JPH0285300A - 再生骨髄から得られる骨形成生長因子 - Google Patents
再生骨髄から得られる骨形成生長因子Info
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- JPH0285300A JPH0285300A JP1162827A JP16282789A JPH0285300A JP H0285300 A JPH0285300 A JP H0285300A JP 1162827 A JP1162827 A JP 1162827A JP 16282789 A JP16282789 A JP 16282789A JP H0285300 A JPH0285300 A JP H0285300A
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- cells
- growth factor
- hbmcm
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
- C07K14/51—Bone morphogenetic factor; Osteogenins; Osteogenic factor; Bone-inducing factor
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
骨髄剥離後、原発骨の柱が血塊にとって代わり、骨髄空
間を満たす骨形成′Ｍ％あることはよく知られている。
間を満たす骨形成′Ｍ％あることはよく知られている。
次いで柱は再生した正常骨髄の出現に先立って遺骨細胞
性吸収を受ける。骨髄空洞内に局部的に骨形成反応があ
るばかりでなく、皮質性骨元における骨形成の刺激と離
れた骨格部位における骨形成及び軟骨形成との増加も認
められる。
性吸収を受ける。骨髄空洞内に局部的に骨形成反応があ
るばかりでなく、皮質性骨元における骨形成の刺激と離
れた骨格部位における骨形成及び軟骨形成との増加も認
められる。
脛骨骨髄の剥離後治癒の骨形成期の間の下顎管類におけ
る観察は、遺骨細胞の数と活性の両方の増加が原因とな
って骨形成が増強されることを示している。１つ又は複
数の因子が再生する骨髄によって局部的に生産され、そ
れが血液循環中に放出された後末梢骨形成応答を仲介す
る説が提言されている（パブ・アイ（Ｂａｂ、 １．）
外、カルシフ・ティッシュ−・インド（Ｃａｌｃｉｆ
Ｔｉ５ｓｕｅ Ｉｎｔ） （１９８５年）、３７巻、５
５１ページ）。本発明は再生する骨髄は骨形成細胞に優
先的効果を与える生長因子活性を生産することを立証し
ている。
る観察は、遺骨細胞の数と活性の両方の増加が原因とな
って骨形成が増強されることを示している。１つ又は複
数の因子が再生する骨髄によって局部的に生産され、そ
れが血液循環中に放出された後末梢骨形成応答を仲介す
る説が提言されている（パブ・アイ（Ｂａｂ、 １．）
外、カルシフ・ティッシュ−・インド（Ｃａｌｃｉｆ
Ｔｉ５ｓｕｅ Ｉｎｔ） （１９８５年）、３７巻、５
５１ページ）。本発明は再生する骨髄は骨形成細胞に優
先的効果を与える生長因子活性を生産することを立証し
ている。
本発明において骨形成期の再生する骨髄は骨形成細胞に
対する強力な生長促進活性を生産することが示された。
対する強力な生長促進活性を生産することが示された。
この活性は遺骨細胞性ＲＯ３細胞の増殖に対するＨ Ｂ
Ｍ ＣＭの効果を測定することにより評価すると、血
清の存在に依存しないがしかしながら血清はこの効果を
増強する。煮沸とヘパリン−セファロース（Ｓｅｐｈａ
ｒｏｓｅ）段階の後に回復される活性の明らかな増加は
、ＨＢＭＣＭがＧＦＡ又はＤＮＡ合成を阻害する物質も
含むことを示唆する。この考えは更に粗ＨＢＭＣＭの最
高の希釈（１：２００）でＲＯ３細胞数を抑制すること
により支持される。ＮＭＣＭはＲＯ３細胞増殖のＨＢ
Ｍ ＣＭ様刺激を引き起こすことができないことは、骨
形成ＧＦＡは骨髄治癒の間に特異的に生産されること又
は正常骨髄で作られるそのようを活性の量は使用する生
物検定の分解能以下であることを示唆している。骨形成
ＧＦＡを生産する細胞の起源は明らかにされていないが
、ＩＩＢＭＣＭの調製に使用される骨ｍ織の顕微鏡観察
は間質細胞、すなわち骨髄の骨形成能力に密接に関連す
ることが知られている線維芽細胞、血管芽細胞及び遺骨
細胞が多量にあることを示している。ヘモポイエチン要
素の存在を除外することはできないが、それらの量は有
意な量の生活性因子の生産には不十分のように思われる
。
Ｍ ＣＭの効果を測定することにより評価すると、血
清の存在に依存しないがしかしながら血清はこの効果を
増強する。煮沸とヘパリン−セファロース（Ｓｅｐｈａ
ｒｏｓｅ）段階の後に回復される活性の明らかな増加は
、ＨＢＭＣＭがＧＦＡ又はＤＮＡ合成を阻害する物質も
含むことを示唆する。この考えは更に粗ＨＢＭＣＭの最
高の希釈（１：２００）でＲＯ３細胞数を抑制すること
により支持される。ＮＭＣＭはＲＯ３細胞増殖のＨＢ
Ｍ ＣＭ様刺激を引き起こすことができないことは、骨
形成ＧＦＡは骨髄治癒の間に特異的に生産されること又
は正常骨髄で作られるそのようを活性の量は使用する生
物検定の分解能以下であることを示唆している。骨形成
ＧＦＡを生産する細胞の起源は明らかにされていないが
、ＩＩＢＭＣＭの調製に使用される骨ｍ織の顕微鏡観察
は間質細胞、すなわち骨髄の骨形成能力に密接に関連す
ることが知られている線維芽細胞、血管芽細胞及び遺骨
細胞が多量にあることを示している。ヘモポイエチン要
素の存在を除外することはできないが、それらの量は有
意な量の生活性因子の生産には不十分のように思われる
。
遺骨細胞性ＲＯ３細胞培養中に高まることが認められ、
分化した遺骨細胞機能の指標となる酵素、アルカリホス
ファターゼもＨＢＭＣＭによって制御′Ｉｌされるが、
ＮＭＣＭによっては市ＩＩ′４卸されなかった。アルカ
リホスファターゼ活性に対する粗ＨＢ Ｍ ＣＭの効果
はそのＲＯ３細胞数に対する効果とは逆に関連していた
。低濃度では細胞数を相当に抑圧し酵素活性を刺激する
が、一方晶濃度では細胞数は増加し、次第にアルカリホ
スファターゼを阻害した。遺骨細胞増殖とアルカリホス
ファターゼ活性の間に同様な関係のあることが知られて
おり、このことは複製する遺骨細胞はそれらの分化した
細胞の機能を発現する能力が減少していることを示唆し
ている。しかしながら高度に精製した物質がないことか
ら、他の考察例えば低濃度で見られる効果はＨＢ Ｍ
ＣＭに多分存在する細胞増殖の阻害物質によってもたら
されるという考察も可能であろう。そのような阻害物質
はアルカリホスファターゼの効果とは無関係にＲＯ３細
胞増殖に影響することがあり得る。
分化した遺骨細胞機能の指標となる酵素、アルカリホス
ファターゼもＨＢＭＣＭによって制御′Ｉｌされるが、
ＮＭＣＭによっては市ＩＩ′４卸されなかった。アルカ
リホスファターゼ活性に対する粗ＨＢ Ｍ ＣＭの効果
はそのＲＯ３細胞数に対する効果とは逆に関連していた
。低濃度では細胞数を相当に抑圧し酵素活性を刺激する
が、一方晶濃度では細胞数は増加し、次第にアルカリホ
スファターゼを阻害した。遺骨細胞増殖とアルカリホス
ファターゼ活性の間に同様な関係のあることが知られて
おり、このことは複製する遺骨細胞はそれらの分化した
細胞の機能を発現する能力が減少していることを示唆し
ている。しかしながら高度に精製した物質がないことか
ら、他の考察例えば低濃度で見られる効果はＨＢ Ｍ
ＣＭに多分存在する細胞増殖の阻害物質によってもたら
されるという考察も可能であろう。そのような阻害物質
