JPH0286791A - グリオーマ特異抗原、該抗原に対する抗体及びそれを用いる該抗原の定量法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔利用分野〕 本発明はヒト脳腫瘍の一種であるグリオーマの細胞に存
在する抗原性物質及びこれに対するモノクローナル抗体
、さらにはこれを用いる脳腫瘍特異抗原の定量法に関す
るものであり、脳腫瘍の診断及び治療経過観察のための
有用な方法に関するものである。

〔従来技術〕

脳腫瘍は、米国の調査では人口１０万人につき、１４．
５人の発生頻度で認められ〔アナルス・オブ・ニューコ
ーク・アカデミ−・サイエンス（Ａｎｎ、　Ｎ。

Ｙ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、）　３８１巻、６〜１６ペ
ージ、　１９８２年：ニューロロジー（Ｎｅｕｒｏｌｏ
ｇｙ）　２２巻、４０〜４８ページ。

１９７２年〕、国内においても１９６９年〜１９７８の
１０年間に２０．１９２例が登録されている（脳腫瘍全
国集計調査報告、１９６９〜１９７８年）。このような
脳腫瘍はその組織型によって髄膜腫、星細胞腫、多形膠
芽腫。

神経鞘腫、悪性星細胞腫等々の組織型に分類される。こ
の分類において、グリオーマ（神経膠腫）と呼ばれる脳
腫瘍は、外科的治療で選択的に創出することは極めて困
難であり、グリオーマの中でも特に悪性度の高いグリオ
ブラストーマの５年間生存率は１０．１％と低い。この
ようにグリオーマは治療が非常に困難な腫瘍である。

近年診断学、検査技術の向上とともに各種悪性腫瘍の診
断法が開発され臨床医学に応用されている。特に腫瘍特
異抗原又は腫瘍関連抗原の発見は各種悪性腫瘍の診断及
び治療に寄与するところが大きい。例えば癌胎児性抗原
α−フェトプロティンは１９６４年にタタリノブ（Ｔａ
ｔａｒｉｎｏν）によって発見され、現在特に肝癌、消
化器癌等の診断、治療の有用な指標として測定されてい
る（Ｇａｎｎ　　７０巻、１３３〜１３９ページ、　１
９７９年）。　又、癌胎児性抗原ＣＥＡは消化器癌を始
め各種のＩ’ｌｌのマーカーとして広く測定されている
（臨床検査　２８巻。

１０１９〜１０２３ページ、　１９８４年）。しかしな
がら、現在なお診断判別の難しい腫瘍（代表的なものに
脳腫瘍）も多い。

前に述べたように、脳腫瘍の中にはグリオーマのように
治療が困難で現在の医療レベルでは完治不可能なものも
ある。その原因の一つとして初期に診断することが、難
しい点が挙げられる。つまり、これら脳腫瘍の診断上の
問題点は、発生部位の関係もあり発病初期に発見するこ
とが他の悪性腫瘍以上に難しいこと、及び簡便な検査法
がないということである。検査法における問題点として
は、特に脳を髄関門の問題がある。即ち、脳を髄系組織
由来の特に比較的高分子の物質は血液中に出難いという
機構が存在する。従って通常、高分子の物質は、たとえ
脳腫瘍組織から放出されても血中にはほとんど流出しな
い。また、前述のαフェトプロティン、ＣＥＡなどの物
質は多（の組織の腫瘍に存在する為、血液中で検出され
ても脳腫瘍であるかどうかの判別はできない。

このようなグリオーマの診断・治療を目的として、グリ
オーマに特異的に存在する抗原の分離が試みられている
。例えば、Ｍ、Ｐｆｒｅｕｎｄｓｃｈｕｈらはグリオー
マの一種であるアストロサイトーマの患者血清中の抗体
と各種の細胞との反応性を調べている。しかし、得られ
た抗体はアストロサイトーマ以外の非脳１１ｆｆｉ瘍あ
るいはカルシノーマなどの多くの腫瘍細胞にも反応する
ものであったり、逆に脳腫瘍であるアストロサイトーマ
には反応しないものであったりと言うように特異性に多
くの問題を有していた［プロシーデイグ・オプ・ザ・ナ
ショナル・アカデミ−・オブ・サイエンス （Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ　ｏｆ　Ｔｈｅ　Ｎａｔｉｏｎ
ａｌ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓ）　、７
５巻、５１２２頁、１９７８年〕。従ってヒトグリオー
マに存在し、しかも正常成人脳組織には存在しないか、
存在しても極微量しか存在しない、つまり実質的に存在
せず、また、ヒトグリオーマ以外の脳腫瘍には存在しな
いか、またはごく限られた非グリオーマ腫瘍にしか存在
しないというような臨床に応用可能なヒトグリオーマ特
異抗原の臨床診断への応用が望まれていた。

〔発明が解決しようとする問題点〕

本発明者らは上記のような現状を考慮し、グリオーマに
特異的な抗原を見出し、これを分離し、これに特異的な
モノクローナル抗体を見出し、さらにはこれらを用いて
生体体液を材料として脳腫瘍特異抗原を定量する方法を
開発した。即ち、従来よりヒトグリオーマ特異抗原は存
在するか、否かは研究者の意見が分かれていたが、本発
明者らの実施したスクリーニングシステムによりヒトグ
リオーマ特異抗原に結合する多くのモノクローナル抗体
が得られ、このモノクローナル抗体を用いることにより
、ヒトグリオーマ特異抗原が分離された。

