル配列に融合し、第２５図と第２６図にそれぞれ概要を述べて いる手順を用いて、短縮されたＰＧＫプロモーター（米国特許出願第７９７，４ ７７号）の転写制御下に置いた。これらの構造の重要な要素は、インベルターゼ シグナル配列（米国特許出願第７９７．４７７号参照）およびし鎖とＨ鎖との遺 伝子用に、シグナル配列プロセシング部位に制限部位を導入するためにインビト ロ変位誘発を用いることである。
これらの制限部位は非常によく位置しているので、制限酵素消化、Ｔ　−４Ｄ　 Ｎ　Ａポリメラーゼ処理のＤＮＡの平滑断端の連結反応により、マチニア−イム ノグロブリン鎖の５°末端と酵素インベルターゼシグナル配列の３゛末端とが相 内、翻訳融合される。
このような遺伝子は、酵素細胞内に表現されると、形質導入マウス５ｐ２１０細 胞から分泌されたキメラのＬおよびＨ鎖と同じ第一級ペプチド配列と共にキメラ のＬおよびＨ鎖の合成、プロセシングおよび分泌を指示する。ＬおよびＨ鎖遺伝 子用に用いられた変異誘発プライマーのＤＮＡ配列は、対応する未変異誘発配列 と同様、第２５Ｂ図および第２６Ｂ図にそれぞれ示される。この方法を用いて、 Ｌ６キメラのＬおよびＨ鎖は、酵素インベルターゼシグナル配列と短縮されたＰ ＧＫプロモーターに融合し、プラスミドｐｌ　ＮＧ　１４０７−７およびｐＩ　 ＮＧ　１４１５（第２５Ｃ図および第２６Ｃ図）となる。
（２）非酵母３°未翻訳ＤＮＡの除去 酵母中のＢ型肝炎表面抗原の表現についての最近の研究により、非酵母３′およ び５°未翻訳配列の除去が酵母中の異型の遺伝子表現の増加された水準となるこ とが証明された（クニースキン等、ジーン４６巻」３５頁（１９８６））。ｐｌ ＮＧ１４０７（第２５Ｃ図）中のキメラのＬ６抗体のｌ遺伝子配列は、ポリＡ配 列の７０ｂｐおよびポリＧ記列の２０ｂｐにより起こるほぼ２００ｂｐの３゛− 未翻訳ＤＮＡを含む。二重鎖エキソヌクレアーゼＢａ１２３１によるキメラのＬ ６Ｌ鎖ＤＮＡの最初の処理によって、ポリＡおよびポリＧの配列と、プラスミド ｐｉ　ＮＧ２１２　ｌｂ（第２７図）を作る３°未翻訳ＤＮＡの９０ｂｐ以外の 全てが除かれた。Ｃｋのみを含むｐｌ　ＮＧ２１２　ｌｂからの制限断片がｐｌ 　ＮＧ　１４１９（第２７図）を作るｐＢ　Ｒ３２２の誘導体にクローン化され た。第二の旦パ３１消化が、次にプラスミドｐｌＮＧ１４３１（第２７図）を作 る非酵母３′未翻訳ＤＮＡの１３ｂｐ以外の全てを除去するのに用いられた。ｐ ｌＮＧ１４１５（第２６図）中のキメラのＬ５Ｈ鎖遺伝子もまた、ポリＡの８０ ｂｐを包含する容ｆｆ１３’未翻訳配列を含む。３°未翻訳ＤＮＡの１ｌｂｐ以 外の全てが、第２８図に示す手順を用い、プラスミドｐｌＮＧ１４２９を作って 、除去された。
部位特異的インビトロ変異誘発が、低頻度で、変異誘発されている領域外のＤＮ Ａの不必要な塩基対変化を導入する。このような変異が、Ｍ２Ｓ中にクローン化 され、部位特異的変異誘発を受けたキメラのＬ６ＬおよびＨ鎖配列に現れないこ とを確実にするため、機能性キメラのＬ６抗体を生成することがＤ　Ｎ　Ａ配列 分析により確認されたかまたは形質導入されたマウス５ｐ２１０細胞中での表現 によって証明された、配列をコードすることより成る、インベルターゼシグナル 配列および短縮されたＰＧＫプロモーターに融合した、ＬおよびＨ鎖遺伝子を構 築した。プラスミドｐｌＮＧ１４３９（Ｌ鎖、第２７図）およびｐＩＮＧ１４３ ６（Ｈ鎖、第２８図）はこれらの構築により作られた。
（３）　ＰＧＫボリアテニル化シグナルにそれぞれ融合した、ｐｌＮＧ１４３９ とｐＩＮＧ１４３６からキメラのＬ６ＬおよびＨ鎖を含む酵母表現プラスミドの 構築酵母から無傷の機能性抗体分子を得るために、ホスト細胞内でのＬおよびＨ 鎖蛋白の平衡合成が提案される。一方法として、異なる選択マーカーをそれぞれ 含む別個の表現ベクター上にＬおよびＨ鎖遺伝子を置いた。プラスミド上に見ら れる選択マーカー中の酵母株欠陥は、次いで同時にまたは連続的にこれるプラス ミドと共に形質転換されうる。
ｐｌＮＧ１４６９（第２７図）およびｐｌＮＧ１４３６（第２８図）からのキメ ラのＬ６ＬおよびＨ鎖遺伝子は、Ｂ９ＱＩ　Ｉ　−Ｘｈｃ吐と旦↓Ｈ１−Ｘｈｏ Ｉ断片として、それぞれ、二つの異なるメディウムコピー数（約２０コピ／細胞 ）表現ベクター（酵母イー・コリシャトル）にクローン化された。これらの一つ 、ｐｌＮＧ８０４ＣＶＳは、完全酵母２−ミクロン環、ＰＧＫ転写終止とポリア デニル化シグナルおよび選択マーカーとして（ｌｅｕ　２遺伝子を含む。他のベ クター、ｐＩＮＧ１１５０は、転写の酵母オリジン、オリイイ、酵母内因性２− ミ写終止とポリアデニル化シグナル、および選択マーカーとしてのｕｒは、これ らの構築物、すなわちｐｌ　ＮＧ　１４４１−Ｌ鎮、担２とｐＩＮＧ　１４４３ −Ｌ鎖、ｕｒａ３（第２９図）；ＰＩ　ＮＧ　１４４０−Ｈ鎖、（ｌｅｕ　２と ｐｉ　ＮＧ　１４４２−Ｈ鎖、ｕｒａ３（第３０図）から生じた。
（４）形質転換された酵母細胞からキメラのＬ６抗体の分泌酵母細胞中りおよび Ｈ鎖合成を得る試みに、二つの別個の形質転換実験を行なった。ＰＩＮＧ１４４ １とｐＩ　ＮＧ　１４４３のおのおの、および別個にｐｌ　ＮＧ　１４４２とｐ ｉ　ＮＧ　１４４３の４μ９を、ＳＤ寒天（２％グルフース、０．６９％酵母− 窒素塩基、２％寒天）上での増殖用の選換により、サツカロミセス　セレビシェ 　株ＢＢ３３１　Ｃ（ＭＡＴａ、　Ｌｌｒａ３＋　ｆｆｅｕ２）に同時変換した 。ＩＪｒａ”　Ｌｅｕ”形質転換体は、３０℃で２−３日のインキ二ベーシッン で出現した。はぼ１００の形質転換体をｐＩ　ＮＧ　１４４０プラスｐｒ　ＮＧ 　１４４３として得た。わずか１５の形質転換体がｐｉ　ＮＧ　１４４２プラス ｐｌＮＧ１４４１として得られた。１０個のコロニーを各プレートから、５０ｍ Ｍコハク酸ナトリウムが補充されたｐＨ５，５の５ｖ（ＳＤプロスに接種し、６ ５時間３０℃で増殖した。細胞を遠心分離により除去し、上滑を固相酵素免疫測 定法（エリザ）によりし鎖とＨ鎖のレベルおよび分泌しおよびＨ鎖の結合程度を 分析した。後者は、ミクロタイターウェルをコートするのにヤギ抗ヒトカッパー 抗血清を、また抗カッパーコートに結合したＨ鎖のレベルを決定するのにペルオ キシダーゼ標識ヤギ抗ヒトガンマ抗血清を用いた。これらの検定結果（第７表） は、ｐｌＮＧ１４４０（Ｈ鎖、む旦２）プラスｐｌ　ＮＧ　１４４３（Ｌ鎖、ジ ３３）で形質転換された細胞からの培養上清は、Ｈ鎖蛋白−のレベルに比べて不 均衡にし鎖蛋白を高レベルに含み、組み立てられたしおよびＨ鎖の証拠はない（ 少なくともエリザにより決定されたところでは）ことを示した。一方、ｐｌ　Ｎ Ｇ　１４４２（Ｈ鎖、ミ視３）＋ｐｌ　ＮＧ　１４４１　（Ｌ鎖、む凹２）で形 質転換された細胞からの上清は、ＬおよびＨ鎖蛋白がより均衡のとれた製品を含 み、ｌＯの分離体の８つはエリザにより決定されるようにいくらかの組み立てら れたしおよびＨ鎖を含むことが明らかにされた。これらの分離体の二つ、Ｎｏ、 ｌとＮｏ、５はまとめられたしとＨ鎖の有意差のある部分を生産した。
第７表 酵母形質転換体１による分泌キメラのＬ５Ｌ５およびＨ鎖のレベルフラスミド５ 　分離体Ｎｏ、カッパー〇　ガンマ６　カッパー／カンマ・ｐｌＮＧ１４４０÷ 　１　２８４　３９　０ｐｌＮＧ１４４３　２　３２４　３３　０ｐｌＮＧ１４ ４１＋　１　１２８７９　３５ｐｌＩＧ１４４２　２　１５０　３０　１ｉｌｌ 　２４５　５７　１２ ａ、Ｓ、セレビシア株Ｂ　Ｂ　３３１　Ｃ（ＭＡＴａ、（！ｅｕ２．ｕｒａ３） は、ＬまたはＨ鎖でｗ３と牲２を伴うプラスミドでＵｒａ”　Ｌｅｕ”に変性異 的なエリザにより測定 ｄ、　ｎｇ／π（！ＩｇＧ樟準と標準ヒトでヒトガンマに特異的なエリザにより 測定 ｅ、　ｎｇ／ｚ（ｌコーティング抗体として抗ヒトカッパーとヒトＩｇＧ標準で 二次抗体として抗ヒトガンマを用いるエリザにより測定さらに分析して、この結 合がＨ，Ｌ、−サイズ蛋白の合成によるものかどうかの測定を行った。非常に低 レベルの明らかなしおよびＨ鎖結合を含んでいる分離体ＮＯ３１および５同様に Ｎｏ、８からの培養上清をコントリコン３０フイルター（アミコン社）による超 遠心分離により濃縮した。濃縮した上清を非還元条件下で７％ポリアクリルアミ ドゲルに流し、ニトロセルロースに詰め、ヤギ抗ヒトカッパー抗血清で、次いで さらにペルオキシダーゼ標識ウサギ抗ヤギ抗血清で試験した。分離体Ｎｏ、８か らの濃縮上清はそうではなかったが、分離体Ｎ０９１および５からの濃縮上清は 一本の免疫反応性横じまを含み、それは形質導入された５ｐ２１０細胞からの精 製キメラのＬ６抗体と共移動した。これらの結果は、分離体Ｎ００１と５が組み 立てられたＬ６キメラの抗体を合成、分泌していることを示唆した。