はアルカリホスファターゼの効果とは無関係にＲＯ３細
胞増殖に影響することがあり得る。
２つの骨形成細胞集団、ＲＯ３１７／２及びＦＲＣ集団
３−５がＨＢＭＣＭ誘４調製品のチャレンジに顕著に応
答し、用量応答関係を示している。ヘパリン−セファロ
ース段階により達成される精製の程度で、これらの細胞
系におけるＤＮＡ合成速度に対する効果はナノグラムの
範囲の使用量で明瞭であった。ＨＢ Ｍ ＣＭ誘導調製
品が他の骨形成結合組繊細胞に影響するか否か及びどの
程度に影響するかを評価するために計画された実験によ
り、非造骨細胞性ラット骨肉腫と頭蓋冠細胞並びにマウ
スの線維芽細胞はＨＢＭＣＭ誘導体のチャレンジに対し
て最低限に反応することが明らかになった。これらの細
胞の増殖は種々なホルモンと生長因子により相当程度に
刺激されることが知られており、この結果はＨｓＭｃＭ
３，３１体は骨細胞に優先的に影響することを示唆して
いる。従って、長管痕跡の無傷の器官培養系でこの因子
の効果を試験することが重要と思われた。実際に、煮沸
したＨＢＭＣＭは遺骨細胞性ＲＯ３及びＦＲＣ細胞に対
して細胞分裂誘起的濃度で胎児の撓骨及び尺骨の軟骨の
伸長を用量応答的に刺激した。全生長に対する効果は骨
幹伸長の刺激より幾らか高（、このことば遺骨細胞と管
端コンドロバイテス（ｃｈｏｎｄｒｏｂｙ ｔｅｓ）の
両方を含む可能性のある骨形成と軟骨形成に対する異な
る影響を示唆する。胎児の長管系における煮沸したＨＢ
ＭＣＭの効果は同一の器官培養系で最大の応答を引き出
すことが既に知られている１ ０−９Ｍインシュリンの
それの約２倍であったことを指摘しなければならない。
３−５がＨＢＭＣＭ誘４調製品のチャレンジに顕著に応
答し、用量応答関係を示している。ヘパリン−セファロ
ース段階により達成される精製の程度で、これらの細胞
系におけるＤＮＡ合成速度に対する効果はナノグラムの
範囲の使用量で明瞭であった。ＨＢ Ｍ ＣＭ誘導調製
品が他の骨形成結合組繊細胞に影響するか否か及びどの
程度に影響するかを評価するために計画された実験によ
り、非造骨細胞性ラット骨肉腫と頭蓋冠細胞並びにマウ
スの線維芽細胞はＨＢＭＣＭ誘導体のチャレンジに対し
て最低限に反応することが明らかになった。これらの細
胞の増殖は種々なホルモンと生長因子により相当程度に
刺激されることが知られており、この結果はＨｓＭｃＭ
３，３１体は骨細胞に優先的に影響することを示唆して
いる。従って、長管痕跡の無傷の器官培養系でこの因子
の効果を試験することが重要と思われた。実際に、煮沸
したＨＢＭＣＭは遺骨細胞性ＲＯ３及びＦＲＣ細胞に対
して細胞分裂誘起的濃度で胎児の撓骨及び尺骨の軟骨の
伸長を用量応答的に刺激した。全生長に対する効果は骨
幹伸長の刺激より幾らか高（、このことば遺骨細胞と管
端コンドロバイテス（ｃｈｏｎｄｒｏｂｙ ｔｅｓ）の
両方を含む可能性のある骨形成と軟骨形成に対する異な
る影響を示唆する。胎児の長管系における煮沸したＨＢ
ＭＣＭの効果は同一の器官培養系で最大の応答を引き出
すことが既に知られている１ ０−９Ｍインシュリンの
それの約２倍であったことを指摘しなければならない。
骨形成細胞生長促進因子の蛋白質的性質はトリプシンに
よる阻害試験により実証された。セファデックス（Ｓｅ
ｐｈａｄｅｘ） Ｇ −２５とＧ−７５ラカムからの溶
離パターンはヘパリン−セファロース段階後に得られる
ＧＦＡは５． ＯＯＯ〜１０，０００．１９．０００及
び３５，０００と測定される分子量の３つの主要な活性
のピークとは異種であることを示唆している。この分子
量範囲（５，０００〜３５．０００）に、線維芽細胞生
長因子、変換生長因子α及びβ、胎児ラット頭苦冠によ
る培養中に生産されるβ２−ミクログロブリン、脱ミネ
ラルした管床から抽出される遺骨細胞誘導骨格生長因子
、及びマクロファージ誘導生長因子のような骨細胞に細
胞分裂誘起効果を持つ幾つかの生長因子がある。しかし
ながら、ＨＢＭＣＭ誘導因子の性質の組合せ、すなわち
煮沸に対する抵抗性、生理的塩濃度におけるヘパリン−
セファロース床からの回収、及び血清の存在又は不存在
下における遺骨細胞に対する優先的効果はこれらの因子
の大部分の性質と一致しないように見える。しかしなが
ら、ＨＢＭＣＭ誘導因子はＰＤＧＦとその性質の幾つか
を共有している。その煮沸に対する抵抗性を除いて、Ｐ
ＤＧＦは比較的低いＮａＣｊ２濃度でヘパリン−セファ
ロースから回収され、骨肉腫細胞増殖の促進物質として
作用する。しかしながら抗体中和試験により測定したと
ころでは、本１１８ＭＣＭ調製品は有意量のＰＤＧＦを
含まないように見える。更にこれらの調製品は胸腺細胞
増殖検定でＩＬＩ活性を示すことができない。傷の治癒
の際に現れる変換生長因子βも、それが遺骨細胞性ＲＯ
３細胞及び頭蓋冠細胞の増殖を阻害することからここに
記述する骨形成生長因子と異なるように見える。
よる阻害試験により実証された。セファデックス（Ｓｅ
ｐｈａｄｅｘ） Ｇ −２５とＧ−７５ラカムからの溶
離パターンはヘパリン−セファロース段階後に得られる
ＧＦＡは５． ＯＯＯ〜１０，０００．１９．０００及
び３５，０００と測定される分子量の３つの主要な活性
のピークとは異種であることを示唆している。この分子
量範囲（５，０００〜３５．０００）に、線維芽細胞生
長因子、変換生長因子α及びβ、胎児ラット頭苦冠によ
る培養中に生産されるβ２−ミクログロブリン、脱ミネ
ラルした管床から抽出される遺骨細胞誘導骨格生長因子
、及びマクロファージ誘導生長因子のような骨細胞に細
胞分裂誘起効果を持つ幾つかの生長因子がある。しかし
ながら、ＨＢＭＣＭ誘導因子の性質の組合せ、すなわち
煮沸に対する抵抗性、生理的塩濃度におけるヘパリン−
セファロース床からの回収、及び血清の存在又は不存在
下における遺骨細胞に対する優先的効果はこれらの因子
の大部分の性質と一致しないように見える。しかしなが
ら、ＨＢＭＣＭ誘導因子はＰＤＧＦとその性質の幾つか
を共有している。その煮沸に対する抵抗性を除いて、Ｐ
ＤＧＦは比較的低いＮａＣｊ２濃度でヘパリン−セファ
ロースから回収され、骨肉腫細胞増殖の促進物質として
作用する。しかしながら抗体中和試験により測定したと
ころでは、本１１８ＭＣＭ調製品は有意量のＰＤＧＦを
含まないように見える。更にこれらの調製品は胸腺細胞
増殖検定でＩＬＩ活性を示すことができない。傷の治癒
の際に現れる変換生長因子βも、それが遺骨細胞性ＲＯ
３細胞及び頭蓋冠細胞の増殖を阻害することからここに
記述する骨形成生長因子と異なるように見える。
骨髄の骨形成能力を表す場合、例えば剥離後及び骨折治
癒、骨髄移植、インビトロの骨髄細胞及び器官培養、並
びにインビボの拡散チャンバー培養は骨形成発現型の発
現及びその全身系ホルモンによる制御との関連において
のみ特徴付けられていた。我々の知るかぎり、本発明は
骨髄がその骨形成能力を発現する場合における仲介者と
しての局部生長因子の役割の最初の示唆である。それら
の局部的活性の外に、そのような因子は血液循環に伝達
され、骨髄の剥離後再生の間における骨形成の全身的増
強を仲介することができる。
癒、骨髄移植、インビトロの骨髄細胞及び器官培養、並
びにインビボの拡散チャンバー培養は骨形成発現型の発
現及びその全身系ホルモンによる制御との関連において
のみ特徴付けられていた。我々の知るかぎり、本発明は
骨髄がその骨形成能力を発現する場合における仲介者と
しての局部生長因子の役割の最初の示唆である。それら
の局部的活性の外に、そのような因子は血液循環に伝達
され、骨髄の剥離後再生の間における骨形成の全身的増
強を仲介することができる。
材且
