JPH04108390A

JPH04108390A - 動物細胞へ外来遺伝子の導入方法

Info

Publication number: JPH04108390A
Application number: JP2227619A
Authority: JP
Inventors: Yoji Niimoto; 洋士新本; Isahiro Kawasaki; 功博川崎; Kaoru Sato; 薫佐藤; Shunichi Dosemari; 俊一堂迫
Original assignee: Snow Brand Milk Products Co Ltd
Current assignee: Snow Brand Milk Products Co Ltd
Priority date: 1990-08-29
Filing date: 1990-08-29
Publication date: 1992-04-09

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】本発明は遺伝子組換技術において必須操作の一つである
動物細胞内に外来遺伝子を導入する方法に関する。

〔従来の技術〕

動物細胞の遺伝子組換技術では、対象とする細胞に、い
かにして外来遺伝子を導入するかが課題である。外来の
遺伝子導入方法としては以下の方法が採用されている。

■　リン酸カルシウムゲル沈澱法 ■　ＤＥＡＥ−デキストラン法 ■　ＤＮＡ封入赤血球ゴースト法 ■　ＤＮＡマイクロインジェクション法、プリツキフグ
法 ■　電気パルス穿孔法 ■　遺伝子銃法これらの外来遺伝子導入方法は遺伝子を導入する宿主細
胞に傷害を与えることが指摘される。特Ｓこ接着性の細
胞の場合二二は困難な場合もある。ま１こ条件乙こよっ
ては、導入効率が悪いなどの欠点も有している。

一方Ｂｉｒｎｓｔｉｅｌらは、血清中の鉄結合蛋白質で
あるトランスフェリンにＤＮＡ結合性を有するボリンン
やプロタミンをコンジュゲートさせ、このコンジュゲー
トを外来遺伝子のキャリアーとして使用し、トランスフ
ェリンレセプターを介し、鳥由来ＨＤ３細胞や、ヒト白
血病細胞株に一５６２細胞へ外来遺伝子を導入できるこ
とを報告している（Ｂｉｒｎｓｔｉｅｌ他Ｐｒｏｃ、　
Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ｌＪ、ｓ、Ａ。

Ｖｏｌ、８７．３４１０〜３４１４．同３６５５〜３６
５９　、同４０３３〜４０３７頁、　１９９０）。この
方法によれば細胞に特に大きなストレスも与えずに外来
遺伝子を導入することが可能となる。しかし、トランス
フェリンレセプターを介しての細胞内への遺伝子導入で
あり、トランスフェリンレセプターの発現していない細
胞には採用できない。またトランスフェリンをキャリア
ーとして使用するために、ＤＮＡに親和性を有するポリ
リシンやプロタミンなとのコン７・ユケトとすることが
必要である。また重工細胞への遺伝子導入の効率は、細
胞表面Ｑこ発現′、−ているトランスフェリンレセプタ
ーの数により左右され、トランスフェリンレセプターの
数を増すため銖キレート剤による処理が必要である（Ｂ
ｉｒｎｓｔｉｅｌ他Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、
　Ｓｃｉ、　Ｖｏｌ、　８７　４０３３〜４０３７１９
９０）。

〔発明が解決しようとする課題］本発明者らは、トランスフェリンと同様鉄結合性を有す
る外分泌性蛋白質ラクトフェリンについて研究を進めた
結果ラクトフェリンは、トランスフェリンと異った特性
を有しており外来遺伝子の細胞への導入用キャリアーと
して使用可能であることを見出し本発明を完成するにい
たった。