（５）酵母培養上清からキメラのＬ６抗体の精製酵母により分泌されたＨｚＬｔ −ｓｉｚｅ蛋白をさらに特徴づけ、これがまとめられたし６キメラの抗体かどう かを決定するため、十分量の酵母生産物質を精製し、種々の結合および機能検定 に付した。ｐＩＮＣ，１４４２＋１４４１形質転換体の分離体Ｎ０１５を、合成 培地（第８表）を用いた１０−リットル培養基中、３０℃で５８時間増殖させた 。細胞は最初９リツトルの９欄培地中で、グルコースレベルが１ｇ／Ｌ以下に下 るまで増殖し、この時点で総量２．５ＬのＢ欄培地を添加した。グルコースレベ ルは培養の残りの経過の間０．５９／Ｌに保った。細胞を遠心分離により除去し 、培養上清は、エリザによってＬおよびＨ鎖蛋白の存在とＨおよびＬ鎖の結合を 検定した。
上ｆｉｉ；！ｌ！ｌｆｆ２５０μｆ／ＬのＬ鎖、２４０μｇ／ＬのＨ鎖および１ ３０μｇ／Ｌの、Ｌ鎖と結合したＨ鎖を含有した。培養上清を次にり。
Ｃ，１０単位以上の限外ろ過（アミコン社）にょ０！！縮し、０．４５ミクロン フィルターでろ過し、ＹＭ３０フィルター（アミコン社）で２ｓｏｚａに濃縮し た。濃縮上清をＫＯＨでｐＨ７，４に調製し、ＰＢＳ（１０訪Ｍリン酸ナトリウ ム、ｐＨ７，４，１５０＋ｅＭ塩化ナトリウム）で５００ｖＱとし、ＰＢＳで予 め平衡化した１１１２蛋白Ａ−セファロース（シグマ）カラムにかけた。カラム を２０ｘ１２ＰＢＳでまず洗い、次いで１０１１２の０．１Ｍクエン酸ナトリウ ム、ｐＨ３，５で、それから１ｏａｒ：ｔの０．１Ｍクエン酸、ｐＨ２，２で洗 浄した。ｐＨ３，５と２．２の溶出液をそれぞれ、１１１Ｑの２Ｍ）リス塩基（ シグマ）を含む管に集めた。ＬおよびＨ超免疫反応性蛋白のバルクをｐＨ３，５ の溶出液中に入れ、次いでセントリフン３０（アミコン社）で濃縮して最終容量 １０６μｇとした。クーマシーブルー染色を用い、抗ヒトカッパー抗血清（シグ マ）でブロックして免疫反応で検出する、非還元ポリアクリルアミドゲル上での 、本蛋白の分析によって、蛋白標識Ｈ，Ｌ。
一部位１５０キロダルトン蛋白横じまが見られた。この蛋白を、Ａ緩衝液（１０ ｍＭＫＰＯ，、ｐＨ６，８）で平衡化したＡＢＸ５−ミクロンカラムを用いる高 性能液体クロマトグラフィーにより、他の蛋白から分離精製した。カラムに試料 をのせたのち、カラムをＡ緩衝液で１０分間（流速１：Ｃ７分）洗い、０％から ５０％Ｂ緩衝液（２５０ＤＭＫＰＯ，、ｐＨ６，８）で１１Ｎ分の速さで５０分 以上、直線勾配溶出にかけた。
第８表 分泌Ｌ６牛メラの抗体１を生成するために酵母培養に用いた借地２、（ＮＨａ） ＊ＳＯｉ　１３．９９／（２８３，３９ＩＱ３、チアミン）ＩＣｆｆ　Ｏ，０１ １９／１２　０．０５９ＩＱ４、ピｔｆン０．０００１１９／ｆｆ　０．００５ ９ＩＱ５、パントテン酸　０．００２９／（１０，００９９／（１６、イノシト ール　０．１９４９＃！　０．８７５ｇ＃！？、ＬＰＯａ　５．６〕ｘＱ／Ｑ　 ２５．５ｘｆｆ／ｆｆ８、　ＫＦｉｔＰＯ４５，７８ｆ／１２　２６．（ｉｆ／ ｊ９、Ｍｇ５Ｏ，，７１１，０３，３３ｆ／（！　１５．２９／（１１０、Ｃａ Ｃ１＊、　２Ｂ＊０　０．３３９ＩＱ　１．５９ＩＱ１１、　ＦｅＳＯ４，７Ｂ ＩＯ０，０７２９／ＱＯ，ａ４９／Ｑ１２、　ＺｎＳＯ４，７ＢｔＯ０，０２２ ｇ／Ｑ０．１０４９ＩＱ１：１．　ＭｎＣ１ｔ、　４）！ｔｏ　０．００：１９ ９／ＱＯ，（Ｈ８ｙ／ｆｆ１４、　Ｃｕ５Ｏ，、５１１１＊Ｏｏ、　００６７ｇ ／Ｑ０．０３１９／Ｑ１５、Ｃ０ｎＣ，ＨｔＳＯ−０，００５６ｘＱ／１２　０ ．０２６ｉ１２／（！ａ、培養は本文に記載した通りに実施した。
ｂ、最初の９リツトルバツチの成分 ｃ、２．５リットルの添加バッチの成分蛋白のバルクを、２８０ｎｍの吸収によ り決定した２０から５０分の間の一つの大きな広いピークに溶解した。第二のよ り小さなピークは５２−５６分に見られ、これは形質導入された５ｐ２１０細胞 からのキメラのＬ６抗体の通常の溶出地位に対応した。カラム分画のエリサ分析 により、５２−５６分でのＵ、Ｖ、吸収ピークに対応する主要なＨ？Ｌ鎖交叉反 応性ピークが見られた。クーマシーブルー染色を用い、プロットして免疫反応で 検出する、非還元ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上での５２−５６分分画の分析 によって、形質導入された５ｐ２１０細胞から精製されたし６キメラ抗体と共移 動する本質的に純粋な蛋白が出現した。
（６）酵母により分泌されたキメラのＬ６抗体についての研究精製された、酵母 から誘導された抗体を、幾つかの方法で機能について評価した。最初に、精製抗 体を、Ｌ６抗原陽性の細胞系に直接結合する能力につき検査した。次に抗体を、 マウスＬ６抗体が抗原陽性の細胞に結合するのを阻害する能力につき検査した。
最後に精製抗体を、抗体機能の二つの状況−ヒト末梢血液白血球の存在下、抗体 依存性細胞媒介細胞傷害を仲介する能力およびヒト補体の存在下、Ｌ６陽性腫瘍 を死滅する能力につき検査した。
直接検査検定　細胞表面上細胞当りほぼ５Ｘ１０’分子のＬ６抗原を発現するヒ ト結腸癌系統、３３４７からの細胞を標的として用いた。Ｔ細胞系、Ｔ５１を、 それまでの検査によれば、検出できるだけの量のＬ６抗原を発現しなかったので 、負のコントロールとして用いた。標的細胞を、最初に５ｐ２１０細胞から、あ るいは酵母由来のキメラのＬ６抗体と、またはマウス膓水から精製されたマウス 上６抗体標準と４°Ｃで３０分間インキュベートした。次いでキメラ抗体のため のＦＩＴＣ標識ヤギ抗ヒトイムノグロブリンと、またはマウス標準のためのＦＩ ＴＣ標識ヤギ抗ヒトイムノグロブリンとインキ；ベートした。了標識抗体はＴＡ ＧＯ（バーリンゲイム、カリフォルニア）から入手し、１：５０に希釈して用い た。細胞表面に結合する抗体はコウルターモデルＥＰＩＣ−Ｃ細胞選別機を用い て決定した。
第９表に示されるように、哺乳類から、および酵母由来のキメラのＬ６抗体は、 ともに、はっきりと、はぼ同程度にＬ６陽性３３４７系統に結合した。それらは 、上記の背景下では、Ｌ６陰性Ｔ５１系統に結合しなかった。
結合の阻害　次の段階として、酵母キメラのＬ６抗体と５ｐ２１０細胞由来のキ メラのＬ６抗体とを、ＦＩＴＣ標識マウスＬ６抗体が抗原陽性３３４７結腸癌細 胞の表面に結合するのを阻害する能力につき試験した。
酵母由来のキメラのＬ６抗体も５ｐ２１０から導かれたものも、ともに標識マウ ス上６抗体の結合を阻害し、結合曲線は平行であった。これらの検討結果を基に し、抗体親和性を大ざっばに評価した。
５ｐ２１０細胞由来のキメラのＬ６の親和性は以前にほぼ４Ｘ１０”であると決 定されていた。データから、Ｌ６抗原のための酵母由来のキメラのＬ６抗体と５ ｐ２１０細胞キメラのＬ６抗体の親和性の間には有意差はなかった。
機能検定　酵母由来のキメラのＬ６．５ｐ２１０細胞由来のキメラのＬ６および 標準マウスＬ６の各抗体の能力を比較し、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を仲 介する効果細胞の起源としてヒト末梢血液白血球の存在下にＬ６抗原陽性細胞を 溶解させた。第１０表に示されるように、酵母からのキメラのＬ６は５ｐ２１０ −細胞由来のキメラのＬ６よりも少し良好であり、そしてすでに明らかにされて いたように、両者は４時間クロム５１遊離試験により測定されるように、ＡＤＣ Ｃを生ずる点で標準マウスＬ６よりも勝っていた。
