JPH0284402A - 平滑筋細胞増殖抑制因子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、平滑筋細胞増殖抑制因子およびグリコサミノ
グリカンに関する。

〔従来技術およびその課題〕

平滑筋細胞は、胃、腸および血管の壁のような組織の遅
く且つ長持続性のく骨格筋と比較して）収縮を生じさせ
ることのできる分化された筋細胞である。例えば、正常
な動脈壁は、動脈の管腔に沿って並んでいる内皮細胞の
単一連続層、単層（小動脈中など）または多重層板（弾
性動脈中など）において配列された平滑筋細胞、並びに
コラーゲン束、弾性繊維、平滑筋細胞および線維芽細抱
から成る外側の外膜から成る。

この定義された動脈構造の維持が、重要な健康問題であ
る。動脈硬化症の初期病因論において内皮細胞の損傷後
の平滑筋細胞の増殖が重要な段階であると仮定されてい
る（ＲｏｓｓおよびＧｌｏｍｓｅｔ。

抗凝血性ヘパリン（ＣｌｏｗｅｓおよびＫａｒｎｏｖｓ
ｋｙ、　Ｎａｔｕｒｅ（１９７７）２６５　：　６２５
−６２６Ｅおよび非−抗凝血性へパリ：／　（Ｇｕｙｔ
ｏｎら、Ｃ１ｒｃ、Ｒｅｓ、（１９８０）４６　：６２
５−６３４　〕についての平滑筋細胞増殖抑制活性を示
している。

同じ研究室からのより最近の研究は、血管の平滑筋細胞
の増殖の抑制に必須であると思われるヘパリンの種々の
構造を検討している。例えば、Ｃａ５ｔｅｌｌｏｔら、
Ｊ、Ｃｅ１ｌ　Ｐｈｙｓｉｏｌ、（１９８４）■２０：
３１５−３２０を参照のこと。内皮細胞により計画的に
分泌される平滑筋細胞増殖のヘパリン様抑制因子もまた
報告されている。例えば、Ｃａ５ｔｅｌｌｏｔ　ら、Ｊ
、Ｃｅ１ｌＢｉａ１．　（１９８１）９０　：　３７２
−３７９を参照のこと。

しかしながら、本発明者らの研究室での研究は、以前の
研究に使われたヘパリン分子が平滑筋細胞の増殖を調節
する天然分子ではないように思われ、従って療法的使用
にとって最適な分子を表わさないだろうことを示した。

従って、追加の平滑筋細胞増殖抑制因子およびそれらを
得る方法が、医学的および生化学的研究の望ましいゴー
ルを指摘し続けている。

〔課題を解決するための手段〕

従って、本発明は、実質的に純粋なグリコサミノグリカ
ンまたはヘパラン硫酸プロテオグリカンを含んで成る、
内皮由来の平滑筋細胞増殖抑制因子を提供する。この抑
制因子は、平滑筋細胞増殖抑制活性を有し、そして１．
４ｇ／ｍｌよりも少ない浮遊密度を有するヘパラン硫酸
プロテオグリカンの全部または一部として内皮細胞−順
化培地から単離され、そしてこれはプロテアーゼ分解に
より約５５．０００〜７５．０００の分子量を有するグ
リコサミノグリカン鎖を放出する。本発明の抑制因子は
、完全なプロテオグリカンとして、完全なグリコサミノ
グリカン鎮として、または抑制活性を維持している断片
として提出され得る。本発明はまた、この内皮由来のプ
ロテオグリカンおよびグリコサミノグリカンを単離する
ための方法を含んで成り、この中で重要な段階は、該グ
リコサミノグリカン（プロテオグリカンとして）を単離
することになっている培地に、透析可能な洗浄剤を添加
することを含んで成る。

〔具体的な説明〕

本発明は、内皮細胞−順化培地が培養液中の平滑筋細胞
の増殖を抑制できることを示す研究の中から一部分生起
した。さらなる研究は、該活性因子が内皮細胞により分
泌されるヘパラン硫酸プロテオグリカンから単離可能な
グリコサミノグリカンであることを示した。該プロテオ
グリカンは、プロテアーゼ開裂にかけた時、サイズ排除
クロマトグラフィーにより測定すると約５５．０００〜
７５．０００、普通的６０．０００〜約７０．０００の
分子量を有するグリコサミノグリカン鎖を放出する。こ
れらの最初に放出される鎖は、本明細書においては“グ
リコサミノグリカン鎮°と称され、前記プロテオグリカ
ンから放出される゛ような完全なグリコサミノグリカン
鎖であることもでき又は平滑筋増殖抑制活性を有する該
グリコサミノグリカン鎖の断片であることもできる、本
発明の活性な“グリコサミノグリカン”に対する広い言
及とは区別される。最初に放出されるグリコサミノグリ
カン鎖から抑制活性を保持している小断片への開裂は、
グリコサミノグリカン鎮中に見つかるサブユニットの繰
り返し性質のために容易に達成される。

本明細書中に後述される精製法は１、種々の源からの内
皮細胞の培養物から得られた内皮細胞−順化培地からの
本発明の抑制因子の精製を可能にする。内皮細胞は、典
型的には哺乳類（特に霊長類）であり、そしてしばしば
ヒト、ブタ、ウシ、ヒツジ、ウサギ、ラット、マウスま
たはサルの内皮細胞である。該細胞は、内皮細胞を含む
いずれの組織または器官からでも得ることができる。内
皮細胞に富む組織および器官、例えば血管および肺は、
好ましい源である。該細胞は、起点の動物から直接得て
もよく　（典型的には屠殺場から）、または組織−もし
くは細胞−培養系の培養後に使用してもよい。例えば、
満期近＜　（ｎｅａｒ−ｔｅｒｍ）のウシ胎児の肺動脈
から培養された内皮細胞は、内皮細胞の有用な源である
。長期細胞培養のための内皮細胞は、様々な出所、例え
ばｔｈｅ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　ＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅ
　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ、　　Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、　
Ｍａｒｙｌａｎｄから商業的に人手可能である。

内皮細胞は、それらの増殖を支持することのできる培地
中で培養される。多数の適切な培地が科学文献中に論じ
られており、一方性のものは商業的に入手可能である。

内皮細胞の増殖に適する市販の培地の例は、ダルベツコ
改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）　；イーグル最少培地（
Ｍ［ＥＭ　；典型的には血清補充を伴って使われる）；
ハムのＦＩＯ，Ｆ１２．　Ｆ１２Ｍ、　Ｆ１２Ｋ。

およびＭＣＤＢｌｏｌ−１０４；並びにＭＣＤＢ１０７
を包含する。

通常、標準培地は血清タンパク質源、典型的には１０％
ウシ胎児血清（Ｆｅ２）が補充される。培養条件は、通
常３７℃にて９５％空気および５％二酸化炭素の湿潤雰
囲気を提供する。細胞培養は普通、繁殖期および維持期
の２段階で起こる。いずれかの増殖培地の適合または細
胞培養物の繁殖のための改変は、まばらにプレートされ
た（５，０００〜２５．０００細胞数／ｃｒｌ）内皮細
胞の増殖を支持する能力の比較により確かめることがで
きる。適切な培地は、典型的な“丸石（ｃｏｂｂｌｅｓ
ｔｏｎｅ）　”表現型の維持を可能にし［５ｔｒｉｋｅ
ら、Ｍｅｔｈｏｄ　ｉｎ　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌｏｇｙ（
１９８０）２１Ａ　：　１３５−１５１中に記載〕、そ
こで該細胞は密接な隣接付着を有しそして単層において
のみ存在する。最適な培地は、培養がコンフルエンスに
達した後、少なくとも２週間の間この表面型の維持を許
容する。順化培地は、該培地中の抑制因子の濃度を増加
させるために、普通少なくとも２４時間、好ましくは７
２時間の間のコンフルエント細胞の維持に利用されてい
るものである。

