JPH0286774A - ＮＡＤ非依存性α―グリセロール―３―リン酸デヒドロゲナーゼおよびその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、ＮＡＤ非依存性α−グリセロール３−リン酸
デヒドロゲナーゼおよびその調製、並びにトリグリセリ
ドおよびグリセロール測定におけるその用途に関するも
のである。

現在、血漿トリグリセリド類は、数種類の酵素を基礎と
する系を使用して、臨床的に測定することができる。生
物体液中のトリグリセリドを測定する、主として使用さ
れる２つの系は、以下の反応によって表される： リパーゼ （ａ）トリグリセリドーーー→グリセロール士脂肪酸グ
リセロール キナーゼ グリセロール＋Ａ　Ｔ　Ｐ　−〉ａ−グリセロール３−
リン酸＋ＡＤＰ α−グリセロ− ル−３−リン酸 オキシターゼ ベルオキシターゼ リパーゼ （ｂ）トリグリセリドーーー十グリセロール＋脂肪酸グ
リセロール キナーゼ グリセロール＋ＡＴＰ−〉α−グリセロール３−リン酸
＋ＡＤＰ ＮＡＤ’非依存性α グリセロール−３ リン酸デヒドロゲナ ーセ′ ジアホラーゼ ＮＡＤＨ十無色ＩＮＴ−＋ＮΔＤ゛十赤色還元型ＩＮＴ
一般的には、本発明は、ＮＡＤ”およびＮＡＤＰ゛非依
存性α−グリセロール−３−リン酸テヒドロゲナーゼ活
性を有する酵素に関するものである。本発明は、−態様
として、バチルス種から入手し得、実質上膜結合してい
ないことを特徴とする、ＮＡＤ非依存性α−グリセロー
ル−３〜リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有する酵素を提
供するものである。この様な酵素は、α−グリセロール
３−リン酸から、ＩＮＴ（２−（４−ヨードフェニル）
−３−（４−ニトロフェニル１−５−フェニルテトラゾ
リウム　クロリド：ｐ−ヨードニトロテトラゾリウムバ
イオレット）、ＤＣＰ　Ｉ　Ｆ（２，６ジクロロヘンゼ
ノン：２，６−ジクロロインドフェノール）、ＭＴＴ（
３−（４，５−ジメチルチアゾール−２）−２，５−ジ
フェニルテトラゾリウムチアプリルブルー）、Ｐ、ＭＳ
（Ｎ−メチル−ジベンゾピラジンメチルサルフェート：
フェナジンメトサルフェート）およびＮＢＴ（２，２’
−ジーｐニトロフェニルー５，５−ジフェニル−３，３
（３，３’−ジメトキシ−４，４゛−ジフエニレン）シ
テトラゾリウム；ニトロブルーテトラゾリウム）の様な
受容体への電子の直接の移動を触媒するので、上記反応
式（ｂ）において、ジアホラーゼ酵素によって触媒され
る反応の必要性が軽減される。本発明は、−船釣には、
α−グリセロール３−リン酸の脱水素反応を触媒する酵
素類の使用に関するものであり、これらはとりわけ、ト
リグリセリド／グリセロール／α−グリセロール−３リ
ン酸の測定に有用である。本発明はまた、トリグリセリ
ド／グリセロール／α−グリセロール−３−リン酸の測
定方法であって、必要に応じ、予めトリグリセリドから
グリセロールを調製し、必要に応じ、予めグリセロール
からグリセロール３−リン酸を調製して、α−グリセロ
ール−３リン酸を含有する試料を調製し、上記の様な酵
素の使用によりその呈色反応を触媒して所望の指標を得
ることを特徴とする測定方法に関するものである。本発
明は更に、α−グリセロール−３リン酸を供給する手段
、上記の様な酵素、およびその特有の反応を行って所望
の指標を得る手段、更に必要に応じグリセロール含有試
料からα−グリセロール−３−リン酸含有試料を調製す
る手段および必要に応じトリグリセリド含有試料からグ
リセロール含有試料を調製する手段を含有してなる、ト
リグリセリド／グリセロール／α−グリセロール−３−
リン酸測定用試験キットに関するものである。