次に酵母由来のキメラのＬ６．５ｐ２１０細胞由来のキメラのＬ６および標準マ ウスＬ６の各抗体のＬ６抗体陽性細胞溶解能力を、ヒト血清を補体の起源として 用い、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）により比較した。この比較結果（第１１表 ）は、５ｐ２１０細胞キメラのＬ６および標準マウスＬ６の各抗体は高細胞溶解 能力を示すが、酵母由来のＬ６抗体は最も高い抗体濃度でも何ら細胞溶解を生じ ないことを証明した。これらの結果は、予期されなかったものであったし、酵母 由来の抗体が新しく独特の性質を有することを証明する。
（７）結論 酵母が機能性抗体を遺伝的に巧みに分泌する工程が明らかにされた。本実施例中 の酵母由来のキメラの抗体は、リンパ様（Ｓｐ２１０）細胞により生成されたキ メラの抗体とほぼ同様の親和で特定の標的抗原と結合する。酵母由来の抗体も、 ５ｐ２１０由来の抗体と同様のＡＤＣＣ活性を示す。酵母由来の抗体は、５ｐ２ １０細胞由来の抗体と異なり、ＣＤＣ活性を示さず、このように酵母由来の抗体 の新しく独特の性質を証明している。この工程は、選択された抗原を保持し、選 択された一定のドメインアイソトープに結合したドメインに結合している、種々 のモノクロナル抗体とキメラの抗体の生産に適用されうる。酵母中で生成された 、遺伝的に処理された抗体やその誘導体は、新規な機能的性質、例えば、いかな る検出可能なＣＤＣ活性もなく、ＡＤＣＣにより標的傷害を選択的に仲介する能 力を示す。ここに記載した工学技術はまた、遺伝的に処理された酵母による種々 の他の異型マルチマー分泌蛋白の生成にも適している。
第９表 Ｌ６抗原陽性でＬ６抗原陰性の細胞系上、酵母またはマウス５ｐ２１０細胞によ り生成された、キメラのＬ６抗体の結合検定標準マウスＬ６　９５　１．０ ８ｐ２１０キメラのＬ６　１１６　１．０醇母キメラのＬ６　１１０　１．Ｏ ａ、全抗体は１０μ９の濃度で用いた。
ｂ、結合比は、ＦＩＴＣ接合第二抗体で処理した標準標品よりも試料がより明る い度数である。ヤギ抗マウス抗体は、標準マウス上６モノクロナル抗体用第二抗 体として用いた。ヤギ抗ヒト抗体は、酵母と５ｐ２１０キメラのＬ６抗体用第二 抗体として用いた。
第１１表 第１０表 結腸癌細胞系３３４７上、酵母又は５ｐ２１０細胞由来のキメラのＬ６抗体と標 準（マウス）Ｌ６抗体のＡＤＣＣ標準マウスＬ６　５．０　４２ １、０　４８ Ｓｐ２１０牛メラのＬ６　１．ｏ　９６０、００１　３７ 酵母キメラのＬ６　１．０　１１４ ０、００１　６０ なし　０２３ ＊標的細胞は”Ｃｒで標識し、標的細胞当り１００包ＭＡｂとヒト末梢血液白血 球との結合に４時間さらし、５ＩＣｒの遊離はその後に測定した。”Ｃｒの遊離 （未処理細胞からの自然遊離量の収集後）はパーセント細胞溶解測定である。
可変部とＣ１１ｌ（第３１図）よりなる先端を切ったＨ鎖分子と結合し結腸癌細 胞系３３４７上、酵母またはマウス５ｐ２１０細胞によるキメラのＬ６抗体のヒ ト補体依存性細胞傷害効率抗体　濃度　補体１　パーセント （μｆ／ｘｆｆ）　（＋又は−）傷害 標準マウスＬ６　５　’−，１２２ Ｓｐ２１０牛メラのＬ６　５　−’、　７１酵母キメラのＬ６　５　＋４−、　 ３ ａ、健康患者からの血清を補体基原として用いた。
ｂ、補体依存性細胞傷害は４時間クロム５１遊離アツセイにより測定した。
実施例■　酵母から機能的キメラのＬ６の分泌ＩｇＧのＦａｂ蛋白は、単一り鎖 分子がジスルフィド結合により、てなる。このＨ鎖断片はＦｄとして知られてい る。Ｆａｂは種々の治療や診断の処理上有用な可能性がある。加えて、これは微 生物の培養により生産される。
Ｆａｂ生産の通常の方法は、無傷のＩｇＧをパパインで消化しく第３１図参照） 、次いで消化中に作られたＦｃ断片からＦａｂを精製する。
この処理は、比較的容易で、高収量でＦａｂが得られるが、初めに全抗体の生成 と精製を行ない、次いで出現し、最後にＦａｂの精製をするのは幾らか時間の浪 費である。それだけでなく、全抗体分子のｌ／３・・・Ｆｃ蛋白（第３１図）が 利用されない。
遺伝子クローニングと部位特異変異誘発の技術の最近の進歩によって、より直接 で簡単な、Ｆａｂ分子の別の生産への接近が可能となった。この試みで、パパイ ン消化が起こるアミノ酸用のコドンのほぼ蝶番部位の内側で停止コドンがＨ鎖遺 伝子に導入される。次いでＦａｂが、Ｈ鎖とＦｄ遺伝子との同時発現により直接 生成され、各蛋白を生成する。これら蛋白はまとめられ、細胞から分泌される。
（１）　Ｌ６牛メラのＨ鎖の蝶番部位への停止コドンの導入停止コドンのＬ６キ メラのＨ鎖の蝶番部位への導入の手順は第３２Ａ図に概略示される。蝶番部位内 の停止コドンの位置と変異誘発プライマーのＤ　Ｎ　Ａ配列は第３２Ｂ図に示さ れる。停止コドン配置は第３１図中のアミノ酸２２６に対応する。この手順は、 ２２８アミノ酸より成る蛋白をコードし、Ｌ鎖に結合するシスティンを越えて６ つのアミノ酸を広げるＦｄ遺伝子を含むプラスミドｐＴ　ＮＧ　ｌ　４０２を出 現した。変異誘発も停止コドンにおいて、Ｆｄの３′末端の続く操作にすぐに用 いられる特異なりｃｌ１１部位を導入した。これらは、限定するのに必要ではな いが、特異アミノ酸用のコードづけ配。
列の添加や溶解蛋白の生成を含むＦｄの種々の型の修飾への処理と同様、Ｈ鎖３ ゛未翻訳ＤＮＡの移動を含む。
（２）酵母インベルターゼシグナル配列と短縮されたＰＧＫプロモーターへのマ チニア−Ｆｄ遺伝子の溶解Ｆｄ遺伝子の酵母インベルターゼ配列への溶解の手順 は、第３３図に概略示されている。この試みには、酵母インベルターゼシグナル 配列−マチュアーＬ６）（鎖溶解（第２６図）の先の構築を使用し、キメラのＬ ６Ｈ鎖の３部分中の特異なＡ　ｐａｆｆ部位を用いて、蝶番部中に停止コドンを 含むｐｌＮＧ１４１２かろの定常部でＣ）ＩＩ、Ｃ）１２およびＣＩ（３より成 るＰＩ　ＮＧ　１４１５中の定常部を置換した。この操作はプラスミドｐｌＮＧ １４１８を産生した。
（３）非酵母３°未翻訳ＤＮＡの除去 Ｆｄ鎖の停止コドンでの特異なりｅ（！Ｉ部位の導入は、全ての非酵母３゛非翻 訳ＤＮＡの除去に便利な方法を供給する。これは第３４図に概略しめつれる手順 を用いてなされ、プラスミドｐＴ　ＮＧ　ｌ　４２８を産生した。停止コドンは 、Ｍ２ＳにクローンされたＨ鎖断片の部位特異性変異誘発により蝶番部分に導入 されたので、変異誘発の間、希望しない変異が導入される可能性があった。その ような変異がないことを確実にするため、インベルターゼシグナル配列に溶解さ れ、ＰＧＫプロモーターに短縮され、そして既知のコードづけ配列よりなるＦｄ 遺伝子が、第３４図に概略示される手順を用いて構築され、プラスミドｐｌＮＧ １４４４を産生した。
（４）　ＰＧＫポリアデニル下シグナルに溶解されるｐｌ　ＮＧ　１４４４から キメラのＬ６Ｆｄ遺伝子を含む酵母発現プラスミドの構築 酵母が無傷の機能的Ｆａｂ分子を生成するために、細胞中でＬとＦｄ鎖蛋白の両 者が均衡が取れて合成されることが同時に起きなければなるない。実施例Ｖで記 載したように、一つの試みは、分離選択マーカーを含む分離シャトルベクター上 にＬ鎖とＦｄ遺伝子を置き、これらのベクターを両選択マーカーが欠損した酵母 菌株に形質転換する。
ｐｌＮＧ１４４４（第３４図）からのＦｄ遺伝子は、ＢａｍＨＩ　−Ｘｈ。
ｌ断片として、酵母中の増殖用配列とＰＧＫポリアデニル化、転写終結シグナル 即ち、担２選択用ｐｌＮＧ８０４ｃＶｓとｕｒａ　３　Ｍ折用ＰＩＮＧＩＩ５０ （第２９．３０図参照）を含んでいる、二つの借地コピー数酵母−イー・コリシ ャトルベクターにクローン化された。