アルカリホスファターゼ・コラゲナーゼＩ型、トリプシ
ン、大豆トリプシン・インヒビター−アガロース（ＳＴ
Ｉ） 、ＢＧＪ培地（フィットンージャクソン（Ｆｉ
ｔｔｏｎ−Ｊａｃｋｓｏｎ）改変）、ビタミンＣ，ウシ
膵臓インシュリン、及びヒト血清アルブミンはシグマ・
ケミカル・カンパニー（ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌ
Ｃｏ、） （セントルイス（Ｓｔ、Ｌｏｕｉｓ） 、
ミズーリ （ＭＯ） ）から購入した。Ｆ １０ （
ｌｌａｍ）培地（栄養源混合）、ウシ胎児血清（Ｆｅ２
）、ダルベツコ（Ｄｕ １ｂｅｃｃｏ）のＰＢＳ、及び
ペニシリンストレプトマイシン溶液はギブコ（Ｇｉｂｃ
ｏ） （チャグリン・フォールス（Ｃｈａｇｒｉｎ Ｆ
ａｌｌｓ）、オハイオ（０１１） ）から入手した。〔
メチル−３Ｈ）チミジン（（３Ｈ） Ｔｄ Ｒ） （
５μＣｉ／ｍｍｏｌ）はヌクレアー・リサーチ・センタ
ー（Ｎｕｃｌｅａｒ Ｒｅ５ｅａｒｃｈＣｅｎｔｅｒ）
（ネゲブ（Ｎｅｇｅｖ）、イスラエル（Ｉｓｒａｅ
ｌ） ）から購入した。セファデックスＧ−２５、セフ
ァデックスＧ−７５、及びヘパリン−セファロースＣＬ
−６Ｂはファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ） （ウプ
サラ（Ｕｐｐｓａｌａ）、スエーデン（Ｓｗｅｄｅｎ）
）から購入した。ミリボア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）メ
ンプランはシュライヒャー・アンド・シュエル（ダソセ
ル（Ｄａｓｓｅｌ）、西ドイツ）から入手した。血小板
誘導生長因子（ＰＤＧＦ）はバイオメディカル・チクノ
ロシース（Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇ
ｉｅｓ） （ストロ−トン（Ｓｔｒｏｕｇｈｔｏｎ）
、マサチェーセッ゛ン（ＭＡ） ）及びヒト組換えイン
ターリューキンＩ−α（ＩＬＩ）はシストロン（Ｃｉｓ
ｔｒｏｎｅ） （パイン・プルツク（Ｐｉｎｅ Ｂｒ
ｏｏｋ） 、二＋ニーシャーシー（ＮＪ） ）から購入
した。すべての他の化学品は分析等級であり、メルク・
アーゲー（Ｍａｒ’ｃｋ ＡＧ） （ダルムスタント
（Ｄａｒｍｓ ｔａｄ ｔ）、西ドイツ）から購入した
。組織培養用デイツシュはヌンク （Ｎｕｎｃ） （
ロスキルド（Ｒｏｓｋｉｌｄｅ） 、デンマーク（Ｄｅ
ｎｍａｒｋ） ）から入手した。ＰＤＧＦに対するウ
サギポリクローナル抗血清はドクター・シー・エッチ・
ヘルプイン（叶、Ｃ，Ｉｌ、ＩＩｅｌｄｉｎ） （ウプ
サラ大学、スエーデン）から供給された。
ン、大豆トリプシン・インヒビター−アガロース（ＳＴ
Ｉ） 、ＢＧＪ培地（フィットンージャクソン（Ｆｉ
ｔｔｏｎ−Ｊａｃｋｓｏｎ）改変）、ビタミンＣ，ウシ
膵臓インシュリン、及びヒト血清アルブミンはシグマ・
ケミカル・カンパニー（ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌ
Ｃｏ、） （セントルイス（Ｓｔ、Ｌｏｕｉｓ） 、
ミズーリ （ＭＯ） ）から購入した。Ｆ １０ （
ｌｌａｍ）培地（栄養源混合）、ウシ胎児血清（Ｆｅ２
）、ダルベツコ（Ｄｕ １ｂｅｃｃｏ）のＰＢＳ、及び
ペニシリンストレプトマイシン溶液はギブコ（Ｇｉｂｃ
ｏ） （チャグリン・フォールス（Ｃｈａｇｒｉｎ Ｆ
ａｌｌｓ）、オハイオ（０１１） ）から入手した。〔
メチル−３Ｈ）チミジン（（３Ｈ） Ｔｄ Ｒ） （
５μＣｉ／ｍｍｏｌ）はヌクレアー・リサーチ・センタ
ー（Ｎｕｃｌｅａｒ Ｒｅ５ｅａｒｃｈＣｅｎｔｅｒ）
（ネゲブ（Ｎｅｇｅｖ）、イスラエル（Ｉｓｒａｅ
ｌ） ）から購入した。セファデックスＧ−２５、セフ
ァデックスＧ−７５、及びヘパリン−セファロースＣＬ
−６Ｂはファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ） （ウプ
サラ（Ｕｐｐｓａｌａ）、スエーデン（Ｓｗｅｄｅｎ）
）から購入した。ミリボア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）メ
ンプランはシュライヒャー・アンド・シュエル（ダソセ
ル（Ｄａｓｓｅｌ）、西ドイツ）から入手した。血小板
誘導生長因子（ＰＤＧＦ）はバイオメディカル・チクノ
ロシース（Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇ
ｉｅｓ） （ストロ−トン（Ｓｔｒｏｕｇｈｔｏｎ）
、マサチェーセッ゛ン（ＭＡ） ）及びヒト組換えイン
ターリューキンＩ−α（ＩＬＩ）はシストロン（Ｃｉｓ
ｔｒｏｎｅ） （パイン・プルツク（Ｐｉｎｅ Ｂｒ
ｏｏｋ） 、二＋ニーシャーシー（ＮＪ） ）から購入
した。すべての他の化学品は分析等級であり、メルク・
アーゲー（Ｍａｒ’ｃｋ ＡＧ） （ダルムスタント
（Ｄａｒｍｓ ｔａｄ ｔ）、西ドイツ）から購入した
。組織培養用デイツシュはヌンク （Ｎｕｎｃ） （
ロスキルド（Ｒｏｓｋｉｌｄｅ） 、デンマーク（Ｄｅ
ｎｍａｒｋ） ）から入手した。ＰＤＧＦに対するウ
サギポリクローナル抗血清はドクター・シー・エッチ・
ヘルプイン（叶、Ｃ，Ｉｌ、ＩＩｅｌｄｉｎ） （ウプ
サラ大学、スエーデン）から供給された。
／″ 髄 （ＨＢＭＣＭ）の
前述（ハブ・アイ外・カルシフ・ティッシュ−・インド
（１９８５年）、３７巻、５５１ページ）のハブライ大
学（Ｈｅｂｒｅｗ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ） （サブラ
（Ｓａｂｒａ） 、 イスラエル）株の４００ｇの雄ラ
ットの一肢から脛骨骨髄を剥離した。直径２１Ａ１の穴
を中央に近い生長板の下の水準の骨幹にドリルで開けた
。次いで、穴を通して挿入したポリエチレンのカニユー
レで骨髄空洞から組織を除き、強力吸引装置に接続した
。１０日後に処理した骨を解剖し、骨幹を縦方向に割っ
て骨髄空洞を露出させた。
（１９８５年）、３７巻、５５１ページ）のハブライ大
学（Ｈｅｂｒｅｗ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ） （サブラ
（Ｓａｂｒａ） 、 イスラエル）株の４００ｇの雄ラ
ットの一肢から脛骨骨髄を剥離した。直径２１Ａ１の穴
を中央に近い生長板の下の水準の骨幹にドリルで開けた
。次いで、穴を通して挿入したポリエチレンのカニユー
レで骨髄空洞から組織を除き、強力吸引装置に接続した
。１０日後に処理した骨を解剖し、骨幹を縦方向に割っ
て骨髄空洞を露出させた。
次いで治癒組織を皮質の骨内膜面から除き、多量の１％
（Ｖ／Ｖ）ペニシリン−ストレプトマイシンを添加した
無血清Ｆ−１０培地で洗浄し、同一培地（１ｍｌｌの培
地当たり一肢からの組織）中で５％ＣＯ□混合空気中、
３７℃で２４時間インキュベートした、次いで培地を集
め、２５．０００ｘｇで３０分間遠心分離し、上澄液を
孔径０．４５μｍのミリボアメンプランを通して濾過し
た。この調製品を粗ＨＢＭＣＭと称し、その蛋白質含量
は３〜８■／ｍｅであった。対照培地は未処理ラットか
ら得られる正常骨髄を使用する外は同一方法で調製した
（ＮＭＣＭ）。冷チミジン、組織培養培地の成分及び他
の低分子量混入物を除くため、粗ＨＢＭＣＭを５ｍＭ酢
酸アンモニウムで平衡にしたセファデックスＧ−２５カ
ラム上でゲル濾過を行った。標準の試験では６又は３５
■蛋白質を、それぞれＰＩ）−１０又は２．６ Ｘ ７
０ ｃｍのカラム上にかけた。両分を５ｍＭ酢酸アンモ
ニウムで溶離し、排液中に蛋白質（分子ｆｉ５．０００
