JPH0347133A - 分子クローニングにより得られたランゲルハンス島細胞の抗原 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、インスリン依存性（夏型）真性糖尿病（ｄｉ
ａｂｅｔｅｓ　　ｍｅｌｌｉｔｕｓ）（ＩＤＤＭ）を病
む患者の血清中に見いだされる抗体と結合する、ランゲ
ルハンス島細胞の抗原に関する。さらに詳しくは、本発
明は、小島細胞抗体（ＩＯＡ）と結合しそして組み換え
ＤＮＡ　（ｒＤＮＡ）または合成法により調製される、
タンパク質およびペプチドに関する。本発明は、また、
このようなＩＣＡタンパク質およびペプチドをエンコー
ドするクローニングしたＤＮＡに関する。本発明のＩＯ
Ａタンパク質およびペプチドは、ＩＤＤＭの症候前の診
断においてイムノアッセイ試薬として有用である。

ＩＤＤＭに関連する細胞および体液の異常の蓄積する証
拠は、この病気が自己免疫の疾患であるという仮説に導
いた。ランゲルハンス島のインスリン産生細胞に対して
向けられた血清の抗体は、免疫蛍光により検出された［
Ｇ、Ｆ、Ｂｏｔｔａｚ　Ｏｌ　Ａ、　　Ｆｌｏｒｉｎ−
Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎｌおよびり、Ｄｏｎｉａｃｈ：
自己免疫ポリエンドタリン欠損をもつ真性糖尿病におい
て小島細胞抗体（Ｉｓｌｅｔ　　Ｃｅ１ｌ　　Ａｎｔｉ
ｂｏｄｉｅｓ　　ｉｎ　　Ｄｉａｂｅｔｅｓ　　Ｍｅｌ
ｌｉｔｕｓ　　　Ｗｉｔｈ　　　Ａｕｔｏｉｍｉｎｅ　
　　Ｐｏ１ｙｅｎｄｏｃｒｉｎｅ　　　　Ｄｅｆｉｃｉ
ｅｎｃｉｅｓ）、Ｌａｎｃｅｔ　　　ｉ　　ｉ　　：　
　１２７９−１２８３（１９７４）、およびＡ、Ｃ，Ｍ
ａ　ｃＣｕ　ｉ　ｓ　ｈ。

Ｊ、　　Ｊｏｒｄａｎ、　　Ｃ，Ｊ、　　Ｃａｍｐｂｅ
　　Ｉ　　Ｉ。

Ｌ、Ｊ、Ｐ、Ｄｕｎｃａｎ、およびＷ、Ｊ、Ｉｒｖｉｎ
ｅ：共存する自己免疫病をもつインスリン依存性糖尿病
における小島細胞に対する抗体（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ
　　ｔｏ　　ｌ５ｌｅｔ−ｃｅｌｌ　　ｉｎ　　Ｉｎ５
ｕｌｉｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔＤｉａｂｅｔｉｃｓ　　
Ｗｉｔｈ　　Ｃｏｅｘｉｓｔａｎｔ　　Ａｕｔｏｉｍｍ
ｕｎｅ　　Ｄｉｓｅａｓａ）、Ｌａｎｃｅｔ　　　ｉｉ
：１５２９−１５３３（１９７４）］。これらの自自己
体は新しく診断された糖尿病（ＮＤＤ）の７０〜８０％
において観察されたが、正常の対照被検体において０．
　１〜１％で観察されるのみである［Ｃ，Ｈ，Ｂｒ。

ｇｒｅｎおよびＡ、Ｌｅｒｎｍａｒｋ：ＩＩＲｊｉ’ｉ
において小島細胞抗体（Ｉｓｌｅｔ　　Ｃｅ１ｌ　　Ａ
ｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　　ｉｎ　　Ｄｉａｂｅｔｅｓ）、
Ｃｌ１ｎ、　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ、Ｍｅｔａｂ。