従って本発明は、ラクトフェリンをキャリアーとして外
来性ＤＮＡを動物細胞に導入する方法に関する。

［課題を解決するための手段］本発明者らは、これまでラクトフェリンの特性について
検討を進めた結果、ラクトフェリンは、トランスフェリ
ンレセプターの発現していない細胞にも強い親和性を有
し、さらにこの親和性はラクトフェリンのアミノ基をグ
アニジル化やアミジン化のような化学修飾を行うことに
より増強されることを確認し、特許出願を行っている（
特願平１−２９３６７号）。又、ラクトフェリンは、Ｄ
ＮＡに対し親和性を有することが知られている（Ｒ，Ｍ
、Ｂｅｎｎｅｔ、を他Ｊ、　Ｌａｂ、　Ｃ１ｎ、　Ｍｅ
ｄ、　Ｖｏｌ、９９１２７〜１３８．１９８２）。

本発明においてはラクトフェリンのこのような細胞親和
性およびＤＮＡ親和性を最大限利用し、細胞内へ外来遺
伝子を導入する方法を提供するものである。

本発明において用いるラクトフェリンは、哺乳動物の乳
由来あるいは唾液等の体液さらには、遺伝子組換により
生産された人工のラクトフェリン、アミノ酸配列の一部
を改変したもの等も使用可能である。またラクトフェリ
ンの天然型は糖鎖を有しているが糖鎖のないものも使用
可能である。

般的には、ヒト、牛などの乳由来のラクトフェリンを使
用することが入手しやすさの面から推奨できる。

ラクトフェリンは入手したままの構造のものでも良いが
細胞親和性を向上させるために、化学修飾をすることが
好ましい。化学修飾はラクトフェリンの立体構造や活性
に大きな影響を与えず、かつ、ラクトフェリン蛋白質の
塩基性を高める方法であればどのような修飾方法でも良
い。一般的にはラクトフェリンの遊離アミノ基に対し、
グアニジル化、アセチミジル化などの化学修飾を行う方
法、或いはアルギニンオリゴマー、リジンオリゴマー、
オルニチンオリゴマーなど塩基性アミノ酸を含有するペ
プチド、またはスペルミン、スペルミジンなどのポリア
ミン、ヒストン、プロタミンなど塩基性蛋白質の酵素分
解ペプチドを共有結合させる方法などが挙げられる。

アミン基の化学修飾と共有結合による塩基性ペプチドな
どの導入を比較した場合、ＤＮＡとの親和性は、共有結
合による塩基性ペプチドなどの導入が好ましい。塩基性
ペプチドやポリアミンなどを共有結合させるためにはカ
ルボジイミド類の縮合剤を用いる方法、酸クロライド法
、活性エステル法など公知の方法で、結合させる分子の
カルボキシル基やラクトフェリンのカルボキシル基を活
性化させて結合させる方法、あるいはゲルタールアルデ
ヒドなどのような公知の架橋試薬を用いてラクトフェリ
ンと塩基性ペプチド、ポリアミンなどとを結合させる方
法などが例示できる。これらの方法を用いる場合には、
ラクトフェリン蛋白質の変性や重合をひきおこさないよ
うな条件を選択することが必要である。特にラクトフェ
リンの変性や重合をおこさない修飾方法として活性エス
テル法が推奨される。活性エステル法では修飾分子中に
カルボキシル基が必要であるが下記（１）に示す反応式
の様に無水コハク酸など無水ジカルボン酸を用いアミ、
ノ基にカルボキシル基を導入Ｌ、このカルボキシル基と
反応させることもできる。

一−−→　Ｒ−ＮＨ−Ｃ−ＣＨ２ＣＨ２・Ｃ−０１（（
１）またラクトフェリンに導入するペプチドやポリアミ
ン、分子中の反応に関与しないアミノ基はあらかしめ、
保護基をつけておき、修飾後除去することが必要である
。アミノ保護基としては、ヘンシルオキシカルボニル基
（Ｚ基）、第三ブチルオキシカルボニル基（Ｂｏｃ基）
、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル基（Ｆｍｏ
ｃｉ）　、メチルスルホニルエチルオキシカルボニル基
（Ｍｓｏｃ基）などを例示できる。

