JPH0286782A - ストレプトミセスからの遺伝子発現方法 - Google Patents

ストレプトミセスからの遺伝子発現方法

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JPH0286782A
JPH0286782A JP1192426A JP19242689A JPH0286782A JP H0286782 A JPH0286782 A JP H0286782A JP 1192426 A JP1192426 A JP 1192426A JP 19242689 A JP19242689 A JP 19242689A JP H0286782 A JPH0286782 A JP H0286782A
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の分野 本発明は異種（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓｌ生物活性蛋
白質、特にストレプトミセス・ゲネラＳｔｒｃｐｔｏｍ
ｙｃｅｓＱＯｎｅｒａから選択される宿主挿入発現系に
よる顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ｒＧＭＣ
ＳＦＪ）の分泌に関づる。
弁明の前頭 市販可能な蛋白質の生産においては、生物活性な形態で
ブロス中に蛋白質を分泌する微生物の能力が重要である
。しかしながら、ＤＮＡが発現される細胞によって分泌
され１ｑない、又は生物活性な形態で蛋白質を分泌し得
ない遺伝子工学的なりＮＡの構築によってコードされる
多数の蛋白質がある。蛋白質がブロス中に分泌されない
揚台は、ダウンストリームプロセッシングを要する。こ
れは、細胞は採取される必要があり、細胞壁は破壊され
ねばならず、所望の蛋白質は純粋な形態で取り出され、
次いでこのＪ：うな蛋白質は化学的に再生して（ｒｅ−
ｎａｔｕｒｅｄ）、その生物活性を修復（ｒｅｓｔｏｒ
ｅ）　Ｌなければならない。蛋白質がブロス中に分泌さ
れるが、しかし生物活性な形態ではない場合は、分泌後
に蛋白質を処理し、生物活性を再び保持するようにしな
ければならない。
細胞及び微生物の中には、生物活性な形態で蛋白質を分
泌することによりダウンストリームプロセッシング（ｄ
ｏｗｎｓｔｒｅａｍ　ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ）と生物学
的に等価なことを行うものもある。Ｈ胞外面を通しての
細胞の外部環境へのある蛋白質の分泌を支配する機序は
未だ十分に理解されているわけではない。例えば、スト
レプトミセス・グリセウスＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　
　ｇｒｉｓｅｕｓ種は生物活性な形態で多数の細胞外蛋
白質を分泌する。生物活性がそれらの特別な五次元分子
構造に依存する商業的価値のある異種蛋白質が、天然の
細胞外蛋白質について観察されるレベルでストレプトミ
セスＳｔｒｃｐｔｏｍｙｃｅｓから分泌される場合は好
都合である。
遺伝子工学的なりＮＡの構築に関する文献の中には、Ｄ
ＮＡに含まれる情報を用いる機能性蛋白質の産生はＤＮ
Ａのコードを解読することにより解決されると仮定した
ちのもあった。この仮定は、蛋白質分子の複雑な三次元
構造を特定するために必バな情報がその蛋白質の一次ア
ミノ酸配列中に含まれる、という原則に基づいていた。
しかしながら、１９８５年１１月　１日にＣａｎｇｃｎ
ｃ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ有活性蛋白質の産生）とい
う表題のカナダ国特許出願第４４９．４５６号明細書に
は、遺伝子工学的なり’ＮＡの構築に由来するある種の
蛋白質の生物活性は正しく位置したジスルフィド結合の
形成によることが例証されている。宿主細胞又は微生物
における異種遺伝子の発現に関して、慣用法よりもざら
に右動な方法が探索された。そこで、その発明は、ダウ
ンストリームプロセッシングを要せずに生物活性な形態
で宿主微生物からｙ４種蛋白質が分泌され得ることを明
らかにした。ある発現系である種の微生物を使用すると
、遺伝的工学的なりＮＡ構築の発現においてジスルフィ
ド結合の形成が促進される。それらの活性構造の組型で
必然的な部分としてシスヂン残塁を有する！ｉｌ造され
た蛋白質の生物活性は、同種のジスルフィドで結合され
た蛋白質を発現及び排出可能な■胞又は微生物から選択
される調節（ｒｅＱｕ　１ａｔｏｒｙ）ヌクレオチド配
列を用いることにより達成された。そのヌクレオチド配
列は、ジスルフィド結合を含有する異種蛋白質をコード
する二次ヌクレオチド配列に遺伝子操作により結合され
ｒする。調節ヌクレオチド配グ１は細胞又は微生物から
の異種蛋白質の分泌を引き起こす蛋白質をコード化した
。異種蛋白質は天然のものでも又はデザインしたもので
ちＪ：かった。
ｃａｎａｇｃｎｅ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎが１９８７
年　７月２１日に提出ｓｔｒｅｐｔｏｍ　ｃｅｓ　Ｇｒ
ｉｓｃｕｓ　（ストーブ１〜ミヒス・グリセウスからの
プロテアーゼＡ及びプロテアーゼＢに関する遺伝子のキ
ャラクタリピーション及び構造）という表題のカナダ［
η特許出願第５４２．６２８号明細書には、同種（ｈｏ
ｍｏｇｅｎｅｏｕｓ　）遺伝子の発現系が開示されてい
る。その発明は、ストレプトミセス・グリセウスＳｔｒ
ｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　　ｇｒｉｓｅｕｓからのプロプア
ーゼＡ及σプロテアーピＢの分；必を支配する調節ヌク
レオチド配列に関り゛るものであった。
プロテアーゼΔ及びプロテアーゼＢはストレプトミセス
・グリセウス壮筬■」■Ｏ３０ｒｉＳｅＵＳ　ＩＣ１３
いては天然に生じる蛋白質ぐあり、したがって、用語的
には「同種」である。その出願は、ストレプトミセスＳ
ｔｒｃｐｔｏｍｙｃｅｓにおけるある型の同種分泌に関
与する調節ヌクレオチド配列を開示するものであった。
同種発現に関与する遺伝子発現系は異１発現に関するそ
の伯の種々の発現系を構築するに際して有用である。
顆粒球マク［！ファージコ［に一刺激因子（ｒＧＭ−Ｃ
ＳＦＪ　）は白血球産生を刺撒する蛋白質である。Ｇ〜
Ｉ−ＣＳ　Ｆは癌治療に関連して使用する生化学的医薬
として非常に有望であり、白血球の修復を促進する。天
然由来のＧＭ−ＣＳＦは１２７個のアミノ酸と２個のジ
スルフィド結合を有する糖蛋白質（ｇｌｖｃｏｐｒｏｔ
ｅｉｎ）である。ＧＭＣＳＦは自然状態でヒトにおいて
は痕跡量存在するにすぎず、このため天然から単離され
た蛋白質の３Ｔ細な構造分析が妨げられていた。したが
って、天然ＧＭ−ＣＳＦの構造についてのデータのほと
んどは韻乳類ｍ胞における相補的ＤＮＡ配列及び相補的
ＤＮＡクローンの発現を分析することにより得られる。
吐乳類細胞において発現されるＧＭ−〇ＳＦは　１２７
個のアミノ酸と２個のジスルフィド結合を含有し、また
１４〜３５キロダルトンのサイズの範囲で異なったグリ
コシル化形態で存在する。
ある形態のＧＭ−ＣＳＦは２個のＮ一連結炭水化物基及
び／又は３個の〇一連結炭水化物基を含有し得るが、こ
れは外見上明らかなサイズの不均一性の原因となる。
ＨＯＯｎｅｎ等（１９８７）は、ハムスターの卵巣細胞
からの分泌によるＧＭ−ＣＳＦ産生に関する方法を報告
している。ＧＭ−ＣＳＦは、生物学的に活性である２６
−キロダルトン糖蛋白質として分泌される。しかしなが
ら、炭水化物基を酵素的に除去することにより生物学的
活性は２０倍に増大され、このことは非グリコシル化形
態のＧＭ−ＣＳＦが臨床的使用においては優れているこ
とを示している。
Ｅｒｎ５ｔ等（１９８７）は、アルファ交配因子前駆体
の使用による酵母菌ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　　ｃ
ｅｒｅｖｉｓｉａｅからの分泌によるＧＭ−ＣＳＦ産生
に関して報告している。ＧＭ−ＣＳＦは、３５〜１００
キロダルトンのサイズ範囲の糖蛋白質の不均質混合物と
して分泌される。分泌ＧＭ−ＣＳＦの一部分のみがアル
ファ交配因子前駆体から正しく処理されて得られた。酵
母菌及び吐乳類細胞において作られるグリコシル化ＧＭ
−ＣＳＦの特異的な生物学的活性はほぼ同じであった。
しかしながら、酵母菌において産生されるＧＭ−ＣＳＦ
の結合炭水化物基の構造は１１１乳類細胞で産生される
ＧＭ−ＣＳＦの天然炭水化物基とは異なっていた。
Ｂｕｒｇｅｓｓ等（１９８７）は、大腸菌Ｅ、　ｃｏｌ
ｉの細胞質からの非グリコシル化ＣＭ−ＣＳＦ様ボリペ
ブ。
ヂドの産生方法を報告している。Ｅ、　ｃｏｌｉ細胞か
ら単離されたままのＧＭ−・ＣＳＦ様ポリペプチドはア
ミン末端メチオニンを有し、また還元され、変性されて
生物学的に不活性であった。Ｅ、　ｃ。
からＩｌ雌された生物学的に不活性なＧＭ−ＣＳＦ様ポ
リペプチドの生物活性な形態への変換には、ｎ　Ｖｉｔ
ｒＯでの酸化的再生を要した。Ｅ、　ｃｏｌｉ産生蛋白
質中にアミノ末端メチオニンが存在するため、再生ＧＭ
−ＣＳＦ様ポリペブヂドは依然として非グリコシル化形
態のＧＭ−ＣＳＦと同等ではなかった。
吐乳類細胞又は酵母菌により分泌されるＧＭ−ＣＳＦは
生物活性を示すが、しかしグリコシル化されていない。
ｃ、　ｃｏｌｉから単離されるＧＭ−ＣＳＦはグリコシ
ル化されていないが、しかし生物活性を示さない。した
がって、Ｇ　Ｍ　−ＣＳ　Ｆを産生する慣用的方法は、
培養物からのＧＭ−ＣＳＦの形態を臨床的使用に好まし
い生物活性な、非グリコシル化ＧＭ−ＣＳＦに変換する
ために、したがって、分泌時に生物活性な蛋白質、特に
生物活性なＧＭ−ＣＳＦを提供する発現系が必要とされ
ている。このような蛋白質産物は構造が生物活性を決定
する訳であるから、構造的に従来の蛋白質産物とは異な
ったものであろう。
発明の要約２ 本発明は、異種蛋白質、特にストレプトミセス江坦■憇
旦射属から選択される宿主からの生物活性な形態での顆
粒球マクロファージコロニー刺激因子（ｒＧＭ−ＣＳＦ
Ｊ　）の分泌を支配する多数の発現系に関する。本文中
では、情況により別の定義が必要な場合を除いては、ｒ
ＧＭ−ＣＳＦＪは木質的に純粋な、非グリコシル化、酸
化ＧＭＣＳＦ蛋白質を意味する。本発明に従って産生さ
れる生物活性なＧＭ−ＣＳＦは、グリコシル化されてい
ないが、しかしながら他の点では天然の対応物によく似
ている。本発明のＧＭ−ＣＳＦは、その天然の対応物と
同様、正しい位置に分子間ジスルフィド結合が存在する
。本発明に従って産生される新規物質はＧＭ−ＣＳＦノ
グリテインと呼ばれる。ＧＭ−ＣＳＦノグリテインは宿
主生物即ちストレプトミセス５ｔｒｅｐｔｏ＋ｎｙｃｅ
ｓ属から選択される宿主から分泌される際、十分な生物
活性を有し、また天然ＧＭ−ＣＳＦ糖蛋白質の全ての構
造的特徴を示す。
本発明に従って、遺伝子発現系は、異種蛋白質をコード
する二次ヌクレオチド配列と結合づる調節ヌクレオチド
配列を有する形で使用される。
調節配列はシグナル配列及びプロモーター配列を包含す
る。シグナル配列は、ストレプトミセスＳｔｒｅｐｔｏ
ｍｙｃｅｓ属から選択する宿主からの生物活性な形態で
の異種蛋白質の分泌を支配するペプチドをコードする。
天然配列又は合成配列あるいは天然配列と合成配列の組
み合わせであってもよい二次ヌクレオチド配列は異種蛋
白質をコードする。
記載の発現系は、生物活性な形態のコード化された蛋白
質のストレプトミセスＳｔｒｅｐｔｏｍ　ｃｅｓ宿主か
らの分泌をもたらす。本発明の発現系は他の宿主中で使
用可能であると予測される。さらに、これらの発現系を
、本発明の教示に従って、０ＭＣＳＦ以外の異種蛋白質
の分泌をもたらすのに用いてもよい。
特に、本発明は、ストレプトミセス Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属から選択する宿主からの生
物活性な形態での顆粒球マクロファージコロニー刺激因
子（ｒＧＭ−ＣＳＦＪ　）の分泌のための遺伝子発現系
に関する。遺伝子発現系は、ＧＭ−ＣＳＦをコードする
二次ヌクレオチド配列に連結する調節ヌクレオチド配列