１１　：　４０９−４３０　（１９８２）　、およびＧ
。

Ｆ、Ｂｏｔ　ｔａｚｚｏ、Ｒ，Ｐｕ　ｊ　ｏ　１−Ｂｏ
　ｒｒｅｌｌ、およびり、Ｄｏｎｉａｃｈ、：真性糖尿
病において体液および細胞の免疫性（Ｈｕ　ｍ　。

ｒａｌ　ａｎｄ　Ｃｅ目ｕｌａｒ　Ｉｍｍｕｎｉｔｙ　
　ｉｎ　　Ｄｉａｂｅｔｅｓ　　Ｍｅｌｌｉｔｕｓ）、
ＣＩ　ｉｎ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、ＡＩ　Ｉｅｒｇｙ　　ｌ
　：１３９−１５９　（１９８１）］。ＩＯＡはＩＤＤ
Ｍの１つの断定的因子として受は入れられるようになっ
た。ＩＯＡについての現在の知識の外観は、Ａ、Ｌｅｒ
ｎｍａｒｋ、糖尿病の薬物（Ｄｉａｂｅｔｉｃ　　Ｍｅ
ｄｉｃｉｎｅ）±：２８５−２９２　（１９８７）に記
載されている。

普通のＩＯＡアッセイは、膵臓の切片を血清に暴露し、
蛍光をもつ［Ｇ、Ｆ、Ｂｏｔ　ｔａｚｚ。

ｅｔ　　ａｌ、、５ｕｐｒａｌ　まＩ；は酵素標識をも
つ［Ｐ、Ｇ、Ｃｏ　１ｍａｎ、Ｍ、Ｔａ　ｔ　ｋｕ　ｓ
。

Ａ、　Ｒａｂｉｚａｄｅｈ、　Ｃ，Ｃａｈｉ　ｌ　ｌ、
およびＧ、Ｓ、Ｅｉｓｅｎｂａｒｔｈ：ラットの膵臓お
よびペルオキシダーゼプロティンＡを使用する小島細胞
抗体のアッセイ（Ａｓｓａｙ　　ｆｏｒＩｓｌｅｔ　　
Ｃｅ１ｌ　　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓｗｉｔｈ　　Ｒａｔ
　　Ｐａｎｃｒｅａｓ　　ａｎｄＰｅｒｏｘｉｄａｓｅ
　　Ｐｒｔｅｉｎ　　Ａ）％　Ｄｉａｂｅｔｅｓ　　Ｃ
ａｒｅ　　ｌｌ：３６７−３６８（１９８８）］第２抗
体で着色し、そして顕微鏡で観察することから成る。他
の同様な方法は、ビオチン−アビジンのサンドイッチお
よび免疫蛍光検出を包含する［Ｔ、コバヤシ、Ｔ、スギ
モト、Ｔ、イトウ、Ｋ、コサ力、Ｔ、タナ力、Ｓ、スワ
、Ｋ、サトウおよびに、ツジ：間接免疫蛍光によりおよ
び新規な方法により研究した日本のインスリン依存性お
よび非インスリン依存性糖尿病患者において小島細胞抗
体の流行（Ｔ　ｈ　ｅ　　Ｐ　ｒ　ｅ　ｖ・ａｆｅｎｃ
ｅ　　　ｏｆ　　　ｌ５ｌｅｔ　　　Ｃｅ１ｌ　　　Ａ
ｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　　　　　　ｉｎ　　　　　　Ｊａ
ｐａｎｅｓｅ　　　　　　１ｎｓｌｉｎ−ｄｅｐｅｎｄ
ｅｎｔ　　　ａｎｄ　　　Ｎ。

ｎ−１ｎｓｌｉｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　　　Ｄｉａｂ
ｅｃｉｃＰａｊｉａｎｔｓＳｔｕｄｉｅｄｂｙ　　　Ｉ
ｎｄｉｒｅｃｔ　　　Ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅ
ｎｃｅ　　　ａｎｄ　　　Ｎｅｗ　　　Ｍｅｔｈａｄｓ
）、Ｄｉａｂｅｔｅｓ　　　３５：３３５−３４０（１
９８６）］。これらの方法は時間を消費し、労力を要し
、再現が困難であり、そして感度が制限される。ＩＣＡ
のより便利なイムノアッセイの開発は、疫学およびＩＤ
ＤＭとの相関関係の広い試験、および究極にはスクリー
ニング試験によるこの病気の予測を可能とするであろう
。