活性エステルによるラクトフェリンの修飾反応は下記式
（ＩＩ）の反応により行なわれる。

サクシミル−カーボネート一一−ブ　ＨＯＯＣ−Ｒ，−（−Ｎｉ１Ｍ５ｏｃ）＋Ｉ
（Ｏ３ｕＮヒドロキシコハク酸イミド一□　５ｕＯＯＣ−Ｒ＋＋　ＮＨ−Ｍｓｏｃ）　＋　Ｒ
ｚ−ＮＨｚラクトフェリンー−−→Ｒ２−ＮＨＯＣ−Ｒ＋−（−ＮＨ−Ｍｓｏｃ）
　　　−−一→ＨＩＩＲ２−ＮＨＣＯ〜Ｒ＋−Ｎｌ（ｚ　　　（ＩＩ　）修飾
ラクトフェリンこのようにして得た修飾ラクトフェリン、もしくはラク
トフェリンはあらかじめ調製した緩衝液に溶解し、さら
に導入する遺伝子をラクトフェリン量の０．１〜１０重
量％を加え、ゆるやかに撹拌混合し、次いで３７°Ｃで
１時間〜２４時間静置し、ＤＮＡラクトフェリン複合体
を生成させる。このようにして得られたＤＮＡラクトフ
ェリン複合体を含む緩衝液を導入しようとする細胞をあ
らかじめ培養した培養液中に、培養液に対し０．１〜１
０容量％を添加し、１〜３日間培養を継続する。ＤＮＡ
は、細胞表面にラクトフェリンを介して付着し、細胞内
へとりこまれる。細胞内へのとりこみは、ファゴサイト
ーシスやビノサイトーンスなどのエンドサイト−シスに
よるものと推定される。導入する遺伝子には、選択可能
なマーカーを付与しておくことにより、培養終了後の遺
伝子導入細胞を容易に選択し得る。−船釣には、Ｇ４１
８耐性遺伝子（ｎｅｏ）、ミコフェノール酸耐性遺伝子
（ｇｐｔ）　、ヒドロキシフオレートレダクターゼ遺伝
子（ＤＨＰＲ）などを例示できる。

ＤＮＡを導入後は、選択用の薬剤を添加した培地に交換
して３〜８週間培養し、生残細胞を遺伝子が導入された
細胞として得ることができる。

以下に実施例を示し本発明をさらに詳細に説明する。

実施例１本実施例においてはラクトフェリンの修飾について説明
する。

＜１−１＞グアニジル化ラクトフェリンの調整人乳より
ジャーナル・オプ・デイリーサイエンス７０巻、７５２
〜７５９頁（１９８７年）に開示された抗ヒトラクトフ
エリンモノクローナル抗体アフィニティーカラムを用い
、ヒトラクトフェリンを調製し１こ。脱脂した人乳を抗
ヒトラクトフエリンモノクロルナル抗体アフィニティー
カラムに負荷し、その後ｐ　Ｈ７，３のリン酸緩衝佳理
食塩水（ＰＢＳ）で洗浄した。さらにｏ、ｌｓｈの食塩
を含むｐ　Ｈ３，７の０．２釘酢酸ナトリウム緩衝液で
ヒトラクトフェリンを溶出し、ｐＨを中性付近に調整し
た後脱イオン水に対し３日間透析し、さらに凍結乾燥に
よりヒトラクトフェリンを得た。このヒトラクトフェリ
ン５＋ｎｇを、０．５Ｍｏ−メチルイソ尿素Ｎａ０１（
−１４ｚｓＯａからなるｐＨ１０の緩衝液１雌中に加え
、Ｏ〜４　”Ｃで１９時間ゆっくり撹拌した。その後、
０．５Ｎ塩酸を数ｇ加えｐＨを５〜７として反応を停止
させた。さらに、ＰＢＳに対し０°Ｃないし室温で３日
間透析した。得られたグアニジル化ヒトラクトフェリン
をアミノ酸分析した結果ヒトラクトフェリンのアミン基
の８７％がグアニジル化されていることが確認された。