更に、本発明のヒトグリオーマ特異抗原は、脳腫瘍組織
のみ、あるいは他のごく一部の腫瘍にしか存在しないた
め、これが生体体液中にご＜＠量でも存在すれば脳腫瘍
が存在することがかなりの可能性で示される。しかしな
がら該ヒトグリオーマ特異抗原は生体体液中にごく微量
しか遊離されないため、従来の方法、例えば第二抗体に
よって結合型の標識抗原を沈澱させて分離する二抗体放
射免疫測定法では測定感度及び測定精度に問題があり、
正確な定量は難しい。特に上記の二抗体放射免疫測定法
では低濃度域での測定精度が悪い。

また、最近繁用されているサンドイッチ酵素免疫測定法
は測定感度、精度ともに良い方法であるが、通常１種類
のモノクローナル抗体のみでは実施出来ない。そこでこ
のヒトグリオーマ特異抗原の定量においては本発明者ら
が開発したモノクローナル抗体を用いる定量法が極めて
適していることが分かった。

〔問題点を解決するための手段及びその作用〕本発明の
ヒトグリオーマ特異抗原とは以下に示すものである。

■　ヒト脳腫瘍のうち、グリオーマ及びグリオーマに関
連する腫瘍の組織・細胞に存在し、■　少なくともヒト
成人正常脳組織には、実質上存在せず、 ■　グリオーマ及びグリオーマに関連する腫瘍以外には
存在しないか、またはごく限られた腫瘍あるいは細胞に
のみ存在する、 ■　単純蛋白質、複合蛋白質、糖質あるいは複合糖質。

を言う。

以上のようなヒトグリオーマ特異抗原はグリオーマ患者
の腫瘍組織に存在するため、腫瘍組織あるいは細胞より
漏出し、腫瘍組織あるいは細胞の増加または病状の悪化
に伴い、生体体液特に脳を髄液または血中に放出される
。

該ヒトグリオーマ特異抗原を分離精製するためには基礎
医学的な研究においては脳腫瘍患者より外科的手術など
で摘出された腫瘍組織あるいは生体体液を材料とするこ
ともできるが、この場合、得られた腫瘍組織と全く同質
のＩＩＩ瘍組織組織定して得ることは難しく、臨床医学
に広く応用し、グリオーマ患者の診断及び治療に応用し
ようとするときは、安定して確保するためにもこれらの
材料は好ましくない。この目的に適した材料としては、
近年発達してきた細胞培養法によって培養して得られた
、各種グリオーマ培養細胞株あるいはグリオーマ関連培
養細胞株が好適に使用できる。具体的にはオリゴデンド
ログリオーマ （ｏｌ　ｉｇｏｄｅｎｄｒｏｇｌｉｏｍａ）、アストロ
サイトーマ（ａｓｔｒｏｃｙｔｏｍａ）　、エッペンデ
イモーマ（ｅｐｅｎｄｙｍｏｍａ）、メデュロブラスト
ーマ（ｍｅｄｕｌｌｏｂｌａｓｔｏｍａ）　、マリグナ
ント・アストロサイトーマ（ｍａｌｉｇｎａｎｔ　ａｓ
ｔｒｏｃｙｔｏｍａ）　、グリオブラストーマ（ｇｌｉ
ｏｂｌａｓｔｏｍａ）などの腫瘍由来の細胞株であり、
これらは識別のために記号で示される。

例えばＵ−１７８−ＭＧ、　Ｕ−２５１−ＭＧ、　Ｕ−
２５１−５Ｐ、　ＫＮＳ−４２，Ｔ−９８゜ＧＬ−２，
ＧＬ−４，ＧＬ−９，ＧＬ−１１，ＧＬ−１３，ＭＫ−
ＭＧ、ＳＫ−ＭＧ−１゜ＳＫ−ＭＧ−４，ＳＫ−ＭＧ−
５，Ｓに一１’１Ｇ−６，ＳＫ−ＭＧ−７，ＳＫ−ＭＧ
−９゜ＳＫ−ＭＧ−１５，５Ｋ−ＡＯ２，ＳＫ−ＭＳ、
　ＫＭＳ−ＩＩ等と示される。このようなヒト脳腫瘍細
胞培養株は通常同質の細胞の集団であり、又、細胞培養
法により大量の細胞を必要な時に得ることができるので
本発明法に最も適した材料となり得る。

ヒト脳腫瘍細胞株の培養は、通常無菌的に行われ、培地
としてはｌ？ＰＭＩ−１６４０，ダルベツコ改変イーグ
ル（Ｄｕｌｂｅｃｃｏｓ’　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇ
ｌ）培地などの基本培地に、牛脂児血清などを加えた培
地が用いられる。牛脂児血清の代わりに種々の増殖因子
を加えた培地での培養も可能であり、このような培地を
用いた場合、培地由来の不純物の混入が少ないので培養
後の脳腫瘍培養株の取扱いが楽になる。又、このような
意味で、栄養源のみからなり牛胎児血清、増殖因子等を
含まない無血清培地で生育増殖するヒト脳腫瘍細胞株を
選択することは、経費の面から考えても好ましい。但し
、すべてのヒト脳腫瘍細胞株が無血清培地で生育増殖す
るとは限らないので使用するヒト脳腫瘍細胞株に適した
培地を選択する必要がある。ヒト脳腫瘍細胞株は、この
ように選択された培地を用いて、フラスコ、ローラーボ
トル、培養タンクなどを用いて培養する。