を包含する。この調節配列はシグナル配列及びプロモー
ター配列を含む。シグナル配列はストレプトミセスＳｔ
ｒｅｐｔｏｍｙｃｅＪ１か天然配列又は合成配列あるい
は天然配列と合成配列の組み合わせであってもよい二次
ヌクレオチド配列は、Ｇ　Ｍ−ＣＳ　Ｆをコードし得る
。
シグナル配列は、ストレプトミセス する。シグナル配列は、ストレプトミセス・グリ廿ウス
Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　　ｇｒｉｓｅｕｓプロテア
ーゼＢ１ストレブトミヒス・ブリカートス江組匹匹五」
ＰＩ　１ｃａｔｕｓエンド−Ｂ−Ｎ−アセヂルグルコサ
ミニダーＬ’Ｈのシグナルペプチド、これらの任意のペ
プチドのハイブリッド、あるいはストレプ１ヘミレスＳ
ｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属から選択りる宿主からの異種
蛋白質、特にＧＭ−ＣＳＦの分泌を支配する任意の他の
シグナルペプチドをコードし１ｑる。シグナル配列は、
グラム陽性細菌、ダラム陰性細菌のシグナルペプチド又
はこれらのペプチドのハイブリッドをコードし得る。さ
らにまた、シグナル配列は、ストレプトミセス５ｔｒｅ
　ｔｏｍｙｃｅｓど他の細菌のシグナルペプチドのハイ
ブリッドをコードし１する。
異種蛋白質のアミン末端に連結するシグナルペプチドよ
り成る融合蛋白質をコードするＲＮＡの合成を指示する
プロモーター配列は、少なくとも１つの型のストレプト
ミセスＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｃｓＲＮ△ポリメラーゼホ
ロ酵素の特異的な結合及びそれによる転写を可能にする
。プロモーター配列は、少なくとも１種類のストレプト
ミセスｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃＣｓＲＮ△ボリメラーゼホ
［１酵素の特異的な結合及びそれによる転写を可能にす
るストレプトミセス・フラツフＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅ
ｓ　　ｆｒａｄｉａｅのアミノグリコシドホスホトラン
スフェラーゼ遺伝子（ｒａｐｈＪ）からの配列を包含し
てもよい。
発現系をストレプトミセスＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓに
おいて形質転換及び複製が可能なベクターに挿入し、こ
のベクターをストレプトミセス壮匹鮭」■卦属から選択
する宿主中に挿入する。
本発明の他の側面では、ストレプトミセスＳｔｒｅｐｔ
ｏｍｙｃｅｓ属から選択する宿主から分泌される生物活
性な形態の顆粒球マクロファージコロニ刺激因子の産生
方法を用いる。その方法は、生物活性な形態でのＧＭ−
ＣＳＦの分泌を支配するペプチドをコードする配列とＧ
Ｍ−ＣＳＦをコードする配列を連結し、その配列をスト
レプトミセス江匹■叩五月中での形質転換及び複製が可
能なベクターに挿入し、そのベクターをストレプトミセ
スＳｔｒａｐｔｏｍｙｃｅｓ１４から選択する宿主中に
挿入し、その形質転換宿主を育成して、生物活性なＧＭ
−ＣＳＦを取り出すことを包含する。
本発明に従って、異種蛋白質と融合するシグナルペプチ
ドをストレプトミセスＳｔｒｅｐｔＯｍ■卦属から選択
する宿主中での異種発現（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓｅ
ｘｐｒｃｓｓ　ｉ　ｏｎ　）により産生ずる。
本発明に従って、ＧＭ−ＣＳＦに融合するシグナルペプ
チドをストレプトミセスＳｔｒｅｐｔＯｍｙＣｅＳ属か
ら選択する宿主中での異種発現により産生する。
本発明に従って、生物活性な蛋白質をストレプトミセス
壮匹■ｏｍｙｃｅｓ属から選択１′る宿主中での異種発
現により産生ずる。
本発明に従って、生物活性なＧＭ−ＣＳＦをストレプト
ミセス壮胆旦竺旦と属から選択する宿主中での異種発現
により産生ずる。
組み換えＤＮＡから誘導されるＧＭ−ＣＳＦは、適当な
宿主、特にス１〜レブトミセス廷阻■印五」属から選択
する宿主から生物活性形態で分泌される。ＧＭ−ＣＳＦ
は分泌に際してグルコシル化されず、また分子内ジスル
フィド結合を有する。
好ましい実施態様の詳細な説明 本発明は、発現系を使用してのストレプトミセス５ｔｒ
ｅ　ｔｏｍ　ｃｅｓからの直接分泌による生物学的に活
性な形態のヒトＧＭ−ＣＳＦの産生方法に関するもので
ある。
本発明はまた、他の異種蛋白質の産生に使用可能な発現
ベクターに関する。発現系は、特定の蛋白質をコードす
る遺伝子、即ち正しくプロセッシングされた蛋白質の成
育媒質への分泌を支配するジグ±ルベブチドをコードす
る核酸配列：及びその蛋白質を］−ドし、ｍＲＮＡの転
写を支配することができるプロモーターを含有する。当
業者には公知のように、発現系は、転写終了に関する付
加的な核酸配列や翻訳の開始と終了に関する付加的な核
酸配列を包含する。
好ましい実Ｍ態様においては、発現系内に含まれる遺伝
子は蛋白質ヒトＧＭ−ＣＳＦをコードする（Ｌｅｅ等、
　１９８５　；　Ｗａｎｇ等、　１９８５）　、　ＣＭ
−ＣＳＦ遺伝子、特に図１におけるＤＮＡ配列で表わさ
れるものは、ストレプトミセスＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅ
ｓのコドン使用（ｃｏｄｏｎ　ｕｓａｇｅ）に従って作
られた合成りＮＡである；即ち、３位にＣ又はＧを有す
る］トンである（Ｂｉｂｂ等、　１９８５）。該遺伝子
は、ストレプトミセスＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓコドン
使用あるいは任意の他のバイアス化又は全くランダムな
］トン使用によって、ＧＭ−ＣＳＦについての天然のｃ
ＤＮＡ配列でもよく、あるいはＧＭ−ＣＳＦをコードす
る任意の他のＤＮＡ配列でもよい。その遺伝子は、１つ
又はそれ以上のアミノ酸が天然のアミノ酸配列中で置換
ざ机、挿入され、又は欠失されたＧＭ−ＣＳＦの生物学
的に活性な誘導体をコードし得る。
発現系内に含まれる異種遺伝子は、別の有用な蛋白質を
コードする天然ｃＤＮＡ配列か又は合成りＮＡ配列であ
ってもよい。組換えＤＮＡ配列によりコードされる特定
の蛋白質としては、キモシン、キモトリプシン、トリプ
シン、アミラーゼ、リグニナーゼ、エラスターゼ、リバ
ーぜ及びセルラーゼといったような真核生物性分泌１’
Ｐｉ索；グルコースイソメラーゼ、アミラーゼ、リパー
ゼ、ペクチナーピ、セルラーゼ、プロテア−ゼ、オキシ
ダーゼ、リグニナーゼのような原核生物性分泌酵糸；ヒ
ルジン、ベーターラクタマーゼ阻害剤、及びアルファ１
−抗トリプシンのような酵素阻害剤ニス−パーオキシド
ジスムターゼのような金属酵素：ファクター■、ファク
ターＩＸ　、組織型ブラスミノーゲンアクチベーター及
びウロキナーゼのような血液因子；プロインシュリンの
ようなホルモン；ベーターインターフェロン及びガンマ
−インターフェロン、並びにインターロイキン−２のよ
うなリンフ才力イン；腫瘍壊死因子、リンフォトキシン
、及びインターロイキン−１のような細胞毒素：神経成
長因子、上皮成長因子、形質転換成長因子、血小板由来
性成長因子、及び繊維芽細胞成長因子のような成長因子
；インターロイキン−３及び顆粒球コロニー刺激因子の
ような他のコロニー刺激因子；合成抗体分子、デザイン
された抗体分子、又は遺伝子工学による抗体分子のよう
なイムノグロブリン関連分子；コレステロール受容体の
ような細胞受容体；ウィルス性へマグルチニン、エイズ
抗原及びイムノゲン、Ｂ型肝炎抗原及びイムノゲン、手
足ロ病ウィルス抗原及びイムノゲンのようなウィルス性
抗原；プロティンＡのようなｉｌｌ菌表面エフエクター
二蛋白質殺虫剤、殺藻剤、殺菌剤、及び殺生物剤のよう
な毒素；心筋梗塞蛋白質（ＭＩＰ）、体重制御因子＜Ｗ
ＣＦ）、及び熱ωキモ白質（ＣＲＰ）のような医学的重
要性を有する全身性蛋白質などが挙げられる。
該遺伝子は、ｉｎ　ｖｉｔｒｏで又は培養中で活性形態
にプロレッシングし得る生物学的に活性な蛋白質の不活
性前駆体くチモーゲン）をコードすることが可能であっ
た。その遺伝子は、１つ又はそれ以上のアミノ酸が天然
のアミノ酸配列において置換され、挿入され、又は欠失
された有用蛋白質の生物学的に活性な誘導体をコード可
能であった。さらに、遺伝子は、２つ又はそれ以上の有
用蛋白質の生物学的に活性な融合蛋白質、あるいは配列
内の相同位置から甲−アミノ酸又はアミノ酸ブロックを
交換することにより作成可能な２つ又はそれ以十の相同
蛋白質のハイブリッドを」−ド可能であった。
シグナル配列は、アミン末端融合蛋白質として生合成さ
れ、異種蛋白質に連結される場合、正しいアミノ末端基
を有して、媒質中への異硬蛋白質の分泌を指示可能な任
意のアミノ酸配列をコード可能であった。好ましい実／
ＩＩ！ｉ態様においでは、ストレプトミセス・グリセウ
ス壮筬■聾五層ＬＬＵＵ」」−プロテアーゼＢ（カナダ
国特許出願第５４２．６４８号明１Ｑ１．，１９８７年
　７月２１日にＣａｎｇｅｎｅＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ
が出願した。）を用いて０ＭＣＳＦ：特に配列Ｍ　ＲＩ
　Ｋ　ＲＴ　Ｓ　Ｎ　ＲＳ　Ｎ　Ａ　Ａ　ＲＲＶＲＴＴ
ＡＶＬＡＧＬＡＡＶＡＡＬＡＶＰＴＡＮへの３８−アミ
ノ酸ペプチドの分泌を指示する。
別の実７７Ｉ態様においては、Ｇ　Ｍ−ＣＳ　Ｆの分泌
を支配するために使用されるシグナルペプチドは、アミ
ノ末端基でストレプトミセス・ブリカートスＳｔｒｅｌ
）ｔｏｍＶｃｅｓ　　ｐｌ　１ｃａｔｔ＋ｓエンド−Ｂ
　−、Ｎ−アセチルグルコサミニダーＬ’Ｈ（エンド１
」）シグナルペプチドの９〜３４番目のアミノ酸に連結
する」工ｇｒｉｓｃｕｓプロテアーゼＢシグナルペプチ
ドの最初の１５個のアミノ酸より成るハイブリッド（Ｒ
ｏｂｂｉｎｓ等、　１９８４）　：特に配列ＭＲＩＫＲ
ＴＳＮＲ８Ｎ△ＡＲＲＶＲＴＡＡＬＡＬＳＡＡＡＡＬＶ
ＬＧＳＴＡＡＳＧＡＳへの４１−アミノ酸ペプチドであ
る。
ＧＩＶＩ−ＣＳＦの分泌は、本発明に詳記のＳｐ＋：ｃ
ａｔｕｓエントド４のシグナルペプチド：特に配列ＭＦ
ＴＰＶＲＲＲＶＲＴＡＡＬＡＬＳＡＡＡＡＬＶＬＧＳＴ
ＡＡＳＧＡＳＡの３４−７ミ／１１べ７チドによっても
支配可能であった。分泌はさらに、別のストレプトミセ
スＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　　シグナルペプチド：特
に−電工」工工とと掻−ブロチアーゼ△、−鉦」■±３
８ｕＳ−アミラービ、５ｔｒｅｌ）ｔｏＩｌｌＶｃｅｓ
　　Ｒ６１ＤＤ−ペプチダーゼのシグナルペプチド、又
は当業界で公知の別の５ｔｒｅ旦Ｑシグナルペプチド（
Ｃｈａｎｇ、　１９８７）により支配可能であった。分
泌はまた、上記シグナルペプチド又は全般的合成アミノ
酸配列を有するシグナルペプチドのハイブリッドの支配
下でも遂行可能であった。シグナルペプチドは、グラム
陽性細菌からのもの：特にバヂルス・ズブヂルスＢａｃ
ｉｌｌｕｓ　　５ｕｂｔｉｌｕｓアルカリ性プロテアー
ゼ（ａｐｒ）のシグナルペプチド、又は当業界で公知の
グラム陽性細菌の別のシグナルペプチド（Ｃｈａｎｇ、
　１９８７）であってもよい。シグナルペプチドはまた
、ダラム陰性細菌からのもの；特に大腸菌Ｅｓｃｈｅｒ
ｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ外膜プ外膜プロティングナルペプ
チド、又は当業界で公知のダラム陰性細菌の別のシグナ
ルペプチド（ｓＪｏｓｔｒｏｍ等　１９８７）であって
もよい。シグナルペプチドはまた、２つ又はそれ以上の
細菌シグナルペプチドのハイブリッドであってもよい。
ある実施態様において、ＧＭ−・ＣＳＦの分泌を支配リ
−るために使用されるシグナルペプチドは、アミン末端
基で８．５ｕｂｔｉｌｕＳａｐｒシグナルペプチドの６
〜３０番目のアミノ酸に連結される１工肛旦剋とプロテ
アーゼＢシグナルペプヂドの最初の１５個のアミノ酸よ
り成るハイブリッド：特に配列ＭＲＩ　ＫＲＴＳＮＲ８
ＮＡＡＲＲＶＷＩＳＬＬＦＡＬＡＬ　Ｉ　ＦＴＭＡＦＧ