ｄ−２＞アセチミシＪし化ヒトラクトフェリンの５周製
実施例１−１で調製したｈＬｆ　６■を０．２５Ｍ　＋
（：１ＢＯ１ｌＫＣｆｆ　　ＮａＯＨ１Ｎ衝１ｆ（ｐＨ
９，０）　０．５ｍｆ２’、二？容かし、これにメチル
アセトイミデート塩酸塩４６．８ｍｇ、４Ｎ　ＮａＯＨ
０，０６ｍＮを加え、室温で２時間反応させた。反応後
０．５Ｎ　Ｈ（＃で反応液のｐＨを７．０に調製し４°
ＣてＰＢＳ　（ｐＨ７，３）に対し３日間透析し目的の
アセナミジル化ヒトラクトフェリンＰＢＳ　溶液を得た
。

＜１−３＞スペルミン化ヒトラクトフェリンの調製スペ
ルミン４塩酸塩３４８■（１ｍｍｏｆ）をジメチルホル
ムアミド頁ＤＭＦ）３ｍｌに溶かし、水冷下トリエチル
アミン（Ｅｔ、Ｎ）　０．１４−を加えた。これに２−
（メチルスルホニル）・エチル−Ｎ−サクシミジル・カ
ーボネー）　（Ｍｓｏｃ　０Ｓｕ）　１３３Ｍ（０，５
ｍ　ｍｏｆ）を加え、室温で８時間撹拌した。これにさ
らに無水コハク酸５０■（０，５当量）を加え室温で８
時間撹拌した。これに１−エチル−３−（３−ジメチル
アミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ−１（
Ｃｆｆｉ　）９５■（０，５ｍ　ｍｏｆ）を加え室温で
８時間撹拌後反応液を減圧濃縮し、残渣として目的の化
学修飾試薬を得た。この残渣を適当量の水に熔かし、こ
のスペルミン誘導体溶液を０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐ）
１７．８＞中、実施例１−１で得たヒトラクトフェリン
１分子に対し２００当量又は１０００当量となるよう加
え０〜１０°Ｃで１２時間撹拌し反応させた。反応終了
後、０．ト水酸化ナトリウムでｐＨを１２に調製し、そ
の後ただちに０，１Ｍ塩酸でｐＨを５〜７にすることで
Ｍｓｏｃ基を除去した。さらにｐＨ７，３のＰＢＳ　！
こ対し３日間透析し遊離の修飾剤を除去し、スペルミン
化ヒトラクトフェリンのＰＢＳ　ｉｇ液を得た。

＜１−４＞スペルミジン化ヒトラクトフェリンの調製ス
ペルミジン３塩酸塩１５５■（１ｍｍｏｊ２）を用い、
実施例１−３の場合と同様にしてスペルミジン化ヒトラ
クトフェリンのＰＢＳ溶液を得た。

＜１−５＞アルギニン含有ペプチド導入ラクトフェリン
の調製通常の化学合成法にて、次の一般式で表わされるペプチ
ドを合成した。

Ｍｓｏｃ−Ｇｌｙ　＋Ａｒｇ　＋、１Ｇｌｙ−Ｏ５ｕ実
施例１−１で調製したヒトラクトフェリンを０．１Ｍ　
ＩＪン酸緩衝液（ｐＨ７，８）に熔解し、これに上記ペ
プチ）”ｎ＝２．４．６についてそれぞれヒトラクトフ
ェリン１分子に対し２００当量又は１０００当量となる
よう加え、０−１０’Ｃで１２時間撹拌し、反応させた
。反応終了後、０．１Ｍ水酸化ナトリウムでｐＨを１２
に調製し、その後ただちに０，１Ｍ塩酸でｐＨを５〜７
にすることでＭｓｏｃ基を除去した。さらにｐ　Ｈ７，
３のＰＢＳに対し３日間透析し遊離の修飾剤を除去しア
ルギニン含有ペプチド導入ラクトフェリンのＰＢＳ溶液
を得た。修飾率はアミノ酸分析により決定した。またウ
シラクトフェリンについても同様な方法で、アルギニン
含有ペプチドを導入した。調製した化学修飾ラクトフェ
リンの修飾率を第１表に示した。