増殖した脳腫瘍培養細胞は通常、培養器具・装置の内面
あるいは培養担体の表面に接着した形で得られるため、
これらから剥離する必要がある。脳腫瘍培養細胞の剥離
法としては、細胞をトリプシン、コラゲナーゼなどの蛋
白分解酵素で処理する方法を用いることができる。しか
し、この分解酵素での処理は目的とする脳腫瘍特異抗原
が分解されることもあり得る。従って、脳腫瘍培養細胞
の剥離法としては物理的、化学的剥離法が好ましい。

具体的には、培養器具を振盪して培地その他の溶液によ
る衝撃によって剥離する方法、ガラス、合成樹脂、ゴム
などの棒、板、ヘラなとでこすり落とす方法などが好ま
しい。又、大量培養などの場合は種々の薬剤を用いて剥
離する方法が適している。このための薬剤としては種々
の酸、アルカリ。

細胞の膜構造や培養性に影響を与えるキレート剤。

各種無機イオンの溶液、あるいは種々の界面活性剤なと
が単独もしくは組み合わせて用いられる。

このようにして得られた脳腫瘍培養細胞を集め、場合に
よってはそれを洗浄する。得られた培養細胞からグリオ
ーマ特異抗原を抽出精製する際には、グリオーマ特異抗
原を特異的に検出・定量し、同時に効率よく精製するた
めに、該グリオーマ特異抗原に特異的なモノクローナル
抗体を作製するのが有効である。

モノクローナル抗体の作製は、上記で得られた脳腫瘍培
養細胞の適当量を生理食塩水等に懸濁し、これをそのま
まもしくは適当なアジュバントと混合し動物の皮肉、腹
腔内等に注射する。この操作を１〜２週間隔でくり返し
、適当な時期に脳腫瘍培養細胞に対する抗体産生の有無
を調べる。抗体産生の有無を調べるには、免疫動物の血
清を用い、通常行われる免疫化学的手法が応用される。

次いで抗体産生の確認された動物よりＢ細胞を分離し、
適当なミエローマ細胞株（例えばマウス由来のＰ３／Ｎ
ＳＩ／１−Ａｇ４−１細胞）との間で常法により細胞融
合を行う。このようにして得られた融合細胞、即ちハイ
ブリドーマの中より脳腫瘍細胞に特異的に結合するモノ
クローナル抗体を産生ずるハイブリドーマを選択する。

なお、上記の脳腫瘍培養細胞を動物に免疫する代わりに
、脳腫瘍培養細胞と動物のＢ細胞を適当な期間、培地中
で接触させた後、上記と同様にＢ細胞とミエローマ細胞
とを融合させても良い。このようなハイブリドーマの作
成に用いられる動物としては現在−船釣に用いられてい
るマウスで良い。得られたハイブリドーマは動物腹腔内
もしくは合成培地中で増殖させることができ、得られた
抗体産生ハイブリドーマはグリオーマ特異抗原に対する
モノクローナル抗体を安定して得ることができる。モノ
クローナル抗体を培養液又は腹水より塩析、ゲルろ過、
イオン交換クロマトグラフィー等の方法でイムノグロブ
リン分画として精製する。

このようにして得られたモノクローナル抗体を用いるこ
とによってヒトグリオーマ特異抗原を効率良く分離・精
製できる。まず、脳腫瘍培養細胞よりヒトグリオーマ特
異抗原を抽出する。抽出法としては目的とするヒトグリ
オーマ特異抗原に応じて検討する。例えば細胞内可溶性
画分に存在する場合には、単に浸透圧の変化によって脳
腫瘍培養細胞を破壊するだけでも良いし、超音波破砕。

あるいは種々の細胞用ホモゲナイザーを用いることもで
きる。又、細胞膜その他細胞の不溶性画分に存在するよ
うな場合には、それら細胞不溶性画分を有機溶媒、塩類
溶液、界面活性剤１種々の酵素剤などによって処理し目
的とする脳腫瘍特異抗原を可溶化する必要がある。更に
高度に精製するためにはモノクローナル抗体を水不溶性
担体に結合させた免疫吸着体を用いる。即ち、上記のヒ
トグリオーマ特異抗原を含む細胞抽出液を免疫吸着体に
接触せしめ、次いで免疫吸着体に結合したヒトグリオー
マ特異抗原を免疫吸着体より解離せしめることにより、
より精製されたヒトグリオーマ特異抗原が得られる。し
かし、この操作のみでは不純物を完全に除けないことも
あり、さらに純度の高いヒトグリオーマ特異抗原を必要
とする場合には、免疫吸着体による精製の前後に他の精
製法を組み合わせて用いることができる。このために用
いることのできる精製法として、イオン交換クロマトグ
ラフィー、ゲルろ過、塩析、各種吸着クロマトグラフィ
ー、レクチンなどを用いるアフィニティークロマトグラ
フィー等々がある。