これらの構築からもたらされた二つのプラスミド−ｐｌＮＧ１４４（５）形質転 換された酵母細胞からキメラのＬ５Ｆａｂの分泌二つの分離形質転換実験が、酵 母細胞中りとＨ鎖の両者合成を得る試みでなされた。ｐｌＮＧ１４４５（第３５ 図）とｐｌＮＧ１４４１（第３０図）とｐｌＮＧ１４４６の分離体（第３５図） およびｐｌ　ＮＧ　１４４２（第３０図）の各４μ９をＳＤ寒天（２％グルコー ス、０．６７％酵母窒素塩基、２％寒天）上、増殖用に選択することによりニス ・セレビシア株Ｂ　Ｂ　３３１　ＣＣＭＡＴａ、　ｕｒａ３、ｂ２）中に同時変 換した。じｒａ”Ｌｅｕ“形質転換体が３０’Ｃで２−３日のインキ二ベーショ ンで現れた。各プレートから５コロニーを、５０ｍＭコハク酸ナトリウムでｐＨ ５，５に調製した６７１ＱのＳＤ培養物に接種し、３０°Ｃで６５時間増殖した 。細胞を遠心分離により除去し、エリザによりＬ鎖のレベルを分析した。これら の検定除去結果からｐｉ　ＮＧ１４４６＋ｐＩＮＧ１４４２形質転換体の培養上 清中のＬ鎖しベルは、ｐｌＮＧ１４４５÷ｐｉＮＧ形質転換体の培養上清中のレ ベルよりも３−６倍高いことが明らかとなった。各グループの形質転換体の培養 上清は、次にセントリコン３０フイルター（アミコン社）による限外濾過により 濃縮され、非還元条件下、１０％ポリアクリルアミドゲル上に流した。蛋白をニ トロセルロース紙にプロットし、ヤギ抗ヒトカッパー血清で次いでペルオキシダ ーゼ棲識つサギ抗ヤギ血清で調査した。ｐｌＮＧ１４４６とｐｌ　ＮＧ　１４４ ２形質転換体からの濃縮上清は、Ｆａｂ蛋白と期待される位置にかすかな交叉反 応性横シまを示し、プロットの大部分上への明らかな抗カッパー交叉反応性塗抹 を含んだ。比較により、ｐｌＮＧ１４４５＋ｐｌＮＧ１４４１形質転換体からの 培養上清は、プロット上、相対的に少しの塗抹の抗ヒトカッパー交叉反応性蛋白 を含有した。加えて、５試料の一つ（Ｎｏ、４）は、特に強い、Ｆａｂ蛋白と期 待される位置に移動した明確な抗カッパー交叉反応性横じまを含有した。
（６）酵母培養上清からキメラのＬ　５　Ｆ　ａｂの精製酵母から分泌されたＦ ａｂ−型抗カソバー交叉反応性蛋白が、本当のＬ６牛メラのＦａｂ蛋白であるこ とを確するために、結合検定を行なうのに十分な量の精製物が必要であった。そ こでｐｌ　ＮＧ　ｌ　４４１＋ｐｌＮＧ１４４５形質転換体分離Ｎ０１４を、１ リツトルの５０ｍＭコハク酸ナトリウムでｐＨ５５に調製したＳＤジブロス中３ ０℃で９５時間増殖した。細胞を遠心分離により除去し、培養上清をエリザによ りＬ鎖蛋白レベルを分析した。上溝はほぼ１３０μｙ／Ｌ鎖蛋白を含有した。培 養上滑を次にアミコンＹＭ３０フィルターによる限外濾過により２ｏπｇに濃縮 した。濃縮上清を１３０ｆｆｉ１２０１０ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ７，５（緩 衝液Ａ）で洗浄し、ＹＭ３０フィルターにより再濃縮して１２．５ｘＩ２とした 。濃縮上清を次に緩衝液Ａで５４ｒ、Ｑとし、緩衝液Ａで平衡状態とした１　、 　５　ｔ、Ｉ２のＳ−セファローズカラムに乗せた。カラムを２ｏｘｃの緩衝液 Ａで洗い、緩衝液Ａ中、Ｏから２００ｍＭの塩化ナトリウム（全量４０！Ｑ）の 直線分配溶出に付した。カラムフラクシジンのエリザ分析により、塩濃度はぼ６ ０ｍＭ濃度に相当する、フラクシヨン８と２１の間に、大きい抗カッパー交叉反 応性ピークが明らかになった。これらのフラクションヲ集め、アミコンＹＭＩＯ とコントリコン−１０フイルター（７ミコン社）で５１μＱに濃縮した。非還元 下および還元下のポリアクリルアミドゲル上、クーマシーブルー染色と抗ヒトカ ッパーと抗ヒ）Ｆａｂ抗血清での西部プロッティングを用いて分析した。これら の分析により非還元ゲル上はぼ４６Ｋｄに移動した本質的に純粋な蛋白が明らか にされた。それは還元ゲル上はぼ２３と２４．５Ｋｄに走る二つの横じまに分解 し、これは、それぞれＬ鎖とＦｄ蛋白として予定された（アミノ酸配列を基礎と して）分子量に相当する。二つの横じまの小さい方は、西部プロット上抗ヒトカ ッパー抗血清に強く反応した。両蛋白横じまは、西部プロット上抗ヒ）Ｆａｂ抗 血清と反応した。
（７）酵母により分泌されたキメラのＬ５Ｆａｂについてなされた検討 Ｆａｂ分子の一次活性は標的抗原への結合能力である。酵母由来のキメラのＦａ ｂは、それゆえ、Ｌ６抗原陽性細胞系はの直接結合能力と、マウス上６抗体の抗 原陽性細胞への結合の阻害能力について試３４７からの細胞を標的として用いた 。抗原陰性細胞系Ｔ５０からの細胞をネガティブコントロールとして用いた。標 的細胞を、最初に、酵母由来のキメラのＬ６Ｆａｂ、５ｐ２１０細胞由来のキメ ラのＬ６抗体と、またはマウス上６抗体と、４℃で３０分間インキユベートシた 。次いでキメラのＦａｂ用ＦＩＴＣ標識ヤギ抗ヒトカフパーイムノグロブリン、 キメラの抗体用ＦＩＴＣ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧと、又はマウス抗体用ＦＩＴＣ標 識ヤギ抗マウスイムノグロブリンとインキユベーションを行なった。再標識抗体 はタボ（バーリンゲイム、カリフォルニア）から入手し、１：５０希釈で用いた 、細胞表面に結合する抗体はコールタ−モデルＥＦＩＣ−Ｃ細胞分選機を用いた 決定した。
第１２表に示されるように、酵母由来のキメラのＬ５ＦａｂはＬ６陽性３３４７ 系に結合した。酵母由来のキメラのＬ　６　Ｆ　ａｂは上記の景色下でＬ６蔭性 Ｔ５１系と結合しなかった。
結合の阻害　次の段階で、我々は酵母由来のキメラのＬ　５　Ｆ　ａｂ又は５ｐ ２１０細胞由来のキメラのＬ６抗体のどの等級別量までＦＩＴＣ標識マウスＬ６ 抗体が抗原陽性結腸癌３３４７細胞表面に結合するのを阻害するかを検討した。
酵母由来のキメラのＬ　６Ｆ　ａｂの濃度は、直接標識マウス上６抗体の結合を 阻害した。しかし、酵母Ｌ６は、マウス上６抗体の標的細胞への結合を５０％阻 害するには、５ｐ２１０細胞由来のキメラのＬ６抗体による結合阻害のの程度に 要求されるよりも高濃度を必要とした。
（８）結論 酵母が遺伝的にイムノグロブリンの機能的Ｆａｂドメインを分泌させうる方法が 明らかになった。本実施例において、酵母由来のキメラのＦａｂは適当な標的抗 原に結合する。そのようなＦａｂ分子は、種々の診断や治療用の便利な標的試薬 に供される。この工程はまた、酵母から不均質な異種二重体分子の分泌の可能性 を証明している。
第１２表 Ｌ６抗原陽性とＬ６抗原陰性の細胞系での酵母により生成されたキメラのＬ６Ｆ ＡＢの結合検定 ５ｐ２１０キメラのＬ６　１０３　１ 酵母キメラのＬ６Ｆａｂ　３２　１ ａ：全抗体は１０．１／πａ′ａ度で用いられた。
ｂ：結合比は、ＦＩＴＣ−接合二次抗体で処理したコントロールよりも試料がよ り明るい度数である。ヤギ抗ヒト抗体は５ｐ２１０キメラのＬ６抗体用二次抗体 として用いられ、ヤギ抗ヒト力・ツバ−抗体は酵母Ｆａｂ用二次抗体として用い られた。
実施例７ 細菌からの機能性キメラＦａｂ分子の分泌。
ｆｉ！ｌ菌類は、全暗号化配列が充分に特定されたプロモーターにより発現可能 なため、は乳類ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａから発現されるキメラ抗体の生産に適している。
エシェリヒア・コリは、多量の遺伝子情報を利用することによりその遺伝子発現 を最適化し得ることから、外来蛋白質の製造を目的とする多くの有用な細菌の一 種である（ホーランド、１、Ｂ、等、「バイオテクノロジー」先：４２７（１９ ８６））。エシェリヒア・フリは、外来蛋白質の内部生産または細胞質からの蛋 白質の分泌に使用され得、それらはべりブラズミック空間に蓄積されることが非 常に多い（グレイ等、「ジーン」旺：２４７（１９８５）、岡等、「プロシーデ ィンゲス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシーズ・オブ・ ザ・ニー・ニス・ニーＪ８２ニア２１２（１９８５））。エシェリヒア・コリ細 胞質からの分泌は、多くの蛋白質について観察され、シグナル配列を必要とする 。細菌において内部生産される蛋白質は、正しく折り畳まれていることが少なく 、細胞封入体と呼ばれる細胞レベル下の粒子中に沈澱する（シ１−す−等、「バ イオテクノロジーＪ３：１５１（１９８５））。しかしながら、細菌から分泌さ れた蛋白質は、正しく折り畳まれていることが多く、天然二次および三次構造を 呈する（シウング等、「バイオテクノロジー」４：９９１（１９８６））。免疫 グロブリン・ペプチドは遺伝子工学によりエシェリヒア・コリにおいて合成され ているが（キ、ビリー等、「プロシーディンゲス・オブ・ザ・ナショナル・アカ デミ−・オブ・サイエンシーズ・オブ・ザ・ニー・ニス・ニーＪ８１：３２７３ （１９８４）、リウ等、「プロシーディンゲス・オプ・ザ・ナシ５ナル・アカデ ミ−・オブ・サイエンシーズ・オブ・ザ・ニー・ニス・ニー」８１：５３６９（ １９８４）、ボス等、「ヌクレイツク・アシ・ノズ・リサーチ」Ｌλ：３７９１ （１９８４））、エシェリヒア・コリからの機能性抗体または抗体フラグメント としてのこれらのペプチドの分泌につい“Ｃは報告されていない。