以上）を含むそれをプールして凍結乾燥し、−７０°Ｃ
に保存した。次の実験の際試料を解かしＰＢＳに溶解し
た。略語ＨＢ Ｍ ＣＭは以下でセファデックス６２５
段階後得られる調製品について使用する。
（Ｖ／Ｖ）ペニシリン−ストレプトマイシンを添加した
無血清Ｆ−１０培地で洗浄し、同一培地（１ｍｌｌの培
地当たり一肢からの組織）中で５％ＣＯ□混合空気中、
３７℃で２４時間インキュベートした、次いで培地を集
め、２５．０００ｘｇで３０分間遠心分離し、上澄液を
孔径０．４５μｍのミリボアメンプランを通して濾過し
た。この調製品を粗ＨＢＭＣＭと称し、その蛋白質含量
は３〜８■／ｍｅであった。対照培地は未処理ラットか
ら得られる正常骨髄を使用する外は同一方法で調製した
（ＮＭＣＭ）。冷チミジン、組織培養培地の成分及び他
の低分子量混入物を除くため、粗ＨＢＭＣＭを５ｍＭ酢
酸アンモニウムで平衡にしたセファデックスＧ−２５カ
ラム上でゲル濾過を行った。標準の試験では６又は３５
■蛋白質を、それぞれＰＩ）−１０又は２．６ Ｘ ７
０ ｃｍのカラム上にかけた。両分を５ｍＭ酢酸アンモ
ニウムで溶離し、排液中に蛋白質（分子ｆｉ５．０００
以上）を含むそれをプールして凍結乾燥し、−７０°Ｃ
に保存した。次の実験の際試料を解かしＰＢＳに溶解し
た。略語ＨＢ Ｍ ＣＭは以下でセファデックス６２５
段階後得られる調製品について使用する。
胞に する生 ′ の２
生長因子活性（ＧＦＡ）を骨形成ラット骨肉腫細胞（Ｒ
Ｏ３１７／２）の培養におけるＤＮＡ合成と細胞複製に
対する影響を試験することにより監視した。ＲＯ３−１
７／２細胞の保存培養は１０％ＦＣ３を含むＦ−１０培
地中に維持した。種々な調製品の細胞分裂誘起効果を試
験するため、合併した培養をトリプシン処理し、２Ｘ１
０”の細胞を２ ｃａｌの培養槽（１６ｍｍ多槽デイツ
シュ）中のＦ−１０培地に接種し、ＣＯ２混合空気中３
７℃でインキュベートした。最初の６時間の間に細胞の
着床を増加するため培地に２％ＦＣ３を添加した。引き
続いてこれをＰＢＳ中に蛋白質溶液として添加した試験
標品を含む無血清培地中で１８時間インキュベートした
。ＤＮＡ合成速度を求めるため、インキュベート期間の
最後の２時間に培養液にＭＨ）ＴｄＲを槽当たりｌμＣ
ｉ添加してパルスを与えた。水冷１０％（ｗｔ／ｖ）
トリクロロ酢酸とエタノール−エーテル（３：１、ｖ
／ ｖ ）で２回洗浄してパルスを終了した。細胞層
を乾燥した後、トリクロロ酢酸不溶性物質を０．２ Ｍ
のＮ ａ ＯＨに熔解し、その全放射能を液体シンチシ
ーソヨンスペクトル測定により評価した。データは生長
因子単位（Ｇ Ｆ Ｕ）として表した。ＲＯ３細胞の増
殖は血清依存性であるからＩＵは所与の実験における１
０％ＦＣ３の効果の半分と定義した。
Ｏ３１７／２）の培養におけるＤＮＡ合成と細胞複製に
対する影響を試験することにより監視した。ＲＯ３−１
７／２細胞の保存培養は１０％ＦＣ３を含むＦ−１０培
地中に維持した。種々な調製品の細胞分裂誘起効果を試
験するため、合併した培養をトリプシン処理し、２Ｘ１
０”の細胞を２ ｃａｌの培養槽（１６ｍｍ多槽デイツ
シュ）中のＦ−１０培地に接種し、ＣＯ２混合空気中３
７℃でインキュベートした。最初の６時間の間に細胞の
着床を増加するため培地に２％ＦＣ３を添加した。引き
続いてこれをＰＢＳ中に蛋白質溶液として添加した試験
標品を含む無血清培地中で１８時間インキュベートした
。ＤＮＡ合成速度を求めるため、インキュベート期間の
最後の２時間に培養液にＭＨ）ＴｄＲを槽当たりｌμＣ
ｉ添加してパルスを与えた。水冷１０％（ｗｔ／ｖ）
トリクロロ酢酸とエタノール−エーテル（３：１、ｖ
／ ｖ ）で２回洗浄してパルスを終了した。細胞層
を乾燥した後、トリクロロ酢酸不溶性物質を０．２ Ｍ
のＮ ａ ＯＨに熔解し、その全放射能を液体シンチシ
ーソヨンスペクトル測定により評価した。データは生長
因子単位（Ｇ Ｆ Ｕ）として表した。ＲＯ３細胞の増
殖は血清依存性であるからＩＵは所与の実験における１
０％ＦＣ３の効果の半分と定義した。
細胞数は試験調製品に４８時間さらした姉妹培養で測定
した。これはトリプシン処理後固定液量血球計で行った
。データは培養槽当たり細胞数として表現した。
した。これはトリプシン処理後固定液量血球計で行った
。データは培養槽当たり細胞数として表現した。
ＨＢＭＣＭからＧＦＡの
加熱の影響
０、５〜１．０ ｍｇ蛋白質を含む１ｍＬのＨＢＭＣＭ
試料を室温に置くかもしくは５６℃で３０分又は６０分
加熱した。同様の試料につき１０分間煮沸に対するＧＦ
Ａの安定性を試験した。ＧＦＡは煮沸操作に対して安定
であることが判明したので（第１表）、煮沸工程を使用
して外来性蛋白質を変性と２５．０００ｘｇで４５分間
の遠心分離により除いた。
試料を室温に置くかもしくは５６℃で３０分又は６０分
加熱した。同様の試料につき１０分間煮沸に対するＧＦ
Ａの安定性を試験した。ＧＦＡは煮沸操作に対して安定
であることが判明したので（第１表）、煮沸工程を使用
して外来性蛋白質を変性と２５．０００ｘｇで４５分間
の遠心分離により除いた。
第１表 無血清ＲＯ３１７／２細胞培養物におけるＨＢ
ＭＣＨの細胞分裂誘起活性（ＤＮＡへの〔３旧ＴｄＲの
取込み）に対する加熱の影響因子３ １１８ＭｃＭ（６０分） ）ＩＢＭＣＭ （３０分、５６Ｃ） １１８ＭｃＭ（６０分、６０Ｃ） ＨＢＭＣＭ（１０分、煮沸） 無血清対照 血清（１０％）対照 計数７分” ＧＦＲ３ ２０３８±３０４ ０．２９±０．０５２７９２±１
２５ ０．５９±０．０７３２１３±８９ ０．
８２±０．０５５８２０±２４３ ２．８２±０．１
８１６７６±１３０ ５３８５±３５０ ＲＴ、室温 為因子濃度は３．６μｇ／ＩＩ！１であった。
ＭＣＨの細胞分裂誘起活性（ＤＮＡへの〔３旧ＴｄＲの
取込み）に対する加熱の影響因子３ １１８ＭｃＭ（６０分） ）ＩＢＭＣＭ （３０分、５６Ｃ） １１８ＭｃＭ（６０分、６０Ｃ） ＨＢＭＣＭ（１０分、煮沸） 無血清対照 血清（１０％）対照 計数７分” ＧＦＲ３ ２０３８±３０４ ０．２９±０．０５２７９２±１
２５ ０．５９±０．０７３２１３±８９ ０．
８２±０．０５５８２０±２４３ ２．８２±０．１
８１６７６±１３０ ５３８５±３５０ ＲＴ、室温 為因子濃度は３．６μｇ／ＩＩ！１であった。
ｂ繰返し４つの培養槽の平均値±ＳＥ
アフィニティークロマトグラフィー
ヘパリン−セファロースカラム（０，９Ｘ２５（Ｊベツ
ドｆｆ１）を製造者の指示により調製し、ＰＢＳを充填
し、室温で０．６ｍｌ／分の流速で吸引した。
ドｆｆ１）を製造者の指示により調製し、ＰＢＳを充填
し、室温で０．６ｍｌ／分の流速で吸引した。
ヘパリン−セファロースをバッチ式に使用スる予備試験
において、０．１５ＭのＮａｃｌ（ＰＢＳ）で平衡にし
た場合ＧＦＡは不溶性基質に結合しないで残ることが示
された。か（して、ＰＢＳ中３０■の沸騰ＨＢＭＣＭを
含む２ ｔａｌの試料をカラムにかけ、ベツドを２４ｔ
ａｌのＰＢＳで洗浄して溶離した。溶離液を５ｍＭ酢酸
アンモニウムに対して２４時間透析し、蛋白質を評価し
凍結乾燥した。
において、０．１５ＭのＮａｃｌ（ＰＢＳ）で平衡にし
た場合ＧＦＡは不溶性基質に結合しないで残ることが示
された。か（して、ＰＢＳ中３０■の沸騰ＨＢＭＣＭを
含む２ ｔａｌの試料をカラムにかけ、ベツドを２４ｔ
ａｌのＰＢＳで洗浄して溶離した。溶離液を５ｍＭ酢酸
アンモニウムに対して２４時間透析し、蛋白質を評価し
凍結乾燥した。
ゲル濾過
ＨＢＭＣＭ誘導因子を更に精製するため、ヘパリン−セ
フブロースカラムから回収した０、５〜６、 Ｏｒｒｇ
／ ｔａ ｌの蛋白質を１ ｒａｌの５ｍＭ酢酸アンモ