ヒトグリオーマ特異抗原やヒトグリオーマ特異抗原に対
するモノクローナル抗体は以下のような用途に使用でき
る。

■　ヒトグリオーマ特異抗原及び／またはそれに対応す
るモノクローナル抗体を用いるヒトグリオーマ特異抗原
の測定用試薬の製造。

■　ヒトグリオーマ特異抗原に対するモノクローナル抗
体を用いるヒトグリオーマ特異抗原の製造。

■　精製されたヒトグリオーマ特異抗原を用いるポリク
ローナル抗体の製造。

■　ヒトグリオーマ特異抗原、モノクローナル抗体及び
／またはポリクローナル抗体を用いるヒトグリオーマ特
異抗原の測定用試薬の製造。

■　■又は■で得られる試薬を用いるヒトグリオーマお
よびヒトグリオーマ関連腫瘍の鑑別診断及び治療効果の
判定。

■　ヒトグリオーマ特異抗原に対するモノクローナル抗
体または■で得られるポリクローナル抗体を用いるラジ
オイムノアッセイ用医薬品の製造。

■　■で得られるラジオイムノアッセイ用医薬品を用い
るヒトグリオーマ及びヒトグリオーマ関連腫瘍の鑑別診
断または治療効果の判定。

■　ヒトグリオーマ特異抗原に対するモノクローナル抗
体または■で得られるポリクローナル抗体を用いるか、
またはそれらの修飾物を用いるヒトグリオーマおよびヒ
トグリオーマ関連腫瘍の治療。

上記の目的で使用できるヒトグリオーマ特異抗原として
はＧ−３抗原、Ｇ−１０抗原、Ｇ−２２抗原、Ｆ−６抗
原等があり、各々に対応するモノクローナル抗体として
はＧ−３モノクロ一ナル抗体、Ｇ−１０モノクロ一ナル
抗体、Ｇ−２２モノクロ一ナル抗体、Ｆ−６モノクロ一
ナル抗体等がある。

更に本発明は上記に述べたヒトグリオーマ特異抗原に対
応するモノクローナル抗体を使用して測定する方法をも
提供するものである。

使用するモノクローナル抗体は上記の如く調製したイム
ノグロブリン分画そのものでも使用できるが、更に脳腫
瘍特異抗原との結合部位のみを分離したＦ（ａｂ’）、
、　Ｆａｂ’、　Ｆａｂなどの分画として使用すること
もできる。

一方、高度に精製したヒトグリオーマ特異抗原を用いて
、検出可能な物質と結合させた標識ヒトグリオーマ特異
抗原を作成する。検出可能な物質としては、その検出感
度がヒトグリオーマ特異抗原の定量法に必要とされる検
出感度に充分なものを選択する必要がある。具体的には
各種放射性同位元素、各種酵素、蛍光物質、金属イオン
などがあり、更に好ましくは＋！５１．１３＋　１．β
−Ｄ−ガラクトシダーゼ、パーオキシダーゼ、アルカリ
ホスファターゼ、フルオレウセイン、メチルウンベリフ
ェロン、マグネシウムなどがあげられる。これら検出可
能な物質とヒトグリオーマ特異抗原との結合は、既知の
方法が用いられる。例えば、放射性同位元素を用いる場
合クロラミンＴ、ヨードゲン（ピアス社製・登録商標）
などの試薬が用いられ、酵素の場合には二官能性試薬に
よるカップリング法、過沃素酸酸化法などが応用できる
。このようにして得られた標識ヒトグリオーマ特異抗原
中には、本来目的とする標識ヒトグリオーマ特異抗原の
他に、検出可能な物質とヒトグリオーマ特異抗原との結
合数の異なるもの、検出可能な物質がヒトグリオーマ特
異抗原への結合操作中に一部変化し本来の活性を失った
もの、結合反応に関与しなかった検出可能な物質そのも
の、あるいは検出可能な物質がヒトグリオーマ特異抗原
に結合しなかったヒトグリオーマ特異抗原そのものなど
が混入していることがある。そこで定量の感度を上げる
ためには目的とする標識ヒトグリオーマ特異抗原のみを
上記の混合物から分離することが必要である。このため
の方法としてはイオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ
過クロマトグラフィーアフィニティークロマトグラフィ
ーなどがある。

上記以外にヒトグリオーマ特異抗原の定量に必要な試薬
としては、水不溶性担体に不溶化されたモノクローナル
抗体に結合する因子がある。モノクローナル抗体はイム
ノグロブリンにあるから結合する因子としては抗イムノ
グロブリン抗体即ち第二抗体を用いることができる。そ
の他イムノグロブリン結合蛋白質である微生物由来のプ
ロティンＡ、プロティンＧなども用いることができる。

これら結合する因子はモノクローナル抗体の結合量を上
げるためにアフィニティークロマトグラフィー等の手段
により高度に精製しておくことが好ましい。結合する因
子を不溶化するための水不溶性担体としては、各種の多
糖ゲル、ポリスチレンなどの合成樹脂で作られた粒子、
ボール、試験管。

その他の小容器、同様の形態のガラス、金属などの他、
ニトロセルロース、ナイロンなどの合成薄膜などが適し
ている。これら水不溶性担体への結合する因子の不溶化
法としては、物理的吸着、共有結合などの化学的結合が
利用できる。例えば物理的吸着法では、一定濃度の結合
する因子の溶液にポリスチレンビーズ等を入れ、一定時
間放置することによりポリスチレンビーズ等に結合する
因子を物理的に不溶化することができる。この際、不溶
化に際して結合する因子の溶液を絶えず動かすことによ
り水不溶性担体表面に結合する因子を均一に不溶化する
ことができる。又、結合する因子の溶液を１５〜４０°
Ｃに保つことにより短時間に不溶化することができる。

化学的結合法では、各種カップリング用試薬、例えば臭
化シアン、グルタルアルデヒド、過沃素酸ナトリウム、
カルボジイミド誘導体、シラン剤、マレイミド誘導体、
サクシニイミドエステル、オキシラン化合物、トシルク
ロライド、カルボニルイミダゾール等々が用いられる。