増殖抑制因子は、サイズ排除クロマトグラフィーにより
測定すると、典型的には約１０５〜１０７、普通約５Ｘ
１０’〜約２×１０６、特に約１０８の分子量、および
少なくとも１．４ｇ／ｍｊ！、普通約１．３ｇ／ｍｌの
浮遊密度を有するヘパラン硫酸プロテオグリカンとして
、内皮細胞−順化培地中に存在する。

該プロテオグリカンは、その分子のタンパク質部分を開
裂するプロテアーゼ酵素により破壊されない、平滑筋細
胞増殖抑制活性を示す。プロテアーゼ開裂は、約５５．
０００〜７５．０００、普通約６０．０００〜７０、０
００の分子量を有し該増殖抑制活性を有するグリコサミ
ノグリカン鎖を放出する。該プロテオグリカンは、基底
膜のヘパラン硫酸プロテオグリカンのタンパク質エピト
ープに対して特異的な結合親和性を有する抗体と特異的
に結合し、このことは、そのような分子との構造類似性
を示す。例えば、エンゲルブレスーホルムースワー、ｂ
（ＥｆｌＳ）ｆｉ瘍により生産される基本型の基底膜ヘ
パラン硫酸プロテオグリ・カンは、本発明の内皮細胞由
来のプロテオグリカンと交差反応性である抗体を生起せ
しめ・るのに使用できる。ＥＨ３腫瘍系は、広く普及さ
れており、そしてＴｈｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｉｒｆｓ
ｔｉｔｕｔｅｏｆ　Ｄｅｎｔａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、
　Ｂｅｔｈｅｓｄａ、　Ｍａｒｙｌａｎｄ　（Ｏｒ。

Ｇｅｏｒｇｅ　Ｍａｒｔｉｎｓ）を含む様々な出所から
人手可能である。本発明のプロテオグリカンの他の特徴
は、アルブミンまたは血清の存在下での完全なプロテオ
グリカンどしての液体の細胞培地への溶解性を包含する
。幾つかく全てではない）の他のプロテオグリカンは溶
解性でないが、同じ条件下で細胞表面に結合する。増殖
抑制活性は、亜硝酸、ヘハリナーゼもしくはヘパリチナ
ーゼでの長い処理により、またはグリコサミノグリカン
鎖を破壊する他の処理により破壊される。本発明のグリ
コサミノグリカンは、平滑筋細胞増殖を抑制することに
おいて、天然の市販の抗凝血性ヘパリンの１０４〜５Ｘ
ｌＯ’倍（重量を基準にして）活性であると評価される
。

本発明のグリコサミノグリカンは、ムコ多糖として従来
知られ、三糖単位の繰返しを含む長い直鎮の多糖鎮から
成る化合物のクラスに属する。該グリコサミノグリカン
はヘパラン硫酸として分類された。ヘパラン硫酸は、理
論上、式（Ａ−Ｂ）ｈ（ここでＡおよびＢは単糖であり
そしてｎは繰返し単位の数である）により表わすことが
できる三糖単位の繰返しを含む。Ａ単位は、典型的には
Ｄ−グルクロン酸またはＬ−イズロン酸くカルボキシル
基が存在する位置におけるＤ−グルクロン酸のエピマー
）であり、そしてＢ単位は、典型的にはＮ−アセチル−
Ｄ−グルコサミンである。Ｄ−ガラスドースおよびＤ−
キシロースもまた、典型的には該グリコサミノグリカン
とコアタンパク質との結合のところに存在する。三糖単
位あたりのスルフェートの数は、典型的には約０．２〜
約３、より頻繁には約１〜３または１．５〜３である。

スルフェートは糖上の水酸基の硫酸エステルとして、ま
たはＮ−硫酸化グリコサミンとして存在する。

ヘパラン硫酸は、同じ選択の糖を含む点でヘパリンと似
ているが、異なる比率のグルクロン酸残基および異なる
程度のＮ−硫酸化を含む点で異なる。

ヘパラン硫酸の構造および他のグリコサミノグリカンと
の関連の簡単なレビューについては、Ｃ＋ｆｏ−ｎｅｌ
ｌｉおよびＫｉｎｇ、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１
９７７）１６　：２１３７−２１４１　；　Ｄｕｒｓｔ
および５ｅｔｔｉｎｅ、　Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ。

（１９８１）　１１５　：　８ｇ−９２；並びに、Ｇａ
ｌｌａｇｅｒ、　ＬｙｏｎおよびＳｔｅｗａｒｄ、　Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ、Ｊ、　（１９８６）２３６　：　３１３
−３２５を参照のこと。

本発明の抑制因子は、内皮細胞により分泌されるような
プロテオグリカン、あるいは、プロテアーゼまたは他の
酵素的もしくは化学的開裂により該プロテオグリカンか
ら遊離されるグリコサミノグリカンを含んで成ることが
できる。さらに、亜硝酸（ヘパラン硫酸鎖を開裂するの
に使用する模範的試薬）のような試薬によるヘパラン硫
酸のグリコサミノグリカン鎮の限定的開裂は、典型的に
は約５００ダルトンの低分子量および約５００の重合度
（即ち、三糖重合単位）から全長の鎖までの低分子量の
断片シリーズを生じさせる。グリコサミノグリカン鎖は
、ヘパリナーゼまたはへバリチナーゼのような酵素を使
っても断片化され得る。そのような開裂された断片の混
合物または開裂された混合物から得られたフラクション
（例えば、サイズ排除クロマトグラフィーによる三糖、
四糖、六糖、へ糖等への分離に基づいたフラクション）
は、必要な平滑筋細胞増殖抑制活性が存在する限り、本
発明の範囲内にある。そのような活性は、下記の特定例
に記載のアッセイを使って容易に測定できる。

グリコサミノグリカンが異種であるので、本発明のグリ
コサミノグリカンの完全構造を特定的に定義することは
不可能である。しかしながら、本発明のグリコサミノグ
リカンまたはプロテオグリカンは、前記の独特な内皮細
胞−順化培地とその中に含まれるプロテオグリカンとの
関係により認識され得る。しかし、グリコサミノグリカ
ン断片の分析は、小さく活性なグリコサミノグリカンの
化学合成（または他の源からのそのような断片の単離）
を可能にする十分な情報を提供するであろう。そのよう
な物質は、本発明のヘパラン硫酸プロテオグリカンから
“単離され”ないが、それにもかかわらず、それから“
単離可能”であり、そして本発明の範囲内に含まれる。

それらは本明細書中に記載の精製技術により容易に得る
ことができるので、最初に放出された本発明のヘパラン
硫酸プロテオグリカンから直接単離される、プロテオグ
リカン、グリコサミノグリカン鎖およびより小さいグリ
コサミノグリカンが好ましい。