ニウムに溶解し、同じ溶液で平衡にした１、２Ｘ５４ｃ
ｍのセファデックスＧ−７５カラムにかけた。
フブロースカラムから回収した０、５〜６、 Ｏｒｒｇ
／ ｔａ ｌの蛋白質を１ ｒａｌの５ｍＭ酢酸アンモ
ニウムに溶解し、同じ溶液で平衡にした１、２Ｘ５４ｃ
ｍのセファデックスＧ−７５カラムにかけた。
蛋白質試料を室温で５ｍＭ酢酸アンモニウムを０．６５
ｍｆｆ／分の流速で使用して溶離した。両分１．３ｎｌ
を蛋白質について評価し、凍結乾燥した。
ｍｆｆ／分の流速で使用して溶離した。両分１．３ｎｌ
を蛋白質について評価し、凍結乾燥した。
１北１２）血止
ＨＢ Ｍ ＣＭ誘導因子の蛋白質的性質を確認するため
、ヘパリン−セファロース段階後のＨＢＭＣＭの１ｆｆ
ｌｌの試料をトリプシン（トリプシン／ＨＢＭＣＭ比１
： ２０ｗｔ／ｗｔ）と共に２５゛Ｃでインキュベー
トした。３０分後混合物を５ＴＩＯカラム（０，４Ｘ１
ｃｍ）にかけて反応を停止した。対照として反応混合物
中でトリプシンを除く以外同様に処理した試料を置いた
。
、ヘパリン−セファロース段階後のＨＢＭＣＭの１ｆｆ
ｌｌの試料をトリプシン（トリプシン／ＨＢＭＣＭ比１
： ２０ｗｔ／ｗｔ）と共に２５゛Ｃでインキュベー
トした。３０分後混合物を５ＴＩＯカラム（０，４Ｘ１
ｃｍ）にかけて反応を停止した。対照として反応混合物
中でトリプシンを除く以外同様に処理した試料を置いた
。
出の細、び２−↑稗−
骨形成細胞に対するＨＢＭＣＭ起源因子の特異性を研究
するため、更に活性調製品につき遺骨細胞性及び非造骨
細胞性脛骨細胞（ＦＲＣ細胞）、並びに非骨形成ラット
骨肉腫細胞（ＲＯ５２５／ｌ）に対するそれらの細胞分
裂誘起効果を試験した。培養をＣＯｚ混合空気中で３７
℃に均一に保った。すべての実験において試験調製品を
ＰＢＳ中蛋白質溶液として培養物に添加した。
するため、更に活性調製品につき遺骨細胞性及び非造骨
細胞性脛骨細胞（ＦＲＣ細胞）、並びに非骨形成ラット
骨肉腫細胞（ＲＯ５２５／ｌ）に対するそれらの細胞分
裂誘起効果を試験した。培養をＣＯｚ混合空気中で３７
℃に均一に保った。すべての実験において試験調製品を
ＰＢＳ中蛋白質溶液として培養物に添加した。
ＲＯ８細胞
ＲＯ３２５／１細胞をＲＯ３１７／２１［１胞ニツき上
で報告したのと同様のプロトコルを用いて培養し試験し
た。
で報告したのと同様のプロトコルを用いて培養し試験し
た。
ＦＲＣ細胞
２１日令のラット胎児の頭頂骨から得られる細胞を一次
培養に使用した。５つの細胞集団をルーベン（Ｌｕｂｅ
ｎ）外、エンドクリノロジー（Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏ
ｇｙ）（１９７６年）、９９巻、５２６ページにより記
述された方法によりコラゲナーゼと１−リプシンで連続
消化して分離した。集団１〜２及び３〜５からの細胞を
プールし、それぞれ非造骨細胞性及び遺骨細胞性と呼称
した。細胞を１６鰭多槽デイツシユに３Ｘ１０’細胞／
槽を接種し、１０％ＦＣ３を添加したＦ−１０培地中で
２４時間発育させた。次いで培地を１％ＦＣ３添加のそ
れで置換し、２４時間後試験調製品及び１．５μＣｉ／
槽の（’Ｈ）ＴｄＲを添加した。（３Ｈ）ＴｄＲのＤＮ
Ａへの取込みと細胞数を更に２４時間後上述のように評
価した。
培養に使用した。５つの細胞集団をルーベン（Ｌｕｂｅ
ｎ）外、エンドクリノロジー（Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏ
ｇｙ）（１９７６年）、９９巻、５２６ページにより記
述された方法によりコラゲナーゼと１−リプシンで連続
消化して分離した。集団１〜２及び３〜５からの細胞を
プールし、それぞれ非造骨細胞性及び遺骨細胞性と呼称
した。細胞を１６鰭多槽デイツシユに３Ｘ１０’細胞／
槽を接種し、１０％ＦＣ３を添加したＦ−１０培地中で
２４時間発育させた。次いで培地を１％ＦＣ３添加のそ
れで置換し、２４時間後試験調製品及び１．５μＣｉ／
槽の（’Ｈ）ＴｄＲを添加した。（３Ｈ）ＴｄＲのＤＮ
Ａへの取込みと細胞数を更に２４時間後上述のように評
価した。
胎児マウス長管
これはソスコルン（Ｓｏｓｋｏｌｎｅ）外、ボン（Ｂｏ
ｎｅ）（１９８６年）、７巻、４１ページにより記述さ
れた方法により実施した。撓骨と尺骨を１６日令の胎児
から除き、解剖して筋肉と軟組織を除いた。
ｎｅ）（１９８６年）、７巻、４１ページにより記述さ
れた方法により実施した。撓骨と尺骨を１６日令の胎児
から除き、解剖して筋肉と軟組織を除いた。
次いで１５０μｇ／ｍβのビタミンＣと４■／１１１１
のヒト血清アルブミンを添加した化学的限定培地（ＢＧ
Ｊ、フィソトン／ジャクソン改変）中で培養した。リン
酸塩濃度を１ｍＭに調節した。
のヒト血清アルブミンを添加した化学的限定培地（ＢＧ
Ｊ、フィソトン／ジャクソン改変）中で培養した。リン
酸塩濃度を１ｍＭに調節した。
個々の骨痕跡の全体及び骨幹の長さを培養期間の始めと
４８時間後に透過光を使用する解剖顕微鏡下で直接測定
した。全体又は骨幹のいずれかの伸長をこれらの測定値
の差として計算し、結果を生長因子で処理した骨と化学
的限定培地のみで生長した対照との間の比率（Ｔ／Ｃ比
）として表した。
４８時間後に透過光を使用する解剖顕微鏡下で直接測定
した。全体又は骨幹のいずれかの伸長をこれらの測定値
の差として計算し、結果を生長因子で処理した骨と化学
的限定培地のみで生長した対照との間の比率（Ｔ／Ｃ比
）として表した。
アルカリフォスファターゼ
この検定のためＲＯ３１７／２細胞の培養液から培地を
除き、細胞をＰＢＳで洗浄し、蒸溜水中に掻き取り、超
音波処理した。酵素活性をアシュトン（Ａｓｈｔｏｎ）
外、カルシフ・ティッシュ−・インド（１９８４年）、
３６巻、８３ページにより記述されたように基質として
ｐ−ニトロフェニル・ホフフエートを用いて検定した。
除き、細胞をＰＢＳで洗浄し、蒸溜水中に掻き取り、超
音波処理した。酵素活性をアシュトン（Ａｓｈｔｏｎ）
外、カルシフ・ティッシュ−・インド（１９８４年）、
３６巻、８３ページにより記述されたように基質として
ｐ−ニトロフェニル・ホフフエートを用いて検定した。
結果は姉妹培養で計数されたｌＯｂ細胞当たり１分当た
り放出されるｐ−ニトロフェニル基のマイクロモル数ト
して表した。
り放出されるｐ−ニトロフェニル基のマイクロモル数ト
して表した。
■亘ｉ會旦
蛋白質はブラッドフォード（Ｂｒａｄｆｏｒｄ） 、ア
ナリティカル・バイオケミストリー（Ａｎａｌ、Ｂｉｏ
ｃｈｅｎ＋、）（１９７６年）、７２巻、２４８ページ
に記述の方法により測定した。
ナリティカル・バイオケミストリー（Ａｎａｌ、Ｂｉｏ
ｃｈｅｎ＋、）（１９７６年）、７２巻、２４８ページ
に記述の方法により測定した。
±旦と蛮立二丘貢
ＩＬＩ活性をバラク（Ｂａｒａｋ）外、シェー・ビオル
・レスポンス・モディフィース（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｒｅｓ
ｐｏｎｓｅＭｏｄｉｆｉｅｓ） （１９８６年）、５
巻、３６２ページにより記述された胸腺細胞増殖検定法
を用いて評価した。
・レスポンス・モディフィース（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｒｅｓ
ｐｏｎｓｅＭｏｄｉｆｉｅｓ） （１９８６年）、５
巻、３６２ページにより記述された胸腺細胞増殖検定法
を用いて評価した。
ヱ山」ヨ運（社）支足
抗ＰＤＧＦ抗体中和試験をｒ’ＤＧＦに対してウサギで
調製したポリクローナル抗血清を用いて実施した。ＰＤ