このようにして調製された水不溶性担体に不溶化された
該モノクローナル抗体に結合する因子は、ヒトグリオー
マ特異抗原の定量に際してそのまま用いるのは好ましく
ない。即ち、そのまま用いた場合、水不溶性担体の表面
、あるいは結合する因子の不溶化のために利用された化
学的に活性な反応基が定量に際して反応液成分を非特異
的に吸着結合し測定感度の悪化をもたらすのである。こ
れを防止するためには、結合する因子を不溶化した後の
水不溶性担体の表面を処理することが必要である。この
処理法としては、結合する因子を不溶化した後の水不溶
性担体を十分に洗浄した後、水不溶性担体の表面を不活
性化する方法が好ましい。水不溶性担体の表面を不活性
化するためには、アルブミン、ゼラチンその他の蛋白を
１種以上含む溶液、各種アミノ酸その他のアミノ基を持
つ化合物の溶液、還元剤、酸化剤などが各々単独もしく
は組み合わせて用いることができる。

このようにして調製された試薬を用いてヒトグリオーマ
特異抗原を定量する。

まず、生体体液（例えば血清、血漿、脳を髄液等）の一
定量とモノクローナル抗体を含む緩衝液の一定量を反応
させる。この時の全反応液量は５０〜１０００ｕｆｆｉ
が好ましい。緩衝液としてはアルブミン、ゼラチンなど
の一種以上の蛋白質を０．０１〜１％含むｐＨ４からｐ
Ｈ８，５の緩衝液が好ましく、反応温度は２°Ｃ以上４
０℃以下が好ましい。反応時間は測定感度に影響する重
要な因子であり、定置すべきヒトグリオーマ特異抗原の
種類に応じて十分に検討する必要があるが、操作性も考
慮すると１０分以上４日以内が好ましい。次いでこの反
応液に検出可能な物質で標識されたヒトグリオーマ特異
抗原と水不溶性担体に不溶化されたモノクローナル抗体
に結合する因子を順次加え、更に反応を行う。反応温度
及び時間は上と同じく、２°Ｃ以上４０°Ｃ以下、１０
分以上４日以内が好ましい。この反応の後、水不溶性担
体を水又は適当な緩衝液で洗浄し、水不溶性担体に結合
した検出可能な物質を測定する。上記操作を既知濃度の
ヒトグリオーマ特異抗原を含む標準液についても行い、
標準液の測定値と生体体液の測定値を比較することによ
り生体体液中のヒトグリオーマ特異抗原の濃度を定量す
ることができる。

叉旌斑工　脳腫瘍培養細胞に対するモノクローナル抗体
の作製 脳腫瘍培養細胞株ＳＫ−ＭＧ−４を１０％牛脂児血清を
含むダルベツコ改変イーグル培地でローラーボトル（８
５０ａｆｌ）を使用して培養した。培養後、ローラーボ
トル内部を０．１５ＭのＮａＣ１を含む２０ｍＭリン酸
緩衝液（ｐＨ７，３）で洗浄した０次いでローラーボト
ル内に界面活性剤（Ｎｏｎｉｄｅｔ　Ｐ−４０：シグマ
社製）１％を含む上記リン酸緩衝液２０ｄを加えて軽く
振盪し、細胞をローラーボトル内面より剥離させた。

得られた細胞懸濁液を０．１５ＭのＮａＣ１にて透析し
、この懸濁液の一部をマウスにそのまま皮下注射した。

２週間後、再度マウスに懸濁液を注射し、以後１週間ご
とに３回同じ操作を行った。このマウスの肺臓細胞を取
り出しマウスミエローマ細胞株Ｎ５−１とポリエチレン
グリコールを用いて融合させ、ハイブリドーマを含む細
胞懸濁液を１０％牛脂児血清を含むＲＰＭＩ−１６４０
−ＨＡＴ培地を含む９６ウエルマイクロタイタープレー
トに分注し、３７°Ｃで３週間培養した。この結果２０
０株のハイブリドーマが得られた。

得られたハイブリドーマの抗体産生能を調べたところ、
脳腫瘍培養細胞ＳＫ−ＭＧ−４の細胞成分に結合するハ
イプリドーマ４株が含まれていた。このハイプリドーマ
４株をＧ−１１，Ｇ−１２，Ｇ−１３，Ｇ−１４と命名
し、各々の生産するモノクローナル抗体の各種腫瘍培養
細胞に対する特異性を調べた。その結果を第１表に示す
。

第１表 実施例２　脳腫瘍細胞抽出液に対するモノクローナル抗
体の作製 マウス細胞株１８．５４−　Ｓ　Ｆ株を無血清合成培地
で培養した。この培養液より細胞を除き、この培養上清
３０％を含むＲＰ旧１６４ｏ培地にて脳腫瘍細胞株ＳＫ
−ＭＧ−４を培養した。培養には３ｇ／ｆのサイトデッ
クス３（ファルマシア社製）を含む３１の上記培地を用
い、ガラスの培養器内で撹拌培養した。