不均一性のために、プロテオグリカンおよびグリコサミ
ノグリカンは、少なくとも、１つの分子構造のみを含む
組成物を提供するために精製するという意味において、
精製および／または単離することは困難である。従って
、本明細書中で使用する時の“純粋”は、本発明のプロ
テオグリカン、グリコサミノグリカンまたは混合物が、
該抑制因子を含む組成物中に存在する同類の分子（例え
ば、他のプロテオグリカンおよびグリコサミノグリカン
並びにそのような分子から誘導された断片）の少なくと
も９９重量％、そして好ましくは他の高分子量分子の少
なくとも９９重量％（より好ましくは、９９．５％より
多く）を含んで成る組成物について言う。高分子量は、
好ましくは、プロテオグリカンについて言及する時には
少なくとも５００　Ｋ　。

そしてグリコサミノグリカン鎖について言及する時は少
なくともＩＯＫである。該組成物は水および低分子量（
好ましくは１０００未満、より好ましくは５００未満）
の小さい分子、例えば緩衝液等を含むことができる。“
実質的に純粋”とは、他の巨大分子を含むことができる
が、内皮細胞−順化培地のものの少なくとも３倍、好ま
しくは５倍のレベル（質量を基準として）、そして同重
量の市販のウシ心臓ヘパリン（例えば、約１２０　ＬＩ
ＳＰ単位／ｍｇの抗凝血活性を有する市販のヘパリン）
のものの少なくとも１０倍、好ましくは１００倍のレベ
ルの平滑筋細胞増殖抑制活性を示す組成物について言及
する。好ましくは、実質的に純粋とは、重量で少なくと
も５０％の純度、より好ましくは重量で少なくとも８０
％の純度、そしてさらに好ましくは重量で少なくとも９
０％の純度について言う。

本発明のプロテオグリカンおよびグリコサミノグリカン
の種々の特徴における数字上での限界および他の特定的
限界は、ある限度が初めはある範囲の限界として表示さ
れていたとしても、無関係に選択して中間の好みのグル
ーピングを提供することができることは認識されるだろ
う。例えば、分子量５５．０００〜Ｔ０．０００のグリ
コサミノグリカン鎖は、選択することのできる１つのそ
のようなグルーピングを意味する。たとえ特徴が初めは
一諸に言及されなくても、異なる特徴、例えば分子量と
内皮細胞の起源とを組合わせて本発明の組成物を提供す
ることも同じく可能である。

テストの数字上の限界は、大部分は実験データから誘導
され、従って実験方法の精度が必要であることが認識さ
れるだろう。異なる測定方法について出現する異なる程
度の精度のために、数字は、異なるパラメーターについ
ては異なる精度を有するであろう。しかしながら、それ
の意味は、問題の物質の性質を定義するためにそのよう
な指標をよく利用する当業者により容易に理解されるで
あろう。従って、数字が等しいことは、有意な相違が存
在しないということを意味する。

“約”という語は、測定の精度により決定されるような
認識できる最小の差よりも大きな差を表わす。普通“約
”は、１９８８年５月に利用できる標準技術を使った実
験的に測定可能な最小の差の１０倍未満、好ましくは５
倍未満、より好ましくは２倍未満を意味する。

本発明はまた、内皮細胞により生化学的に合成されるよ
うな該抑制因子を含む培地から、グリコサミノグリカン
またはプロテオグリカン平滑筋増殖抑制因子を精製する
方法を提供する。本発明のプロテオグリカンおよびグリ
コサミノグリカンを単離する最初の試みは、精製を行う
容器の表面に該プロテオグリカンコアタンパク質がくっ
つく傾向があるために失敗した。しかしながら、本発明
者らは、該プロテオグリカンを単離することになってい
る培地中に透析可能な洗浄剤を含め、そして精製段階の
間、該プロテオグリカンの存在下に洗浄剤を維持するこ
とにより、生成物の極端な損失なしに精製段階を行い得
ることを発見した。例えば、ゲル濾過、密度勾配遠心お
よびイオン交換クロマトグラフィーといった典型的な精
製技術を洗浄剤の存在下で実施し、所望の生成物を得る
ことができるが、一方この段階を洗浄剤の非存在下で行
うと、所望の生成物をもたらさない。

本発明の実施において利用できる生物学的洗浄剤は、商
業的源から容易に入手できる。例えば、化学試薬および
生化学試薬のＳｉｇｍａ社およびＡｌｄｒｉｃｈ社のカ
タログは、生物学的状況においても利用できる多数の洗
浄剤を載せている。オクチルグルコシドが特に好ましい
洗浄剤である。他の透析可能な洗浄剤は、デオキシコー
ル酸ナトリウム：３−（３−コラミドプロピル）ジメチ
ルアミノ−１−７’ロバンスルホネー）　（ＣＩＩＡＰ
Ｓ）　；ヘキシル−へブチル−、オクチル−、ノニル−
およびデシル−β−Ｄ−グリコピラノシド；ヘプチル−
およびオクチル−β−Ｄ−チオグルコピラノシド；並び
に、オクタノシル−、ツノニル−およびデカノニル−Ｎ
−メチルグルカミド（例えば、Ｏｍｅｇａ　Ｃａｒｐ。

からのＭ　Ｅ　Ｇ八−８，ＭＥＧＡ−９およびＭＥＧＡ
−１０）を包含する。

他の洗浄剤もまた、本発明の抑制因子を含む溶液中臨界
ミセル濃度の１〜５倍に洗浄剤を含め、５×１０３〜５
００Ｘ１０３（好ましくは多くて２５０Ｘ１０’より好
ましくは多くて１００×１０６）の分子量カットオフを
有する透析チューブにおいて培地または緩衝化塩類溶液
に対して試料洗浄剤を透析し、そして透析された試料か
ら平滑筋細胞増殖抑制活性が回復できるかどうかを測定
することにより、本発明のこの観点における利用可能性
について容易にテストできる。

例えば、尿素およびオクチルグルコシドを内皮細胞−順
化培地に添加し、それぞれ約５−７Ｍおよび１−２ｇ／
ｍｌの最終濃度を提供することができる。この培地をイ
オン交換カラム上に負荷し、次いでこれを典型的な方法
で洗浄する。塩化ナトリウム勾配による溶出が、精製さ
れた本発明のプロテオグリカンを提供する。

あるいは、オクチルグルコシド（上記のような）、グア
ニジンおよび塩化セシウムを等密度勾配超遠心にかけて
、約１．３ｇ／ｍｌの最初の浮遊密度を有する精製フラ
クションを得ることができる。

第三の精・製法として、オクチルグルコシドを含む順化
培地の緩衝化溶液をゲル濾過にかけ、分子量に従って分
子を分別することができる。

これらの精製段階は、所望であれば、イオン交換に続く
勾配遠心の後のゲル濾過を含んで成る好ましい順序で、
組み合わせることができる。

安定化用タンパク質、通常血清またはアルブミンは、典
型的に゛は洗浄剤の除去またはプロテオグリカンからの
グリコサミノグリカンの放出の前に試料に加えられ、こ
れはいずれにせよ最初にくる。

例えば、１−２０％、好ましくは約１０％の濃度の血清
が十分適する。試料を緩衝化塩溶液に対して透析して洗
浄剤が除去でき、その時点で抑制活性ヲバイオアッセイ
において評価できる。