ＳＴＳＳＡＱＡの４０−アミノ酸ペプチドである。ＧＭ
−ＣＳＦに加えて、他の異種蛋白質は、本発明に詳記の
シグナルペプチド又は当業界で公知の他の細菌シグナル
ペプチドを有するストレプトミセスＳｔｒｅｐｔｏｍｙ
ｃｅｓから分泌可能であった。達成し得る分泌のレベル
は培養物の１μｑ／ｆＪ以上であるが、好ましくは１１
１１ｇ、１以上である。
プロモーターは、異種蛋白質のアミノ末端基に連結され
るシグナルペプチドより成る融合蛋白質をコードメする
ＲＮＡの合成を支配する。プロモーターは、少なくとも
１種類のストレプトミセスＳｔｒｃｐｔｏｍｙｃｅｓＲ
Ｎ　Ａポリメラーゼホロ酵素の特異的結合及びそれによ
る転写を可能にする。好ましい実施態様においては、ス
トレプトミセス・フラディア／汗坦■匣り月ｒｒａｄｉ
ａｅアミノグリコシドボスボトランスフェラーゼ遺伝子
（ｒａｐｈ　Ｊ　）のプロモーター（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ
とＧｒａｙ、　１９８３）を使用して、Ｇ　Ｍ　−ＣＳ
　Ｆ　ｌｊ　融合されるシグナルペプチドをコードする
ｍＲＮＡを転写する。
このプロモーターは、少なくとも１種のストレプトミセ
スＲＮＡポリメラーゼホロ酵素の特異的結合及びそれに
よる転写を可能とする。プロモーターは、ストレプトミ
セス・エリ／スレウス江咀吐馴旦勉　虹ヱＰＥμ長−■
リスロマイシンＥ、ストレプトミセス・コエリコＩコア
ｓｔｒｃｐｔｏｍｙｃｅｓｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒアガラ
ーゼを含む別のストレプトミセスの種廷匹旦叩…ｅｓ　
　ＳＤＤ、から、あるいは当業界で公知の方法により立
証されるようなプロモーター活性を有する公知の又は未
確定起源の任意の配列からのものであってもよい。プロ
モーターは、１つ以上の天然プロモーター配列又は完全
合成プロモーター配列のハイブリッドであってもよい。
プロモーターは、向上した機能を有するプロモーターの
突然変異性体（ｖｅｒｓｉｏｎ）を得るために１つ又は
それ以上の基が置換され、挿入され又は欠失された天然
配列又はハイブリッド配列であってもよい。突然変異は
、ランダム様式又は部位指示模式で、並びにｉｎ　Ｖｉ
ｔｒＯ又は原核生物宿主細胞内で、化学的に又は酵素的
に発生し得る。
プロモーターは、１つの転写開始部位を有する単一プロ
モーターであっても、又は２つ以上の転写開始部位を有
する多重プロモーターであってもよい。好ましい実施態
様においては、ａｐｈプロモーターは、転写開始に関す
る２つの部位を有するＤＮＡフラグメント上に位置する
。部位１は、翻訳イニシエーターΔＴＧの八で転写を開
始し、−方部位２は、部位１からざらに３１３塩基上流
で転写を開始すると考えられる。別の実施態様では、開
始部位１のみを有するａｐｈプロモーターを用いて、Ｇ
Ｍ−ＣＳＦに融合するシグナルペプチドをコードＪるｍ
ＲＮＡを転写する。多重のプロモーターの各転写開始部
位は、同一の又は異なる種類のＲＮΔポリメラーゼホロ
酵素により認知され得るし、また同−又は異なる成長時
間あるいは発育状態において活性であり得る。多重の転
写開始部位を有するプロモーターは、天然配列であって
もよく、あるいは１つ以上の天然又は合成単一ブ〔１モ
一ター配列より成るハイブリッド配列であってもよい。
プロモーターは、単一であれ多重であれ、培養（構成的
）中のいかなる時間でも活性であり得るし、あるいはあ
る種の媒地成分、代謝物質、又は化学薬品の存否により
、調節可能である。さらに、プロモーターは、培養の温
度又は化学環境の変化により調節可能である。
好ましい実施態様においては、ａｐｈプロモーターを、
蛋白質、特にＧＭ−ＣＳＦを］−ドする核酸配列にフレ
ーム内に連結されるシグナルペプチドをコードする核酸
配列に連結する。ＮＣ０Ｉ制限工ンドヌクレアーゼ部位
を用いて、ａｐｈプロモーターを、シグナルペプチドを
コードする合成オリゴヌクレオチドに連結した。この部
位は、この立体配座においてシグナルペプチドのアミン
末端メチオニンを表わすａｐｈ遺伝子の天然イニシエー
タＡＴＧを含有する。ストレプトミセス・リビダンス５
ｔｒＱｔｌｌｔＱＩＩＩＶＣ（！Ｓ　　１ｉｖｉｄａｎ
ｓの１８３リボゾームＲＮＡの３°端に対して補完的な
りＮＡ配列を、翻訳の開始を増大するためにこのＮｃｏ
Ｉ部位で含入することができる。便宜上、ｐｓｔ■部位
又はＮ５ｉＩ部位を、シグナルプロセッシング部位に位
冒さばて、分泌さけるべき蛋白質をコードするＤＮＡ配
列を連結する。ｐｓｔＩ部位又はＮ５ｉＩ部位における
ＧＣＡコドンは、シグナルペプチドのカルボキシ末端で
のアラニンを表わす。好ましい実施態様では、コード化
シグナルベブヂドのカルボキシ末端が、関係のあるコー
ド化蛋白質のアミノ末端に直接融合されるようＤＮＡ配
列を形成する。配列をコードする付加的ペプチドをＰＳ
ｔＩ部位又はＮ５ｉ１部位に挿入して、シグナルペプチ
ドの分泌又はプロセッシングを促進してもよい。その結
果生じるアミノ末端延長を有Ｊる蛋白質を、自然工程に
より培養中に、あるいは公知の化学的又は酵素的方法に
より＋ｎ　　ＶｉｔｒＯで除表してもよい。
本発明の明細書に記載のシグナルペプチド、特に３８−
アミノ酸ブ［１テアーゼＢジグ犬ルペブチド、３４−ア
ミノ酸エンドＨシグナルペプチド、４１−アミノ酸プロ
テアーゼＢ−エンドＨハイブリッドシグナルベブチド、
及び４０−・アミノ酸プロテアーピ３−ａｐｒハイブリ
ットシグナルベブチドを、異種蛋白質の分泌に関して、
本発明に記載のもの以外の発現系とともに使用し得ると
予測される。本発明に記載のシグナルペプチドを、他の
発現系、特に他のグラム陽性細菌に関する発現系（Ｃｈ
ａｎｇ　。
チ １９８７）　、殊にバＺルス・ズブチルスＢａｃｉｌｌ
ｕｓＳＵｂｔｉｌｉＳ及びスタフィロコッカス・オウレ
ウス５ｔａｐｈｙｌＯＣＯＣＣｕＳ　　ａｕｒｅｕｓに
関する発現系で使用してもよい。
Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ以外の細菌宿主中で自然工程
により、本発明に記載のシグナルペプチドの１つをコー
ドづるＤＮＡセグメントに連結し、異種蛋白質をコード
するＤ　Ｎ　Ａ　ｔグメントに連結する、プロモーター
として礪能するＤＮＡセグメントを含む発現系から合成
可能であると予測される。融合蛋白質は、そのアミン末
端で本発明に記載のシグナルペプチドの１つを有し、そ
のカルボキシ末端で０ＭＣＳＦであり得る異種蛋白質を
有するであろう。
シグナルペプチドのカルボキシ末端は異種蛋白質のアミ
ン末端に直接連結して、融合蛋白質を形成してもよい。
融合蛋白質は、細菌宿主にお【プる異種蛋白質の分泌に
有用であろう。
プロモーター、シグナルペプチドをコードする核酸配列
、及び関係する特定の蛋白質をコードする核酸配列より
成る菫伝子発現系は、ストレプトミセスＳｔｒｅｐｔｏ
ｍｙＣｅＳにおいて形質転換及び複製が可能なりＮＡベ
クター中に存在する。本ベクターは、ｐＩＪｌｏｌ　、
ＤＳＬＰｌ、２　、　ｐＳＣＰ２　＊を含むＳｔｒｅｐ
ｔｏｍｙｃｅｓの天然由来のプラスミド、又は０Ｃ３１
を含むＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓの天然由来のファージ
、あるいは廷匹旦竺五卦にお１ノる複製が可能な任意の
非−ストレプトミセス性プラスミド又はバクテリオファ
ージの各々の誘導体を含有し得る。ベクターは、宿主生
物中で自律的複製が可能であるか、あるいは宿主生物の
染色体又は大型染色体外因子への統合（ｉｎｔｅｇｒａ
ｔｉｏｎ）を必要とづる場合もある。
後者の場合、ベクターは宿主ゲノムにおける特定のＤＮ
Ａ配列か又は未確定ＤＮＡ配列による１ｎｖｉｖｏ組換
えを促准することができる適当な核酸配列を含有するも
のと思われる。これらの配列は、プラスミド又はファー
ジａｔｔ部位、運搬可能因子の組換え配列、又は統合を
促すに十分な宿主ゲノムレグメントに関する相同性を有
する任意の配列を包含し１ｑる。Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃ
ｃｓのゲノム、殊に５ｔｒｅ　ｔｏｍ　ｃｅｓ　　ｃｏ
ｅｌｉｃｏｌｏｒのＤＮＡの５．７−ｋｂ増幅可能（ａ
ｍｐｌｉｆｉａｂｌｃ）　ｔｌｉ位において自然に増幅
されるＤＮＡセグメントはベクターに包含され、Ｍ　伝
子Ｒ現系の多重−複写統合（ｍｕ　Ｉ　ｔ　ｉ　−Ｃｏ
ｐｙｉｎｔｅｇｒａｔ　１ｏｎ）を得るために使用され
得る。そのベクターはまた、形質転換体の形質転換中及
びその後の培養中の両方において、宿主生物の形質転換
株に関する選択をもたらす適当な遺伝子を含有する。こ
の選択の標識物質は、ヂオ゛ストレプｉ−ン、カナマイ
シン、ビオマイシン、ヒグロマイシンのような抗生物質
に対する耐性を提供し得るし、あるいは宿主生物の独立
栄養型（ａ（ＩＸＯｔｒＯｐｈｉＣ）又は条件致死型（
ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ　１ｅｔｈａｌ）突然変六株を
補完し得る。
好ましい実施態様では、図２に略記の変法に従って、ベ
クターとしてプラスミドｐ　ｌ　Ｊ　６８０を採用した
。第１段階では、Ｅ、　ｃｏｌｉプラスミドｐｔＪｃ８
の２３５４塩基対のｐｖｕ［断片をｐＩ　Ｊ　６８０の
３３９０位（第１６部位）でｐｓｔ１部位に導入した（
ｌｌｏｐＷＯＯｄ等、　１９８５）　、プラント末端ｐ
ｖｕ［断片を図２に示す通り、合成アダプターを用いて
Ｉ）ＳｔＩ部位の−ＴＧＣＡ３°端に連結した。ｐｓＢ
部位に挿入されるＩＥ、　ｃｏｌｉプラスミドを有する
ベクターは、アンピシリン選択下ではＥ、　ｃｏｌｔ中
で、またチオストレプトン耐性についての選択において
はストレプトミセスｓｔｒｃｐｔｏｍｙｃｅｓ中で複製
可能である。ベクターのＥ、　ｃｏｌｉプラスミド部分
は、ベクター中の発現系の集合を促すにすぎず、−旦完
成ブラスミドが５ｔｒｅｐｔｏ＋ｎｙｃｅｓの形質転換
に向けて用意されたならば必要でなくなると思われる。
例えば、Ｃ１ａＩによる部分的消化とその後のＤＮＡリ
ガーげによるベクターの再環化（ｒｅｃｉｒｃｕｌａｒ
ｉｚａｔｉｏｎ）によって、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ
を形質転換する前に　Ｅ、　ｃｏｌｉプラスミドセグメ
ントを除去＋ｉＪ能である。
第二段階では、ａｐｈ遺伝子のプロモーター及びコード
領域を合成りＮＡ配列で置き換えて、今後の構築を容易
にする。これは、合成り（＋ｌＩ［リンカ−ＧＡＧΔＴ
ＣＴＣをＣＣＧＣＧＧ　　５ａｃＩ［部位における２番
目のＣに連結することにより、ｐＩ　Ｊ　６８０の４８
８３位（部位第３２番）でのＳａＣ■部位を変化（Ｈｏ
ｐｗｏｏｄ等、　１９８５）させることを含む。
ある実施態様では、合成リンカ−ＣＧＧＡＴＣＣＧをＡ
ＧＡＴＣＴ　　ＢａｌＩＩ部位のＣと連結することによ
りＢ（ＩＩＩＩ部位をＢａｍＨＩ部位に変換し、その結
果、ベクターＤＳＳ２を生じる。別の実施態様において
、合成リンカ−ＣＡＡＧＣＴＴＧをＴＣＴＡＧＡ　　Ｘ
ｂａＩ部位のＧに連結しＴＸｂａＩ位部位をＨｉｎｄＩ
［［部位に変換する。
ｐｓｓ２のＢａｍＨＩ　−Ｘｂａ工断片は、プロモータ
ー、シグナルペプチドをコードする核酸配列、及び関係
のある特定の蛋白質をコードする核酸配列から成る発現
系により置き換え得る。便宜上、制限部位Ｂａｆｆ１Ｈ
Ｉ、及びＸｂａＩを選択したけれども、遺伝子発現系を
ベクターに結合するためには、これらに代えて、あるい
はこれらに加えて、任意の他の制限部位を使用可能であ
ると理解すべきである。発現系をＢａｍＨＩ部位と×ｂ
ａ■部位の間に何れの方向にでも挿入することができる
が、しかし図２に示した通り、好ましい配向とすること
により反時計方向の転写が行われることになろう。これ
により、Ｘｂａｉ部伶に隣接するａｐｈ転写ターミネー
タ−（オリジナルｐ　ｌ　Ｊ　６８０の３９５５位（部
位２１）と３８４３位（部位１９）の間に位置する（ｔ
ｌｏｐｗｏｏｄ等、　１９８５）　）の利用が［ＩＪ能
になると考えられる。しかしながら、当業界で公知の任
意の転写ターミネータ−は、ａｐｈに対するｂのの代り
に、又はそれに加えて使用？ｉＪ能である。ｐｓｓ２ベ