ＧＦ又はＨＢＭＣＭ誘導調製品を抗体の存在又は不存在
下でＲｏｓ １７／２細胞に添加し、（’Ｈ）ＴｄＲの
取込みに対する効果を試験した。
調製したポリクローナル抗血清を用いて実施した。ＰＤ
ＧＦ又はＨＢＭＣＭ誘導調製品を抗体の存在又は不存在
下でＲｏｓ １７／２細胞に添加し、（’Ｈ）ＴｄＲの
取込みに対する効果を試験した。
ＲＯ３１７／２細胞の数及びアルカリホスファターゼ活
性に対する粗ＨＢＭＣＭとＮＭＣＭの効果は実証されて
いる。粗ＨＢＭＣＭの最高希釈（１：２００）で、細胞
数の７５％の減少と酵素活性の２倍以上の増加が認めら
れた。ｌ：１００〜１：１０のより低い希釈では細胞数
は未処理培養に比較して約２倍高（、アルカリホスファ
ターゼ活性は用量依存的阻害を示した。試験した希釈で
、ＲＯ３１？／２細胞の増殖とアルカリ、オスファター
ゼ活性に対するＮＭＣＭの効果は小さかった。
性に対する粗ＨＢＭＣＭとＮＭＣＭの効果は実証されて
いる。粗ＨＢＭＣＭの最高希釈（１：２００）で、細胞
数の７５％の減少と酵素活性の２倍以上の増加が認めら
れた。ｌ：１００〜１：１０のより低い希釈では細胞数
は未処理培養に比較して約２倍高（、アルカリホスファ
ターゼ活性は用量依存的阻害を示した。試験した希釈で
、ＲＯ３１？／２細胞の増殖とアルカリ、オスファター
ゼ活性に対するＮＭＣＭの効果は小さかった。
粗ＨＢＭＣＭをセファデックスＧ−２５カラム上のゲル
濾過にかけた場合、添加した蛋白質の約８０％が排液か
らなる両分に回収された（分子量ｓ、 ｏ ｏ ｏ以上
）。これらの両分はカラムから溶離されるほとんどすべ
て（９４％）の細胞分裂誘起活性を含んでいた。
濾過にかけた場合、添加した蛋白質の約８０％が排液か
らなる両分に回収された（分子量ｓ、 ｏ ｏ ｏ以上
）。これらの両分はカラムから溶離されるほとんどすべ
て（９４％）の細胞分裂誘起活性を含んでいた。
ＨＢＭＣＭからＧＦＡの部
ＧＦＡに対する熱の効果
ＨＢＭＣＭ誘１ＧＦＡに対する熱の効果を第１表に要約
する。温度又は露出時間のいずれかを高めると、ＲＯ３
１７，２細胞のＤＮＡへの〔３Ｈ〕ＴｄＲの取込みに対
するＨＢＭＣＭの刺激効果の増加が認められた。特に１
０分間煮沸後細胞分裂誘起活性に顕著な増加が認められ
、煮沸と遠心分離により得られる上澄液の細胞分裂誘起
効果はＦｅ２のそれと同等であった。比活性の８倍の増
加を伴って蛋白質の半量を煮沸と遠心分離により除くこ
とができた（第２表）、ＲＯ３１７／２細胞検定におけ
る煮沸した調製品の用量応答曲線は０．５〜５μｇ／槽
で有意の量のＧＦＡを示しており、より高い用量では減
衰する。０．５μｇをＦＲ’Ｃ細胞集団３〜５のプール
の培養に添加した場合も煮沸した調製品の活性が記録さ
れた。
する。温度又は露出時間のいずれかを高めると、ＲＯ３
１７，２細胞のＤＮＡへの〔３Ｈ〕ＴｄＲの取込みに対
するＨＢＭＣＭの刺激効果の増加が認められた。特に１
０分間煮沸後細胞分裂誘起活性に顕著な増加が認められ
、煮沸と遠心分離により得られる上澄液の細胞分裂誘起
効果はＦｅ２のそれと同等であった。比活性の８倍の増
加を伴って蛋白質の半量を煮沸と遠心分離により除くこ
とができた（第２表）、ＲＯ３１７／２細胞検定におけ
る煮沸した調製品の用量応答曲線は０．５〜５μｇ／槽
で有意の量のＧＦＡを示しており、より高い用量では減
衰する。０．５μｇをＦＲ’Ｃ細胞集団３〜５のプール
の培養に添加した場合も煮沸した調製品の活性が記録さ
れた。
第２表 煮ｉとヘパリン−セファロース上のアフィニテ
ィー・クロマトグラフィーによるＨＢＭＣＭ誘導生長因
子の部分精製 セフ７デフクス Ｇ−２５５４９５９９煮沸
２．５ ２．２３０ ８２２アフィニティ・
クロマトグラフィ 煮沸したＨＢＭＣＭをヘパリン−セファロースカラムに
かけた場合、かけた蛋白質の２０％はＰＢＳにより溶離
され、残りの蛋白質は結合して残った。この両分に回収
される全細胞分裂誘起活性は比活性の顕著な増加の結果
として約１．３００％テアった（第２表）、ヘパリン−
セファロース段階のＧＦＡの増加も用量応答曲線によっ
て示され、そこではＲＯ３１７／２細胞に対する影響は
５０ｎｇ／槽で明らかであった。ＤＮＡ合成速度のピー
クの刺激は０．５μｇ／槽で認められ、その後は減少し
た。又ヘパリン−セファロースを用いて得られる調製品
は遺骨細胞性ＦＲＣ細胞に対しても相当の細胞分裂誘起
効果を持っていた。ヘパリン−セファロースカラムから
回収される物質をトリプシン消化に当てた場合、ＨＢ
Ｍ ＣＭ誘１ＧＦＡの９５％以上の阻害が認められた（
第３表）。
ィー・クロマトグラフィーによるＨＢＭＣＭ誘導生長因
子の部分精製 セフ７デフクス Ｇ−２５５４９５９９煮沸
２．５ ２．２３０ ８２２アフィニティ・
クロマトグラフィ 煮沸したＨＢＭＣＭをヘパリン−セファロースカラムに
かけた場合、かけた蛋白質の２０％はＰＢＳにより溶離
され、残りの蛋白質は結合して残った。この両分に回収
される全細胞分裂誘起活性は比活性の顕著な増加の結果
として約１．３００％テアった（第２表）、ヘパリン−
セファロース段階のＧＦＡの増加も用量応答曲線によっ
て示され、そこではＲＯ３１７／２細胞に対する影響は
５０ｎｇ／槽で明らかであった。ＤＮＡ合成速度のピー
クの刺激は０．５μｇ／槽で認められ、その後は減少し
た。又ヘパリン−セファロースを用いて得られる調製品
は遺骨細胞性ＦＲＣ細胞に対しても相当の細胞分裂誘起
効果を持っていた。ヘパリン−セファロースカラムから
回収される物質をトリプシン消化に当てた場合、ＨＢ
Ｍ ＣＭ誘１ＧＦＡの９５％以上の阻害が認められた（
第３表）。
第３表 ヘパリン−セファロース上でクロマトグラフし
たＨＢＭＣＭによるＲＯ３１７／２細胞のＤＮＡ合成に
対するトリプシン消化の効果 １１ＢＭＣＭ ｃ ７２４５＋
３５７１１８ＭＣＭ ＋ ＳＴＩ ’
６３０９±６８３１１８ＭｃＭ ＋）リブシン
＋ＳＴＩ １５０２±６９無血清対照
１３３０±７５３．５９±０．２８ ２．８９±０．５２ ０．１３±０．０５ １別記せぬ限り血清不存在下で ５繰返し４つの培養槽の平均値±ＳＥ ０培養当培養へパリン−セファロース・クロマトグラフ
ィーにより得られたＨ Ｂ Ｍ ＣＭの２マイクログラ
ム ６培養当たりヘパリン−セファロース及びＳＴＩアガロ
ースクロマトグラフィーにより得られたＨ Ｂ Ｍ Ｃ
Ｍの２マイクログラム。
たＨＢＭＣＭによるＲＯ３１７／２細胞のＤＮＡ合成に
対するトリプシン消化の効果 １１ＢＭＣＭ ｃ ７２４５＋
３５７１１８ＭＣＭ ＋ ＳＴＩ ’
６３０９±６８３１１８ＭｃＭ ＋）リブシン
＋ＳＴＩ １５０２±６９無血清対照
１３３０±７５３．５９±０．２８ ２．８９±０．５２ ０．１３±０．０５ １別記せぬ限り血清不存在下で ５繰返し４つの培養槽の平均値±ＳＥ ０培養当培養へパリン−セファロース・クロマトグラフ
ィーにより得られたＨ Ｂ Ｍ ＣＭの２マイクログラ
ム ６培養当たりヘパリン−セファロース及びＳＴＩアガロ
ースクロマトグラフィーにより得られたＨ Ｂ Ｍ Ｃ
Ｍの２マイクログラム。
セファデックスＧ７５上のゲル濾過
Ｒｏｓ ｌ ７／２１１１胞のＤＮＡへの（３Ｈ）Ｔｄ
Ｒの取込みの増加により視覚化されるセファデックス０
７５カラムからのＧＦＡの溶離プロファイルは確立され
た。大部分の蛋白質と幾らかの細胞分裂誘起活性はカラ
ムの空体積近くで溶離した。活性の３つの主要なピーク
は両分１９〜３８に分離した。分子量マーカーの溶離位
置に基づいて、３つのピークの分子量は３５，０００．
１９，０００及び１０，０００以下と評価された。
Ｒの取込みの増加により視覚化されるセファデックス０
７５カラムからのＧＦＡの溶離プロファイルは確立され