本発明によれば、下記の反応式に基づく方法によって、
とりわけトリグリセリドおよびグリセロールを測定する
ことができる： リパーゼ （ｃ）トリグリセリド−〉グリセロール士脂肪酸グリセ
ロール キナーゼ グリセロール＋ＡＴＰ−〉α−グリセロール−３＝リン
酸＋ＡＤＰ α−グリセロール−３−リン酸＋無色ＩＮＴ本発明は、
種々の供給源からのトリグリセリドおよびグリセロール
の測定、例えば食糧および血液中のトリグリセリドの評
価に適用することができる。

本発明の好ましい酵素は、バチルス種、より詳細にはＢ
、メガテリウム（Ｂ、　ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）から得
ることができる。この様な酵素は、Ｂ、ズブチリス［オ
ウ等（Ｏｈ、Ｙ、に、、　　ｅｔ　ａｌ、　　Ｊ、Ｂａ
ｃｔ、＋　　１１３．１０３４−４５．（１９７３））
コにより報告された。この科学雑誌においては、ＮＡＤ
非依存性α−グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナー
ゼ活性は、メデイエータ−としてのＰＭＳの存在下、Ｍ
ＴＴの還元によって測定された。この様な酵素のその他
のバクテリア供給源は、リン［Ｌ　ｉｎ、　ＥＣ，Ｃ，
、Ａｎｎ、　Ｒｅｖ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、、　　３０
．　５３５＋（１９７６）］によって総括された。これ
らは、ニジエリシア・コリ、クレブシェラ・アエロケネ
スおよびロドシュードモナスを包含する。セルロモナス
・ゲリダも、供給源として記載された［ニシセ等（Ｎｉ
ｓｈｉｓｅ、Ｈ，、ｅｔ　ａｌ、、　　Ａｇｒｉｃ、Ｂ
ｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２土９．６２９−６３６．（１９８
５））参照］。

Ｅ、コリからの酵素は、精製された。これは、膜結合し
ており、抽出には、界面活性剤および高い塩濃度による
可溶化が必要である［ワイナーおよびヘソベル（Ｗｅｉ
ｎｅｒ、　Ｊ　、　Ｈ、、ａｎｄ　Ｈｅｐｐｅｌ、　Ｌ
Ａ、、　　Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ、
Ｃｏｍ、＋　　４７＋　　１３６０−１３６５．（１９
７２））参照］。

本発明の酵素は、当業者既知の通常の方法によって、種
々の供給源から得ることができる。本発明の一態様は、
適当なバクテリアを培養し、収穫し、細胞を破壊し、細
胞不含のエキスを分離し、所望の酵素を少な（とも部分
精製することからなる、該酵素の調製方法に関するもの
である。

この様な酵素は、以下に例示する方法で微生物を培養す
ることによって、バチルス種、とりわけＢ、メガテリウ
ムから得ることができる：栄養寒天スラントを使用し、
例えばグリセロール（４−１０９ｆｆ−リ、酵母エキス
（４ｇ５一つ、真菌学的ペプトン（２−４９＋２−’）
または細菌学的ペプトン（２１０９１２−’）、Ｋ　、
ＨＰ　Ｏ、（５９ｆ２−’）、ＮａＨ，ＰＯ２・２　Ｈ
、Ｏ（１ｇＦ’）、ＣａＣＱ−（０、１ｍＭ）、Ｍ　ｇ
　Ｓ　Ｏ４７Ｈ，Ｏ（１，０ｍＭ）および微量のコバル
ト、７７ガン、ホウ酸塩、銅、亜鉛および鉄（ＩＩ）を
含有している培地１００ｆｆＣに接種することができる
。

培地をオートクレーブまたは濾過によって滅菌し、７．
６の明期ｐＨとすることかできる。培養物を、回転振盪
盤（１５０−３０Ｏｒｐｍ）にて３０’Ｃで８１２時間
振盪培養することができる。この種培養を使用し、大き
な振盪フラスコまたは発酵槽に１〜１０％の接種密度で
接種することができる。

大きな振盪フラスコ中の培養物は、回転振盪盤（１５０
３００ｒｐｍ）にて３０’Ｃで８−１６時間培養すると
よい。発酵槽中の培養物は、７．０−７．６に調節した
ｐＨにて、５００−１００　Ｏｒｐｍで撹拌しながら、
３０’Ｃで８−１２時間培養するとよい。