本発明の内皮由来抑制因子は、平滑筋細胞の増殖を抑制
する目的で種々の技術に利用され得る。

その方法は、典型的には、本発明の内皮由来抑制因子の
増殖抑制量を、生体内であれ生体外であれ、平滑筋細胞
を含む媒質に添加することを含んで成る。

典型的な生体外適用は、天然源からの内皮細胞の増殖に
関するものである。平滑筋細胞から内皮細胞を分離する
ことは難しく、そして本発明の抑制因子は、平滑筋細胞
が培地に増殖しすぎないように培地に添加することがで
きる。該抑制因子は、典型的には約２０〜約１１０００
ｎ／ｍｌ！、好ましくは５０〜２５０ｎｇ／＋＋＋４！
の培地中濃度を提供するような量において加えられる。

必要量は培地中での増殖条件に応じて望ましいように調
整できる。

典型的な生体内操作は、哺乳動物、典型的には人間への
本発明の抑制因子の投与であろう。そのような場合にお
いては、本発明の組成物が加えられる“増殖培地”は、
動脈または静脈であろう。

哺乳類に投与する時、抑制因子の量は、通常５０〜５０
０ｎｇ／ｍｌの濃度を提供するのに十分なものである。

成人においては、有効量範囲は、５〜５０、好ましくは
１０〜２５ｆｆ　／患者／日であると予測される。本発
明の完全なグリコサミノグリカンまたはプロテオグリカ
ンを動脈壁または静脈壁に供給する方法による投与が好
ましく、典型的な静脈内投与が好ましい。特にグリコサ
ミノグリカンについては、皮下、筋肉内および経口投与
もまた可能である。

本発明を今まで一般的に説明してきたが例示の目的での
み与えられそして特に明示しない限り本発明の限定とし
て見なしてはならない、下記の詳細な説明への参照によ
り、よく理解されるであろう。

〔実施例〕

略　　　号 ｃｐｃ　＝塩化セチルピリジニウム；ＤＭＥＭ＝ダルベ
ツコ改良イーグル培地；ＥＣ−内皮細胞；ＩＥｌｌｓ＝
エンゲルプレスーホルムースワーム；ＦＣ３＝ウシ胎児
血清；ＧＡＧ＝グリコサミノグリカン；ＰＧ＝プロテオ
グリカン、ＳＭＣ＝平滑筋細胞；ＴＢＳ＝）ＩＪス緩衝
化塩溶液。

材料および方法 細胞培養 平滑筋細胞（ＳＭＣ）は、Ｒｏｓｓ、　Ｊ、Ｃｅ１ｌ、
　Ｂｉｏｌ。

（１９７１）５０　：　１７２−１８６の外植片法によ
り、満期近くの（ｎｅａｒ−ｔｅｒｍ）　　ウシ胎児の
主要肺動脈から培養され、そして位相差および電子顕微
鏡検査により特徴付けられた。平滑筋細胞は、−次培養
物から収得した後、第二から第四継代における実験に使
用された。内皮細胞（ＥＣ）は、満期近くのウシ胎児の
肺動脈から培養され、そして位相差および電子顕微鏡検
定により、並びに抗−■因子抗体およびアセチル低密度
リポタンパク質を使った染色により特徴付けられた。■
因子抗原（凝固因子）は、もっばら内皮により生産され
る。アセチル低密度リポタンパク質は、内皮細胞上に存
在するが他の細胞タイプには存在しない特異的なレセプ
ターに選択的に結合する。従って、これらは培養された
ＳＭＣおよびＥＣの培養は、Ｂｅｎ１ｔｚら、ｐｅｄｉ
ａｔｒ。

Ｒｅｓ、　（１９８６）２０　：　９６６−９７２１：
記載サレテいル。ＥＣは、−次培養物からの収得の後第
二または第三継代における実験のみに使われた。２０ｍ
Ｍ　Ｔｒｉｓ。

１４０ｍＭ　ＮａＣＩ！および０．５ｍＭ　ＥＤＴＡを
含む緩衝液（ｐＨ７，４）で単層を洗浄し、そしてＴｒ
　１ｓ−ＮａＣｊｉ！　−ＥＤＴＡで１＝２〜１：３に
希釈されたトリプシン（１：　２５０．　ＮＦ；０．５
　ｇ　／　Ａ）−ＥＤＴＡ（０，５ｍＭ）での３〜５分
間の消化により細胞を遊離せしめることにより、−次培
養物を収得した。細胞をすぐ実験に用いるか、またはウ
シ胎児血清（Ｆｅ２　；Ｔｉ５ｓｕｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ
Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、　Ｔｕｌａｒｅ、　ＣＡ）中の
１０％ジメチルスルホキシド中に入れて液体窒素中で凍
結させた。

全ての培養および実験のための標準培地は、２ｍＭグル
タミン、ＩＯＵ／ｎｉｌ！ペニシリンおよび１０籍／ｒ
ｒＬｌストレプトマイシンを含むダルベツコ改良イ標準
培地であった。全ての培養物は、９５％空気５％ＣＯ２
の湿潤雰囲気下で３７℃にてインキュベートされた。

順化培地の調製および代謝的ラベル化 １０％ＦＣ３が補充された培地を、少なくとも３日間コ
ンフルエンスにされた内皮細胞培養物上し、そしてすぐ
に使用するかまたは６０日間以内の使用のために凍結せ
しめた。１００ｍｍの培養皿中ＥＣのコンフルエントな
単層を、１００μＣｉ　／　ｍｅの担体フリーのＨ２３
５ＳＯｓ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ。

Ｂｏｓｔｏｎ、　ＭＡ）を含む１０％ＦＣ３含有ＤＭＥ
Ｍ　８　ｒｎｌ中で４８時間ラベル化した。代謝的にラ
ベル化された培地を収集し、そして上述のようにして保
存した。該内皮細胞層をＰｕｃｋの均衡塩類溶液で２回
すすぎ、そしてラベル化されたグリコサミノグリカン（
ＧＡＧ）およびプロテオグリカン（ＰＧ）を、Ｐｕｃｋ
の均衡塩類溶液中の２％ＳＤＳ中に抽出した。

増殖抑制アッセイ 増殖抑制活性は、以前発表されたＳＭＣ増殖アッセイ　
（ｇＢｅｎｉｔｚら、Ｊ、Ｃｅ１ｌ　Ｐｈｙｓｉｏｌ、
　（１９８６）　１２７　：１−７）を使って分析され
た。簡単に言えば、ＳＭＣを、１０％ＦＣ３を含む［１
ＭＥＭ中２５．０００細胞数／　３５　ｍｍ皿でプレー
トし、そして４〜６時間付着させた。次いで入っている
培地を取り除き、そして実験用培地または対照（非順化
）培地を３通りまたは４通りの皿に添加した。幾つかの
皿は０時間の試料として凍結された。６日間のインキュ
ベート後、全試料のＤＮＡ含量を、Ｈｏｅｃｈｓｔ　３
３２５８分光蛍光計を使って測定した。増殖抑制率は次
の式から計算した。