Ｆａｂ分子は、単一ジスルフィド架橋により連結された２種の異なる蛋白質鎖に より構成される。これら２種の鎖は、無傷の抗体軽鎖並びに抗体重鎮、ＦｄのＶ 、ＪおよびＣお１部分である。Ｌ６キメラ軽鎖およびＦｄ遺伝子の正しいｅＤＮ Ａクローンは既に同定されている。この実施例では、これらのｃ　Ｄ　Ｎ　Ａク ローンを、エルウィニア・カロトボラから得られたペクチン酸リアーゼ（ｐｅｌ 　Ｂ　）遺伝子リーダー配列への遺伝子融合体として単一細菌オペロン（ジシス トロン・メソセージ）中に組織しくレイ等、「ジャーナル・オプ・バクテリオロ ジー」投稿中（１９８７））、２種の強力な調節プロモーターのいずれか一方か ら発現させた。その結果、エシェリヒア・コリにおける２種の蛋白質路の同時発 現用システムが得られ、Ｌ６キメラ抗体の免疫学的活性で正しく組立られたＦａ ｂが培養生長培地に分泌された。
Ａ、Ｌ６キメラＦａｂ用エシェリヒア・コリ発現システムの構築。
１、ｐｅｌＢリーダー配列カセットの組立。
エルウィニア・カロトボラＥＣは、幾つかのペクチン酸リアーゼ（ポリガラクツ ロン酸トランス一二すミナーゼ）をコードする（レイ等、「ジーンＪ３５：６３ （１９８５））。３種のペクチン酸リアーゼ遺伝子がクローン化され、これらの 遺伝子のＤＮＡ配列が決定された。強力なプロモーターの制御下でエシェリヒア ・コリにクローン化されると、ｐｅｌＢ遺伝子が発現され、大量のペクチン酸リ アーゼがベリブラズミソク空間に蓄積するｅｐｅｌＢシグナル配列はエシェリヒ ア。
コリにおいて有効に機能し、この例では抗体遺伝子の分泌シグナルとして使用さ れた。ｐｅｌＢ遺伝子のシグナル配列を囲むヌクレオチド配列を第３６ａ図に示 す。
ｐｅｌＢシグナル配列は、シグナル・ペプチダーゼ開裂部位ａｈａ−ａｌａに隣 接したアミノ酸２２にＨａｅｌｌｌ制限部位を含む。プラスミド・ベクターＰＵ 　Ｃ８（ビエイラおよびメリック、「ジーンＪ１９：２５９（１９８２））中に ｐｅｌＢ遺伝子を含む、プラスミドｐｓｓ１００４（レイ等、「ジャーナル・オ ブ・バタテリオロジー」、投稿中（１９８７））をＨａｅｌｌ＋およびＥｃｏＲ Ｉにより消化した。このＤＮＡを８塩基対５ｓｔｌリンカ−と共に５ｓｐｌおよ びＥｃｏＲＩ切断したｐＢ　Ｒ３２２にライゲーションした。生成したプラスミ ドは、ｐｅｌＢの２２アミノ酸リーダー配列を含む３００ｂｐフラグメントおよ び約２３０ｂｐの上流エルウィニア・カラトボラＤＮＡを含んでいた。このプラ スミドｐＩ　ＮＧ　ｌ　７３は、５ｓｔｌによる消化およびＴ４　ＤＮＡポリメ ラーゼによる処理後、入来遺伝子とフレーム内機能性細菌リーダー配列を含む、 蛋白質融合体を生成させる遺伝子の成熟暗号化配列の第一アミノ酸が側面に位置 するＤ　Ｎ　Ａフラグメントに直接ライゲーションされ得る、挿入体を含む。ｐ ｌＮＧ１７３における５ｓｔｌ〜Ｅｃ。
Ｒ１制限フラグメントをｐＵｃ１８（ヤニッヒーベロン等、「ジーン」３３：１ ０３（１９８５））へクローン化することにより、ｐＲＲ１７５が生成される。
これは、ｌａｃプロモーターの下流にｐｅｌＢリーダーおよび隣接上流非暗号化 配列（リポソーム結合部位を含む）を含む。
ｐＲＲ１７５の構築の概略を第３６ｂ図に示す。
２、細菌発現用キメラム６軽鎖遺伝子の製造。
シグナル配列プロセッシング部位にＡａｔｌ＋制限部位および遺伝子の下流に特 有のＢｇｌ１１部位を含む無傷のＬ６キメラ軽鎖遺伝子を、酵母発現プラスミド ｐｌＮＧ１２９８（第２５ａ図）から１２００ｂｐＤＮＡフラグメントとして取 り出した。このフラグメントをプラスミドｐＲＲ１７５に挿入した。生成したプ ラスミドｐＲＲ１７７−８は、ｐｅｌＢリーダーおよび親プラスミドに存するｌ ａｃプロモーターの下流のＬ６軽鎖のフレーム内融合体を含んでいた。このプラ スミドの幾つかの誘導体を構築して、ｐＲＲ１７７−８におけるｐｅｌＢ：：軽 鎖遺伝子融合体の５°および３°末端の両方から非暗号化配列を削除した。
ｐｅｌＢリーダー配列開始コドン（第３６図）から−４８ｂｐにおけるＮｄｅＩ 制限部位を利用して上流非暗号化配列を削除すると、ｐＲＲ１８０−２が得られ た。酵母におけるＬ６６軽鎖現用に最適化されたプラスミドｐｌＮＧ１４３１（ 第２７ａ図参照）からのフラグメントをｐ　・ＲＲ１７９中に置き換えることに より、３”非暗号化配列を削除すると、ｐＲＲ１９１が生成した。別のプラスミ ドｐＲＲ１９０はｐＲＲ１９１、と似ているが、軽鎖遺伝子の３°末端に９０ｂ ｐの非暗号化真核生物ＤＮＡを含む。これらの構造を第３７図に示す。
３、細菌発現用キメラＬ６　Ｆｄ遺伝子の製造。
シグナル配列プロセッシング部位に５ｓｔｌ制限部位を含み、部位突然変異（第 ３２ａ、ｂ図）およびアミノ酸２２６に終止コドンを作成することにより導入さ れたＢｅ１１部位および遺伝子の下流に特有のＢａｍＨ１制限部位を含む無傷の し６キメラＦｄ遺伝子を、８８０ｂｐＤＮＡフラグメントとしてプラスミドｐｌ ＮＧ１４０６（第３３図）から取り出した。このＤＮＡフラグメントをプラスミ ドｐＲＲ１７５に挿入すると％ｐｅｌＢリーダー配列およびｌａｃプロモーター の下流のＬ６　Ｆｄ遺伝子のフレーム内融合体、ｐＲＲ１７８−５が生成された 。幾つかの誘導体を構築して、ｐＲＲ１７８−５に含まれる配列の５゛および３ ″末端の両方から非暗号化配列を削除した。Ｆｄ遺伝子の終止コドンの直後にＸ ｈｏｌリンカ−を含む、酵母におけるＬ６　Ｆｃ１発現用に最適化されたプラス ミド、ｐｉ　Ｎｏ　１４２８（１３４図）からの制限フラグメントを置き換える ことにより３“非暗号化配列を除去すると、プラスミドｐＲＲ１８６が生成され た。リーダー配列から−４８におけるＮｄｅ１部位の上流のエルウィニア・カロ トボラＤＮＡ配列を除去すると、プラスミドｐＲＲ１９６が生成された。これら のプラスミドの構造を第３８図に示す。
４、軽鎖およびＦｄ遺伝子用マルチシストロン発現システム。
細菌により誘導されたＦａｂを製造するためには、軽鎖およびＦｄの両方が細胞 内で同時に製造される必要がある。これらの遺伝子の各々により別々に構築され たプラスミドを用いて、単一プロモーターからの転写が両遺伝子を特定するよう に配列された両遺伝子を含む一連の発現ベクターを構築した。これは、２種の遺 伝子間の非暗号化ＤＮＡを６０ｂｐに最小限化する方式で行なわれた。各遺伝子 は、翻訳開始に必要とされるリポソーム結合部位および−４８かるｐｅｌＢリー ダー二二抗二連抗体遺伝子ジャンクシ５ン一のＤＮＡ配列を有する。２種の遺伝 子を一直線に並べるためには、幾つかのクローニング段階が必要であった。ｐＲ Ｒ１８０−２においてｐｅｌＢリーダーに連結された軽鎖遺伝子の一部分を、ｐ ＲＲ１８６におけるＦｄ遺伝子の下流にクローニングすることにより、ｐＦＫｌ ｏｏが生成された。軽鎖遺伝子の残りをｐＲＲ１７７−８からｐＦＫｌｏｏにサ ブクローニングすることにより、ｐＦＫｌｏｌが生成された。同様に、ｐＲＲ１ ９０およびｐＲＲ１９１からの真核生物配列の３゛欠失を含むＤＮＡフラグメン トをｐＦ　Ｋ　１０１ヘクローン化することにより、ｐＦＫ　１０３およびｐＦ Ｋ１０２が各々生成された。ｐＲＲ１９２およびｐＦＫｌｏｌからのＤＮＡフラ グメントをライゲーションすると、ｐＦＫ１０４が生成された。これは、Ｆｄ遺 伝子から一４８ｂｐの上流配列の欠失を含む。これらのプラスミドにおけるＦｄ および軽鎖遺伝子カセットの地図を第３９図に示す。
５、誘導性プロモーターの制御下における軽鎖およびＦｄに関するジシストロン ・メツセージの配置。