遠心によって培養物を収穫し、例えば°゛トリトンＴ　
ｒｉｔｏｎ）”、“ブリソジュ（Ｂ　ｒｉｊ）”または
パツウィーン（Ｔ　ｗｅｅｎ）　”の様な界面活性剤を
含有する、ｐＨ７，０−７，６の緩衝液に再懸濁するこ
とができる。

通常の方法によって所望の酵素を細胞から溶液に放出さ
せ、生じた細胞残骸を遠心によって除去することができ
る。当業者なら理解できることであるが、放出された酵
素の比活性は、培養条件によって種々であり、通常、０
０３〜０．４８０／次ｇタンパクの範囲となり得る。所
望の酵素の精製は、当業者既知のゲル濾過またはイオン
交換クロマトグラフィーの様な通常の方法によって行う
ことができる。

バチルス種、特にＢ、メガテリウムから入手し得る好ま
しい酵素は、とりわけトリグリセリドおよびグリセロー
ルの測定に用いる場合、その他の既知のＮＡＤ”非依存
性酵素にない幾つかの利点を有している。例えば、これ
は、基質であるＬα−グリセロール−３−リン酸に対し
て比較的高い親和性（低Ｋｍ）（ｉｔ電子受容体しての
ＩＮＴについて、Ｋｍ＝０．１７８ｍＭ）を有している
。これは、Ｅ、コリからの酵素のＫｍ値、０．４ｍＭ（
ワイナーおよびへ、ベル、前掲）およびロドシュードモ
ナス・カプスラタからの酵素のＫｍ値、２．３ｍＭ［ラ
ッキング等（Ｌｕｃｋｉｎｇ、Ｂ、、　ｅｔ　ａｌ、　
　Ｊ、Ｂａｃｔ、、土工５．８９７−９０３．（１９７
３））参照コに匹敵する。バチルス種のバクテリアから
の好ましい酵素を使用する検定においては、ＰＭＳまた
はメナジオンの様なメデイエータ−を含有させる必要は
ない。この酵素は、他の供給源からよりも容易に抽出さ
れる。ある種の界面活性剤が使用されるが、高い塩濃度
は必要ではない。電子受容体としてＤＣＰＩＦを使用す
ると、６２ＸＩＯ−３ミリモル／分／リットル培養の活
性が得られる。高速遠心によって分画した時、高割合の
酵素活性（６０％）が細胞不含のエキス中で可溶性であ
ることがわかった。本発明の好適な酵素の重要な特性の
１つは、これが一部分、少なくとも可溶性であるという
ことである。この種の酵素として既知のものは、膜結合
している。これは、本発明方法による好ましい酵素の回
収にとりわけ好都合である。

前記の様に、多数の種類の電子受容体を本発明の酵素と
一緒に使用することができる。本発明の酵素は、この様
な色素に基づく比色分析以外に、電気化学的センサーの
様なその他の分析系で使用することができる。

本発明の一態様は、改良された酵素、および更に、好適
な供給源からのその調製に関するものである。この様な
酵素は、トリグリセリドおよびグリセロールの測定にと
りわけ有用であり、本発明の範囲に含まれるキットの構
成成分として用いることができる。

以下に詳細に説明することによって、Ｂ　メガテリウム
から得られる好ましい酵素をより具体的にホす 分子量（ゲル濾過によって測定）は、約４５００００で
ある。この酵素は、分子ｆｆ１７１，０００および１９
．０００（ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に
よって測定）のサブユニットを有している。至適ｐＨは
、トリス緩衝液を使用し、ｐＨ８，５以上であった。最
大活性の約５０％は、ｐＨ７、５で見られた。この酵素
は、その基質であるし一α−グリセロールー３−リン酸
に対し、０１７８　ｍＭのミカエリス−メンテン定数（
Ｋｍ）を有する。活性は、透析に安定である。酸素電極
を使用し、Ｌ−α−グリセロール−３−リン酸の存在下
の酸素取り込み率は同量の細胞不含のエキスについての
ＩＮＴ還元率のわずか１０％であることがわかった。従
って、酸素は、この酵素のための一次受容体ではない。