放射性スルフェート−ラベル化物質は、塩化セチルピリ
ジニウム（ＣＰＣ）が含浸されたｌｌｌａｔｍａｎｎ　
　３ｍｍ濾紙上に試料をプロットすることにより分析さ
れた。乾燥後、該フィルターを水中で２回洗浄し、２５
ｍＭ硫酸ナトリウム中に１時間浸し、そして再び水中で
洗った。これらの工程は、ＣＰＣの存在下で可溶性であ
る遊離のスルフェートおよび他の物質（ＧＡＧの分解に
より生成する硫酸化されたオリゴ糖を含む）を除去する
が、ＧＡＧ−含有物質は該フィルター上に残る。次の１
０％トリクロロ酢酸による該フィルターの抽出は、遊離
のＧＡＧを定量的に除去するがＰＧを除去することはで
きない。これらの処理に続いて、該フィルターを９５％
エタノールで１回洗い、乾燥し、そしてシンチレーショ
ンカウンティングにかけた。この操作は、それらの試料
中の３５ｓｏ、−ラベル化ＧＡＧおよび”５Ｏ４−ラベ
ル化ＰＧの悉速な定量を可能にする。

あるいは、取り込まれていない３５ＳＯ，を、５ｅｐｈ
ａｄｅにＧ−１００上での緩衝液交換により、放射能ラ
ベル化された順化培地の試料から取り除き、巨大分子中
への”ｓｏ、の取込みをＡｑｕａｍｉｘ（ＩＣＮ　Ｒｏ
ｄｉｏｃｈｅｍｉ−ｃａｌｓ、　Ｉｒｖｉｎｅ、ＣＡ）
中でのシンチレーションカウンティングにより評価した
。

酵素的および化学的消化 培地を０．５Ｕ／ｍｊ！のフラボバクテリウム菌（Ｆｌ
ａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）　ヘパリンリアーゼ（ヘパ
リナーゼ；Ｍｉｌｅｓ、　［Ｅｌｋｈａｒｔ、　ＩＮ）
で３７℃にて１時間処理した；残った酵素活性は１０分
間の煮沸により破壊した。順化および非順化培地は、０
．４■／ｉのストレプトマイセス菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｍ
ｙｃｅｓ）　プロテアーゼ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ−Ｂ
ｅｈｒｉｎｇ、　Ｌａ　Ｊｏｌｌａ、　ＣＡ）により３
７℃にて処理した。１２時間後、追加のプロテアーゼ（
０，２ｍｇ／ｍｌ）を各試料に加え、そしてさらに１２
時間消化を続けた。次いで該試料を１５分間煮沸し、そ
して０．２２μのフィルターを通す濾過により滅菌した
。コンドロイチンＡＢＣリアーゼ（コン゛ドロイチナー
ゼＡＢＣ；Ｍｉｌｅｓ、　Ｂｌｋｈａｒｔ。

ＩＮ）での培地の処理は、０．０５Ｕ／ｍｌの酵素濃度
において３７℃で３時間行い、そして１０分間の煮った
後、スルファミド酸アンモニウムの添加で反応を停止さ
せた。亜硝酸消化物をＮａＯＨで中和し、そして６００
０−８０００ダルトン分子量カットオフの透析チューブ
（ＳｐｅｃｔｒａＰｏｒ、　Ｌｏｓ　Ａｎｇｅｌｅｓ、
　ＣＡ）中で、ｌ　ＱｍＭ　Ｔｒｉｓ、　１４ＱｍＭ　
ＮａＣｊ！中の３０％ポリエチレングリコール（１５−
２０，０００フレーク）に対して透析し、該試料をそれ
らの元の体積に戻した。次に、これらの消化生成物を、
０Ｍ８Ｍに対する徹底的な透析（４日間に渡って５回交
換）によりバイオアッセイ用に再構成した。はとんどの
場合、新鮮なＦｅ２（１０％）を各試料に添加した。血
清が補充されなかったプロテアーゼ−処理試料には、１
ｍｇ／＋ｎ７！のウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ、　
Ｓｔ、　Ｌｏｕｉｓ。

ＭＯ）を添加した；これは、増殖抑制アッセイの間培養
プレートにＳＭＣを付着させておくために必要であった
。

ＰＧ分析用には、代謝的にラベル化された培地から密度
勾配超遠心により調製されプールされたフラクションを
、０，１％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００と共に５０ｍＭ　
Ｔｒｉｓおよび３０ｍＭ酢酸す）　ＩＪウムを含む緩衝
液（ｐＨ８，０）に対して透析し、そして０．１５Ｕ／
ｍｌのコンドロイチナーゼＡＢＣにより３７℃で３時間
消化した。次いで追加の酵素（０，１５Ｕ／ｒｎりを添
加し、もう１時間消化を続けた。該消化物のアリコート
を、還元条件下（Ｉ　Ｍ　ＫＢＨ，）において１００ｍ
Ｍ　ＮａＯＨにより３７℃にて２０時間さらに処理し、
続いて酢酸でｐＨ５，５に中和するか、または前述のよ
うに亜硝酸で処理した。

イオン交換クロマトグラフィー ＥＣ−順化培地を、６Ｍ尿素および５０ｍＭｎ−オクチ
ルグルコピラノシドまたは０．５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１
００に調整し、そして緩衝液Ａ　（６Ｍ尿素、５０ｍＭ
　Ｔｒｉｓ、　１０ｍＭ　ＥＤＴＡ、　２００ｒｎＭ　
Ｎａｌ、　ｐＨ７，４）で予め平衡化されているＤＢＡ
Ｂ−３ｅｐｈａｃｅｌ上に負荷した。カラムを緩衝液Ａ
で洗い、次いで同緩衝液中２００−８００ｍＭのＮａＣ
ｆ勾配により溶出させた。

各フラクション中の塩濃度は伝導度の測定により決定さ
れた（ＣＤＭ　８Ｑ伝導度計、Ｒａｄｉｏｍｅｔｅｒ、
　Ｃｏｐｅｎ−ｈａｇｅｎ）。

超遠心浮遊密度 密度勾配からプールされたフラクションは、公称５００
０ダルトンの分子量カットオフを有するフィルターを使
った超遠心により、５０ｍＭｎ−オクチルグルコピラノ
シドまたは０．５％７ｒｉｔｏｎ　Ｘ　−１００を含む
４ＭグアニジンＨＣｌ　、　１５０＋ｎＭ　ＮａＣｌ　
。

５０ｍ１Ｊ　Ｔｒｉｓ、　１０ｍＭ　ＥＤＴＡ（１）８
７．４）に緩衝液を交換し、次いで結晶の塩化セシウム
の添加により最終密度１．３ｇ／ｒｎＩ！に調整した。

ＥＣ−順化培地からの少量の３ＳＳＱ、−ラベル化巨大
分子（Ｓｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−１００からプールされた
約２００．　ＯＯＯｃｐｍのＶｏフラクション）を添加
し、ＧＡＧおよびＰＧの分配の評価を行った。Ｌ８−７
０Ｍ遠心機（ｆｌｅｃｋｍａｎ、　Ｐａ１ｏ−ＡＩｔｏ
、　ＣＡ）中５Ｗ−６５０−ターを使った１５℃におけ
る４８時間の４６．００Ｏｒｐｍでの遠心により、勾配
を形成せしめた。上述のように、勾配物を分画し、そし
てシンチレーションカウンティングにより放射能分布を
決定した。密度分布は、アリコートを計量することによ
り決定された。フラクションをプールし、そしてＦｅ２
（１０％）の添加および６０００〜８０００ダルトン分
子量カットオフのチューブ中リン酸塩（１０ｍＭ）緩衝
化塩溶液（１４０ｍＭＮａｉ）に対する透析、続いて４
℃でのＤＭＥＭに対する徹底的な透析により、バイオア
ッセイ用に再構成した。そして各プールされた試料を、
Ｄ　Ｍ　Ｅ　！ＡおよびＦｅ２の添加（最終濃度１０％
に）により、調製に使われた順化培地の出発体積にした
。