現在のＩＣＡ試験の主な制限は、含まれる小島細胞抗原
の制限された知識および特性決定である。

ＩＯＡは低い力価および親和性をもち、そして特性決定
した抗体を使用してのみアプローチすることができる。

免疫蛍光試験により１検出されるＩＣＡ抗原は、特別な
興味をもたれている：それらは次のものを包含するであ
ろう： （１）小島細胞表面方法部分［Ｎ、に、ＭａｃＬａｒｅ
ｎ％Ｓ、Ｗ、Ｈｕｇｎｇ、およびＪ、Ｆｏｇｈ：インス
リン依存性糖尿病における培養したヒト島細胞腫細胞に
対する抗体（Ａｎｔｉｂ。

ｃｉｙヒｏＣｕｌｔｕｒｅｄＨｕｍａｎＩｎｓｕｌｉｎ
ｏｍａ　　Ｃｅ１ｌｓ　　ｉｎ　　Ｉｎ５ｕｌｉｎ−ｄ
ｅｐｅｎｄｅｎｔ　　Ｄｉａｂｅｔｅｓ）、Ｌａｎｃｅ
ｔ　　　ｌ　　：９９７　　１０００　　（１９７５）
、およびＡ、Ｌｅｒｎｍａｒｋ、Ｚ、Ｆ。

５ｔｅｉｎｅｒ、Ｒ，Ｌ、Ｊａｃｋｓｏｎ、Ｒ。

Ｊ　、　Ｗ　ｉ　ｎ　ｔ　ｅ　ｒおよびＨ，Ｓ、Ｔｒａ
　ｉ　ｓｍａｎ：若年型真性糖尿病における小島細胞表
面抗体（Ｉｓｌｅｔ−ｃｅｌｌ−ｓｕｒｆａｃｅ　　Ａ
ｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　　　　ｉｎ　　　　Ｊｕｖｅｎｉ
ｌｅ　　　　Ｄｉａｂｅｔｅｓ　　Ｍｅｌｌｉｔｕｓ）
、Ｎ、Ｅｎｇｌ、Ｊ、Ｍｅｄ、２２９：３７５　３８０
　（１９７８）］、 （２）インスリン［Ｊ、Ｐ、Ｐａ　１ｍｅ　ｒ、Ｃ。

Ｍ、Ａｓｐｌ　ｉｎ、Ｐ、Ｃｌｅｍｏｎｓ％に、Ｌｙｅ
ｎ、　　Ｏ，Ｔｅｔｐａｔ　　ｉ　ｌＩ　Ｐ、　　Ｋ、
　　ＲａｇｈＵおよびＴ、Ｌ、Ｐａｑｕｅｔｔｅ：イン
スリン処置前のインスリン依存性糖尿病におけるインス
リン抗体（Ｉｎｓｕｌｉｎ　　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓｉ
ｎ　　Ｉｎ５ｕｌｉｎ　　Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）、５ｃ
ｉｅｎｃｅ　　２２２：１３３７　１３３９（１９８３
）、およびＳ、Ｓｒ　１ｋａｎｔａ、Ａ、Ｔ。

Ｒｉｃｈｅｒ、Ｄ、に、ＭｃＣｕ　ｌ　１ｏｃｈ、Ｊ。

Ｓ、５ｏｅｌｄｎｅｒ、Ｇ、Ｓ、Ｅｉｓｅｎｂａｒｔｈ
およびＪ、Ｐ、Ｐａ　１ｍｅ　ｒ　：インスリンに対す
る自己免疫性、ベータ細胞の機能不全、およびインスリ
ン依存性真性糖尿病の進展（Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ
　　ｔｏ　　Ｉｎ５ｕｌｉｎ、Ｂｅｔａ　　Ｃｅ１ｌ　
　Ｄｙ５ｆｕｎｃｔ＋ｏｎ、ａｎｄ　　Ｄｅｖｅｌｏｐ
ｍｅｎｔ　　ｏｆ　　Ｉｎ５ｕ１ｉｎ−ｄｅｐｅｎｄｅ
ｎｔ　　ＤｉａｂｅｔｅｓＭｅｌｌｉｔｕｓ）、Ｄｉａ
ｂｅｔｅｓ　　３５：１３９−１４２　（１９８６）］
、 （３）未知の細胞の局在化の６４．０００ダルトン（６
４ｋ　ｄ）の小島タンパク質［Ｓ、Ｂａｅｋｋｅｓｋｏ
ｖ、　　Ｊ、　　Ｈ，Ｎｉｅ　　１ｓｅｒ＋ｓ　　Ｂ。