（Ｉ、−α−グリセロール３−リン酸の還元型ＩＮＴへ
の変換は、理論量的であった。）この酵素は、凍結に対
して安定であるらしい。細胞不含のエキスをリン酸緩衝
液、ｐＨ７，５によって０．５＋ｇタンパク／！１２ま
で希釈し、４°Ｃで５日間貯蔵した時、その酵素活性の
７０％が保持されている。

酵素活性は、多数の化合物によって阻害され得、例えば
、以下の化合物によって、５０％阻害が生じ得る；胆汁
酸塩（０，０３％）、硫酸アンモニウム（１％）および
デスオキシコール酸塩（＜０．０３％）。酵素活性は、
濃度１１ｍＭのＺｎ”によって完全に阻害される。

好適な酵素の回収は、以下によって、より具体的に説明
することかできる： バチルス種の培養物を、他のバクテリアの培養に際する
不純物として得た。栄養寒天スラントを使用し、グリセ
ロール（８９Ｃ−’）、酵母エキス（４９０、−’）、
真菌学的ペプトン（２！７（１−’）、Ｋ、ＨＦＯ２（
５９ｃｍす、ＮａＨ，ＰＯ，・２Ｈ２０（１１？Ｑ−’
）、ＣａＣｆ２゜（０，１ｍＭ）、ＭｇＳ　Ｏ４・７　
Ｈｔｏ　（１、０ｍＭ）および微量のコバルト、マンガ
ン、ホウ酸塩、銅、亜鉛および鉄（Ｉｆ）を含有してい
る培地１００ｍ＆に接種した。培地をオートクレーブに
よって滅菌し、７６の初期ｐＨとした。回転振盪盤（２
０Ｏｒｐｍ）にて３０’Ｃで１２時間、培養物を振盪培
養した。

この種培養１０ｘρを使用して同一培地５００ｍ（１に
接種し、回転振盪盤（２００ｒｐｍ）にて３０°Ｃで１
２時間、培養物を振盪培養した。１８，０００×ｇで遠
心して微生物を収穫し、０．５％（ｖ／ｖ）“′トリト
ンーｘ−ｔｏｏ’”を含有している０、０５Ｍ　Ｎａ、
ＨＰＯ，／ＮａＨ２ＰＯ，緩衝液、ｐＨ７，５に４°Ｃ
で再懸濁した。この細胞懸濁液を、ＭＳＥ（モデル１５
０Ｗ）音波処理装置を使用し、７Ｘ２０ｓ　バーストの
音波によって破壊処理した。１８、０００　ｘｙで遠心
し、ホモジネートから細胞残骸を除去した。上清をデカ
ントし、細胞不含のエキスとする。細胞不含のエキス中
のα−グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼの比
活性は、０、０３０／屑ｇタンパクであった。

バチルス種の栄養寒天スラントを使用し、グリセロール
（８９１２−’）、酵母エキス（４ｇρ″Ｉ）、真菌学
的ペプトン（２ｙＱ−’）、Ｋ　、ＨＰ　Ｏ，（５ｇＱ
−’）、ＮａＨ２ＰＯ，・２ＨｔＯ（１９ｊ−’）、Ｃ
ａＣ＆−（０，１ｍＭ）、Ｍｇ５Ｏ−・７ＨｚＯ（１，
０ｍＭ）および微量のコバルト、マンガン、ホウ酸塩、
銅、亜鉛および鉄（′Ｈ）を含有している培地１００ａ
ｆｆに接種した。培地をオートクレーブによって滅菌し
、７．６の初期ｐＨとした。回転振盪盤（２００ｒｐｍ
）にて３０°Ｃで１２時間振盪することによって、培養
物を増殖させた。この種培養１００ｘ＋２を使用し、グ
リセロールＣ６９Ｑ′□′）、酵母エキス（４ｇＱ−’
）、真菌学的ペプトン（２９Ｉ２−Ｉ）、Ｋ、ＨＰＯ，
（５９Ｃ−’）、Ｎａ１（２ＰＯ，・　２Ｈ，Ｏ（１ｇ
＋２−リ、　　ＣａＣ（２（０，１ｍＭ）、　　Ｍｇ５
ｏ、・７Ｈ，○（１，０ｍＭ）および微量ａ））　−１
ハル）、マンガン、ホウ酸塩、銅、亜鉛および鉄（ｎ）
を含有している発酵槽（１５００ｉＣ）に接種した。泡
立ちを制御するために、ＰＰＧＩＪ！（！を加えた。