ゲル濾過クロマトグラフィー 塩化セシウム勾配からプールされたフラクションをコン
ドロイチナーゼＡＢＣで消化した。ゲル濾過のためまた
はアルカリもしくは硝酸での更なる処理のために前記の
ようにアリコートを取り出した。カラムへの適用の前に
、全ての試料を１５ｍＭ５ＤＳおよび５０ｍＭ　Ｔｒｉ
ｓ（ｐＨ８，０）に調整した。

サイズ排除クロマトグラフィーは、室温にて５ｅｐｈａ
ｒｏｓｅ　ＣＬ　−４Ｂ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、　Ｐｉ
ｓｃａｔａｗａｙ。

ＮＪ）のカラム（０，８Ｘ　２５ｃｍ）上１％ＳＤＳ、
　１５０ｍＭＮａＣ１，５０ｍＭ　）リス緩衝液（Ｉ］
Ｈ８，０）により０．１ｍｌ／ｍｉｎの速度で溶出させ
て行われた。溶出したフラクションのアリコートを、Ｌ
Ｓ−２０００シンチレーシヨンカウンター（Ｂｅｃｋｍ
ａｎ、　Ｐａ１ｏ　Ａｌｔｏ、　ＣＡ）を使ってＡｑｕ
ａｍｉｘ　（Ｗｅｓｔｃｈｅｍ、　Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ
、　ＣＡ）中シンチレーションカウンティングするため
に取った。

間隙体積（Ｖ、１１）および全排除体積（Ｖア）は、マ
ーカーとしてそれぞれブルーデキストランＴ−２０００
（Ｓｉｇｍａ、　Ｓｔ、Ｌｏｕｉｓ、　Ｍｌ、ンおよび
ヒ゛タミン８１２（Ｓｉｇｍａ、　Ｓｔ、Ｌｏｕｉｓ、
ＭＯ）を使って決定された。分子量はＫａｖ法により評
価された。

イムノドツト分析 ＰＧの面相免疫検出法は、イムノドツト装置（Ｂｉｏ−
Ｒａｄ、　Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、　ＣＡ）中に置かれた湿
ったカチオン性ナイロン膜（Ｇｅｎｅ−Ｔｒａｎｓ；Ｐ
ｌａｓｃｏ、　Ｗｏｂｕｒｎ。

ＭＡ）を使って行われた。穏和な吸引を使って該膜上に
負荷する前に、塩化セシウム勾配からの試料を０．２Ｍ
より低い最終塩化物濃度に希釈し、そして５０ｍＭ酢酸
塩でｐＨ４，５に緩衝化した。次いで酸膜をマニホール
ドから取りはずし、そして酢酸塩緩衝化塩溶液（５０ｍ
Ｍ酢酸塩、１５０［１１Ｍ　ＮａＣｊ！、　ｐＨ４，５
）で１回すすぎ、そして０．１％Ｔｖｅｅｎ−８０を含
む２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　、　１４０＋ｎＭＮａＣｊ！、
　ｐＨ７，２（ＴＢＳ）で２回すすいだ。その膜を、Ｔ
ＢＳ中１：６２５に希釈されたＥｎｇｅｌｂｒｅｔｈ−
Ｈｏ１ｍ−３ｗａｒｍ　（ＥＨ３）腫瘍の基底膜のヘパ
ラン硫酸ＰＧに対して生起された抗血清（ＢＭ−１と命
名）と共に一晩インキユベートし、次いで１％ＦＣ３を
含むＴＢＳ中１：１５００に希釈されたペルオキシダー
ゼ−接合ヤギ抗−ウサギＩｇＧ（ＣＡＬＴＡＧ、　５ｏ
ｕｔｈ　Ｓａｎ　Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、　ＣＡ）と共に
室温で３０分間インキコベートした。ＢＭ−１抗血清は
、ｔｈｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｉｎ
５ｔｉｔｕｔｅｓ　ｏｆ　Ｄｅ−ｎｔａｌ　Ｒｅ５ｅａ
ｒｃｈ、　Ｂｅｔｈｅｓｄａ、　Ｍａｒｙｌａｎｄ（Ｏ
ｒ、ＪｏｂｎＨａｓｓｅｌｌ）から人手でき、または免
疫学の標準法およびＥＨＳ基底膜ヘパラン硫酸プロテオ
グリカン（免疫原として）を使って、同等の抗血清を調
製することができる。固定化されたペルオキシダーゼ接
合体は、ＴＢＳ中の４−クロロ−１−ナフトール（０，
５％　Ｗ／Ｖ）および過酸化水素（０，０３％　Ｖ／Ｖ
）で可視化された。

統計的方法 各グループの試料についてのＤＮＡ含量および増殖の抑
制率は、少なくとも３つの皿についての平均値上標準偏
差として表わされる。ＤＮＡ含量は、一方だけの（ｏｎ
ｅ−ｗａｙ）分散の分析により比較した。試料平均値の
選択されたペアは、Ｓｔｕｄｅｎｔの両端が対でない場
合のｔ検定（ｕｎｐａｉｒｅｄ　ｔｗｏ　−ｔａｉｌｅ
ｄ　ｔ　ｔｅｓｔ）を使って比較した。そのようなｔ検
定が重複比較に利用された時は常にＢｏｎｆｅｒｒｏｎ
ｉ補正を行った。有意水準（ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ
）はヱく０．０５にて仮定された。

結果 順化培地はＳＭＣ増殖のヘパリン様抑制因子を含む ＥＣ−順化培地と共に６日間インキュベートしたまばら
に置かれたＳＭＣ培養物のＤ’ＮＡ含量の増加は、非順
化培地と共にインキニベートした対照の培養物のものの
わずか５３％であった（工＜０．００５）。プロテアー
ゼ処理は、ＳＭＣ増殖を支持する順化培地および非順化
培地の両者の能力を完全に破壊した（Ｐ＜０．００５）
。ＳＭＣ増殖は、新鮮なＥＣ３（１０％）が補充されプ
ロテアーゼ処理された対照培地中で対照レベルまで完全
に回復したが、同様に補充されたＥＣ−順化培地中では
明らかに減少した（Ｐ＜０．００５）。新しいＤ　Ｍ　
Ｅ　Ｍの添加（１：　１）またはＤＭＥＭに対する徹底
的な透析に続＜ＥＣ３（１０％）の補充もまた、ＥＣ−
順化培地の増殖抑制効果を廃止することができなかった
。

これらの結果は、胎児の肺動脈からのＳＭＣの増殖が、
血清中に存在するポリペプチド因子を必要とすることを
確証し、そして培養されたＥＣにより順化された培地中
のＳＭＣ増殖の減少が血清因子または培地の成分の除去
のためであることを示す。加えて、ＳＭＣ増殖のＥＣ由
来の抑制因子は、プロテアーゼ消化および１５分間の煮
沸による破壊（プロテアーゼ前処理を伴いまたは無しで
）に耐え、従ってポリペプチドではないことを示す。