培養後、細胞の付着したサイトデックス３を集め、０．
１５Ｍ　ＮａＣ１で洗浄後、１％Ｎｏｎ１ｄｅｔ　Ｐ−
４０及び１　ｍＭ　ＰＭＳＦ　（フェニルメチルスルホ
ニルクロライド）を含む０．１Ｍリン酸緩衝液１００Ｉ
１１１で細胞成分を抽出した。この抽出液を遠心分離し
、不溶性成分を除去した細胞抽出液を得た。この抽出液
を濃縮透析し、この液を用いて２施拠土と同様にハイプ
リドーマ５株を分離した。このハイプリドーマ４株をＧ
−２１，Ｇ−２２２、Ｇ−２３，Ｇ−２４，Ｇ−２５と
命名し、各々の生産するモノクローナル抗体の各種腫瘍
培養細胞に対する特異性を調べた。なお、抽出液をマウ
スに注射する際には、フロイントのコンプリート・アジ
ュバントでエマルジョンにして注射した。その結果を第
２表に示す。

（以下余白） 第２表 洗浄した後、０．１Ｍ酢酸及び０．５Ｍ酢酸にて脳腫瘍
特異抗原を溶離した。各々のモノクローナル抗体不溶化
セファロースのカラムで得られた脳腫瘍特異抗原の量を
第３表に示す。

第３表 尖３１９１Ｊ主　脳腫瘍特異抗原の精製実施例１と同様
に脳腫瘍培養細胞株ＳＫ−ＭＧ−４及びＵ−２５１−Ｍ
Ｇを培養し、清」１例」−の方法に準じて細胞抽出液を
得た。一方、尖施炭上で得られたハイブリドーマＧ−１
２及び！ｎｕで得られたハイブリドーマＧ−２２２を用
いて各々に対するモノクローナル抗体Ｇ−１２及びモノ
クローナル抗体Ｇ−２２２を得た。

上記モノクローナル抗体をセファロース４Ｂに不溶化し
、これをカラムに充填した後、上記細胞抽出液をカラム
に流した。各々のカラムをＩＭのＮａＣ１を含む０．１
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７）で十分に上記ｔｌ−２５１−
ＭＧ細胞より得られたＧ−２２２モノクロ一ナル抗体に
対応する脳腫瘍特異抗原を、更にＴＳＫ　Ｇ３０００Ｓ
Ｗカラム（東洋曹達社製）で精製したところ、第１図の
溶出パターンが得られた。Ｇ−２２２モノクロ一ナル抗
体との結合活性、即ち脳腫瘍特異抗原は２０分から３０
分のフラクションに認められた。この溶出パターンより
計算すると第３表のＵ−２５１−ＭＧ細胞よりＧ−２２
２モノクロ一ナル抗体を用いて得られた脳腫瘍特異抗原
の純度は約７０％となる。

ｇ４土　Ｇ−３抗原及びＧ−３モノクロ一ナル抗体の作
製。

ヒトグリオーマ細胞株Ｕ−１７８−ＭＧをｌｉｔ例」２
と同様にして培養し、得られた細胞懸濁液をマウスに免
疫した。このマウスの肺臓細胞を取り出しマウスミエロ
ーマ細胞株Ｐ３／ＮＳＩ／１−Ａｇ４−１とポリエチレ
ングリコールを用いて融合させた。ハイブリドーマを含
む細胞懸濁液を１０％牛脂児血清を含むＲＰＭＩ−１６
４０−ＨＡＴ培地を含む９６ウエルマイクロタイタープ
レートに分注し、３７°Ｃで３週間培養した結果、Ｇ−
３抗原を認識するＧ−３モノクロ一ナル抗体を産生ずる
ハイブリドーマＧ−３が得られた。Ｇ−３モノクロ一ナ
ル抗体のイムノグロブリンのクラスはＩｇＭであった。

各種細胞抽出液をニトロセルロース膜に滴下し、膜を洗
浄したのち、膜に結合した細胞抽出液成分とＧ−３モノ
クロ一ナル抗体を反応させ、次いで膜上のＧ−３抗体と
結合したＧ−３モノクロ一ナル抗体をペルオキシダーゼ
標識抗マウスＩｇＭ抗体で検出した。その結果、Ｇ−３
抗原はヒトグリオーマ細胞、ヒト神経芽細胞腫細胞、ヒ
トメラノーマ細胞、ヒト肺癌細胞には存在したが、ヒト
成人正常脳細胞には検出されなかった。

清」１例５　　Ｇ−１０抗原及びＧ−１０モノクロ一ナ
ル抗体の作製。

実施桝土と同様に、ヒトグリオーマ細胞株Ｕ−１７８−
ＭＧを用いて、Ｇ−ｉ０抗原に対するモノクローナル抗
体産生ハイブリドーマＧ−１０を得た。Ｇ−１０モノク
ロ一ナル抗体を用いて、Ｗ土と同様にＧ−１０抗原の分
布を調べたところ、Ｇ−１０抗原はヒトグリオーマ細胞
、ヒトＢ細胞系腫瘍細胞、ヒト非Ｔ非Ｂ系腫瘍細胞に存
在した。また、成人正常脳細胞では検出されなかったが
、ヒト９週令胎児脳細胞には検出され、Ｇ−１０抗原は
一種の癌胎児抗原と考えられた。なお、Ｇ−１０モノク
ロ一ナル抗体はＩｇＭであった。

３１１例６　　Ｇ−２２抗原及びＧ−２２−Ｔ−ツクｏ
−ナル抗体の作製。

ヒトグリオーマ細胞株ＳＫ−ＭＧ−４を免疫原として遺
」１例」２と同じ方法でＧ−２２抗原に対するモノクロ
ーナル抗体産生ハイブリドーマＧ−２２を得た。Ｇ−２
２モノクロ一ナル抗体はＩｇＧ２ａであった。