クターは、異種遺伝子の発現には用いられない転写の開
始に関する部位を有し得る。
種々の遺伝子発現系をｐｓｓ２ベクターに挿入すること
により、発現ベクターを構築できる。ある実施態様によ
れば、発現系ＤＡ１）Ｏ，０ＭＣＳＦ（図３）は、ＧＭ
−ＣＳＦをコードする核酸配列に連結されるプロテア−
ピロシグナルペプチドをコードする核酸配列に連結され
るａｐｈプロモータを含有する。別の実施態様によれば
、発現系ｐＡＥｏ、ＧＭＣＳＦ　（図４）は、Ｇ　Ｍ　
−ＣＳ　Ｆをコードする置換可能な核酸配列に連結され
るプロテアーゼ１３−エンド１」ハイブリッドシグナル
ペプチドをコードする核酸配列に連結されるａｐｈプロ
モーターを含有する。別の実施態様においては、発現系
ｐＡＰｏ、Ｇ　（図５）は、置換可能な核酸配列に連結
されるプロテア−Ｅ！Ｂシグナルペプチドをコードする
核酸配列に連結されるａｐｈプロモーターを含有する。
さらに別の実施態様では、ＸｂａＩ部位に合成りＮＡ　
（ＣＴＡＧＣＡＡＧＣＴＴ　Ｇ　）を挿入することによ
り、ｐΔＰＯ，Ｇから発現系ｐＡＰＯ，Ｈを構築した。
発現系ＤＡＥＯ。
ＳＸ（図６）は、置換可能な核酸配ダ１に連結されるプ
ロテアーゼＢ−エンドＨハイブリッドシグナルベプチド
をコードする核酸配列に連結されるａｐｈプロモーター
を含有する。さらに別の実施態様においては、ＸｂａＩ
部位に合成りＮＡ　（ＣＴＡＧＣＡＡＧＣＴＴＧ）を挿
入することにより、ｐＡＥＯ，ＳＸから発現系ｐＡＥＯ
，ｓＨを構築した。同様にこれに代わるものとしては、
置換可能な核酸配列に連結されるプロテア−１：’Ｂシ
グナルペプチドをコードする核酸配列に連結されるａｐ
ｈプロモーターを含有するｐＡＰｏ、ＳＸ　（図７）が
ある。
全発現ベクターにおけるＢａｍＨＩ−ＭｌｕＩ断片は、
異なるプロモーター及び／又はコードされたシグナルベ
ブヂドアミノ末端を含有するＤＮＡ断片で置換し得る。
また、ｐＡＥＯ，ＧＭＣＳＦ。
ｐＡＥＯ，ＳＸ、ｐＡＥｏ、ＳＨ又はＤＡＰＯ。
ＳＸのＭ　ｌｕＩ　−Ｐ　ｓｔＩ断片、あるいはｐＡＰ
ｏ。
Ｇ又はｐＡｐｏ、ＨのＭｌｕＩ−ＮｓｉＩ断片は代りの
シグナルペプチドをコードするＤＮＡ断片で置換し得る
。同様に、ｐＡＥＯ，ＧＭＣＳＦ又はｐＡＥＯ，５ｔ−
１のＰｓｔＩ　−Ｈｉｎｄ　ｍ断片；あルイはｐＡＥＯ
，ＳＸ又はｐＡｐｏ、ｓｘのｐ　ｓｔＩ　−Ｘ　ｂａＩ
断片；あるいはｐＡｐｏ、ＨのＮｓｉニー１１ｉｎｄ　
ｍ！ｌｌ′ｉ片；あるいはＩ）ＡＰＯ，ＧのＮ５ｉＩ−
ＸｂａＩ断片は、蛋白質をコードする別のＤＮＡ断片で
置換し得る。
本発明の好ましい実施態様を、以下例示する。
ここに記載の方法及び結果は実施例のためのちのであり
、いかなる意味においても本発明の範囲を限定覆るもの
ではない。
調　　製 菌株及びプラスミド ストレプトミセス・リビダンスｓｔｒｃｐｔｏｍｙｃｅ
ｓｖｉｄａｎｓ　　６Ｇ　（Ｂｉｂｂ等、　１９８０）
　、並びにプラスミドｐ　Ｉ　Ｊ６１　（１９８２にＴ
ｈ０ｆｆｌｐＳＯｒ１等により開示され、Ｓ、　　Ｉ　
１ｖｉｄａｎｓ　　Ｔ　Ｋ　２４／　Ｔ　Ｋ　４２５か
ら単離可能である）は、Ｊｏｈｎ、１ｎｎｅｓ　Ｉｎ５
ｔｉｔｕｔｅから入手した。
全ての形質転換において、Ｅ、　　ｃｏｌｔ　　１−１
８１０１株（△Ｔ　Ｃ０３３６９４）を用いた。プラス
ミドｐｕｃａ（ＶｉｅｉｒａとＭｅｓｓｉｎｇ、１９８
２）　、並びにｐＵＣ１８及びｐ　Ｕ　Ｃ１９（Ｎｏｒ
ｒａｎｄｅｒ等、　　１９８３）はＢｅｔｈｅｓｄａＲ
ｅｓｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓより購入し
た。プラスミドｐＵＣ６８０Ｔは、１９８８年６月２８
日、寄託番号４０４６６で＾ｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ
Ｃｕｌｔｕｒｅ　ｃｏｌｌｃｃ口Ｏｎに寄託した。
材　　　　料 アブライドバイオシステムズＡＤＤｌｉｅｄＢｉＯｓｙ
ＳｔｅｍＳ社１３８０Δ型ＤＮＡシンセサイザーを用い
て、オリゴヌクレオチドを合成した。オリゴヌクレオ゛
ヂド合成に用いたカラム、ホスホアミダイト、及び試薬
は、Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ　Ｍａｒｋｅｔｉｎｇ＾５ｓｏ
ｃｉａｔｅｓを通じて、アブライドバイオシステムズ社
から購入した。ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行な
い、次いでＤＥＡＥセルロースクロマトグラフィーを行
なうことにより、オリゴヌクレオチドを精製した。ＤＮ
Ａの消化及び修飾用の酵素は、Ｎｅｗ　Ｉ’ｎｇｌａｎ
ｄ　Ｂｉｏｌａｂｓより購入し、提供者の勧告に従って
使用した。放射性同位元素（α−３２Ｐ）ｄΔＴ　Ｐ　
（３０００Ｃｉ　／　ｍｍｏｌ　）及び（γ−３２Ｐ　
）　Ａ　Ｔ　Ｐ　（３００００ｉ　／ｍｍｏｌ）　４；
ｔ＾ｍｅｒｓｈａｍより入手した。チオストレプトンは
、ニュー］−りの５ｑｕｉｂｂＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ
より寄贈された。
ＤＮＡの単離 アルカリ性溶解法（ａｌｋａｌｉｎｅ　１ｙｓｉｓ　ｐ
ｒｏｃｅｄｕｒｅ）（ｌｌｏｐｗｏｏｄ等、　１９８５
）により、形質転換鉦　ｌ１ｖｉｄａｎｓのプラスミド
ＤＮＡを調製した。５０μｇ／−アンピシリンを含有す
るＹＴ培地（Ｍｉｌｌｅｒ、　１９７２）上でＥ、　　
ｃｏ旦形質転換株を育成した。急速煮沸法（ＨＯｌｍｅ
ＳとＱｕｉｏｌｅｙ　、　１９８１）により、Ｅ、・ｃ
ｏｌｉから得たプラスミドＤＮＡを精製した。全ての構
築に用いたＤＮＡ断片及びベクターを低融点アガロース
上で電気泳動により分離し、フェノール抽出及びエタノ
ール析出（Ｈａｎｉａｔｉｓ等。
１９８２）により溶融アガロースから精製した。
ＤＮＡ配列決定 １−Ｉ　Ｐ　Ｌ　Ｃ（Ｅｄｗａｒｄｓｏｎ等、　１９８
６）　１．：より精製したプラスミドＤＮＡを、ジデオ
キシ法（Ｓａｎｇｅｒ等。
１９７７）の変法（Ｈａｔｔｏｒｉ等、　１９８５）を
用いて配列決定した。必要な場合は、Ｍ１３バクテリオ
ファージｍｐ１８及びｍｐ１９　（Ｎ０ｒｒａｎｄｅｒ
等、　１９８３）中でサブクローンを調製し、−２０ｉ
ニバーサルブライマー（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉ
ｏｌａｂｓ）を用いてジデオキシ配列決定反応を行なっ
た。′？ａ固な二次構造のいくつかの領域において、圧
縮及びポリメラーゼ欠損は、配列を明確にするためのジ
デオキシ反応において、デアザグアノシン（Ｈｉｚｕｓ
ａｎａ等、　１９８６）（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｈａ
ｎｎｈｅｉｍ）類縁体の使用を必要トシた。ＤＮＡ５Ｔ
ＡＲｔｌ′１のソフトウェア　（ＤＯ（］ｇｅｔｔとｅ
＋ａｔｔｎｅｒ、　１９８５）を用いて配列をコンパイ
ルした。
実施例１　　ｐＵＣ６８０Ｔの ストレプトミセス５ｔｒｅ　ｔｏｎ　ＣｅＳプラスミド
Ｄ　Ｉ　Ｊ６８０　（１〜２μｇ）を４分間、１．２単
位のＰＳｔＩを用いた部分消化により線状化した。線状
化１）　Ｉ　Ｊ　６８０プラスミドを表わす５．３−ｋ
ｂ　　ＰｓｔＩＤＮＡ断片をｐｓｔＩ及び仔つシ腸アル
カリホスフブラスミドＤＵＣ８と混合した。次いでその
混合物をＴ４　ＤＮＡリガーゼで結合して、Ｅ、　　ｃ
ｏｌｉ中に形質転換した。その形質転換体を、正しい組
換え体に関し、プラスミドＤＮＡ分析によりスクリニン
グした。あるプラスミド、ｐＵ　Ｃ６８０は、ｐｌ　Ｊ
　６８０の３３９０位（部位番号１６）でｐｓｔｌ：部
位に挿入されたｐＵ　Ｃ８プラスミドを有した。
１）　Ｉ　Ｊ　６８０のサブクローンを作製して、ａｐ
ｈプロモーター及び：」−ド領域の置換を容易にした。
このサブクローンｐｃＭ６８０Ｂは、Ｄ　Ｉ　Ｊ　６８
０（ｕｏｐｗｏｏｄら、　１９８５）の４８８３位から
５２９０位まで（部位番号３２から１の間）の０．４ｌ
−ｋｂ　　５ａｃｌＩ−Ｘｈ。
ｌＤＮＡ断片を含有する。合成リンカ−ＧΔＧＡＴＣＴ
Ｃを、ＤＮＡポリメラーゼ■のＫ　ｌ　ｅｎｏ＊断片を
用いて平滑末端化された５ａｃｌＩ部位に結合すること
により、５ａｃｌＩ部位をＢ＋ＩＩＩＩに変えた。新規
に生成されたＢ（ＩＩＩＩ部位は、Ｘｂａ１部位で終わ
る０、９２−ｋｂの合成りＮＡにＶＪ接している。
ｐＩ　Ｊ　６８０サブクローンと連結する合成りＮＡＲ
片ヲ含有ｔ６ｐｃＭ６８０　Ｂ）１．３３−ｋｂ　　Ｘ
ｂａＩ−ＸｈｏＩ　　ＤＮＡ断片を、Ｅ、　　ｃｏｌｉ
ベクターを含むｐ　Ｕｏ　６８０の６．６−ｋｂ　　Ｘ
　ｂａＩ−Ｘ　ｈｏＩ　Ｄ　ＮΔ断片と混合した。その
混合物をＴ４ＤＮ△リガーゼと結合し、［、ｃｏｌｉ中
に形質転換した。その結果生じたプラスミドｐＵＣ６１
３０Ｔを、形質転換体のプラスミドＤＮＡを分析するこ
とにより見出した。
プラスミドｐＵＣ６８０Ｔは、１９８８年６月２８日、
ｔｈｅ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ
　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎに寄託番号４０４６６号で寄託
された。
実施例２　　ｐｓｓ２の作製 ｐＵｃ８の２．３６−ｋｂ　ＰｖｕｌＩ断片を、Ｔ４　
ＤＮＡリガーゼを用いて、配列ＣＡＴＣＧＡＴＧのリン
酸化Ｃ１ａＩリンカ−（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉ
ｏｌａｂｓ）に結合した。６５℃に加熱して結合反応を
終結させ、連続的リンカ−を結合して生成した部位を利
用するＮ５ｉｌ：で消化した。２．３６−ｋｂ　Ｎ　Ｓ
ｉ丁断片を単離して、ｐＵＣ６８０王の５．３−ｋｂ　
　Ｐ　ｓｔ　Ｉ断片トｉ含ｔ。
た。その混合物を、Ｎ５ｉＩ及びｐｓＢの存在下でＴ４
ＤＮ△リガーけを用いて結合した。６５℃に加熱して結
合反応を終結さけ、Ｅ、　　ｃｏｌｉ中に形質転換した
。形質転換体のプラスミドＤＮＡを分析すｑし ることにより見出キ「；プラスミドｐＳＳ１は、前の方
のＰＳｔＩ部位に第２図に示す方向で挿入されたＥ、　
　ｃｏｌｉプラスミドセグメントを含有する。
ｐｓｓｉ　（７）唯一のＢ！ＩＩｍ部位をＢａｍ）−Ｉ
Ｉに変えて、プロモーター配列の交換を容易にした。プ
ラスミドＩ）３３１をＢ（ＩＩＩＴで消化して、線状化
プラスミドの末端をＤＮＡポリメラーゼ■のＫ　Ｉ　Ｑ
ｎＯＷ断片で塞いだ。次いで、平滑末端化ＤＮＡ断ハを
、Ｔ４１′）ＮΔリガーゼを用いて配列ＣＧＧＡＴＣＣ
Ｇのリン酸化ＢａｍＨＩリンカ−（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａ
ｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）に結合した。６５℃に加熱して
結合反応を終結させ、ＢａｍＨＩで消化した。
次いで、ＢａｍＨＩ末端を有する精製線状プラスミドを
、Ｔ４ＤＮ△リガーゼを用いて再環化し、Ｅ、　　ｃｏ
ｌｉ中に形質転換した。その結果生じたプラスミド、即
ち本来のＢ！ＩＩＩＩＩ部位を置換する唯一のＢａｍＨ
Ｉ部位を有するＩ）ＳＳ２は、形質転換体のプラスミド
ＤＮＡを分析することにより見出された。
ストレプトミセスＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓプラスミド
ＤＩＪ６１の２．１−ｋｂ　　Ｅ　ｃｏＲＶ　−Ｎ　ｃ
ｏＩ断片を３ａｕ３ＡＩで消化して、適当なベクターの
ＢａｍＨ工部位及びＮＣｏＩ部位に結合した。組換え体
の中で、ａｐｈプロモーターに対応する配列を有する０
、４Ｏ−ｋｂ　Ｓａｕ　３△１−ＮＣＯＩ断片を含有す
るｐｌＪ６１のサブクローン、叩ちｐＡＰＨ，４が見出
された（第８図）。ＮＣｏＩ部位はａｐｈ遺伝子のイニ
シエーター△ＴＧを含有する。
実施例４　プロテア−１ｆｆｉＢプロモーター　びシナ
ルベブチ゛を　　するＤＮＡ断片のサブク［１−ニング プＯテアーゼＢｌ伝子を含有した２、８−ｋｂＢａｌｌ
ＩｆＩ片を含むプラスミドの１．４−ｋｂ　　Ｂ　５Ｓ
Ｉ−＋　ＩＩ断片からプロテアーゼＢｌ伝子のサブクロ