ＥＣ−順化培地によるＳＭＣ増殖の抑制は、ヘパリナー
ゼによる該培地の処理により減少されるが完全には除去
されなっかだ。ヘパリナーゼ処理は、対照（非順化）培
地中でのＳＭＣの増殖に効果がないが、ＳＭＣ増殖にお
けるヘパリン（１０に／ｍｌ）の抑制効果を逆転させた
（Ｐ〈０．０１）。

ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓのプロテアーゼによるＥＣ−
順化培地の処理は、増殖抑制活性を増加させた（Ｐ　＜
　０．０１）。

このプロテアーゼで消化されたＥＣ−順化培地の抑制活
性は、ヘパリンおよびヘパラン硫酸を選択的に分解する
亜硝酸での処理後、顕著に減少した。

コンドロイチン−４−硫酸、コンドロンチン−６−硫酸
およびデルマタン硫酸を消化するコンドロイチナーゼＡ
ＢＣでの処理は、増殖抑制に全く効果がなかった。これ
らの結果は、ウシ胎児肺動脈由来の培養されたＥＣがＳ
ＭＣ増殖のヘパラン硫酸またはヘパリン−様抑制因子を
生産することを示す。

グリコサミノグリカンへの３ＳＳＯ，取込みの速度論内
皮細胞培養物を、０〜４８時間の範囲の間隔で担体フリ
ーの３５ＳＯ４（１００μｃｉ／ｍｊ’）で代謝的にラ
ベル化した。培地または細胞層（ＥＣもそれらの細胞外
マトリックスも含む）のＧＡＧおよびＰＧへの”ｓｏ、
の取込みは、ＣＰＣフィルターアッセイを使って評価さ
れた。これらの試料の各々について、ＣＰＣ−沈澱性３
５ｓｏ、の９５％以上が、該フィルターから１０％トリ
クロロ酢酸への抽出に抵抗し、これは遊離のＧＡＧがほ
とんど存在しないことを示す。ＰＧの放射能ラベルは細
胞層中約１６時間で定常状態に達したが、培地中の放射
能ラベル化ＰＧは少なくとも４８時間の間直線的な蓄積
があった。ＣＰＣが含浸しされたフィルター上へのプロ
ッティングの前に、亜硝酸またはコンドロイチナーゼＡ
ＢＣによる”ｓｏ、−ラベル化そして６０％がコンドロ
イチン硫酸またはデルマタン硫酸中にあることを証明し
た。従って、肺動脈ＥＣは、それらの培地中にヘパラン
硫酸ＰＧを放出する。

浮遊密度分画 塩化セシウム中解離条件下での７２時間のＥＣ−順化培
地の超遠心は、約１．２〜１、Ｔｇ／ｍｌの密度勾配の
形成をもたらす。ＣＰＣ−沈澱性”ＳＱ４ラベルは、１
．３ｇ／ｒｎ１の形式上密度を有する中間密度のフラク
ションおよび１．５ｇ／ｍｊ！に至る範囲のより高い密
度のブロードなピークにおいて回収された。この順化培
地のプロテアーゼ消化後には、ＣＰＣ−沈殿性３５ｓｏ
、ラベルは、高い密度（〉１．６ｇ／ｍＡ’）のフラク
ションにおいてのみ回収された。この結果は、ＥＣ−順
化培地中の”５Ｏ４−ラベル化物質がＰＧであり、ＰＧ
からプロテア−らのフラクションを等サイズの４つのプ
ールされたフラクションＨ−ＩＶと命名）に合併した。

対照は非順化培地から同様に調製されたフラクションか
ら成る。最も低密度のプール（フラクション■、密度１
．２〜１．３５　ｇ　／ｍｌ）において増殖抑制活性が
回収され、この中に放射能ラベル化ＰＧが１．３ｇ／ｍ
ｌの形式上浮遊密度で存在していた。

ＥＣ−順化培地のフラクションＩ、ｎＪよび■から調製
された培地中の増殖は、対照のものと大して違わなかっ
た。

ゲル濾過クロマトグラフィー 塩化セシウム勾配からプールされたフラクション■を、
０．１％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００を有するコンドロイ
チンＡＢＣリアーゼ緩衝液に対して透析し、そしてコン
ドロイチンＡＢＣリアーゼで消化した。

この調製物のアリコートを５ｅｐｈａｒｏｓｅ　ＣＬ−
４Ｂ上でのゲル濾過にかけ、そして”５（１４−ラベル
化物質の溶出をシンチレーションカウンティングにより
分析した。”ｓｏ、−ラベルは２つのピークにおいて溶
出し、１つは０．０３〜０．０７のＫａｖにおいて（は
とんどカラム中に保持されない）、もう１つはＶアにお
いて溶出した。アルカリ消化後、大きい分子量の方のピ
ークが０．４５〜０．５００ＫａＶにシフトし、これは
ＧＡＧがコアタンパク質に付着したことを意味する。亜
硝酸での消化後、３Ｓｓｏ４−ラベルはＶアの位置のみ
で溶出し、これは０．０３〜０．０７および０．４５〜
０．５０のＫａｖで溶出するピークがヘパラン硫酸から
成ることを示す。従って、プールされたフラクション■
は、約１０６　ダルトンの分子量を有するヘパラン硫酸
ＰＧを含む。既知の分子量のコンドロイチン硫酸クラス
ター〇溶出位置との比較により、ヘパラン硫酸鎖の分子
量は６０．０００〜７０、０００ダルトンであると評価
された。

イムノブロッティング ウシの肺動脈のＥＣにより放出されるヘパラン硫酸は、
全体のサイズ、ＧＡＧ鎖のサイズ、および浮遊密度にお
いて、ＥＨ３腫瘍の低密度基底膜ヘパラン硫酸に類似し
ている〔例えば、Ｈａｓｓｅｌｌら、Ｊ、Ｂｉｏｌ、　
Ｃｈｅｍ、　（１９８５）２６０　：　８０９８−８１
０５］ので、このＥＨ３腫瘍ＰＧに対して生起されたＢ
Ｍ−１抗血清との交差反応性をテストした。塩化セシウ
ム勾配からの個々のフラクションのイムノブロッティン
グは、増殖抑制活性とＢＭ−１免疫反応性の同一分布を
証明した。プールされたフラクション■のアリコートも
、このアッセイにおいてＢＭ−１抗血清との反応性を示
した。このアッセイにおいて、ＧＡＧ鎮は該ＰＧを膜に
結合させるが、ＧＡＧの無いコアタンパク質は保持され
ない。フラクション■のアルカリ処理後、”ｓｏ、ラベ
ルは膜上に保持されたが、免疫反応性は消失した。この
ことは、ＢＭ−１抗体がＥＣ由来のＰＧのコアタンパク
質と反応することを示す。しかし、亜硝酸での処理後、
カチオン性膜に残る放射能が減少し、そして免疫反応性
が消失した。このことは、該膜上にヘパラン硫酸ＰＧ抗
原を固定化できないことが免疫反応性の消失をもたらす
ことを示す。

従って、ＢＭ−１抗血清は、牛胎児の肺動脈から培養さ
れたＥＣにより生産されるヘパラン硫酸ＰＧのコアタン
パク質と反応する（しかし、コンドロイチン硫酸とは反
応しない）。これらの結果は下表に示されるように、Ｅ
Ｃ由来のＳＭＣ増殖抑制因子がＥＨ３腫瘍の基底膜のヘ
パラン硫酸ＰＧの多数の特徴を分けもっていることを示
す。