ＳＫ−ＭＧ−４細胞を培養し、その抽出液をＧ−２２モ
ノクロ一ナル抗体不溶化セファロースのカラムに流し、
０．１Ｍの酢酸緩衝液（ｐＨ３）でＧ−２２抗原を溶出
した。得られた精製Ｇ−２２抗原を１２８１で標識し、
１′Ｉ標識Ｇ−２２抗原、Ｇ−２２モノクロ一ナル抗体
及び抗マウスＩｇＧ血清を用いた二抗体法放射免疫測定
法で各種細胞のＧ−２２抗原を測定した。Ｇ−２２抗原
はヒトグリオーマ細胞、ヒトメラノーマ細胞、ヒト肺癌
細胞及びヒト９週令胎児脳細胞には検出されたが、成人
正常脳細胞では検出されなかった。

！ＭｉＬ　Ｆ−６抗原及びＦ−６モノクロ一ナル抗体の
作製。　　　　　　　　　、− ヒト胎児脳細胞を免疫原としてマウスハイブリドーマＦ
−６を得た。Ｆ−６モノクロ一ナル抗体はＩｇＭであっ
た。叉旌適土と同様にＦ−６抗原の分布を調べたところ
、グリオーマ、メデュロブラストーマ、メラノーマ及び
ヒト胎児脳に存在した。

実施ＩＬ　　脳を髄液中でのＧ−１０抗原の存在。

大施桝旦に準じてＧ−１０抗原のＲＩＡ法測定用試薬を
調製した。良性及び悪性疾患患者の脳を髄液についてＧ
−１０抗原の測定を行ったところ、グリオーマ患者では
陽性であったが、非グリオーマ脳腫瘍である神経芽細胞
腫、及び非腫瘍性脳疾患であるクモ膜下出血症、髄膜炎
の患者では陰性であった。

実施例９　　Ｇ−２２抗原の精製 グリオーマ細胞株Ｕ−２５１−ＭＧを培養し、細胞をあ
つめ、抽出液を得た。抽出液をＧ−２２モノクロ一ナル
抗体不溶化セファロースのカラムに流し、カラムを洗浄
後、０．５Ｍの酢酸でＧ−２２抗原を溶出した。

８５０ｃｍのローラーボトルより２４０ｕｇのＧ−２２
抗原が得られた。ＳＯ３電気泳動により、Ｇ−２２抗原
の分子量を調べたところ、約６７．０００であった。

７刊　Ｇ−１７抗原及びＧ−２２抗原の分布グリオーマ
細胞株Ｕ−２５１−ＭＧを１０％牛脂児血清を含むダル
ベツコ改変イーグル培地で培養した。得られた細胞を１
％Ｎｏｎ１ｄｅｔ　Ｐ−４０（シグマ社製）を含む５０
ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７）で抽出した。抽出液をグ
リオーマ特異抗原（Ｇ−１７抗原）に対するＧ−１７モ
ノクロ一ナル抗体及びス」１例」−で得られた、Ｇ−２
２モノクロ一ナル抗体を各々不溶化したセファロースの
カラムに順次流し、各々のカラムを洗浄後、各々のカラ
ムより０．５Ｍ酢酸にてＧ−１７抗原及びＧ−２２抗原
を遊離した。得られた各々の抗原をウサギに免疫し、Ｇ
−１７ポリクロ一ナル抗体及びＧ−２２ポリクロ一ナル
抗体を得た。これらポリクローナル抗体を用いて、ヒト
腫瘍組織の酵素抗体法による染色を行った。その結果を
第４表に示す。いずれのポリクローナル抗体もグリオー
マ及び関連する脳腫瘍の組織と強く反応した。

（以下余白） 第４表 ７　　Ｇ−１１モノクロ一ナル抗体に対応する脳腫瘍特
異抗原（Ｇ−１１抗原）の定量ス」１例」工で得られた
Ｇ−１１モノクロ一ナル抗体産生ハイプリドーマをマウ
ス腹腔内にて培養し、Ｇ−１１モノクロ一ナル抗体を含
むマウス腹水を得た。この腹水に５０％飽和の硫安を加
え、生じた沈澱を透析後、ＤＥＡＥ−セファロースのカ
ラムに流し、抗体を得た。この抗体５■を３１！ｔｉの
ＣＮＢｒ活性化セファロース（ファルマシア社製）に不
溶化し、これをカラムに充填した。このカラムを用いて
藷（ＩＪ　３の方法に準じて脳腫瘍培養細胞株ＳＫ−Ｍ
Ｇ−４より脳腫瘍特異抗原（Ｇ−１１抗原）を精製した
。得られたＧ−１１抗原をヨードゲン（ピアス社製）を
用いてＩｇ！１１で標識した。これを用いてＧ−１１抗
原の定量を行った。

標準抗原液（０，１，０，５，１，５，，１０，５０及
び１００Ｂ　ｌ　／Ｔｕｂｅ）にＧ−１１モノクロ一ナ
ル抗体Ｌｏｎｇを含む１００μｌのゼラチン緩衝液（０
，５％のゼラチン。

０．３Ｍ　ＮａＣ１を含む２０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ
７）を加え４℃で１２時間反応させた。この反応液に１
２５Ｉ標識Ｇ−１１抗原２０００ｃｍｐを含むゼラチン
緩衝液５０ａｌ及びマウスＩｇＧカラムで精製したヤギ
の抗マウスＩｇＧを物理的吸着によって不溶化したポリ
スチレンビーズ（６，３ｍｍ径）を入れ、更に３７°Ｃ
で３時間反応させた。得られた検量線を第２図に示す。