ーンを調製した（１９８７年７月２１日にｃａｎｇｃｎ
ｅ　ｃｏｒｐｏｒａ−ｔｉｏｎ社が出願したカナダ国特
許出願第５４２，６４８号）。ＤＮＡポリメラーゼ１の
Ｋ　ｌ　ｃｎｏｗ断片を用いてＢ５５ＨＩＩ断片の末端
を塞ぎ、次いで、実施例２の枚目に従って、リン酸化Ｂ
ａｍ１−ＩＩリンカ−に結合した。その結果得られたＢ
ａ１ｌｌＨＩ末端を有する１、４−ｋｂ断片を、Ｂａｍ
ＨＩで消化された且つアルカリ小スファターピで処理さ
れたｐＵｃ８ベクター中に結合した。その結果生じたプ
ラスミドｐＳＰＲＢ１．４は完全なプロテアーゼＢ遺伝
子を含有した。
２つのアニールされたオリゴヌクレオチドＧＧＣＣＴＣ
ＧＴＣＴΔＧＡ及びＡＡＧＣＴＴＣＴＡＧＡＣＧＡＧＧ
ＣＣＴＧＣ△をＰＳｔＩ部位及び）−１ｉｎｄｌ１１部
位に結合することによって、ざらにサブクローニング用
にプラスミドｐＵｃ８を改造しＣ１プラスミドｐＵｃ、
ＰＸＨとした。プラスミドＤＳＰＲＩ”３１．４をｐｖ
ｕ［Ｆ消化して、Ｔ４ＤＮ△リガーゼを用いて配列ＧＣ
ＴＧＣＡＧＣのリン酸化ｐｓｔＩリンカ−（Ｎｅｗ　Ｅ
ｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ）に結合した。６５℃に加
熱して結合反応を終結させ、ＰｓｔＩ及び３ａｍＨＩで
消化した。
０、４９−ｋｂＢ　ａｍ）−Ｉ　Ｉ　−Ｐ　ｓｔ　Ｉ断
片を精製し、次いでＤＵｃ、ＰＸＨベクターのＢａｍＨ
Ｉ及びｐｓ１４部位に結合した。その結果生じたプラス
ミドｏＰＰＩは、プロモーター、シグナルペプチド及び
プロペプチドの最初の１０個のアミノ酸、即らブ［１デ
アーゼＢｉ伝子のすべてを含有した。
５　プロテアーゼＢシ　ナルペプチドを異種蛋白質分泌
用にプロテア−ぜＢシグナルを改造するために、プロテ
アーゼＢシグナルペプチドのカルボキシ末端の９個のア
ミノ酸及びヒト成長ホルモンのアミノ末端の８個のアミ
ノ酸をコードづる２つの合成オリゴヌクレオチド４２−
マー及び５０−マーを使用した（第１０図）。合成オリ
ゴヌクレオチドを３通りの結合法でプロテアーゼＢナブ
クローンｐＰＰＩの０．４４−ｋｂ　　Ｂ　ａｍ　Ｉ　
−ＨａｅＩＩ断片（第９図）、並びにＢａｍＨＩ及びＸ
ｂａＩテ消化したｐＳＳ２のベクター断片に連結した。
その結果生じたプラスミドｐＰＰｏ、Ｇは、プロテアー
ゼＢプロモーター及びシグナルペプチドを含有する０、
４６−ｋｂＢ　ａｍｌｌ　Ｉ　−Ｎ　Ｓｉ　Ｉセグメン
トを有した。Ｎ５ｉＩ部位は、プロセッシング部位（−
１位）直前にアラニン残基のＧＣＡコドンを含有した。
ミノ酸をコードする４３−マーの２つの合成オリゴヌク
レオチドを用いて、プロテアーゼＢのシグナルペプチド
をａｐｈプロモーターからの発現用に改造した（第１１
図）。合成オリゴヌクレオチドを、合 ３通りの結１法で、本実浦例の教旨に従って、ａｐｈプ
ロモーターを含有する０、４Ｏ−ｋｂ　　Ｂ　ａｍＨｌ
−ＮＣ０Ｉ断片（第８図）及び ｐＰＰｏ、ＧのＢａｍＨＩ−Ｍ　ｌｕＩベクター断片に
連結した。その結果生じた発現ベクターｐＡＰ○。
Ｇは、プロテアーゼＢシグナルペプチドをコードする配
列に連結されたａｐｈプロモーターを含む０．５ｌ−ｋ
ｂ　　ＢａｍＨＩ−ＮｓｉＩセグメントと、蛋白質をコ
ードする置換可能な配列を含む０．０３−ｋｂＮｓｉＩ
−ＸｂａＩセグメント（第５図）とを有した。
６　プロテア−ｔ’Ｂシ　ナルベブチ゛を用いた代　　
　系の　、１ ｆｆｉ白質ヲコ−トｔル１．１−ｋｂ　　ＰｓｔＩ−Ｘ
ｂａＩ断片を含有するプラスミドｐＰｃＭをＰＳｔＩ及
びＸｂａ丁で消化し、その１．１−ｋｂ断片をｐＰＰ１
ベクターのｐｓｔ■部位及びＸｂａＩ部位に結合した。
その結果生じたプラスミドＤＰＰ１．ＰＣＭは、単一ベ
クター中にｐＰＣＭの１．１−ｋｂ　　Ｐ　ｓｔＩ　−
Ｘ　ｂａＩ断片に：　連結Ｌｌ　タ、ｐ　Ｐ　Ｐ　１　
（Ｄ　Ｏ，４９−ｋｂ　　Ｂ　ａｍｌ−Ｉ　Ｉ　−ｐＳ
ｔＩ断片を含有１）だ。
をコードする２つの合成２６−マーオリゴヌクレオチド
を用いる必要があった（第１２図）。合成オ。
リボヌクレオチドを３通りの結合法でｐＰＰｌの０．４
４−ｋｂ　　Ｂ　ａｍＨＩ　−ＨａｅＩＩ断片と、Ｂａ
ｍＨＩ及びＰＳｔＩで消化されたｐＰＰｌ、ＰＣＭのベ
クター断片とに連結した。その結果生じたプラスミドｐ
ＰＰＯ，ＰＣＭは、プロテアーピＢプロモーター及びシ
グナルペプチドを含む０．４６−ｋｂ１３　ａｍＨＩｐ
ｓｔ■セグメントを有した。ｐｓｔＴ部位はプロセッシ
ング部位（＋１位）直後にアラニン残基のＧＣ△コドン
を含有した。
次いで、ｐＰＰｏ、ＰＣＭの１６−ｋｂ　　Ｂ　ａｍＨ
ＩＸｂａＩ断片を、１）ＳＳ２のＢａｍＨＩ　−Ｘｂａ
Ｉベクター断片に結合した。その結果生じたプラスミド
ｐＰＰｏ−ＰＣＭ／８２は、蛋白質をコードする合成り
ＮＡ上セグメント連結されたプロテアーゼＢプロモータ
ー及びシグナルペプチドを、即ちＤＳＳ２ベクター内の
すべてを含有した。
実施例５の教旨に従って、ａｐｈプロモーターからの発
現用に、ｐＰＰｏ、ＰＣＭ／Ｓ２作製の際辱 ミノ酸をコードする４３−マーオリゴヌクレオチドを、
ａｐｈブＯＥ−ターを含有する０、４Ｏ−ｋｂ　　Ｂ　
ａｍＨＩ−ＮｃＯＩ断片及びＣｌＰＰ０．ＰＣＭのＢａ
ｍＨＩ−ＭＩＩＪＩベクター断片に３通りの結合方法で
連結した。その結果生じた発現ベクターｐＡＰｏ。
ＰＣＭは、プロテアーゼ１３シグナルペプチドをコード
する配列に連結されたａｐｈプロモーターを含む０．５
ｌ−ｋｂ　Ｂ　ａｍｌ−Ｉ　Ｉ　−Ｐ　ＳｔＩセグメン
トを有した。
便宜上、ベクターｐＡＰｏ、ＰＣＭ内において蛋白質を
コードするＤＮＡセグメントを、０．８−ｋｂＳ　ａｃ
Ｉ　−Ｘ　ｂａ■断片を欠失させることにより７．０縮
した。ベクターｐΔＰＯ，ＰＣＭを５ａｃＩ及びＸｂａ
Ｉで澗化し、合成ＡリゴヌクレオーチドＣＴ△ＧΔＧＣ
Ｔに結合づることによりベクター断片を再環化した。そ
の結果生じた発現ベクターｐＡＰＯ，ＳＸ　＜第７図）
は、３ａｃｌ：部位及び×ｂａＩ’部位の双方を保持す
るが、ブ［１テア−ｔ２Ｂシグナルペプチドをコードす
る配列に連結したａｐｈｊロモ含有する０、３２−ｋｂ
　　ＰｓｔＩ−ＸｂａＩ　（又はｐｓｔ丁５ａｃＩ）ｔ
グメントとを有する。
盟 エンドＨシグナルペプチドのアミノ酸配列及びストレプ
トミセス用のコドン使用法（ＣＯｄｏｎ　ｕｓａｇｅ）
を用いて、合成りＮＡ配列を決定した。合成配列及びそ
の相補鎖を６つのオリゴヌクレオチドに分割した。これ
らのうち最初の２つ、即らＳｌ、ＥＮＤ及びＳ２．ＥＮ
Ｄをａｐｈプロモーターに連結させた（実施例１１参照
）。これらのうちその次の４つ、即らＳ３．ＥＮＤ〜Ｓ
６．ＥＮＤは、エントド１シグナルペプチドの残りの２
７個のアミノ酸を］−ドした（第１３図）。オリゴヌク
レオチドＳ４．ＥＮＤ及びＳ５．ＥＮＤ（各２μｇ）を
、１ｏｍｖ　ＴｒｉＳ塩酸（ｐＨ７，５）、１０ｍＭＩ
ＶＩＱＣ，ｌｌ　　　、　　５ＲＭ　　　ＤＴＴ。
０．５ｍＭ　　ＡＴＰ及び５単位のＴ４ボリヌクレオチ
ドギナーゼを含有する２０μｍの反応液中で３７°Ｃで
３０分間、別々にリン酸化した。リン酸化オリゴヌクレ
オチド（各１０μｇ）を各々　１μグの非リン酸化Ｓ３
．ＥＮＤ及びＳ６．ＥＮＤ、並びに５００ｍＭＴｒｉｓ
塩ｇ（ｐＨ７゜８）−１００ｍＭ　　ＭｑＣ，ｆｌ　２
　３μΩと６Ｍ合して、最終容呈を３１μｍとした。９
０℃で１０分間、オリゴヌクレオチドのアニーリングを
行い、その後１２〜１６時間、室温に徐々に冷却した。
アニールしたオリゴヌクレオチド（１５μｆＪ）を、５
０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ　３２２１１　（ＤＩ（７，８）、
１ｏ１ｒＬＭ　　ＩｖｌｏＣｕ２゜１ｍＭ　　ＡＴＰ及
び１６００単位のＴ４　ＤＮ△リガーゼを含有する２０
０μｇの反応液中で、１６℃で４時間、ともに結合した
。次いで、エンド１−１シグブルペブチドをコードする
完全合成遺伝子を、ａｐｈプロモーター、プロテアーゼ
Ｂシグナルペプチド、発現ベクターｐＡＰｏ、ＳＸのＭ
ｌｕｉ部位及びＰＳｔＩ部位に結合したく第７図）。こ
れは、プロテアーゼＢシグナルのアミノ末端の１５個の
アミノ酸をエントド」シグナルのカルボキシ末端の２６
°個のアミノ酸に連結し、プロテアーゼＢ−エンドＨハ
イブリッドシグナルペプチドを形成した。ＰＳｔＩ部位
は、シグナルペプチドの一１位にアラニンのＧＣＡコド
ンを含有する。その結果生じた発現ベクターｐＡＥｏ、
ＳＸは、プロテアーゼＢ−エンドＨハイブリッドシグナ
ルペブチドをコードする配列に連結したａｐｈプロモー
タを含有する０５２−ＸｂａＩ（又はＰｓｔＩ−３ａｃ
Ｉ　）　ｔ？グメントとを有した（第６図）。
８　　ＧＭ−ＣＳＦをコードする合成遺伝−，１！と飢
１ ストレプトミセスＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ用のコドン
選択法を用いたＧＭ−ＣＳＦアミノ酸配列の逆翻訳によ
り合成りＮＡ配列を決定した。実施例７の枚目オリゴヌ
クレオチドの合成に、このＤＮＡ配列及びその逆相補鎖
（ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）を用いた。
次いで、完全な０．４８−ｋｂ合成ＧＭ−ＣＳＦ遺伝子
（第１図）をＩ）ＵＣｌ３の　ＰｓｔＩ部位及びＸｂａ
Ｉ部位に結合し、Ｅ、　　ｃｏｌｉの形質転換に用いた
。
ＰＳｔＩ部位は一１位にアラニンのＧＣＡコドンを含有
したが、これはプロテアーゼＢ及びエンドＨの発現系と
矛盾しない。プラスミドＤＮＡの制限分析により形質転
換体をスクリーニングした後、ＤＮへ配列分析により、
合成ＧＭ−ＣＳＦ遺伝子が本物であることが確定された
。
実施例９　プロテアーゼＢシグナルペプチドを１）ＡＰ
Ｏ，Ｇ１７）ＸｂａＩ部位をｌ−１ｉｎｄＢ１部位に変
換して、合成ＧＭ−ＣＳＦ３ＥＩ伝子の挿入を容易にし
た。ベクターｐＡＰｏ、Ｇをｘｂａ■で消化し、その結
果生じた線状ベクター末端をＤＮＡポリメラーゼ■のＫ
ｌｅｎｏｗ断片を用いて塞ぎ、次いでＴ４ＤＮＡリガー
ゼを用いて配列ＣＡＡＧＣＴＴＧのリン酸化Ｈｉｎｄｎ
［リンカ−（Ｎｅｗ　ＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ）
に結合した。６５℃に加熱して反応を終結させ、Ｈｉｎ
ｄＩ［Ｉで消化した。次イテ、Ｔ４　ＤＮＡリガーゼを
用いて、ＨｉｎｄＩ［Ｉ末端を右りる精製線状ブラ、ス
ミドを再環化した。その結果生じた発現ベクターｐＡＰ
ｏ、Ｈは、プロプアーゼＢシグナルペプチドをコードす
る配列に連結したａｐｈプし１モーターを含む０．５ｌ
−ｋｂ　　Ｂ　ａｍＨＩ　−Ｎ　ｓｉ　Ｉセグメントと
、蛋白質をコードする置換可能な配列を含む０．０３−
ｋｂ　　Ｎ　ｓｉ　Ｉ−Ｈｉｎｄ　Ｉ［ｌセグメントと
を有する。
ＧＭ−ＣＳＦ遺伝子を含有する、ｐｕｃ。
０ＭＣＳＦの０．４８−ｋｂ　　ＰｓｔＩ−ＸｂａＩ断
片を、Ｔ４　ＤＮＡリガーゼを用いて、ａｐｈプロモー
タを含有し、且つプロテアーゼＢシグナルペプチドをコ
ードするｐＡＰＯ，ＧのＢ　ａｎｔ−Ｉ　Ｉ　−Ｐ　ｓ
ｔＩベクター断ハに結合した。その結果得られた発現ベ
クターｐＡＰＯ，ＧＭＣＳＦ内で、コードされたシグナ
ルペプチドのカルボキシ末端をコードされたＧＭ−ＣＳ
Ｆ蛋白質のアミン末端に直接融合する。
ｐＡＥｏ、ＳＸのＸｂａＩ部伶を、実施例９の枚目に従
って、）−１ｉｎｄＩ１１部位に変換した。その結果生
じた発現ベクターｐＡＥｏ、ＳＨは、プロテアーゼＢ−
エンドＨハイブリッドシグナルペブブドをコードする配
列に連結したａｐｈプロ七−夕を含む０．５２−ｋｂの
ＢａｍＨＩ　−ＰｓｔＩ　ｌｘグメントと、蛋白質をコ
ードする置換可能な配列を含む０．３２−ｋｂＰｓｔＩ
−Ｈｉｎｄ　ｍ　（又はｌ）　ｓｔＩ　−Ｓ　ａｃＩ　
）セグメントを有する。
Ｇ　Ｍ　−Ｇ　Ｓ　Ｆ　）１１伝子を含有するｐｕｃ。
０ＭＣＳＦの０．４８−ｋｂ　Ｐ　５ｔＩ−１−１ｉｎ
ｄ　ｍを、８面プロモータを含有し、且つプロテアーゼ
Ｂ−エンドＨハイブリッドシグナルペプチドをコードす
るｐΔＥＯ，ＳＨのＰＳｔＩ　−Ｈｉｎｄ　Ｉｌｌベク
ター断片に結合した。その結果得られた発現ベクターｐ
ＡＥＯ，ＧＭＣＳＦ内で、コードされたシグナルペプチ
ドのカルボキシ末端をコードされた０ＭＣＳＦ蛋白買の
アミノ末端に直接融合する。