特徴 全体のサイズ（ダルトン） ＧＡＧｉｎのサイズ グリコサミノグリカン 浮遊密度 内皮触質の　ＥＨ３腫瘍基底膜の ）ＩＳＰＧ　　　　　　Ｈ３ＰＧ 〜１，０００．０００　　　７５０，０００６５．００
０　　　６５，０００ ヘパラン硫酸　　　　　　ヘパラン硫酸１．３−１．３
５　　　　１．３２−１．４しかしながら、 それらは平滑筋抑制活性において 異なっている。

今まで本発明を十分に説明してきたが、特許請求の範囲
または精神から逸脱することなく、多くの変更および改
良を行い得ることは当業者にとって明らかであろう。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、平滑筋細胞増殖抑制因子であって、平滑筋細胞増殖
   抑制活性を有し、そして約１０＾５〜１０＾７の分子量
   および１．４ｇ／ｍｌ未満の浮遊密度を有するヘパラン
   硫酸プロテオグリカンの部分として内皮細胞−順化培地
   から単離可能である実質的に純粋なグリコサミノグリカ
   ンを含んで成り、プロテアーゼ開裂の際に約５５，００
   ０〜７５，０００の分子量を有するグリコサミノグリカ
   ン鎖を放出する、平滑筋細胞増殖抑制因子。 ２、前記グリコサミノグリカンが、前記抑制因子を含む
   組成物中、少なくとも１０００の分子量を有する分子を
   少なくとも９０重量％含んで成る、請求項１に記載の抑
   制因子。 ３、前記内皮細胞−順化培地が、ヒト、ブタ、ウシ、ヒ
   ツジ、ウサギ、ラット、マウスまたはサルの内皮細胞か
   ら本質的に成る細胞を含む、請求項１に記載の抑制因子
   。 ４、前記グリコサミノグリカン鎖が約６０，０００〜７
   ０，０００の分子量を有し、そして前記プロテオグリカ
   ンが約１．３ｇ／ｍｌの浮遊密度および約０．８×１０
   ＾６〜１．２×１０＾６の分子量を有する、請求項１に
   記載の抑制因子。 ５、前記グリコサミノグリカンが約５５，０００〜約７
   ５，０００の分子量を有する、請求項１に記載の抑制因
   子。 ６、前記グリコサミノグリカンが約１，０００〜５５，
   ０００の分子量を有する、請求項１に記載の抑制因子。 ７、前記プロテオグリカンが、基底膜のヘパラン硫酸プ
   ロテオグリカンのタンパク質エピトープに対して特異的
   な結合親和性を有する抗体と特異的に結合する、請求項
   １に記載の抑制因子。 ８、前記基底膜のヘパラン硫酸プロテオグリカンが、Ｅ
   ＨＳ腫瘍により生産される、請求項７に記載の抑制因子
   。 ９、前記抑制因子を開裂条件下でコンドロイチンＡＢＣ
   リアーゼと接触せしめた時に前記活性が保持される、請
   求項１に記載の抑制因子。 １０、前記抑制因子が、アルブミンまたは血清の存在下
   で前記培地中に完全なプロテオグリカンとして溶解でき
   、そして内皮細胞から可溶性のグリコサミノグリカン鎖
   を放出させるために全くエンドグリコシド的開裂を必要
   としない、請求項１に記載の抑制因子。 １１、内皮細胞−順化培地から単離可能であり、そして
   約１０＾５〜約１０＾７の分子量、１．４ｇ／ｍｌ未満
   の浮遊密度、プロテアーゼ開裂の際に約５５，０００〜
   ７５，０００の平均分子量を有するグリコサミノグリカ
   ン鎖および平滑筋細胞増殖抑制活性を有する、実質的に
   純粋なヘパラン硫酸プロテオグリカンを含んで成る、平
   滑筋細胞増殖抑制因子。 １２、前記プロテオグリカンが約１．３ｇ／ｍｌの浮遊
   密度を有する、請求項１１に記載の抑制因子。 １３、前記分子量が約１０＾６である、請求項１１に記
   載の抑制因子。 １４、前記プロテオグリカンが、基底膜ヘパラン硫酸プ
   ロテオグリカンに特異的な抗体により認識されるタンパ
   ク様エピトープを含んで成る、請求項１１に記載の抑制
   因子。 １５、プロテオグリカン平滑筋細胞増殖抑制因子を、内
   皮細胞により生化学的に合成された時に前記抑制因子を
   含んで成る液体培地から精製する方法において、 解離的またはカオトロピック条件を誘導する試薬の添加
   の前に前記培地中に透析可能な洗浄剤を含め、そして前
   記精製の間、前記プロテオグリカンの存在下に前記洗浄
   剤を維持する、ことを含んで成る改良方法。 １６、前記精製が内皮−順化培地のゲル濾過を含んで成
   る、請求項１５に記載の方法。 １７、前記精製が密度勾配遠心を含んで成る、請求項１
   ５に記載の方法。 １８、平滑筋細胞増殖抑制因子を精製する方法であって
   、 増殖培地中の内皮細胞を前記培地から分離して内皮−順
   化培地を用意し； 前記順化培地に透析可能な洗浄剤を添加し；そして 前記洗浄剤が添加された順化培地中に存在する他の巨大
   分子からヘパラン硫酸プロテオグリカンを分離する； ことを含んで成る方法。 １９、前記分離が、イオン交換、ゲル濾過または密度勾
   配遠心を含んで成る、請求項１８に記載の方法。 ２０、前記分離が、密度勾配遠心および約１．２５〜１
   ．３５ｇ／ｍｌの浮遊密度のフラクションの収集を含ん
   で成る、請求項１８に記載の方法。 ２１、少なくとも５００，０００の分子量により特徴付
   けられる試料を提供するためのゲル濾過を含んで成る、
   請求項１８に記載の方法。 ２２、密度勾配遠心および約１．２５〜１．３５ｇ／ｍ
   ｌの浮遊密度のフラクションの収集をさらに含んで成る
   、請求項２１に記載の方法。 ２３、前記洗浄剤が、前記インヒビターを含む溶液から
   、５００，０００以下の分子量カットオフを有する半透
   膜を通して透析可能である、請求項１８に記載の方法。 ２４、前記洗浄剤がオクチルグルコシドまたはデオキシ
   コール酸ナトリウムである、請求項１８に記載の方法。 ２５、平滑筋細胞の増殖を抑制する方法であって、前記
   細胞を含む増殖培地に、請求項１に記載のグリコサミノ
   グリカンまたはプロテオグリカンの増殖抑制有効量を添
   加することを含んで成る方法。 ２６、前記量が、前記細胞に接触する液体培地中２０〜
   １０００ｎｇ／ｍｌの濃度を提供するものである、請求
   項２５に記載の方法。 ２７、前記増殖培地が、動物の動脈または静脈である、
   請求項２５に記載の方法。 ２８、前記添加が静脈内注射によるものであり、そして
   前記量が５０〜５００ｎｇ／ｍｌの血清濃度を提供する
   ものである、請求項２７に記載の方法。 ２９、前記増殖培地が、生体外の組織−または細胞−培
   養培地である、請求項２５に記載の方法。