培地をオートクレーブによって滅菌し、７．６の初期ｐ
Ｈとした。培養物を、以下の条件下、発酵槽で８時間増
殖させた：撹拌５００　ｒｐｍ、通気０゜５ρ／分、温
度３０°Ｃ，ｐＨ３Ｍ　ＮａＯＨて７．６に調節。１８
０００Ｘｙで遠心することによって微生物を収穫し、５
ｍＭ　ジメチルグルタル酸緩衝液、ｐＨ７，５に再懸濁
し、１０％の細胞濃度とした。細胞！！！％副１ｆｆｌ
を、７５％出力のインプットで１３分まで音波処理する
ことによって破壊処理した。

１８０００Ｘ９で遠心して、ホモジネートから細胞残骸
を除去した。上清をデカントし、細胞不含のエキスとし
た。細胞不含のエキス中のα−グリセロール−３−リン
酸デヒドロゲナーゼの比活性は、Ｏ，Ｉ　８６　Ｕ／ａ
ｙｇタンパクであった。

以下の分析試験系では、得られた細胞不含のエキス、お
よび部分精製α−グリセロール−３−リン酸デヒドロゲ
ナーゼを含有しているその他の試料の一部分を使用した
： ＤＬ−α−グリセロール− ３−リン酸　　　　　　　　　　　２．ＱｍＭＩＮＴ　
　　　　　　　　　　　　　　　Ｏ，５ｍＭジメチルグ
ルタル酸緩衝液、 ｐＨ７，５６０ｍＭ 吸光度の変化の割合を、５０５ｎｍ、３７°Ｃにて分光
光度計で測定した。この試験によると、精製酵素（ゲル
濾過クロマトグラフィーから）の比活性は、１．０ユニ
ツト（単位）／ｍｇタンパクであった。ここで、ｌユニ
ットとは、１分間に還元されるＩＮＴのマイクロモル数
である。

酵素を部分精製するために、細胞不含のエキスの一部を
、高速（ｔｏｏ、０００ｘ９）で９０分間回転させた。

この高速で得た上清を、゛′セファデックスＧ−２００
”ゲル濾過樹脂を含有しているクロマトグラフィーカラ
ム（Ｌ６Ｘ１５０ｃｍ）にかけた。タンパクを、５０　
ｍＭ　Ｎ　ａ２ＨＰ　Ｏ４緩衝液、ｐＨ７，５、流速７
ｘＱ／ｈで溶離した。溶出液を１．５ｉ（！フラクショ
ンづつ集め、前記試験系により分析して、α−グリセロ
ール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ活性体の溶出点を求
めた。酵素は、カラムの空容量の少し後に、４５０，０
００の分子量で溶出することがわかった。集めた活性フ
ラクションは、１０Ｕ／ｍｇタンパクの比活性を有した
。

また、α−グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ
は、陰イオン交換クロマトグラフィーを使用し、細胞不
含のエキスから精製された。細胞不含のエキスを、５０
ｍＭトリス緩衝液、ｐＨ７５で平衡化したＤＥＡＥセフ
ァロース樹脂を充填したカラムにかけた。活性体は樹脂
に結合し、５０ｍＭ　　トリス緩衝液、ｐＨ７，５中、
ＮａＣｆｆ漸増濃度（０〜１．ＯＭ）のグラジェントを
使用し、溶離した。溶出液を４村フラクシヨンで集め、
前記試験系によって分析した。酵素は、０．３〜０，８
ＭＮａＣ１２で溶出した。集めた活性フラクションは、
０．３６　Ｕ／ｙｒｇタンパクの比活性を有した。

細胞不含のエキスに１５％ポリエチレングリコールを加
えて、α−グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ
を沈澱させると、そのペレットを再溶解することによっ
て回収し得る。この方法によって、比活性が０．０５Ｕ
／ｘｇタンパクに、２倍上昇した。３３ｍＭの濃度まで
Ｚｎ’°を添加することによって、ＰＥＧでの酵素の沈
澱を増大することができる。３３ｍＭの濃度まで加える
場合、Ｚｎ’°のみを使用して酵素を沈澱させることが
できる。Ｚｎ’°による酵素活性の阻害は、酵素沈澱を
、５０ｍＭＥＤＴＡを含有している３ＱｍＭジメチルグ
ルタル酸緩衝液、ｐＨ７，５に再懸濁することによって
克服することができる。この方法によって、比活性が１
．６倍に上昇し、酵素活性の９１％が回収された。