ブ５スミ）’ｐＦＫ１０１、ｐＦＫ１０２、ｐＦＫ１０３およびｐＦＫ１０４は 、ベクターｐＵｃ１ＢまたはｐＬｌｃ］９においてｌａｃプロモーターの制御下 で連続的にクローン化されたＦｄおよび軽鎖遺伝子を含む。エシェリヒア・フリ 株、例えばＪＭｌ　０３　Ｆ’１ａｃｉＯ（メッシング等、「ヌクレイツク・ア シソズ・リサーチＪ９：３０９（１９８１））の場合、ペリプラズムに蓄積する 軽鎖の量は、ｌａｃプロモーター誘導剤イソプロピルＢ−Ｄ−チオガラクトピラ ノシド（Ｉ　ＰＴＧ）による影響は受けない（第１３表参照）。さろに、細菌の 生長は遅く（ｐＵ　Ｃ１８を含む細胞と比較して）、細胞コロニーは、小さく乾 燥して粗い改変された形態を呈し、構成外来遺伝子の発現が細胞生長に有害であ ることを示唆している。２つの戦略を用いることにより、さらに厳密に調節され たプロモーターの下でこの遺伝子カセットを配置した。
第一に、ｐＦＫｌ○４からのＰｓｔ　Ｉ　−ＥｃｏＲＩフラグメントを、ｐＩＴ ２０６にライゲーションすることにより、エシェリヒア・コリにおける強力なプ ロモーターとして充分に特定されているサルモ不う・テフィムリウムａｒａ　Ｂ プロモーターの直接制御下でＦｄおよび軽鎖遺伝子力セントを配置した。ｐｌＴ ２０６制限地図およびｐｌＴ１０４の構造を第４０図に示す。細菌遺伝子の発現 におけるａｒａ　Ｂプロモーターおよびその調節蛋白質ａｒａＣの使用について は、アメリカ合衆国特許出願６９５３０９（１９８５年１月２６日付）および７ ９７４７２（１９８５年１１月１３日付）に記載されている。第１４表に示す通 り、アラビノースを培養生長培地へ加えることにより、生成したプラスミドｐｌ 　Ｔ　ｌ○４を軽鎖合成用に調節する。アラビノースを加えることにより、少な くとも１０倍の誘導が行なわれる。
これは、Ｆａｂ遺伝子の高レベルの発現が細胞の生長に有害であることを確認し ている。アラビノースの非存在下で生長させた場合、ｐＩＴ１０４を宿す細菌コ ロニーは、ｐｌＴ２０６を宿すエシェリヒア・コリとは表現型的に区別がつかな い。
第二に、１ａｅｉ遺伝子を含むＤＮＡフラグメント、ｌａｃプロモーターのリプ レッサーを、高度コピー発現ベクターｐＦＫ１０２にクローン化した。高コピー 数ベクターからの１ａｃｉの発現は、高コピー数ベクターにおけるｌａｃプロモ ーターの発現の調節に有用である（ラッセル等、「プラスミド」、投稿中（１９ ８７）、スイング等、「バイオテクノロジー」±：９９１（１９８６））。ｐＭ Ｃ９（カロス等、「プロシーディンゲス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・ オプ・サイエンシーズ・オブ・ザ・ニー・ニス・ニー」−電車：３０１５（１９ ８３））における１ａｃｉ遺伝子を含む１．７ｋｂＥｃｏＲ１フラグメントを取 り出し、Ｔ４ポリメラーゼによりプラント末端にし、Ｐｓｔｌリンカ−とライゲ ージ璽ンし、ｐＦＫ１０２の特有のＰｓｔＩ部位にクローン化することにより、 ｐＦ　Ｋ　１０２１ａｃｉが生成された。ｐＦＫ１０２１ａｃｉの地図を第４０ ｂ図に示す。正確なりローンの同定に使用される選択方法により、生成したプラ スミドｐＦＫ１０２１ａｃｉが、機能的に抑制されたｌａｃプロモーターを含む ことを確かめた。マツコンキー−ラクトース・プレート上の白色または明るいピ ンク色のコロニーは全て、１ａｃｉ挿人体を有するプラスミドを含んでいたが、 ｐＦＫ１０２のみを含む形質転換体は赤かった。これは、高コピー数１ａｃｉ遺 伝子によるｌａｃプロモーターの機能的抑制を示している。第１４表は、ｐＦＫ １０２１ａｃｉを含む細胞からの細菌性Ｆａｂの発現がｐＦＫ１０２からの発現 と類似していることを示している。異常型コロニーを形成し、ブロス培養でゆっ くりと生長したｐＦＫ１０２を含む細胞とは異なり、ＰＦＫ１０２１ａｃｉを含 む細胞は、ｐＵｃ１８を含む細胞と似ていた。
Ｂ、細菌により産生されるＦａｂの発現、５ＤＳ−ＰＡＧＥおよび精製。
１、クローン化された抗体遺伝子を宿すエシェリヒア・コリの培養。
標準エシェリヒア・コリ形質転換方法により、プラスミドＤＮＡをエシェリヒア ・コリＪＭＩ　０３またはＭＣ１０６１に形質転換した。適当な抗生物質（ペニ シリン２５０μｇ／ｒ（１、テトラサイクリン１５μｙ／ｚＩ２）を補ったＴＹ Ｅ（）リプトン１．５％、酵母抽出物１゜０％およびＮａＣｆｆ０．５％）にお いて細菌培養を生長させた。細菌培養を５１〜１リツトルの容量で光学密度０Ｄ ６００＝０．８（約４×１０８細胞／１１Ｑ）に３７℃で生長させ、ＩＰＴＧ（ ０，２ミリモル）、ラクトース（１，０％）またはアラビノース（１，０％）を 用いてアリコートを誘導した。さらに４〜２１時間培養を生長させた。各培養の 一部分を軽鎖生成について分析した。柳田等（［ジャーナル・オブ・バクテリオ ロジーＪｌ　６６：９３７（１９８６））に記載された浸透圧シラツクにより、 エシェリヒア・コリ細胞のベリプラズミック空間から蛋白質を放出させた。別法 として、培養上清を抗体鎖の存在について直接検定した。
Ｌ６軽鎖の定量には、ヤギ抗ヒト・カッパ軽鎖抗体（カッペル、マルバーン、ペ ンシルバニア）によるＥＬＩＳＡを用いた。Ｆｄは、マウス・モノクローナル抗 ヒトＦｄ抗体くカルビオケム、サンディエゴ、カルフォルニア）を用いたＥＬＩ ＳＡにより検出され得る。第１３表は、エシェリヒア・コリ・ペリプラズミック 抽出物における軽鎖反応性物質の発現に関する代表的データを示す。軽鎖は、細 菌細胞質からペリプラズム中に分泌される。また、抗体鎖は細菌から培養上清中 へ放出される。これは異常な発見であり、エシェリヒア・コリにおいて発現され た真核生物蛋白質の間でもＬ５Ｆａｂ独特の特性であり得る。しかしながら、あ る種の条件下では、細菌蛋白質はエシェリヒア・コリから放出されることが知ら れている（アブラー６９：１３８６（１９８６））。第１４表は、ペリプラズム 中に分泌された軽鎖の量を、培養上滑中に分泌された量と比較している。軽鎖反 応性物質は、クローン化された軽鎖単独または軽鎖＋Ｆｄを宿すプラスミド含有 培養物に存在する。Ｆａｂの最も優れた生産体（ｐＦＫ１０２、ｐＦＫ１０４お よびｐＦ　Ｋ　１０２１ａｃｉ）は、代表的には培養培地中へ３００−１０００ ｒ＋ｌ／ｉｆｆのＥＬＩＳＡ反応性軽鎖を分泌する。軽鎖遺伝子の次にＦｄ遺伝 子が続く別の構築物を作製した（ｐＦＫ１０７）。この構築物は、反対順序での 遺伝子による構築物と似たレベルでＦａｂの合成および分泌を指図する。すなわ ち、遺伝子の順序はＦａｂの分泌にとって厳密なものではない。
２、細菌により生成されたキメラム６軽鎖およびＦｄの５ＤＳ−ＰＡＧＥ。
細菌により生産された抗体鎖を、還元および非還元条件下でポリアクリルアミド ・ゲル電気泳動により分析した。溶解した全細菌細胞の蛋白質抽出物、浸透圧シ ョックによりペリプラズミ、、タ空間から放出された蛋白質および培養上清中に 分泌された蛋白質を電気泳動法により分析した。ウェスタン分析による完全な還 元条件下でのゲル分Ｍ蛋白質のニトロセルロースへの移動およびヤギ抗ヒト軽鎖 抗体を用いた免疫学的染色は、本物のし６キメラ軽鎖と同じ分子量の蛋白質が存 在する（約２３Ｋｄ）ことを示した。非還元条件下での５ＤＳ−ＰＡＧＥによる 蛋白質試料の分析は、軽鎖遺伝子のみを有するプラスミド（ｐＲＲ１９１または ＋５ＲＲ１９０）を宿す細胞からの抽出物が、さらに高い分子量形態に会合した 軽鎖反応性物質を大きな比率で含むことを示した。この物質の多くは、軽鎖２量 体であると思われるものにおいて約４６Ｋｄで移動した。軽鎖２量体は、軽鎖の みを生産するミエローマ細胞から観察された。また、軽鎖およびエシェリヒア・ フリ蛋白質問に非特異的ジスルフィド形成ヲ示シ得る他の免疫反応性蛋白質バン ドが存在する。軽鎖およびＦｄ遺伝子の両方を宿すエシェリヒア・コリ細胞から の蛋白質試料（ペリブラズミ、り抽出物または培養上清）は、非還元性ゲル条件 下で分離された場合、細菌性軽鎖２ｊ１体よりも僅かに高い分子量で移動する約 ４ｇＫｄにおける軽鎖反応性バンドを含む。この物質は、細菌により生産された し６キメラＦａｂである。ｐＦＫ　１０２１ａｃｉ、　ｐＦ　Ｋ　１０１、ｐＦ Ｋ１０２、ｐＦＫ１０３またはｐＦＫ１０４を宿すエシェリヒア・コリにおいて 、非還元条件下で行なわれたＳＤＳゲルにおいて観察される４８Ｋｄバンドは、 最も著しく免疫反応性を示す種類である。さらに、軽鎖のみを含む抽出物で見ら れる免疫反応性蛋白質の基底値スミアは、軽鎖およびＦｄを共に含む細胞からの 抽出物の場合では大きぐ減少する。