＊ＩＬｆ１分子あたりの当量数＊２　ｔ、ｒｔ分子あたりに導入されたペプチドの数＜
１−６＞　リジン含有ペプチド導入ラクトフェリンの調
製通常の化学合成法にて次の一般式で表わされるペプチド
を合成した。

Ｍｓｏｃ−Ｇｌｙ　＋Ｌｙｓ（Ｍｓｏｃ）　＋ａ　Ｇｌ
ｙ　・ＯＳｕこのペプチドｎ＝２．４．６について実施
例１−５と同様にしてリジン含有ペプチドを導入したラ
クトフェリンを調製した。調製した化学修飾ラクト様に
してヒスチジン含有ペプチドを導入したラクトフェリン
を調製した。調製した化学修飾ラクトフェリンの修飾率
を第３表に示す。

ウシ　　　１０００　　　　　９．３＊１　ラクトフェリン１分子あたりの当量数＊２　ラク
トフェリン１分子あたりに導入されたペプチドの数＜１−８＞リジン・アルギニンをともに含有するペプチ
ドを導入したラクトフェリンの調製通常の化学合成法にて次の一般式で表わされるペプチド
を合成した。

Ｍｓｏｃ＋Ｌｙｓ（Ｍｓｏｃ）　Ａｒｇ＋、　ＨＯＳｕ
このペプチドｎ＝１．２．３について実施例１−５と同
様にしてこのリジン・アルギニン含有ペプチフェリンの
修飾率を第２表に示した。

ペプチド当量°１ペプチドの量りウシ１０．６ウシ　　　　１０００　　　　　９．８ウシ　　　　１
０００　　　　１３．２＊ｌ　ラクトフェリン１分子あ
たりの当量数＊２　ラクトフェリン１分子あたりに導入
されたペプチドの数ｄ−７＞ヒスチジン含有ペプチド導入ラクトフェリンの
調製通常の化学合成法にて次の一般式で表わされるペプチド
を合成した。

Ｍｓｏｃ−Ｇｌｙ−Ｈ（ｉｓ＋１ｌＧｌｙ　・ＯＳｕこ
のペプチドのｎ＝４について実施例１−５と同ドを導入
したラクトフェリンを調製した。調製した化学修飾ラク
トフェリンの修飾率を第４表に示した。

ウシ２２．２ウシ１２．６ウシ　　　　１０００　　　　　　１１．９＊ｌ　ラク
トフェリン１分子あたりの当量数＊２　ラクトフェリン
１分子あたりに導入されたペプチドの数実施例２本実施例においては、実施例１で得た修飾ラクトフェリ
ンおよびヒト、牛ラクトフェリンを用い１こ外来遺伝子
の動物細胞への導入例を示す。

＜２−１＞ヒト−ヒトハイブリドーマ９Ｐ−１３−２へのラクトフ
ェリンを用いたｐＳＶ２ｎｅｏあるいはｐｓＶ２ｇｌ）
を遺伝子の導入（１）細胞１０％ＦＣ５を含むＥＲＤＦ培地（極東）て継代培養し
たヒト−ヒトハイブリトーマ９Ｐ−１３−２をホストに
用いた。

（ｉｉ）遺伝子導入する遺伝子はジエネティシン（Ｇ４１Ｂ）耐性遺伝
子（ｎｅｏ）を持つｐＳＶ２ｎｅｏ　　［５ｏｎｔｈｅ
ｒｎ、　ＢｅｒｇＪ、　Ｍｏ１．＾ｐｐ１．　Ｇｅｎｅ
ｔｉｃｓ、土、　３２７〜３４１　（１９Ｂ２）：１あ
るいは、ミコフェノール酸耐性遺伝子軸ｐｔ）を持つｐ
ＳＶ２ｇｐｔ　（Ｍｕｌｌｉｇａｎ、　Ｂｅｒｇ、　Ｐ
ｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　７８　、２０７２〜２０７６　（
１９８１）　）を用いた。