Ｍａｒｎｅｒ％　Ｔ、　　Ｂｉ　　ｌｄｅ％　Ｊ、　　
Ｌｕｄｖｉｇｓｓｏｎ、およびＡ、Ｌｅ　ｒｎｍａ　ｒ
ｋ　：新しく診断した糖尿病の子供における自己抗体は
ヒトランゲルハンス島細胞タンパク質を免疫沈澱させる
（ＡｕＬｏａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　　ｉｎ　　Ｎｅｗｌ
ｙ　　Ｄｉａｇｎｏｓｅｄ　　ＤｉａｂｅｔｉｃＩｓｌ
ｅｔ　　Ｃｅ１ｌ　　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）、Ｎａｔｕｒ
ｅ　　２９８：１６７　１６９（１９８２）］、および （４）細胞質抗原［Ｇ、Ｆ、Ｂｏｔｔａｚｚｏ、Ａ、　
Ｆｌｏｒｉｎ−Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ、およびり、Ｄ
ｏｎｉａｃｈ：自己免疫ポリエンドタリン欠損をもつ真
性糖尿病において小島細胞抗体（Ｉｓｌｅｔ　　Ｃｅ１
ｌ　　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓｉｎ　Ｄｉａｂｅｔｅｓ　
ＭｅｌｌｉｔｕｓＷｉｔｈ　　Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ　
　Ｐｏ１ｙｅｎｄｏｃｒｉｎｅ　　Ｄｅｆｉｃｉｅｎｃ
ｉｅｓ）、Ｌａｎｃｅｔ　　２：１２７９　１２８３　
（１９７４）、Ａ、Ｃ，ＭａｃＣｕｉｓｈ、Ｊ、Ｊｏｒ
ｄａｎ、Ｃ，Ｊ、Ｃａｍｐｂｅ　　Ｉ　　Ｉ　、　Ｌ、
　　Ｊ、　　Ｐ。

ＤｕｃａｎｘおよびＷ、Ｊ、Ｉｒｖｉｎｅ：共存する自
己免疫病をもつインスリン依存性糖尿病における小島細
胞に対する抗体（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　　ｔｏ　　ｌ
５ｌｅｔ−ｃｅｌｌ　　ｉｎ　　Ｉｎ５ｕｌｉｎ−ｄｅ
ｐｅｎｄｅｎｔ　　Ｄｉａｂｅｔｉｃｓ　Ｗｉｔｈ　Ｃ
ｏｅｘｉｓｔａｎｔ　Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ　　Ｄｉｓ
ｅａｓｅ）、Ｌａｎｃｅｔ　　２：１５２９　１５３３
（１９７４）、Ｒ。

Ｌｅｎｄｒｕｍ、Ｇ、Ｗａ　１ｋｅｒ１およびり。

Ｒ，Ｇａｍｂｌｉ：最近の開始の若年型真性糖尿病にお
いて小島細胞抗体（Ｉｓｌｅｔ−ＣｅｌｌＡｎｔｉｂｏ
ｄｉｅｓ　　ｉｎ　　Ｊｕｖｅｎｉｌｅ　　Ｄｉａｂｅ
ｔｅｓ　　Ｍｅｌｌｉｔｕｓ　　ｏｆＲｅｃｅｎｔ　　
０ｎｓｅｔ）、Ｌａｎｃｅｔｌ：８８０−８８３　（１
９７５）、およびＷ、Ｊ。