１１　　エン゛１」シグナルペプチドを用いたｍし久ｆ
１４１ ｐＡＥＯ，ＧＭＣＳＦ中のシグナルペプチドのアミノ末
端を、実施例５の教習に従って、０．４４−ｋｂ　Ｂａ
ｍＨＩ−Ｍ　ｌｕＩ断片を３通りの結合法で、ｐＡＰＨ
，４の０．４Ｏ−ｋｂ　　Ｂ　ａｍＨＩ−Ｎ　ｃｏＩ断
片、並びにアニールされたオリゴヌクレオチドＳ　１．
　ＥＮＤ　（ＣＡＴＧＴＴＣＡＣＴＣＣＣＧＴＴＣＧＧ
△ＧＡ＞及びＳ２．ＥＮＤ　（ＣＧＣＧＴＣＴＣＣＧ△
Ａ　ＣＣＧ　Ｇ　Ａ　Ｇ　−ｒ　Ｇ　Ａ　Ａ　）で置換
することにより、ブ［１テアーゼＢからエンドＨに変え
た。その結果生じた発現ベクターｐＡＥｏ−ＬＧＭＣＳ
Ｆは、エンド１」シグナルペプチドをコードする配列に
連結したａｐｈプロ（−ターを含む０．５０−ｋｂＢａ
ｍＨＩ−ＰｓｔＩｆ１片をＲした。
レブトミセスＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｃｓ用のコドン使用
法を用いて、合成りＮＡ配列を決定した。プロテアーゼ
［３−ａｐｒハイブリッドシグナルペブチド発現ベクタ
ーの作製には、プロテアーゼＢシグナルベブヂドのアミ
ノ酸１５及びａｐｒシグナルペプチドのカルボキシ末端
の２５個のアミノ酸をコードする２つの合成オリゴヌク
レオチド、８１−マーと　７３−マーの使用を必要とし
た（第１４図）。合成オリゴヌクレオチドをアニールし
、次いで発現ベクタｐＡＥｏ、ＳＨのＭＩＬＩＩ部位及
びｐｓｔ１部位に結合した（第６図）。その結果生じた
プラスミド１）Ａａｌ）ｒ、ＳＨは、ａｐｈプロモータ
ー、プロテアーゼａｐｒシグナルペプチドのアミノ酸配
列及びストした。プロテアーゼ３−　ａｐｒハイブリッ
ドシグノ−ルベブチドは、ａｐｒシグナルペプチドのカ
ルボキシ末端の２５個のアミノ酸に連結したプロテアー
ゼＢシグナルペプチドのアミノ末端の１５個のアミノ酸
を含有する。
ＧＭ−ＣＳＦのアミン末端の９個のアミノ酸をコードす
る２つの合成オリゴヌクレオチド２１−マー　（ＣＣＣ
ＧＣＣＣＧＧＴＣＧＣＣＣＴＣＧＣＣＧ）及び２９−マ
ー（ＴＣＧＡＣＧＧＣＧＡＧＧＧＣＧｔＡＣＣＧＧＧＣ
ＧＧＧＴＧＣＡ＞を用いることにより、合成ＧＭ−ＣＳ
Ｆ遺伝子をｐＡ　ａｔ）ｒＳＨ発現ベクターに適応させ
た。合成オリゴヌクレオチドをアニールし、次いで３通
りの結合法で、ｐＵｃ、、ＧＭｃｓＦの０．３６−ｋｂ
　　Ｓ　ａｔ　Ｉ　−Ｈｉｎｄ■断片（第１図）、並び
にｐｓｔＩ及びｌ−１ｉｎｄｌ［［で消化されたｐＡａ
ｌ）ｒ、ｓＨのベクター断片に結合した。その結果得ら
れた発現ベクターｐＡａｐｊ、ＱＭＣＳＦ内で、コード
されたシグナルペプチドの力ルボギシ末喘を、コードさ
れたＧ　Ｍ−ＣＳ　Ｆ蛋白質のアミン末端に直接融合す
る。
の作製 発現ベクターｐＡＰｏ、ＧＭＣＳＦを５ａｃＩＩｒ演化
し、その結果生じた断片をＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌ
ｅｎｏｗ断片で処理して平滑末端化した。次いで平滑末
端をもつ５ａＣＩＩ断片を、実施例２の教旨に従ってリ
ン酸化ＢａｍＨＩリンカ−に結合した。
結合氾合物をＢａｎＨＩ及びＨｉｎｄＩ［Ｉで間化して
、０、６２−ｋｂ断片を精製した。次いで０．６２−ｋ
ｂ　ＢａｍＨＩ−ＨｌｎｄＩ［Ｉ断片を、ＢａｍＨＩ及
びＨｉｎｄｌｎで消化されたｐＡＰｏ、Ｈのベクター断
片に結合した。その結果生じた発現ベクターｐΔ”ｐｏ
。
ＧＭＣＳＦは、ＧＭ−ＣＳＦをコードする配列に連結さ
れたプロテアーゼＢシグナルペプチドをコードする配列
に連結した０、１２−ｋｂ　ａｐｈブ１」モータセグメ
ントを有した。
１４　　ＧＭ−ＣＳＦ　環系を有する 実施例１５　５ ｖｉｄａｎｓ形質転換体の増殖 Ｓ、　　１ｉｖｉｄａｎｓ　ｅｅのプロトプラストを形
質転換に用いた。Ｓ、　　１ｉｖｉｄａｎｓ　６６の培
養物を、０．５％グリシンを含むＹＥＭＥ培地（Ｈｏｐ
ｗｏｏｄら、　１９８５）中で３０℃で４０時間増殖さ
せた。開示の方法（ｌｌｏｐｗｏｏｄら、　１９８５）
と同様にして、採取した菌糸をリゾデームで処理して接
寺プロトプラストを調製し、ミラクロスＨｉｒａｃｌｏ
ｔｈ　　（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ　ｌ１ｏｅｃｈｓＢを
通して濾過することにＪ：り精製した。ブし］ドプラス
ト（４Ｘ　１０９個）を発現ベクター（１μ９）のプラ
スミドＤＮＡで形質転換し、開示の方法（ｌｌｏｐｗｏ
ｏｄら、　１９８５）と同様にして、Ｒ２ＹＥ平根上に
接種した。３０℃で２２時間インキュベートした後、平
板をチオストレプトン（３０μｇ／ｄ）を含有する５ｏ
ｆｔ　Ｎｕｔｒｉｅｎｔ　八ｇａｒで被覆し、胞子形成
が起こるまで、３０°Ｃでインキュベートした。
ＧＭ−ＣＳＦ発現ベクターで形質転換されたＳ、　　１
ｉｖｉｄａｎｓ　６６のコし！ニーを、チオストレプト
３２℃で６５時間増殖させた。１５ｄ組織ホモジナイザ
ー（Ｔｃｎｂｒｏｅｃｋ−Ｂｅｌｌｃｏ）を用イテ培養
物を分散させて、二次培養用接種材料として用いた。Ｌ
Ｂ培地２００−＋チオストレプトン（５μｇ／ｒＲ１）
を含有する２！のバッフル何振盪フラスコに吸光度（Ａ
　６００）　０．２となるように接触し、環境シェーカ
ー　（２４ｏｒｐｍ）中で２〜４日間、３２℃でインキ
ュベートした。増殖Ｏ〜９６時間目の間の適当な時点で
培養物から１０ｄのアリコートを取り出した。乾燥重量
測定に用いる菌糸を、４℃の臨床用遠心分離器中で４０
００ｒｐｍで１０分間遠心分離して取り出した。
ＧＭ−ＣＳＦを含有する分泌蛋白質を含む上清画分を分
析前に一２０℃で凍結した。
実施例１６　　ＧＭ−ＣＳＦ分泌のモニタリングＧＩＶ
Ｉ−ＣＳＦを含有する分泌蛋白質を含む実施例１５に記
載の上清画分をポリアクリルアミドゲル電気泳動によっ
て分析し、関係のある蛋白質を、蛋白質の特異染色法に
より染色するかあるいはＷｅＳｔｅｒｎブロツデイング
により分析して視覚化した。
培養上清の１．５ｍｅのアリコートを、最終８度１０％
（Ｗ／Ｖ）となるようにトリクロロ酸！！ｌ！２（ＴＣ
△）の５０％（Ｗ／Ｖ）溶液（氷上）を添加し、更にそ
の結果得られた湿合液を約４℃で約１５〜３０分間イン
キュベートすることにより凝集させた。ＧＭ−ＣＳＦを
含有する分泌蛋白質を含む生成沈殿物を、室温で５分間
、最大速度でＥｐｐｅｎｄＯｒｔ遠心器中で遠心分離し
て収集した。２ＮＮａＯ）−ｉを添加して、再懸濁ＴＣ
Ａ沈殿物のａｌｌをサンプル緩衝液のｐＨに調整するた
めの変法を含めて、１．ａｅｍｍ　ｌ　ｉ　（１９７０
）が記載の方法に従って、電気泳動用に沈殿したサンプ
ルを調製した。Ｌａｅｍｍ　ｌ　ｉ　（１９７０）が記
載した手順に従って、ポリアクリルアミドゲル（１５％
アクリルアミド）に印加した。上記手順により分離した
蛋白質のプロフィルを、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ　Ｂｒ１ｌ
ｌｉａｎｔＢｌｕｅで染色して視覚化したく第１５ａ図
）。
Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｌｏｗ　Ｈｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｗ
ｅｉｇｈｔ　５ｔａｎｄａｒｄｓと比較した場合、約ｉ
ｓ、ｓｏｏダルトンの見掛けの分子量を有して移動する
、Ｇｌ’１−ＣＳＦ遺伝子を含む細胞中に存在する新規
の蛋白質バンドが認められるルミ気泳動（第１５ｂ図）
によって分離された蛋白質のｗｅｓｔｅｒｎブロッティ
ングによりこの分析を行なったが、この場合、ＧＭ−Ｃ
ＳＦ形買転換体中に見出された新規の、蛋白質バンドは
、０ＭＣＳＦすると抗体と交叉反応した。Ｂｕｒｎｅｔ
ｔｅ（１９８１）の改良法であるＴｏｗｂ　ｉ　ｎら（
１９７９）の方法に従って、ｗｅｓｔｅｒｎブ［１ツテ
イングを行った。
Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ　Ｂｒ１ｌｌｉａｎｔ　Ｂｌｕｅ染
色ゲルと−ａｓｔｅｒｎプロットの双方をスギャンさせ
ることにより、Ｇ　Ｍ　−〇　Ｓ　Ｆの分泌レベルの定
早を行なった（表■）。Ｂｏｏ−Ｒａｄ蛋白質アッセイ
により上清中の総蛋白質量を測定した。
ＧＭ−ＣＳＦの分泌されたレベルは、ｐＡＰＯ。
０ＭＣＳＦを含有するＳ、　　ｌ　１ｖｉｄａｎｓテ最
高である（レーン９〜１（１）。中−の開始部位を右す
るａｐｈプロモーターを含有ＪるＩ）Ａ”ＰＯ，０ＭＣ
ＳＦに関しては、わずかに低レベルの分泌ＧＭ−ＣＳＦ
ｂ＜ｉＡ察された。ｐＡＰＯ，０ＭＣＳＦ中のプロテア
ーゼＢシグナルベブヂドのカルボキシ末さ 端の２３　　　ミノ酸くレーン５〜６）を、ｐＡＥＯ。
０ＭＣＳＦ中の１ンドＨシグナルペブヂドのカルφ ボキシ末端の２６個アミノ酸（レーン１〜２）で、又は
ｐＡａｐｒ、ＧＭｃｓＦのａｐｈシクナルヘフチトノカ
ルボキシ末端の２　！＋　ｆＪｊ”’；’ミノ酸で置き
換えると、分泌されたＧ　Ｍ−ＣＳ　Ｆのレベルが約１
７３に低下した。しかしながら、分泌されたＧＭ−ＣＳ
Ｆのレベルは、ｐＡＥｏ、０ＭＣＳＦのプロテアーゼＢ
−エンド］」ハイブリッドシグナルペプチドを用イタ方
が、ｐＡＥＯ−１，０ＭＣＳＦのエンド）」シグナルペ
プチドを用いた場合よりも高がったが（レーン７〜８）
、これはハイブリッドシグナルベ豐 ブｆドが天然シグナルペプチドよりも良いことを示して
いる。
′実施例１７　　ＧＭ−ＣＳＦの生物学的　性　験軟質
寒天中のコロニーの増殖を刺激する能力に関して細胞を
採点するメチルセルロースコロニ刺激アッセイにより、
分泌されたＧＭ−ＣＳＦの生物学的活性を測定した。要
約すると、造血性コロニー刺激活性アッセイ用の非付着
性骨＋ｉａ胞を、ＧｒｅＯＯｒｙとＥａｖｅｓ（１９７
７）が記載したのと同様にして、健東成人被験者から採
取したサンプルＪ：り調製した。アッセイ用に、細胞を
終濶度約５ｘ　１０’細胞／ｄとなるよう平板培養した
。培地には、Ｃｏｕ　ｌ　ｏｍｂｃ　ｌら（１９８３）
及びＣａｓｈｍａｎら（１９８５）の報へと同様にして
、０．８％メチルゼルロース、３０％ウシ胎児血清（Ｆ
ｌｏｗ）　、１％脱イオン化ウシ血清アルブミン（Ｂ　
Ｓ　Ａ　、　Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、　
　セントルイス）、０．１ｍＭ２−メルカプトエタノー
ル及びアルファ培地を含有させた。十分な湿度を有する
５％Ｃｏ２含右空気中、３７℃で一般に７〜１４日の期
間の間、成長因子を含有する培地の存在中で細胞をイン
キュベートした。反転顕微鏡下、その場で〕ロニーを採
点した。
１）ＡＰＯ．ＧＭＣＳＦ及びｏＡＥｏ．ＧＭＣＳＦの両
方に関して生物学的活性の分析を行い（表イン］ニング
培地（ヒトＧＩＶＩＣＳＦを含有）を用いて見出された
のと同様の比率で、赤血球／混合大型コロニーの低レベ
ルの刺激とともに、顆粒球／マクロファージ型コロニー
の有意の刺激が実証された。
■）、どららの場合にも、１０％ヒト白ｍ１球コンデ表 ■ Ｓ、　　ｌ　１ｖｉｄａｎｓ　６６中で形質転換された
異なる構築物からのＧＭ−ＣＳＦの発現。
＼ 構築物 ｐＡＰＯ，０ＭＣＳＦ ｐＡＥｏ、０ＭＣＳＦ ｐＡＥｏ−１，０ＭＣＳＦ Ｍａｐｒ、０ＭＣＳＦ ｐＡ“ＰＯ，０ＭＣＳＦ Ｍ−ＣＳＦ （ｒｎ９／、０　） １４．５ ＜０１ ４．０ １２．０ 実　例１８　　ＧＭ−ＣＳＦの精製 ポリアクリルアミドゲルからＧＭ−ＣＳＦを溶出するこ
とにより、ＧＭ−ＣＳＦを少量精製した。
！！！殖の約２４時間口に上清蛋白質１０ｄを採取し、
４℃で臨床用遠心器中、４０００ｒｐｍで１０分間遠心
分離して菌糸を取り出した。実施例１６の教旨に従って
ＧＭ−ＣＳＦを含有する上清蛋白質を凝集し、Ｌａｃｍ
ｍｌｉ　（１９７０）の方法に従い、但しサンプル調製
及びゲルの印加に関してはｌ１ｕｎｋａｐ　ｉ　ｌ　Ｉ
ｅｒら（１９８３）の改良法に従って、１５％ポリアク
リルアミドゲル上を移動させて分離した。１ｌｕｎｋａ
ｐｉ　ｌ　Ｉｅｒら（１９８３）が記載のゲル溶出法に
よりＧＭ−ＣＳＦ蛋白質バンドを分離し、その結果得ら
れた蛋白質溶液を凍結乾燥により濃縮した。実施例１６
の教旨に従って、溶出バンドの純度及び性質を分析した
。
１９　　ＧＭ−ＣＳＦのアミノ末端配列の分析 のモントリオールのｔｈｅ　Ｉｎ５ｔ已ｕｔ　ｄＯＲｃ
ｃｈｅｒｃｈｃｅｎＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅで分
析された。［ｄｍａｎ自動分解循環法（ＥｄｍａｎとＢ
ｃｇｇ、　１９６７）を用いるアプライドバイオシステ
ムズＡｐｐｌｉｅｄ　Ｂｃｏｓｙｓｔｅｍｓ社製気相ス
クエネータ上でアミノ末端配列決定を行った。蛋白質の
最初の９個のアミノ酸に関して１ｑられた配列はＡ　Ｉ
）　Ａ　ＲＳ　Ｐ　Ｓ　Ｐ　Ｓであったが、これは′Ｙ
−朋したアミノ酸配列と一致した。
本発明の好ましい実施態様が詳細に記載されているｔプ
れども、本発明の思想又は付記のクレームの範囲を逸脱
しない限りにおいての変更は可能であると、当業者は理
解されたい。
【図面の簡単な説明】
図面に関しては、制限部位、デオキシリボ核酸、ベクタ
ー、及び関連した情報を児分けるために種々の短縮形を
用いた。当業名が容易に認知できるように、これらの成
分すべてを確認するに際しては標準的用語を用いた。 本発明の好ましい実施態様を、図面で説明すると以下の
通りである。 第１図は、Ｇ　Ｍ−ＣＳ　Ｆをコードするｐｓｔ■Ｈｉ
ｎｄｌ断片のＤＮＡ配列である。 第２図は、ベクターＤ　Ｉ　Ｊ　６８０の特異的な入れ
替え（ａｌｔｅｒａｔｉｏｎ）を示している。 第３図は、 （ａ）発現ベクターｐΔＰＯ，ＧＭＣＳＦの制限地図：
及び （ｂ）挿入する３ａｍｌ（（−日１ｎｄｌ［ＤＮＡ断片
の配列である。 第４図は、 （ａ）発現ベクターｐＡＥｏ、ＧＭＣＳＦの制限地図；
及び （ｂ）挿入ｔ６１３ａｍＨＩ−Ｈｉｎｄ　Ｉ［ＤＮＡ断
片の配列である。 第５図は、 （ａ）発現ベクター１）ＡＰＯ，Ｇ　（又はｐＡＰｏ。 ）」）の制御地図；及び （ｂ）挿入するＢａｌ１ｌＨＩ−ＸｂａＩ（又は３ａｍ
ＨＩ−Ｈｉｎｄｌｌ［）ＤＮＡ断片の配列である。 第６図は、 （ａ）発現ベクターｐΔＥＯ，ＳＸ　（又はｏＡＥｏ、
５ｔ−１）の制御地図；及び（ｂ）挿入するＢａｍＨＩ
−ＸｂａＩ　（又はＢａｍＨＩ−Ｈｉｎｄ　ＩＩＩ）　
ＤＮＡ断片の配列である。 第７図は、 （ａ）発現ベクターｐＡＰｏ、ＳＸの制限地図：及び （ｂ）挿入するＢａｍＨＩ−ＸｂａＩ　　ＤＮＡ断片の
配列である。 第８図は、ａｐｈプロ七−夕を含むＢａｍＨＩＮｃｏＩ
　　ＤＮＡ断片の配列である。 第９図は、プロテア−ぜＢプ１コモータを含イ１し、且
つプロテアーゼＢシグナルペプチドとプロテアーゼＢブ
ローペブヂドのアミノ末端の１０個のアミノ酸とをコー
ドするｏＰＰＩのＢａｍ１−Ｉ　Ｉ−ＰｓｔＤＮＡ断片
の配列である。 第１０図は、プロテアーゼＢシグナルペプチドのカルボ
キシ末端及びヒト成長ホルモンのアミノ末端をコードす
るト１ａｅＩＩ−ＸｂａＩ　　ＤＮＡ断片の配列である
。 第１１図は、プロテアーゼＢシグナルペプチドのアミン
末端をコードするＤＮＡ断片の配列である。 第１２図は、プロテアーゼＢシグナルペプチドのカルボ
キシ末端をコードするＨ　ａｅＩＩ　−Ｐ　５ｔＩＤＮ
Ａ断片の配列である。 第１３図は、エンド１」シグナルペプチドのカルボキシ
末９８の２７個のアミノ酸をコードするＭｌｕ工Ｐｓｔ
ＩＤＮＡ断片の配列である。 第１４図は、ａｐｒシグナルペプチドのカルボキシ区 末端の２５個のアミノ酸をコードするＭ１ノ■−ｐｓｔ
ｉＤＮＡ断片の配列である。 第１５図は、 （ａ）ポリアクリルアミドゲル電気泳動及び（ｂ）　ｗ
ｅｓｔｅｒｎブロッティングによる０ＭＣＳＦ分泌の分
析結果を示す。 ＦＩＧ、　３ｂ （イグン２ ＦＩＧ、５α。 ＦＩＧ、６ａ ＦＩＧ、６ｂ （イブ１） ＦＩＧ７ａ。 ＦＩＧ、　８ ＦＩＧ　９ ＡＴｒ３ＡＧＧＣＣＡ

Claims (39)

    【特許請求の範囲】
  1. （１）ストレプトミセスＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属か
    ら選択した宿主からの生物活性型異種蛋白質の分泌を支
    配するペプチドをコードする調節ヌクレオチド配列を、
    前記異種蛋白質をコードする第二ヌクレオチド配列に結
    合させた前記調節ヌクレオチド配列を包含する遺伝子発
    現系。
  2. （２）ストレプトミセスＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属か
    ら選択した宿主からの生物活性型顆粒球マクロフアージ
    コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）の分泌を支配するペ
    プチドをコードする調節ヌクレオチド配列を、前記顆粒
    球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）を
    コードする第二ヌクレオチド配列に結合させた前記調節
    ヌクレオチド配列を包含する遺伝子発現系。
  3. （３）前記調節ヌクレオチド配列がシグナル配列及びプ
    ロモーター配列を包含する特許請求の範囲第１項又は第
    ２項のいずれか一項に記載の遺伝子発現系。
  4. （４）前記第二ヌクレオチド配列が第１図に示される配
    列である特許請求の範囲第１項又は第２項のいずれか一
    項に記載の遺伝子発現系。
  5. （５）前記シグナル配列がストレプトミセス・グリセウ
    ス￥Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ￥￥ｇｒｉｓｅｕｓ￥プ
    ロテアーゼＢのシグナルペプチド、ストレプトミセス・
    プリカートス￥Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ￥￥ｐｌｉｃ
    ａｔｕｓ￥エンド−Ｂ−Ｎ−アセチルグルコサミニダー
    ゼＨのシグナルペプチド、グラム陽性細菌のシグナルペ
    プチド、又はグラム陰性細菌のシグナルペプチドをコー
    ドする特許請求の範囲第３項記載の遺伝子発現系。
  6. （６）前記シグナル配列が、ストレプトミセス￥Ｓｔｒ
    ｅｐｔｏｍｙｃｅｓ￥属のシグナルペプチドのハイブリ
    ッド、ストレプトミセス・グリセウス￥Ｓｔｒｅｐｔｏ
    ｍｙｃｅｓ￥￥ｇｒｉｓｅｕｓ￥プロテアーゼＢのシグ
    ナルペプチドとストレプトミセス・プリカートス￥Ｓｔ
    ｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ￥￥ｐｌｉｃａｔｕｓ￥エンド−
    Ｂ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼＨのシグナルペプ
    チドとのハイブリッド、細菌のシグナルペプチドのハイ
    ブリッド、ストレプトミセス￥Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅ
    ｓ￥属のシグナルペプチドと細菌のシグナルペプチドと
    のハイブリッド、又はストレプトミセス・グリセウス￥
    Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ￥￥ｇｒｉｓｅｕｓ￥プロテ
    アーゼＢのシグナルペプチドとバシルス・サブチルス￥
    Ｂａｃｉｌｌｕｓ￥ｓｕｂｔｉｌｌｕｓ￥アルカリ性プ
    ロテアーゼのシグナルペプチドとのハイブリッドをコー
    ドする特許請求の範囲第３項記載の遺伝子発現系。
  7. （７）前記調節配列が多数のプロモーター配列を含有す
    る特許請求の範囲第１項又は第２項のいずれか一項に記
    載の遺伝子発現系。
  8. （８）前記プロモーター配列の１つが、他のプロモータ
    ー配列と異なるストレプトミセス￥Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙ
    ｃｅｓ￥ＲＮＡポリメラーゼホロ酵素の特異的結合及び
    該酵素による転写を許容する特許請求の範囲第７項記載
    の遺伝子発現系。
  9. （９）前記プロモーター配列が、同一のストレプトミセ
    ス￥Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ￥ＲＮＡポリメラーゼホ
    ロ酵素の特異的結合及び該酵素による転写を許容する特
    許請求の範囲第７項記載の遺伝子発現系。
  10. （１０）前記プロモーター配列が、ストレプトミセス￥
    Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ￥ＲＮＡポリメラーゼホロ酵
    素の特異的結合及び該酵素による転写を許容する特許請
    求の範囲第３項記載の遺伝子発現系。
  11. （１１）前記プロモーター配列が、ストレプトミセス￥
    Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ￥ＲＮＡポリメラーゼホロ酵
    素の特異的結合及び該酵素による転写を許容する、スト
    レプトミセス・フラジア￥Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ￥
    ￥ｆｒａｄｉａｅ￥のアミノグリコシドホスフォトラン
    スフエラーゼ遺伝子由来の配列を包含する特許請求の範
    囲第３項記載の遺伝子発現系。
  12. （１２）ストレプトミセス￥Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ
    ￥属のシグナルペプチドをコードするＤＮＡシグナル配
    列。
  13. （１３）シグナルペプチドが、ＭＲＩＫＲＴＳＮＲＳＮ
    ＡＡＲＲＶＲＴＴＡＶＬＡＧＬＡＡＶＡＡＬＡＶＰＴＡ
    ＮＡである特許請求の範囲第１２項記載のＤＮＡシグナ
    ル配列。
  14. （１４）ストレプトミセス・プリカートス ￥Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ￥￥ｐｌｉｃａｔｕｓ￥エ
    ンド−Ｂ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼＨのシグナ
    ルペプチドをコードするＤＮＡシグナル配列。
  15. （１５）シグナルペプチドが、ＭＦＴＰＶＲＲＲＶＲＴ
    ＡＡＬＡＬＳＡＡＡＡＬＶＬＧＳＴＡＡＳＧＡＳＡであ
    る特許請求の範囲第１４項記載のＤＮＡシグナル配列。
  16. （１６）ストレプトミセス￥Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ
    ￥属のシグナルペプチドのハイブリッドをコードするＤ
    ＮＡシグナル配列。
  17. （１７）シグナルペプチドが、ＭＲＩＫＲＴＳＮＲＳＮ
    ＡＡＲＲＶＲＴＡＡＬＡＬＳＡＡＡＡＬＶＬＧＳＴＡＡ
    ＳＧＡＳＡである特許請求の範囲第１６項記載のＤＮＡ
    シグナル配列。
  18. （１８）グラム陽性細菌のシグナルペプチドをコードす
    るＤＮＡシグナル配列。
  19. （１９）グラム陰性細菌のシグナルペプチドをコードす
    るＤＮＡシグナル配列。
  20. （２０）細菌のシグナルペプチドのハイブリッドをコー
    ドするＤＮＡシグナル配列。
  21. （２１）ストレプトミセス￥Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ
    ￥属のシグナルペプチドと他の細菌のシグナルペプチド
    とのハイブリッドをコードするＤＮＡシグナル配列。
  22. （２２）シグナルペプチドが、ＭＲＩＫＲＴＳＮＲＳＮ
    ＡＡＲＲＶＷＩＳＬＬＦＡＬＡＬＩＦＴＭＡＦＧＳＴＳ
    ＳＡＱＡである特許請求の範囲第２１項記載のＤＮＡシ
    グナル配列。
  23. （２３）ストレプトミセス・グリセウス￥Ｓｔｒｅｐｔ
    ｏｍｙｃｅｓ￥￥ｇｒｉｓｅｕｓ￥プロテアーゼＢのシ
    グナルペプチドの一部とストレプトミセス・プリカート
    ス￥Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ￥￥ｐｌｉｃａｔｕｓ￥