その結果、１　ｎｇ／　ｔｕｂｅ以上のＧ−１１抗原が
定量できた。

脳１１１７！　（グリオーマ）患者の脳を髄液について
Ｇ−１１抗原を上記と同様の操作で測定したところ、２
３ｍｇ／ｍの濃度であった。一方髄膜炎患者のを髄液で
はＧ−１１抗原が検出されなかった。

犬隻±旦　Ｇ−２２抗原の定量 ｍ−で得られたＧ−２２モノクロ一ナル抗体及びＴＳＫ
　Ｇ３０００ＳＷカラムで精製されたＧ−２２抗原を用
いてＲＩＡ法による測定を行った。Ｇ−２２抗原はクロ
ラミンＴを用いて＋３１１で標識した。

標準抗原液（０，０，１，０，３，１，０，１０，３０
，１００゜３００　ｎｇ／Ｗｉ）又は検体（脳を髄液又
は血清）１００μ！とＧ−２２モノクロ一ナル抗体液（
５０ｎｇ／　ｒｔｄｌ　；　　０．５％ゼラチン、０．
１％牛血清アルブミン、　０．ＩＭ　ＮａＣ１，ｉ　ｎ
＋Ｍ　ＥＤＴＡ及び０．１％ＮａＮ。

を含む２０ｍＭ’Ｊン酸緩衝液、　ｐＨ７，２に溶解）
１００μｌを混合し４°Ｃで４日間反応させた。この反
応液番び３１１標識Ｇ−２２抗原（１００００ｃｐｓ／
１ｄ）５０μｌ及びセファロース４Ｂに不溶化した抗マ
ウスＩｇＧ抗体の懸濁液０．５−を加え、４°Ｃで２日
間反応させた。この反応懸濁液を遠心分離し、更に該セ
ファロース４Ｂを洗浄後、結合した１３１１標識Ｇ−２
２抗原の量をガンマ−カウンターで測定した。

各種脳腫瘍患者及び良性疾患患者の脳を髄液及び血清中
のＧ−２２抗原量を第５表に示す。尚、表中でｎｄは検
出限界以下を示す。

第５表 Ｇ−２２抗原は脳腫瘍の中でもグリオーマが陽性、なか
でもグリオブラストーマ、メデュロブラストーマの未分
化悪性グリオーマでは比較的に高値を示し、エペンデイ
モーマ、アストロサイトーマの分化良性グリオーマでは
比較的に低値を示す傾向が認められた。しかし一方、発
生起源の異なるニューリノーマでは検出されなかった。

又、血清中の濃度は脳を髄液中の濃度より低かった。

叉施炭肥　Ｇ−２４２抗原の定量 実施例４の方法で脳腫瘍培養細胞Ｕ−２５１−ＭＧを用
いてＧ−２４２モノクロ一ナル抗体産生ハイブリドーマ
を得た。

標準抗原液（０，１，３，１０，３０，１００゜３００
ｎｇ　／ｍｌ）　　１００μｉ、とＧ−２４２モノクロ
一ナル抗体体液（１１００ｎ／ｒｎ１．；ヤギ正常血清
３０μ！を含む０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，２）に
溶解〕１００μ℃を混合し、３７°Ｃで３０分間反応さ
せた後、″５Ｉ標識６−２４２抗体（４００００ｃｐｍ
／ｄ）　５０ｕ　１と災施史旦で用いた抗マウスＩｇＧ
抗体不溶化ポリスチレンビーズ１個を入れ、３７°Ｃで
１時間反応させた。上記ビーズを洗浄後、ビーズに結合
した放射活性を測定した。脳＋＋ｉ瘍患者脳を髄液では
Ｇ−２４２抗原が検出されたが、同じ脳に存在する腫瘍
でも、他臓器から転移した腫瘍あるいは非腫瘍低脳疾患
ではＧ−２４２抗原は検出されなかった。

〔発明の効果〕

本発明のグリオーマ特異抗原及びグリオーマ特異抗原に
対するモノクローナル抗体はグリオーマ及びグリオーマ
関連腫瘍の診断・治療に応用することができ、またこれ
を用いた本発明の抗原の測定法によって脳腫瘍特異抗原
を感度良く定量することができ、臨床医学上で非常に有
用なものである。

【図面の簡単な説明】

第１図は脳腫瘍特異抗原Ｇ−２２のＨＰＬＣ分画ノ分画
−ンであり、第２図は脳腫瘍特異抗原Ｇ−１１のＲ１へ
法による検量線を示したものである。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）ヒトグリオーマ細胞に存在し、正常脳組織には実
   質的に存在しないグリオーマ特異抗原。
2. （２）ヒトグリオーマ細胞に存在し、正常脳組織には実
   質的に存在しないグリオーマ特異抗原に特異的な抗体。
3. （３）ヒトグリオーマ細胞に存在し、正常脳組織には実
   質的に存在しないグリオーマ特異抗原に特異的なモノク
   ローナル抗体と生体体液を反応させた後、検出可能な物
   質で標識されたグリオーマ特異抗原に特異的なモノクロ
   ーナル抗体に対応する脳腫瘍特異抗原と水不溶性担体に
   不溶化されたグリオーマ特異抗原に特異的なモノクロー
   ナル抗体に結合する因子を添加し、反応させ、該水不溶
   性担体に結合した検出可能な物質を測定することを特徴
   とする抗原の定量法。