ｆｒｖｉｎｅ、Ｃ，Ｊ、ＭｃＣａｌｌｕｍ、Ｒ。

Ｓ、Ｇｒａｙ、Ｇ、Ｊ、Ｃａｍｐｂｅ　Ｉ　Ｉ、Ｌ。

Ｊ、Ｐ、Ｄｕｎｃａｎ、Ｊ、Ｗ、Ｆａｒｑｕｈａｒ、Ｈ
，ＶａｕｇｈａｎｂおよびＰ、Ｊ、Ｍｏｒｒｉｓ：糖尿
病、同時に存在する自己免疫病、およびＨＬＡ型の期間
および型と相関関係をもつ真性糖尿病におけるランゲル
ハンス島抗体（ＰａｎｃｒｅａｅｉｃＩｓｌｅｔＣｅｌ
ｌＡｒ＋ｔｉｂｏｄｉｅｓ　ｉｎ　Ｄｉａｂｅｔｅｓ　
Ｍｅｌｌｉｔｕｓ　　Ｃｏｒｒｅｌａｔｅｄ　　Ｗｉｔ
ｈＴｈｅ　　Ｄｕｒａｔｉｏｎ　　ａｎｄ　　Ｔｙｐｅ
ｏｆ　　Ｄｉａｂｅｔｅｓ、Ｇｏ−ｅｘｉｓｔｅｎｔ　
　Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ　　Ｄｉｓｅａｓｅ。

ａｎｄ　　ＨＬＡ−ｔｙｐｅ）、Ｄｉａｂｅｔｅｓ２６
：１３８−１４７　（１９７７）。

（５）糖接合体［Ｒ，Ｃ，Ｎａ　ｙ　ａｋ、Ｍ、Ａ。

Ｋ、Ｏｍａｒ％Ａ、Ｒａｂｉｚａｄｅｈ、Ｓ、５ｒｉｋ
ａｎｔａ、およびＧ、Ｓ、Ｅｉｓｅｎｂａｒｔｈ、「細
胞質ｊ小島細胞抗体：標的抗原はシアログリココンジュ
ゲートである証拠（”Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ’１ｓｌ
ｅｔ　　　　Ｃｅ１ｌ　　　　　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ
：Ｅｖｉｄｅｎｃｅ　　Ｔｈａｔｔｈｅ　　Ｔａｒｇｅ
ｔ　　Ａｎｔｉｇｅｎ　　ｉｓａ　　Ｓｉａｌｏｇｌｙ
ｃｏｃｎｊｕｇａｔｅ）、Ｄｉａｂｅｔｅｓ　　　３４
：６１７−６１９　　（１９８５）　　；Ｐ、Ｖａｒｄ
ｉ、　　Ｅ、　　Ｅ、Ｄｉｂｅｌｌａ、Ｔ、Ｊ、Ｐａ５
ｑｕａｒｅ　ｌ　ｌｏ、およびＳ。

５ｒｉｋａｎｔａ、小島細胞自己抗体：病理生物学およ
び臨床的適用（Ｉｓｌｅｔ　　Ｃｅ１ｌ　　Ａｕｅｏａ
ｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐａｔｈｏｂｉ。

Ｉｇｙ　　ａｎｄ　　Ｃ１１ｎｉｃａｌ　　Ａｐｐｌｉ
ｃａｔｉｏｎｓ）、Ｄｉａｂｅｔｅｓ　　Ｃａｒｅｌｏ
：６４５−５６　（１９８７）；Ｂ、に、ａｉ　ｌ　Ｉ
　ａ、ｒｄ、Ｊ、Ｗ、Ｔｈｏｍａ　ｓ、Ｌ、Ｊ。

Ｎｅ１ｌおよびＤ−Ｍ、Ｍａ　ｒｃｕ　ｓｌ　１型真性
糖尿病をもつ患者の血清分離された核酸ガングリオシド
ＧＴ３に対する抗体（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　　Ａｇａ
ｉｎｓｔ　　ＧａｎｇＩｉｏｓｉｄｅＧＴ３　　ｉｎ　
　ｔｈｅ　　５ｅｒａ　　ｏｆ　　Ｐａｔｉｅｎｔｓ　
　ｗｉｔｈ　　Ｔｙｐｅ　　Ｉ　　Ｄｉａｂｅｔｅｓ　
　Ｍｅｌｌｉｔｕｓ）、Ｊｏｕｎａｌｏｆ　　Ｉｍｍｕ
ｎｏｌｏｇｙ　　１４２：３８２６３２（１９８９）］
。

６４ｋｄの抗原は、放射線標識した小島タンパク質の免
疫沈澱により大きさおよび等電点タンパク質について特
性決定されたが、配列の情報は存在しない。２つの報告
は、前糖尿病の血清ならびに新しく診断した糖尿病血清
中のこのタンパク質を認識する七いう、抗体の高い流布
を示す［Ｓ。