    エンド−Ｂ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼＨのシグ
    ナルペプチドの一部とをコードするシグナル配列と；ス
    トレプトミセス￥Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ￥ＲＮＡポ
    リメラーゼホロ酵素の特異的結合及び該酵素による転写
    を許容するプロモーター配列と；並びに第１図に示され
    るヌクレオチド配列とを包含し、前記シグナル配列が前
    記プロモーター配列及び前記ヌクレオチド配列と共有結
    合している遺伝子発現系。
  24. （２４）ストレプトミセス・グリセウス￥Ｓｔｒｅｐｔ
    ｏｍｙｃｅｓ￥￥ｇｒｉｓｅｕｓ￥プロテアーゼＢのシ
    グナルペプチドをコードするシグナル配列と；ストレプ
    トミセス￥Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ￥ＲＮＡポリメラ
    ーゼホロ酵素の特異的結合及び該酵素による転写を許容
    するプロモーター配列と；並びに第１図に示されるヌク
    レオチド配列とを包含し、前記シグナル配列が前記プロ
    モーター配列及び前記ヌクレオチド配列と共有結合して
    いる遺伝子発現系。
  25. （２５）ストレプトミセス・グリセウス￥Ｓｔｒｅｐｔ
    ｏｍｙｃｅｓ￥￥ｇｒｉｓｅｕｓ￥プロテアーゼＢのシ
    グナルペプチドをコードするシグナル配列と；ストレプ
    トミセス￥Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ￥ＲＮＡポリメラ
    ーゼホロ酵素の特異的結合及び該酵素による転写を許容
    する、ストレプトミセス・フラジア￥Ｓｔｒｅｐｔｏｍ
    ｙｃｅｓ￥￥ｆｒａｄｉａｅ￥のアミノグリコシドホス
    フォトランスフェラーゼ遺伝子由来のプロモーター配列
    と；並びに第１図に示されるヌクレオチド配列とを包含
    し、前記シグナル配列が前記プロモーター配列及び前記
    ヌクレオチド配列と共有結合している遺伝子発現系。
  26. （２６）特許請求の範囲第１項、第２項、第３項、第４
    項、第２３項、第２４項、又は第２５項のいずれか一項
    に記載の遺伝子発現系を存在させたストレプトミセス￥
    Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ￥内で、形質転換及び複製が
    可能なベクター。
  27. （２７）特許請求の範囲第１項、第２項、第３項、第４
    項、第２３項、第２４項又は第２５項のいずれか一項に
    記載の遺伝子発現系を存在させたストレプトミセス￥Ｓ
    ｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ￥内で、形質転換及び複製が可
    能なベクターｐＳＳ２。
  28. （２８）特許請求の範囲第１項、第２項、第３項、第４
    項、第２３項、第２４項又は、第２５項のいずれか一項
    に記載の発現系を、ストレプトミセス￥Ｓｔｒｅｐｔｏ
    ｍｙｃｅｓ￥内の形質転換及び複製が可能なベクターに
    挿入し、並びに該ベクターをストレプトミセス￥Ｓｔｒ
    ｅｐｔｏｍｙｃｅｓ￥属から選択した宿主に挿入するこ
    とを包含する遺伝子発現方法。
  29. （２９）特許請求の範囲第２７項又は第２８項のいずれ
    か一項に記載のベクターを、ストレプトミセス￥Ｓｔｒ
    ｅｐｔｏｍｙｃｅｓ￥属から選択した宿主に挿入するこ
    とを包含する遺伝子発現方法。
  30. （３０）ストレプトミセス￥Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ
    ￥属から選択した宿主から分泌される生物活性型異種蛋
    白質の産生方法であつて、 −以下のＤＮＡ配列：ストレプトミセス￥Ｓｔｒｅｐｔ
    ｏｍｙｃｅｓ￥ＲＮＡポリメラーゼホロ酵素の特異的結
    合及び該酵素による転写を許容する、ストレプトミセス
    ・フラジア￥Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ￥￥ｆｒａｄｉ
    ａｅ￥のアミノグリコシドホスフォトランスフエラーゼ
    遺伝子由来のプロモーター配列と；ストレプトミセス・
    グリセウス￥Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ￥￥ｇｒｉｓｅ
    ｕｓ￥プロテアーゼＢのシグナルペプチドをコードする
    シグナル配列と；及び異質蛋白質をコードするヌクレオ
    チド配列とを結合し； −前記ＤＮＡ配列をベクター、即ちストレプトミセス￥
    Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ￥内で形質転換及び複製が可
    能なベクター中に挿入し； −前記ベクターをストレプトミセス￥Ｓｔｒｅｐｔｏｍ
    ｙｃｅｓ￥属から選択した宿主に挿入して、形質転換宿
    主を増殖させ；並びに −生物活性蛋白質を取り出すことを包含する前記産生方
    法。
  31. （３１）ストレプトミセス￥Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ
    ￥属から選択した宿主から分泌される生物活性型異種蛋
    白質の産生方法であって、 −以下のＤＮＡ配列；ストレプトミセス￥Ｓｔｒｅｐｔ
    ｍｙｃｅｓ￥ＲＮＡポリメラーゼホロ酵素の特異的結合
    及び該酵素による転写を許容する、ストレプトミセス・
    フラジア￥Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ￥￥ｆｒａｄｉａ
    ｅ￥のアミノグリコシドホスフオトランスフエラーゼ遺
    伝子由来のプロモーター配列と；ストレプトミセス・グ
    リセウス￥Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ￥￥ｇｒｉｓｅｕ
    ｓ￥プロテアーゼＢのシグナルペプチドの一部とストレ
    プトミセスプリカートス￥Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ￥
    ｐｌｉｃａｔｕｓ￥エンド−Ｂ−Ｎ−アセチルグルコサ
    ミニダーゼＨのシグナルペプチドの一部とをコードする
    シグナル配列と；及び異種蛋白質をコードするヌクレオ
    チド配列とを結合し； −前記ＤＮＡ配列をベクター、即ちストレプトミセス￥
    Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ￥内で形質転換及び複製が可
    能なベクター中に挿入し； −前記ベクターをストレプトミセス￥Ｓｔｒｅｐｔｏｍ
    ｙｃｅｓ￥属から選択した宿主に挿入して、形質転換宿
    主を増殖させ；並びに −生物活性蛋白質を取り出すことを包含する前記産生方
    法。
  32. （３２）ストレプトミセス￥Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ
    ￥属から選択した宿主から分泌される生物活性型顆粒球
    マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）の産
    生方法であって、 −以下のＤＮＡ配列：ストレプトミセス￥Ｓｔｒｅｐｔ
    ｏｍｙｃｅｓ￥ＲＮＡポリメラーゼホロ酵素の特異的結
    合及び該酵素による転写を許容する、ストレプトミセス
    ・フラジア￥Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ￥￥ｆｒａｄｉ
    ａｅ￥のアミノグリコシドホスフォトランスフェラーゼ
    遺伝子由来のプロモーター配列と；ストレプトミセス・
    グリセウス￥Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ￥￥ｇｒｉｓｅ
    ｕｓ￥プロテアーゼＢのシグナルペプチドをコードする
    シグナル配列と；及び第１図に示されるヌクレオチド配
    列とを結合し； −前記配列をベクター、即ちストレプトミセス￥Ｓｔｒ
    ｅｐｔｏｍｙｃｅｓ￥内で形質転換及び複製が可能なベ
    クターに挿入し； −前記ベクターをストレプトミセス￥Ｓｔｒｅｐｔｏｍ
    ｙｃｅｓ￥属から選択した宿主に挿入して、形質転換宿
    主を増殖させ；並びに −生物活性型ＧＭ−ＣＳＦを取り出すことを包含する前
    記産生方法。
  33. （３３）ストレプトミセス￥Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ
    ￥属から選択した宿主から分泌される生物活性型顆粒球
    マクロファージコロニー刺激因子の産生方法であって、
    −以下のＤＮＡ配列：ストレプトミセス ￥Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ￥ＲＮＡポリメラーゼホロ
    酵素の特異的結合及び該酵素による転写を許容する、ス
    トレプトミセス・フラジア￥Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ
    ￥￥ｆｒａｄｉａｅ￥のアミノグリコシドホスフォトラ
    ンスフエラーゼ遺圧子由来のプロモーター配列と；スト
    レプトミセス・グリセウス￥Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ
    ￥ｇｒｉｓｅｕｓ￥プロテアーゼＢのシグナルペプチド
    の一部とストレプトミセス・プリカートス￥Ｓｔｒｅｐ
    ｔｏｍｙｃｅｓ￥ｐｌｉｃａｔｕｓ￥エンド−Ｂ−Ｎア
    セチルグルコサミニダーゼＨのシグナルペプチドの一部
    とをコードするシグナル配列と；及び第１図に示される
    ヌクレオチド配列とを結合し； −前記配列をベクター、即ちストレプトミセス￥Ｓｔｒ
    ｅｐｔｏｍｙｃｅｓ￥内で形質転換及び複製が可能なベ
    クターに挿入し； −前記ベクターをストレプトミセス￥Ｓｔｒｏｐｔｏｍ
    ｙｃｅｓ￥属から選択した宿主中に挿入して、形質転換
    宿主を増殖させ；並びに −生物活性型顆粒球マクロファージコロニー刺激因子を
    取り出すことを包含する前記産生方法。
  34. （３４）特許請求の範囲第１項、第２項、第３項、第４
    項、第２３項、第２４項又は第２５項のいずれか一項に
    記載の遺伝子発現系によってコードされる融合蛋白質。
  35. （３５）特許請求の範囲第２８項、第２９項、第３０項
    、第３１項、第３２項又は第３３項のいずれか一項に記
    載の方法により産生される生物活性蛋白質。
  36. （３６）適当な宿主から生物活性型で分泌される組換え
    ＤＮＡ誘導ＧＭ−ＣＳＦ。
  37. （３７）前記ＧＭ−ＣＳＦがグリコシル化されず、分子
    内ジスルフィド結合を有する、適当な宿主から分泌され
    る組換えＤＮＡ誘導ＧＭ−ＣＳＦ。
  38. （３８）ストレプトミセス￥Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ
    ￥属から選択した宿主から生物活性型で分泌される組換
    えＤＮＡ誘導ＧＭ−ＣＳＦ。
  39. （３９）前記ＧＭ−ＣＳＦがグリコシル化されず、分子
    内ジスルフィド結合を有する、ストレプトミセス￥Ｓｔ
    ｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ￥属から選択した宿主から分泌さ
    れる組換えＤＮＡ誘導ＧＭ−ＣＳＦ。
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