た。大部分の蛋白質と幾らかの細胞分裂誘起活性はカラ
ムの空体積近くで溶離した。活性の３つの主要なピーク
は両分１９〜３８に分離した。分子量マーカーの溶離位
置に基づいて、３つのピークの分子量は３５，０００．
１９，０００及び１０，０００以下と評価された。
他の び のＨＢＭＣＭ” 調高の効
果 非造骨細胞性ＲＯ８２５／１細胞をＲＯ３１７／２細胞
と同一の腫瘍から得たが、後者と異なり造骨細胞表現型
（５）を表さなかった。ＩＩＢＭｃＦＩ誘導調製品、特
にヘパリン−セファロース段階後に得られるものはＲＯ
３２５／１細胞培養物においてＲＯ３１７／２細胞に刺
激性であったのと同様な濃度で幾らかの細胞分裂誘起反
応を引き出した。
果 非造骨細胞性ＲＯ８２５／１細胞をＲＯ３１７／２細胞
と同一の腫瘍から得たが、後者と異なり造骨細胞表現型
（５）を表さなかった。ＩＩＢＭｃＦＩ誘導調製品、特
にヘパリン−セファロース段階後に得られるものはＲＯ
３２５／１細胞培養物においてＲＯ３１７／２細胞に刺
激性であったのと同様な濃度で幾らかの細胞分裂誘起反
応を引き出した。
しかしながら、ＲＯ３２５／１細胞の反応の大きさはＲ
Ｏ３Ｌ ７／２細胞のそれと比較してかなり小さかった
。その上、ＨＢ Ｍ ＣＭ誘導調製品は非造骨細胞性Ｆ
ＲＣ細胞のＤＮＡ合成速度に対して明瞭な効果を示さな
かった（集団１〜２）。
Ｏ３Ｌ ７／２細胞のそれと比較してかなり小さかった
。その上、ＨＢ Ｍ ＣＭ誘導調製品は非造骨細胞性Ｆ
ＲＣ細胞のＤＮＡ合成速度に対して明瞭な効果を示さな
かった（集団１〜２）。
煮沸したＨＢＭＣＭを胎児の撓骨と尺骨の器官培養に添
加した場合、骨幹と全体の両方の伸長における増加によ
り表される顕著な用量依存的増加が認められた。ピーク
の効果は８μｇ／ｍｌの蛋白質濃度で認められた。この
濃度で骨幹と全体の長さの増加は生長因子無添加対照を
それぞれ２００％及び２５０％上回っていた。骨幹と全
痕跡の間の伸長の大きさの差は軟骨管端の増加した生長
の結果として生ずる。煮沸したＨＢＭＣＭのピークの効
果は正のインシュリン対照のそれの２倍近くであった。
加した場合、骨幹と全体の両方の伸長における増加によ
り表される顕著な用量依存的増加が認められた。ピーク
の効果は８μｇ／ｍｌの蛋白質濃度で認められた。この
濃度で骨幹と全体の長さの増加は生長因子無添加対照を
それぞれ２００％及び２５０％上回っていた。骨幹と全
痕跡の間の伸長の大きさの差は軟骨管端の増加した生長
の結果として生ずる。煮沸したＨＢＭＣＭのピークの効
果は正のインシュリン対照のそれの２倍近くであった。
ＩＬＩの
第４表はＰＨＡを含む培地において、煮沸したＨＢＭＣ
Ｍ又はヘパリン−セファロース段階後に得られる誘導体
のいずれも、ＩＬＬ調製品とは異なり胸腺細胞ＤＮＡへ
の（’Ｈ）ＴｄＲの取込みを刺激せず、このことはＨＢ
ＭＣＭ誘導生長因子はＩＬＩと類似しないことを示唆し
ている。
Ｍ又はヘパリン−セファロース段階後に得られる誘導体
のいずれも、ＩＬＬ調製品とは異なり胸腺細胞ＤＮＡへ
の（’Ｈ）ＴｄＲの取込みを刺激せず、このことはＨＢ
ＭＣＭ誘導生長因子はＩＬＩと類似しないことを示唆し
ている。
第４表 分離されたネズミ胸腺細胞のＤＮＡへの（’Ｈ
）ＴｄＲの取込みに対するＩＬＬ煮沸ＨＢＭＣＭ
０．４μｇ７ ４．０μｇ／ ＨＳ−ＨＢＭＣＭ’ ０．７μｇ７１．１μｇ／ ＩＬＬ ４ ５．０μｇ／ＩＬＬ ”
５．０μｇ／ＰＨＡ １
０．０μｇ／ｍｌ １７００±１３ ｍｌ １６１３±１１ ｍＩｔ ２６６７±５ ｍｌ ２２９０±１７ ｍ ｆｌ ７６３４±３５ ＋ｍβ ６５３２±３０ ｍ ｌ ２５９０±２０ ＨＢＭＣＭとＩＬＩ調製品は１０．０ｍｆｆ１のＰＨＡ
の存在下で試験した。
）ＴｄＲの取込みに対するＩＬＬ煮沸ＨＢＭＣＭ
０．４μｇ７ ４．０μｇ／ ＨＳ−ＨＢＭＣＭ’ ０．７μｇ７１．１μｇ／ ＩＬＬ ４ ５．０μｇ／ＩＬＬ ”
５．０μｇ／ＰＨＡ １
０．０μｇ／ｍｌ １７００±１３ ｍｌ １６１３±１１ ｍＩｔ ２６６７±５ ｍｌ ２２９０±１７ ｍ ｆｌ ７６３４±３５ ＋ｍβ ６５３２±３０ ｍ ｌ ２５９０±２０ ＨＢＭＣＭとＩＬＩ調製品は１０．０ｍｆｆ１のＰＨＡ
の存在下で試験した。
８つの培養ミクロ槽の平均値±ＳＥ
ヘパリンーセファロースａ階＆（７）ＨＢＭＣＭヒト単
細胞体から ヒト組換え体 ヱＤＧヱＪＪＬ ＲＯ３１７／２細胞へのポリクローナル抗ＰＤＧＦ抗体
の添加はＰＤＧＦ刺激複製を阻害するが、煮沸ＨＢＭＣ
Ｍ及びヘパリン−セファロース段階後に得られる調製品
の中程度の用量でもたらされる細胞分裂誘起効果を減少
させなかった（第８図）。
細胞体から ヒト組換え体 ヱＤＧヱＪＪＬ ＲＯ３１７／２細胞へのポリクローナル抗ＰＤＧＦ抗体
の添加はＰＤＧＦ刺激複製を阻害するが、煮沸ＨＢＭＣ
Ｍ及びヘパリン−セファロース段階後に得られる調製品
の中程度の用量でもたらされる細胞分裂誘起効果を減少
させなかった（第８図）。
これらの条件下でＨＢＭＣＭ誘導調製品中に有意量のＰ
ＤＧＦの存在が、抗血清と共に試験した場合ＲＯ３細胞
増殖の増加が減少する結果を生じたのであろう。
ＤＧＦの存在が、抗血清と共に試験した場合ＲＯ３細胞
増殖の増加が減少する結果を生じたのであろう。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、５，０００〜１０，０００、１９，０００又は３５
，０００の分子量を持つ骨形成生長因子。 ２、５，０００〜１０，０００の分子量を持つ請求項１
記載の骨形成生長因子。 ３、１９，０００の分子量を持つ請求項１記載の骨形成
生長因子。 ４，３５，０００の分子量を持つ請求項１記載の骨形成
生長因子。 ５、１００℃で１０分閤煮沸後安定である請求項１記載
の骨形成生長因子。 ６、生理的塩濃度でヘパリン−セファロースカラムから
回収される請求項５記載の骨形成生長因子。 ７、０．１５ＭのＮａＣｌで回収される請求項６記載の
骨形成生長因子。 ８、タンパク質性である請求項６記載の骨形成生長因子
。 ９、骨髄から得られる請求項１記載の骨形成生長因子。 １０、骨髄が再生される請求項９記載の骨形成生長因子
。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US21239988A | 1988-06-27 | 1988-06-27 | |
| US212,399 | 1988-06-27 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0285300A true JPH0285300A (ja) | 1990-03-26 |
Family
ID=22790844
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1162827A Pending JPH0285300A (ja) | 1988-06-27 | 1989-06-27 | 再生骨髄から得られる骨形成生長因子 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0349048A3 (ja) |
| JP (1) | JPH0285300A (ja) |
| IL (1) | IL90683A0 (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH02282396A (ja) * | 1989-02-23 | 1990-11-19 | Merck & Co Inc | 再生骨髄から同定された骨形成成長ポリペプチド |