Ｂａｅｋｋｅｓｋｏｖ、Ｍ、Ｌａｎｄ　ｉｎ、Ｊ。

Ｋ、Ｋｒ１ｓｔｅｎｓｅｎ、Ｓ、５ｒｉｋａｎｔａ、Ｇ
、Ｊａｎ　　Ｂｒｕｉｎｉｎｇ、Ｒ，Ｍａｎｄｒｕｐ−
Ｐｏｕｌｓｅｎ、Ｃ，ｄｅＢｅａｕｆｏｒｔ、Ｊ、Ｓ、
５ｏｅｌｄｎｅｒ、Ｇ、Ｅｉｓｅｎｂａｒｔｈ、Ｆ、Ｌ
ｉｎｄｇｒｅｎＳＧ、５ｕｎｄｑｕ　ｉ　ｓ　ｔｓおよ
びＡ、Ｌｅ　ｒｎｍａ　ｒｋ　：６４．０００分子量の
ヒト小島細胞抗体に対する抗体は、インスリン依存性糖
尿病の臨床的開始より先行する（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ
　　ｔｏ　　ａ６４．０００　　ＭＷ　　Ｈｕｍａｎ　
　ｌ５ｌｅｔＣｅｌｌ　　Ａｎｔｉｇｅｎ　　Ｐｒｅｃ
ｅｄ　　ｔｈｅ　　Ｃ１１ｎｉｃａｌ　　０ｎｓｅｔ　
　ｏｆ　　Ｉｎ５ｕｌｉｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　　Ｄ
ｉａｂｅｔｅｓ）、Ｊ、ＣＩ　ｉｎ、Ｉｎｖｅｓｔ、７
９：９２６−９３４　（１９８７）、およびＭ、Ａ、Ａ
ｔｋｉｎｓｏｎ、　　Ｎ、　　Ｋ、Ｍａｃｌａｒｅｎ、
Ｗ。

Ｊ、Ｒｉ　ｌｅｙ、Ｄ、Ｗ、５ｈａｒｐおよびり。

Ｈｏ　Ｉｍｅ　ｓ　：Ｍｒ６４，０００の自己抗体（６
４ＫＡ）の予測インスリン依存性糖尿病（Ｍｒ６４．０
００　　Ａｕｔｏａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　（６４ＫＡ）
　　Ｐｒｅｄｉｃｔ　　Ｉｎ５ｕｌｉｎ　　Ｄｅｐｎｄ
ｅｎｔ　　Ｄｉａｂｅｔｅｓ）、Ａｍｅｒｉｃａｎ　　
Ｄｉａｂｅｔｅｓ　　Ａｓ５ｏｃ、４８ｔｈ　　Ａｎｎ
ｕａｌ　　Ｍｅｅｔｉｎｇ（１９８８）Ａｂｓｔｒａｃ
ｔ　　＃３９１］。

いくつかの他の分子種は、ウェスタン・プロットにより
、糖尿病血清により認識される「共通の抗体」であると
して特性決定された［Ｄ、Ｇ、Ｋａｒｏｕｎｓ、Ｖ、Ｊ
、Ｖｉｒｔａ、Ｌ、Ｊ、Ｎｅ１１、およびＪ、Ｗ、Ｔｈ
ｏｍａ　ｓ　：ヒトおよびＲＩＮｍ５Ｆ小島細胞抗原の
分析（Ａｎａｌｙｓｉｓ　　ｏｆ　　Ｈｕｍａｎ　　ａ
ｎｄ　　ＲＩＮｍ５Ｆ　　ｌ５ｌｅｔ　　Ａｎｔｉｇｅ
ｎｓ）、Ａｍｅｒｉｃａｎ　　Ｄｉａｂｅｔｅｓ　　Ａ
ｓ５ｏｃ、Ｒｅｓ、ｓｙｍｐ、Ｗｏｏｄｓ　　　Ｈｏ１
ｅ、ＭＡ、０ｃｔｏｂｅｒ　　　１９８７；Ａｂｓｔｒ
ａｃｔ　　　＃１２０］。これらの抗原は、１５０ｋｄ
、８４ｋｄ、６０ｋｄ、４９ｋｄ、および３６ｋｄの分
子量を有する。