３、細菌により生産されたキメラｌ−５Ｆａｂの精製。
免疫学的および機能的活性（下記参照）細菌性Ｆａｂを、ｐＦＫ１０２１ａｃｉ またはｐｌＴ１０４を宿すエシェリヒア・コリの培養上清またはべりブラズミッ ク蛋白質抽出物から精製した。ペリブラズミツク物質を精製するために、４時間 誘導された細胞ｌ　’Ｊ　、ノ）　）レカ１らｉ尋られたペリブラズミ・ツク・ フラクションを５０πＣの蒸留水中（こ放出した。この物質を２０分間５０００ ｇで遠心分離に力１け、０．４５μ裏フイルターによりろ過した。次いで、ペリ ブラズミ・ツク抽出物をＹＭＩＯ膜（アミコン）により約５ｘＱに濃縮した。こ の物質を出発緩衝液（１０ミリモルに！ＨＰＯ，、ｐＨ７，５）により８倍に希 釈し、１゜Ｏ１０１分の流速で１ｉｄｓ−セファロース・カラムｊこ適用した。
カラムを２５ｘＱの出発緩衝液で洗浄し、出発緩衝液中０〜２００　ミ！Ｊモル ＮａＣ１勾配により溶離した（全容１ｔ２００ｚ（り。免疫反応性勾配ピークを プールしく溶離は約１００ミリモルで行なわれた）、セント１ノコン１０で濃縮 した。精製ＦａｂをＰＢＳ＋２．０％ＢＳＡ中で貯蔵した。
１リツトルの細胞培養上清から分泌されたＦａｂを精製するため１；、誘導剤に より２１時間生長させた後、遠心分離により細胞を除去し、上清を０．４５μ夏 フイルターによりろ過した。培地をＹＭＩＯ膜（アミコン）により約１６１ｆ） に濃縮し、次いで１０ミリモルに、ＨＰＯ。
で１０５ｚＣに希釈した。この物質を１．５ｉ（Ｓ−セファロース・カラムに適 用し、４０πＣ中０〜２ｏＯミリモルＮａＣ１勾配により溶離した。Ｓ−セファ ロース・クロマトグラフィーから回収されたＦａｂは、非還元性クーマシー染色 １０％アクリルアミドゲルのデンシトメーター追跡により測定したところ、７０ ％より高い純度であった。
細菌培養上清から精製されたＦａｂは、１５％還元性ゲルにおｔ）て約２３Ｋｄ および２４．５Ｋｄの２つの主たる蛋白質ノインドに分解する。
Ｄ　Ｎ　Ａ配列に基づいたＦｄおよび軽鎖の分子量は、２４．５Ｋｄおよび２３ Ｋｄであり、これは観察された蛋白質サイズと明確に対応している。２つのバン ドのうちの小さい方は、ウェスタン・プロットにおいてヤギ抗ヒト・カッパ軽鎖 抗血清と強く反応した。ベリプラズミック空間または細菌培養上清から精製され た細菌性Ｆａｂは、上記で試験したどの分析基準を用いても区別がつかない。
４、Ｌ６抗原に対する細菌産生キメラＬ６Ｆａｂの機能的結合活性。
Ｓ−セファロース・クロマトグラフィーにより精製された細菌産生Ｆａｂを、Ｌ ６抗原含有細胞への結合について試験した。第１５表で示す通り、細菌性Ｆａｂ は、ヒト結腸癌セルライン３３４７と特異的に結合する。ＴセルラインＴ５１か ら得た細胞を陰性対照として用いた。標的細胞を、細菌産生Ｌ６キメラＦａｂ、 ５ｐ２１０細胞で産生された無傷のし６キメラ抗体またはマウスの腹水から精製 されたマウス上６抗体と４°Ｃで３０分間インキニベーシヨンした。この後、Ｆ ａｂ検出用のＦＩＴＣｍ識ヤギ抗ヒト軽鎖抗体、キメラ抗体検出用のＦＩＴＣ標 識ヤギ抗ヒト免疫グロブリン、またはマウス抗体検出用のＦＩＴＣ標識ヤギ抗不 ズミ免疫グロブリンとインキ二ベーシ１ンした。コールタ−・モデルＥ　Ｐ　Ｉ 　Ｃ−Ｃ細胞ソーターを用いて、細胞表面に結合する抗体を測定した。
細菌産生Ｆａｂはまた、抗原陽性３３４７結腸癌細胞表面に対するＦＩＴＣ標識 マウスＬ６抗体の特徴的な結合阻害を呈する。細菌産生Ｆａｂおよび５ｐ２１０ 誘導キメラＬ６が似た結合阻害プロフィールを有するということは、細菌産生Ｆ ａｂおよび５ｐ２１０誘導牛メエシエリヒア・コリを宿主として用いることによ り、免疫グロブリンの機能的活性Ｆａｂ領域を製造し、これらをペリプラズミッ ク空間中および培養培地において分泌させる新規方法が開示されている。
この分子は、適切に組み立てられた抗体認識部位の予期される結合特性を呈する 。この技術を用いることにより、エシェリヒア・コリにおいて他の結合特異性を 有する抗体遺伝子を発現させることができる。
１、修飾抗体ｃＤＮＡクローンによりフードされる蛋白質は、シグナル配列を用 いて細菌から分泌され得る。
２．２種の抗体遺伝子が、ジシストロン・メツセージとして単一細菌性プロモー ターから発現され得る。
３．２種の外来蛋白質（この実施例では抗体軽鎖およびＦｄ）が、適切に組み立 てられ得、すなわち、細菌から分泌された場合、正確な二次、三次および四次構 造を呈する。
４、少なくとも２種、恐ら（は多くの細菌性プロモーターが、抗体遺伝子の発現 に使用され得る。
５、この実施例は、他の抗体値をコードする遺伝子がジシストロン・メツセージ として一緒に発現され得る一般的方法である。これらは、軽鎖およびＦｄ遺伝子 または軽鎖および無傷の重鎮遺伝子を含む。
６、プロモーターに関する遺伝子順序は、エシェリヒア・コリのＦａｂ産生能に おいて重要ではない。Ｆｄ遺伝子の後に軽鎖を構築した場合、逆の順序で遺伝子 を組織した場合と同じ機能を有する。
７、Ｆａｂは、エシェリヒア・コリから培養上清中に分泌され得、そこで、それ は安定しており、精製され得る。細胞質膜を通る大部分のＦａｂ鎖は、培養上溝 中に分泌される。
微生物寄託 サツカロミセス・セレビシエよりＢ５３１Ｃ（４１／４２−５）、Ｇ１８７は、 １９８７年７月９日ＡＴＣＣに寄託され、受は入れ番号２０８５６が与えられた 。エシェリヒア・コリＪＭ１０３（ｐＦＫｌ　０２１　ａｃｉ）、Ｇ１８６もま たそこに同じ日付で寄託され、受は入れ番号６７４５７が与えられた。両寄託は ブダペスト条約に基づくものであった。
第１３表 エシェリヒア・コリのペリプラズムから得られた軽鎖の定量ｎｆ／ｉρ（培養） プラスミド　−　＋ ｐＲＲ１７５００ ｐＲＲ１７７−８８，５１１ ｐＲＲ１８０３９９４１２ ｐＲＲ１９０２００２４１ ｐＲＲ１９１４６３７７２ ｐＦＫ１０１　３６　２８ ｐＦＫ１０２　６８　５５ ｐＦＫ１０３　３８　４５ ｐＦＫ１０４　９１　６８ エシェリヒア・コリＪＭ１０３またはＭＣ１０６１（結果は類似）を各プラスミ ドにより形質転換した。新鮮な形質転換体を３７°Ｃで○Ｄ６００＝０．８にＴ 　Ｙ　Ｅ中で培養した。培養物を分割し、誘導剤（Ｉ　ＰＴＧ）を０．２ミリモ ル〜１アリコートに加えたく−または÷ＩＰＴＧ）。細胞を３７℃で４時間生長 させた。ペリプラズミック蛋白質抽出物を調製し、アリコートを、ヤギ抗ヒト・ カッパ抗体を用いたＥＬＩＳＡにより軽鎖に関して試験した。各値は、少なくと も２つの独立した実験の平均である。抗体遺伝子に対する非暗号化配列５°およ び３゛両末端を除去すると、ペリプラズムにおける軽鎖の蓄積が増加した。
第１４表 銹導後の上清およびペリプラズムにおける軽鎖の蓄積上清　ペリプラズム プラスミド　誘導剤　４時間　２１時間　４時間　２１時間ｐＲＲ１９００ｎｄ 　２’ＯＯｎｄ ｐＲＲ１９０＋　５　１８８　２４１　ｎｄｐＦＫ］０２　１２　ｎｄ　６８　 ｎｄｐＦＫ１０２　÷　５７　８２８　５５　４０ｐＦＫ１０４　１３　ｎｄ　 ９１　ｎｄｐＦＫ１０４　＋　１５０　２９０　６８　３５ｐＦＫ１０２１ａｃ ｉ　−２５３６０５０１００ｐＦ　Ｋ　１０２１ａ、ｃｉ　÷　７２６０６　３ ７　４０ｐＩＴ１０４　１３　ｎｄ　１０　ｎｄｐＩＴ１０４　÷　１５０２１ ６　１９　３５プラスミドを含むエシェリヒア・コリ株を生長させ、調製し、第 １３表における記載と同様に検定した。ｐＲＲ１９０ＳｐＦＫ１０２、ｐＦＫ１ ０４およびｐＦ　Ｋ　１０２１ａｃｉについては、０．２ミリモルエＰＴＧによ り細胞を誘導した。１％アラビノースによりｐＩ　Ｔ　１０４を誘導した。各値 は、少なくとも２つの独立した実験の平均である。エシェリヒア・コリ培養上清 を分析するため、細菌を遠心分離により除去し、培養上清を０．４５μＭフィル ターに通した。値をｎ９／戚（培養）で表す。
ｎｄ＝測定されず。