| WO1993012807A1 (fr) * | 1991-12-26 | 1993-07-08 | Snow Brand Milk Products Co., Ltd. | Agent de consolidation des os, et aliment et boisson contenant ledit agent |
| JP2002542301A (ja) * | 1999-04-22 | 2002-12-10 | アイトゲネシッシェ、テヒニッシェ、ホッホシューレ（エーテーハー） | ヘパリン含有マトリックスからの増殖因子の制御放出 |
Families Citing this family (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5284756A (en) * | 1988-10-11 | 1994-02-08 | Lynn Grinna | Heterodimeric osteogenic factor |
| US5461034A (en) * | 1989-02-23 | 1995-10-24 | Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem | Osteogenic growth polypeptides identified from regenerating bone marrow |
| US5206023A (en) * | 1991-01-31 | 1993-04-27 | Robert F. Shaw | Method and compositions for the treatment and repair of defects or lesions in cartilage |
| US5693615A (en) * | 1991-06-05 | 1997-12-02 | The Procter & Gamble Company | Therapeutic compositions for osteoinduction |
| IL101747A0 (en) * | 1992-04-30 | 1992-12-30 | Yissum Res Dev Co | C-terminal modified osteogenic growth polypeptides |
| IL104954A (en) * | 1993-03-04 | 2006-08-01 | Yissum Res Dev Co | Use of osteogenic oligopeptides in the preparation of pharmaceutical compositions for the treatment of bone diseases and some such novel oligopeptides, pharmaceutical compositions containing them and their preparation |
| US20040081704A1 (en) | 1998-02-13 | 2004-04-29 | Centerpulse Biologics Inc. | Implantable putty material |
| US20020114795A1 (en) | 2000-12-22 | 2002-08-22 | Thorne Kevin J. | Composition and process for bone growth and repair |
| US7166133B2 (en) | 2002-06-13 | 2007-01-23 | Kensey Nash Corporation | Devices and methods for treating defects in the tissue of a living being |
| US7718616B2 (en) | 2006-12-21 | 2010-05-18 | Zimmer Orthobiologics, Inc. | Bone growth particles and osteoinductive composition thereof |
| US8613938B2 (en) | 2010-11-15 | 2013-12-24 | Zimmer Orthobiologics, Inc. | Bone void fillers |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS59190919A (ja) * | 1983-04-12 | 1984-10-29 | コラ−ゲン・コ−ポレイション | 部分的に精製された成骨因子，及び鉱物質除去された骨又は骨肉腫からのその調製方法 |
| JPS6069020A (ja) * | 1983-06-06 | 1985-04-19 | デイビツド ベイリンク | 骨格成長因子 |
| JPS60226814A (ja) * | 1984-01-04 | 1985-11-12 | ザ ダウ ケミカル カンパニ− | 骨形成因子 |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4795804A (en) * | 1983-08-16 | 1989-01-03 | The Regents Of The University Of California | Bone morphogenetic agents |
| US4627982A (en) * | 1984-07-16 | 1986-12-09 | Collagen Corporation | Partially purified bone-inducing factor |
| CA1282725C (en) * | 1986-04-18 | 1991-04-09 | Brian A. Naughton | Process for replicating bone marrow in vitro and using the same |
-
1989
- 1989-06-20 EP EP89201608A patent/EP0349048A3/en not_active Withdrawn
- 1989-06-20 IL IL90683A patent/IL90683A0/xx unknown
- 1989-06-27 JP JP1162827A patent/JPH0285300A/ja active Pending
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS59190919A (ja) * | 1983-04-12 | 1984-10-29 | コラ−ゲン・コ−ポレイション | 部分的に精製された成骨因子，及び鉱物質除去された骨又は骨肉腫からのその調製方法 |
| JPS6069020A (ja) * | 1983-06-06 | 1985-04-19 | デイビツド ベイリンク | 骨格成長因子 |
| JPS60226814A (ja) * | 1984-01-04 | 1985-11-12 | ザ ダウ ケミカル カンパニ− | 骨形成因子 |
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0349048A3 (en) | 1990-07-11 |
| EP0349048A2 (en) | 1990-01-03 |
| IL90683A0 (en) | 1990-01-18 |
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