α−グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼを、陰
イオン交換樹脂クロマトグラフィーを使用し、再懸濁し
たＺｎ”沈澱から精製した。再溶解したＺｎ”沈澱を、
５０ｍＭ）リス緩衝液、ｐｌ−ｔ７．５で平衡化したＱ
Ａセルロースを充填したカラムにかけた。活性体は、セ
ルロースに結合し、５０＋ｎＭトリス緩衝液、ｐＨ７，
５中、ＮａＣρ漸増濃度（０〜１．Ｏｍ）のグラジェン
トを使用し、溶出した。酵素は、０．７〜１．０Ｍ　Ｎ
ａＣｌ２で溶出した。集めた活性フラクションは、０．
９６　Ｕ／ｌｘｇタンパクの比活性を有していた。

非変性ポリアクリルアミド電気泳動ケル（７，５％）に
細胞不含のエキスの試料を適用し、ＤＥ５２樹脂を使用
するバッチ式イオン交換法でタンパクを回収した。泳動
後、ゲルを半分に切断し、タンパク染色、またはＤＬ−
α−グリセロール−３リン酸およびＴＮＴを含有する活
性染色で染色した。活性染色ゲル中の濃いピンクのバン
ドは、タンパク染色に見られる２本の主要なバンドの１
本に対応する。ゲル濾過クロマトグラフィーで集めた活
性フラクションのＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳
動は、酵素が、分子ｆｆ１７１，０００のサブユニット
および分子１１ｔ１９，０００のより軽い種類のサブユ
ニットで構成されていることを示した。

（上記Ｂ、メガテリウムの完全な呼称は、バチルス・メ
ガテリウムＪＥＩである。これは、ナショナル・コレク
ション・オブ・インダストリアル・アンド−７リン・バ
クテリア（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　
ｏｆ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ　ａｎｄ　Ｍａｒｉｎｅ　
Ｂａｃｔｅｒｉａ）に、１９８７年２月１６日に寄託さ
れ、受託番号ＮＣＩＭＢ１２４７０を与えられた。）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、バチルス種から入手し得、実質上膜結合していない
   ことを特徴とする、ＮＡＤ非依存性α−グリセロール−
   ３−リン酸デヒドロゲナーゼ活性を有する酵素。 ２、バチルス・メガテリウムＪＥＩ（ＮＣＩＭＢ１２４
   ７０）から得られる請求項１に記載の酵素。 ３、約０．１７８ｍＭのＫｍを有する請求項２に記載の
   酵素。 ４、適当なバクテリアを培養し、収穫し、細胞を破壊し
   、細胞不含のエキスを分離し、所望の酵素を少なくとも
   部分精製することを特徴とする請求項１〜３のいずれか
   に記載の酵素の製造方法。 ５、α−グリセロール−３−リン酸の脱水素を触媒する
   ために請求項１〜３のいずれかに記載の酵素を使用する
   方法。 ６、トリグリセリド／グリセロール／α−グリセロール
   −３−リン酸の測定方法であって、必要に応じ、予めト
   リグリセリドからグリセロールを調製し、必要に応じ、
   予めグリセロールからグリセロール−３−リン酸を調製
   して、α−グリセロール−３−リン酸を含有する試料を
   調製し、請求項１〜３のいずれかに記載の酵素の使用に
   よりその呈色反応を触媒して所望の指標を得ることを特
   徴とする測定方法。 ７、α−グリセロール−３−リン酸を含有する試料を供
   給する手段、請求項１〜３のいずれかに記載の酵素、お
   よびその特有の反応を行って所望の指標を得る手段、更
   に必要に応じグリセロール含有試料からα−グリセロー
   ル−３−リン酸含有試料を調製する手段および必要に応
   じトリグリセリド含有試料からグリセロール含有試料を
   調製する手段を含有してなる、トリグリセリド／グリセ
   ロール／α−グリセロール−３−リン酸測定用試験キッ
   ト。