それぞれのプラスミドは大腸菌に導入し、アンピシリン
耐性クローンを取得後、これを増殖させた。

常法にしたがって大腸菌からＤＮＡを抽出し、セシウム
クロライド密度勾配遠心法によってプラスミドＤＮＡを
精製した。

（ｉｉｉ）　ＤＮＡ−ラクトフェリン複合体の調製プラ
スミドＤＮＡを、最終的に０．２５Ｍマンニトール、１
０ｍ１エチレンジアミン４酢酸を含む２ｍＭ）リス塩酸
緩衝液（ｐ）１７．４）に、５０μｇｅｍ１の濃度で溶
解した。

この溶液に、ラクトフェリンあるいは実施例】−１から
１〜６で調製した修飾ラクトフェリンを１　ｍｇ／−の
濃度になるように加え、３７℃で１時間静置後、これを
ＤＮ＾−ラクトフェリン複合体として、使用まで一８０
゛Ｃに保存した。

（ｉｖ）遺伝子導入Ｉ　Ｘ　１０７の９Ｐ−１３−２を、１０％ＦＣ５含有
ＥＲＤＦ培地４０ｄに浮遊させ、ここにｐＳＶ２ｎｅｏ
　５０μｇとラクトフェリン１■の複合体、あるいはｐ
ｓＶ２ｇｐｔ　５０μｇとラクトフェリン１■の複合体
を加えてよく混合し、９６穴マイクロカルチヤープレー
ト（フアシヨン３０７２）に１００ｕ１．づつまき込ん
だ。３７°Ｃで２日間培養後、ｐＳＶ２ｎｅｏは２ｍｇ
／ｄのＧ４１８　（ジｘ’Ａティシフ）　、ｐＳＶ２ｇ
ｐｔは２ｔ１ｇ／ｍ１のミコフェノール酸および２５０
　μｇｏｄのキサンチンを含む培地を添加して、選択培
養を開始した。

培養３〜８週の間に増殖した形質転換細胞が出現したウ
ェル（穴）数を算出した。

この結果を第５表に示す。ｐＳＶ２ｎｅｏ　、　ｐＳＶ
２ｇｐ　ｔともに、ラクトフェリンによって効率的に細
胞（９ｐ１３−２）に導入された。

特に修飾ラクトフェリンでは、形質転換ウェルの出現数
が未修飾のラクトフェリンの最高３倍にも達した。

第　　５　　表＜２−２＞ヒト正常線維芽細胞−Ｉ−３８へのラクトフェリンを用
いたｐＳＶ２ｎｅｏ遺伝子の導入（ｉ）細胞Ｗｌ−３８は大日本製薬■より入手し、１０％ＦＣ３を
含むＥＲ叶で培養した。細胞の継代はトリプシン処理し
た細胞を、ファルコン３００３シャーレに１：４の希釈
でまき込むことによって行なった。

（１１）遺伝子実施例３−１　と同しｐＳＶ２ｎｅｏを用いた。

（１１）遺伝子導入継代、２日目のン＋−レにｐＳＶ２ｎｅｏ　　１０μｇ
とラクトフェリンの複合体を加えて２日間培養した後、
２■／ｄの６４１８を含む培地に変換して選択培養を行
なった。同一試料につき、シャーレ２枚を用い、４週間
後に増殖したコロニー数を計測した。

第６表に示すように、ｐＳＶ２ｎｅｏは、ラクトフェリ
ンによって効率的に罰−３８に導入された。

第６表：参考例〕本考案例においては実施例１で得た修飾ラクトフェリン
の細胞親和性増強効果のｉ！認試験の結果を示す。細胞
親和性の増強により、ＤＮＡの導入効率が上昇すると考
えられる。

（１）　　リバースプラークアッセイ法による修飾ヒト
ラクトフェリン細胞親和性の測定健康な成人男子未稍血より採取したリンパ球に対する修
飾ヒトラクトフェリンの親和性を測定した。