第１５表 細菌性Ｆａｂの結合検定 結合割合＊ ３３４７細胞　Ｔ５１細胞 抗体　Ｌ６÷　Ｌ６− 標準マウスＬ６　９５　１ Ｓｐ２１０キメラＬ６　１１６　１ 細菌性Ｌ　６　Ｆ　ａｂ　５４　１ 標準Ｌ６Ｆａｂ　１６　１ ＊結合割合は、ＦＩＴＣフンジニゲート第二抗体で処理した対照試料と比べて、 試験試料の場合が何倍明るいかを示した数である。
マウス上６抗体の酵素消化により標準Ｌ　６　Ｆ　ａｂを調製した。
微生物 （寄託機関の名称） アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（寄託機関の住所） １２３０１　パークローン・ドライブ ロックビル、メリーランド２０８５２、アメリカ合衆国（寄託日）　（受は入れ 番号） １９８６年１０月２４日　ＨＢ９２４０（追加表示） ハイブリドーマＣ２５５（キメラム６抗体）ヨーロッパ特許がめられる指定国に 関して、寄託された微生物の試料は、ヨーロッパ特許の付与の告示が公表される まで、または出願が拒絶されもしくは取り下げられ、または取り下げられたとみ なされる日まで、その試料を要求する人により指定された専門家に対して前記試 料を供給する場合のみ利用可能である（規則２８（４，）ＥＰＣ）。
微生物 （寄託機関の名称） アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（寄託機関の住所） １２３０１　パークローン・ドライブ ロックビル、メリーランド２０８５２、アメリカ合衆国（寄託臼）　（受は入れ 番号） １９８６年１０月２４日　ＨＢ９２４１（追加表示） ハイブリドーマＣ２５６（キメラム６抗体）ヨーロッパ特許がめられる指定国に 関して、寄託された微生物の試料は、ヨーロッパ特許の付与の告示が公表される まで、または出願が拒絶されもしくは取り下げられ、または取り下げられたとみ なされる日まで、その試料を要求する人により指定された専門家に対して前記試 料を供給する場合のみ利用可能である（規則２８（４）ＥＰＣ）。
ＦＩＧ、　４ Ｃ８４３’ｕ７ ｂ、　ｃＤＮＡ　７Ｑ−７ヒイ Ｂ、Ｖぐ艷ぢ奴゛（」）−−／Ｌ−ギ艮＼めレンｈめとト＋３ｅｉ、不賢と仰フ Ｄ−二ンフにフタ−ＦＩＧ、６ 巳、ヒトＣＫ４史ぢて一７ｏ−二ンク′λ°クタークー％ｔεＡ二を頷ｙ−Ｃ４ １Ｊ畷　−Ｊニー８１１゜却−ヒト１．（，１ｆ、／４Ｈ−１，弧シＣ−℃Ｉ２ □□細ｎ ８７も／＋ ンシス！情臭Ｊ城９杉良−ｂｒ＄ｙｙ？−ｓ　棗　Ｋ　に　μｍに１　ｘａπい απｎｍＴｃ ＦＩＧ、７Ｂ ｃ−７ウス可蘭賽７コン？〉丈７７シイ７−マクズ咥ｊ受工乞７ンンｂ マシヌ華濠重灸Ｊどクンント コ７１−ンカ−７７；づＴ＝ｓ　ｔ＋ｚｃ−罠　ｃｃｃＡｃｃ　入Ａｃｃ＝丁　 ＣＡＣｐ、マウス１２久、ゴーと一７″”＋ンクンヨ／Ｚ〉イ２−り八２−＾” ”　３’　Ａｈａ）　Ｓ’ＦＩＧ、８ ＦＩＧ、　１０ 肝　託　的　的　とり　畦　化 ｅ（ ｉト　啄　晶　酩　狂　珪　錠 旅　韮　計　市　さコ　訃　啄 非　迷　晶　止　テ葺　井　２８ 止壬゛紡：すＦトξ畦″＝３駐＝龜士　韮ＨＥ■目゛詫晋り旧始＊ヨ３５肛弓ｔ 　韮詳旨菖酩　尿　庄　５ミ　■トＦ 鍔口非　沫　藷　的　５口　比 一← ＦＩＧ、　１Ｂ ＦＩＧ、１’４ ｐＭＶＨＣ２４ＡｐｏニーＢｏｒｎＨ１（ＣＨ）ＦＩＧ、　１５ Ｆｉｇ、Ｉ６ □τ−ム−ｄ＊２＞イ？− Ｆｉｇ、１７ａ ＦＩＧ、　１８ ＦＩＧ、２１ ９１？ｌ　ｓｅｒ　ｇｌｙ　ａｌａ　ｇｌｕ　ユｅｕ　ｖａｌ　ａｒｇ　ｐｒｏ 　ｇｌｙ　ａｌａ　ｓｅｒ　ｖａｌ　ユｙＥ　ｍｅｔ　＃ｅH　Ｃ’１Ｅ ＣＡＧ　ｔｅｘ　ＧＧＧ　ＣＣＴ　ＣＡに　Ｃ０Ｇ−ＣＴＣＡＣＣＣＣＴ　Ｇ＋ −Ｇ　ＧＣＣｊＣＡ　ＣＴＧ　入入Ｃ入τり７ＣＣ？ＧＣユγ寓　ｓｅ：　ｍｅ ｒ　ｍｅｒ　ｔｈ：　ａｌ；　ｔｙｒ　ｍｅｔ　９１ｒ＋　ｌｅｕ　ｍｔｒ　ｓ ｅｒ　ユｔｕ　ｔｈｒ　ｍｃｒ　ｑ＠磨@ａｓｐ ＡＪ−Ａ　ＴＣＣＴＣＣＡＣＣＡＣＡ　Ｇｅｅ　ＴＡＣＡＴＣＣＡＧ　ＣＴＣＡ ＧＣＡにＣＣＴＣＡＨＡ　７Ｇ丁Ｃ入＾　Ｃ入ＣＦ１α２２ ａｈａ　ｅｒｇ　ｐｈｅ　ｓｅｒ　ｇａｙ　ｓｅｒ　ｇｌｙ　ｓｅｔ　ｇａｙ　 ｓｈｒ　ｓｅｒ　ｔｙｒ　ｗｅ：　ユｅｕ　Ｌ’＋ｒ　ｉ）メ@５ｅ＝ ＣＣＴ　ＣＧＣ丁７ＣｋＧ丁　（−ＧＣＡにＴ　ＧＧＧ　ＴＣＴ　ＧＧＧ　ｋＣ ＣＴＣＴ　丁＾Ｃ丁Ｃ）　Ｃ丁ＣλＣ＾　入子ＣλＧＣｅｒｇ　ｖａｌ　ｇｌｕ 　ａｌｍ　ｇｌｕ　ａｌｐ　ａｈａ　ａｈａ　ｔａｒ　ｔｙｒ　ｔｙｒ　ｃｅｓ 　＋、Ｙ”、ｓｎ　ｔａｐ　ｓｉｒ@ｅｖｅ 入（：Ａ　ＣＴＧ　ＣＡＩ：　ＧＣ′Ｔ　（、ＡＡ　ＣＡＴ　（：ＣＴ　ＧＣＣ Ａｃ丁　？ＡＴ　ＴＡＣ”！ＧＣＣＡＣＣＡＣＷＧ　入Ｃ丁@７７］ ＦＩＧ、２３ ２）　Ｔ−４Ｐｏ１ Ｆｌ（”−、−２６ ＦＩＧ、２８ ＦＩＧ、　２９ ＦＩＧ、　３０ ＮＧ、３２ 寞戚繊に１にα眞編−Ｃ−僚μｌａ−ぽ黒４カ（心賀〜Ｉ−翫シの慣−ａＩπ弼 ムＦＩＧ、３３ 邊 ＦＩＧ、３４ ＦＩＧ、３５ ｐｌＮＧ１４４６ ＡＩ）ｔｅＩ ＦＸＧ、３７ ｎＧ、３Ｂ ００ｂｐ ＦＩＧ、　３９ ｎＧ、　４Ｑ 国際調査報告 １″″１°Ｉｔ＠ｍ　Ａ＊ｌ１ｉＣａｌｌｅｅ　ｓｏアヤ！７，８１１゜っヨ、 □

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 米国特許証により包含されることを意図する新規事項は、１．キメラ重鎖免疫グ ロブリンまたはそのフラグメントおよびキメラ軽鎖免疫グロブリンをコードして いるジシストロン転写単位と機能的に結合しているプロモータ領域を含有するポ リヌクレオチド分子。 ２．該プロモータが原核性である請求項１に記載の分子。 ３．キメラ重鎖および軽鎖が、別々にポリペプチド分泌シグナルをコードしてい る配列に機能的に結合している請求項１に記載の分子。 ４．ポリペプチド分泌シグナルと結合しているキメラ重鎖免疫グロブリン分子ま たはそのフラグメント。 ５．該フラグメントがＦｄフラグメントである請求項４に記載の分子。 ６．ポリペプチド分泌シグナルに結合しているキメラ軽鎖免疫グロブリン分子。 ７．該ポリペプチド分泌シグナルが原核性分泌に有用である請求項３、４または ６に記載の分子。 ８．該ポリペプチド分泌シグナルが真核性分泌に有用である請求項３、４または ６に記載の分子。 ９．該真核性分泌が酵母分泌である請求項８に記載の分子。 １０．該真核性分泌が真菌分泌である請求項８に記載の分子。 １１．キメラＦａｂ免疫グロブリン分子。 １２．キメラＦｄ免疫グロブリン分子。 １３．請求項４、５または６に記載の免疫グロブリン分子をコードしているポリ ヌクレオチド分子。 １４．請求項７に記載の免疫グロブリン分子をコードしているポリヌクレオチド 分子。 １５．請求項８に記載の免疫グロブリン分子をコードしているポリヌクレオチド 分子。 １６．請求項１１または１２に記載の免疫グロブリン分子をコードしているポリ ヌクレオチド分子。 １７．停止コドンまたはその下流に制限部位を含んでいるキメラ重鎖免疫グロブ リンのＦｄフラグメントをコードしているポリヌクレオチド分子。 １８．ヒト不変領域および非ヒト可変領域を有する免疫グロブリン重鎖のＦｄ部 を製造する方法であって、培養条件下で該Ｆｄ部を発現し得る宿主を培養し、該 培養から該重鎖の該Ｆｄ部を回収することからなる方法。 １９．ヒト不変領域および非ヒト可変領域をそれぞれ有する重鎖および軽鎖を含 んでいるキメラ免疫グロブリンのＦａｂ部を製造する方法であって、該重鎖、ま たは該軽鎖、若しくはその両者を発現し得る宿主を培養条件下で培養し、該培養 から該キメラ免疫グロブリン分子のＦａｂ部を回収することからなる方法。 ２０．該Ｆａｂフラグメントが該宿主から、完全にたたみ込まれ、会合した、機 能し得る形態で製造される請求項１９に記載の方法。 ２１．キメラ免疫グロブリンフラグメントとポリペプチドシグナル部分を含有す る融合遺伝子の製造方法であって、該ポリペプチドシグナル部分をコードしてい る遺伝子配列をキメラＦｄフラグメントをコードしている遺伝子配列に機能的に 結合させ、該融合遺伝子を宿主細胞中で発現させることからなる方法。 ２２．該宿主が原核性である請求項２１に記載の方法。 ２３．該宿主が真核性である請求項２１に記載の方法。 ２４．該宿主が酵母である請求項２１に記載の方法。
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