リンパ球を常法に従ってｌＸｌ０’個／ｄとなるように
１０％ＦＣ５を含むＲＰＭ１１６４０培地に浮遊させ、
５０μｇのヒトラクトフェリン又は実施例１で得られた
ヒトラクトフェリンを添加して３７°Ｃ１５％Ｃ０□９
５％空気、湿度９０％以上の雰囲気下で４日間培養した
。ペプチド修飾ラクトフェリンについては、いずれもラ
クトフェリン１当量当り１００当量のペプチドを反応さ
せたものである。

次いでハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）で２回リンパ球を洗
浄後、さらにＨＢＳＳに所定細胞数になるように分散さ
せた。次いで０．０５％（Ｗ／Ｖ）　ＤＥＡＥ−デキス
トランを含む０．５％（Ｗ／Ｖ）寒天溶液３００μｌ、
３０％（Ｖ／Ｖ）−スタフィロコッカス−プロティンＡ
結合ヒツジ赤血球２００μ！、リンパ球分散液１００μ
ｌ、モルモット補体２０μ！および希釈した抗ヒトラク
トフエリン抗血清（ダコ社製）２０μ！を混合してプラ
スチックシャーレ（１５Ｘ１００ｍ、ファルコン１００
１）に注いだ。

ゲル化後、３７°Ｃ１３〜４時間インキュベートした後
、形成したプラーク数をカウントした。

この結果を、第７表に示す。第７表にみられるように、
ヒトラクトフェリンに導入したアルギニン含有ペプチド
が長鎖になるほどプラーク数は増加した。未修飾のヒト
ラクトフェリンに対し、Ｇｌｙ＋Ａｒｇ＋ａＧｌｙを導
入したヒトラクトフェリンのプラーク数は約３倍高いも
のであり、グアニジル化、アセチミジル化は、プラーク
数を５割程度増加させた。

これに対してスペルミン化、スペルミジン化ラクトフェ
リンはＧｌｙ　＋Ａｒｇ　４６Ｇｌｙと同等の、未修飾
ラクトフェリンの３倍以上のプラーク数を与え、細胞と
の親和性が高まっていた。

（２）　　リバースプラークアッセイ法による修飾ウシ
ラクトフェリンの細胞親和性の測定本参考例においてヒト−ヒトバイプリドーマ９Ｐ−１３
−２に対する修飾ウシラクトフェリンの親和性を測定し
た。まず９Ｐ−１３〜２に細胞をｌＸｌ０’個／ｄとな
るように調製し、５０μｇのウシラクトフェリンまたは
修飾ウシラクトフェリン実施例１−５を添加して４日間
培養した。抗ウシラクトフェリン血清を用いたリバース
プラークアッセイは実施例２−１　と同様にしてプラス
チックシャーレに注ぎゲル化させた。３７°Ｃ１３〜４
時間インキュベートした後、形成したプラーク数をカウ
ントした。

えず外来遺伝子を導入することができる。また遺伝子操
作を容易に行うことができる。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）動物細胞へ外来遺伝子を導入するに当り、導入し
ようとする目的遺伝子とラクトフェリンとの複合体を動
物細胞の培養液中に加えて静置し、細胞内に取りこませ
ることを特徴とする動物細胞に外来遺伝子を導入する方
法。
（２）ラクトフェリンが天然型である請求項（１）記載
の外来遺伝子を動物細胞に導入する方法。
（３）ラクトフェリンが修飾されたラクトフェリンであ
る請求項（１）記載の外来遺伝子を動物細胞に導入する
方法。
（４）目的遺伝子とラクトフェリンとの複合体が緩衝液
中に目的遺伝子とラクトフェリンを溶解し、静置後遺伝
子−ラクトフェリン結合体としたものである請求項（１
）〜（３）のいずれかに記載の外来遺伝子を動物細胞に
導入する方法。