本発明は、ランゲルハンス島細胞抗体と選択的に結合す
る、１または２以上のタンパク質またはペプチド断片の
遺伝情報を指定する、１系列のクローニングした核酸を
提供する。このようなりロニングした核酸は、受託され
た組み換えバクテリオ７アージＡＴＣＣ４０５５０，４
０５５２，４０５５２、４０５５３、４０５５４、４０
７０３，４０７０４，４０７０５、または４０７０６中
のＤＮＡインサートにより特性決定される。

したがって、本発明は、また、クローニングした核酸に
よりエンコードされそしてインスリン依存性（■型）真
性糖尿病（ＩＤＤＭ）の診断において有用である、ＩＯ
Ａタンパク質およびペプチド断片を提供する。ＩＯＡ上
の抗体結合部位に結合するこのようなタンパク質および
ペプチドの能力は、また、循環するヒト免疫グロブリン
、Ｔ細胞、およびＢ細胞を包含する、ＩＤＤＭにおいて
含まれるヒト免疫グロブリン、Ｔ細胞またはＢ細胞の結
合またはブロッキング（ｂｌｏｋｉｎｇ）における実用
性を与える。

本発明のＥＣＡタンパク質およびペプチドは、本発明の
クローニングした核酸の完全なまたは部分的発現のよう
な方法により、必要に応じて引き続く断片化により得ら
れる；そして本発明のクロニングしたｃ　ＤＮＡからか
、あるいは決定することができるかまたは小島細胞の核
酸から分離できる全長のＩＯＡ抗原遺伝子から、決定さ
れたアミノ酸配列に基づくペプチドまたはポリペプチド
の合成は、本発明の相補的クローニングしたｃＤＮＡ配
列の助けにより遊離する。したがって、このようなＩＯ
Ａタンパク質は、小島細胞の中にまたは上に存在する全
長のＩＣＡタンパク質を包含し、そして前記ＩＯＡタン
パク質は本発明のクロニングしたｃＤＮＡの完全な配列
と少なくとも部分的に相補的であるｍＲＮＡをもつヒト
遺伝子により発現される。また、本発明のＩＣＡタンパ
ク質およびペプチドには、部分的発現によるか、あるい
は引き続く断片化、例えば、制限ヌクレアーゼを使用す
る断片化により得られる、このようなタンパク質の本発
明のｃＤＮＡインサートおよび断片からなる組み換えク
ローニングベヒクル（Ｖｅｈｉｃｌｅ）により発現され
たタンパク質が包含される。本発明のＩＯＡタンパク質
およびペプチドは、また、タンパク質合成により得られ
たペプチド、例えば、長さが３アミノ酸以上であり、Ｉ
ＣＡエピトープまたはその類似体または誘導体を表すも
のを包含する。

本発明はある数の利点を提供する。ＩＣＡ抗原の分子ク
ローニングは、ＩＤＤＭの研究、診断、および処置にお
いて使用するために、ならびに小島細胞の破壊およびＩ
ＯＡの出現において含まれる生物学的機構を研究する機
械として、大きいおよび再現性可能な量の材料の調製を
提供する。大量の純粋な抗原の入手可能性は、症候前の
ＩＤＤＭまたはＩＤＤＭを発生させるための素因のため
の一般的集団のスクリーニングするために使用できる、
高度に感受性の特異的イムノアッセイの開発を可能とす
る。

ここで使用するとき、用語ｒｌｃＡ抗原」は本発明によ
り提供されるタンパク質およびペプチドを意味すると理
解すべきであるが、ある場合において、ペプチドの形態
は厳格な意味において「抗原」ではない、すなわち、そ
れらはハプテンであろう。なぜなら、それらは宿主動物
における抗体の産生を刺激するために普通の高分子担体
への取り付けを必要とするであろうからである。

さらに、「クローニングした核酸」、「クローニングし
たＩＯＡ抗原配列」、ｒｃＤＮＡインサート」などは、
受託された組み換えバクテリオファージＡＴＣＣ４０５
５０，４０５５１，４０５５２，４０５５３，４０５５
４，４０７０３，４０７０４，４０７０５、または４０
７０６中のインサート、およびまた、このような受託さ
れた配列からなる、全長の遺伝子の他の核酸配列、また
はこのような配列の断片を意味する。ｌまたは２以上の
全長のＩＯＡ抗原は、上の受託されたｃＤＮＡインサー
トとの相同性により特性決定されることが認識されるで
あろうが、２またはそれ以上のこの上うなｃＤＮＡイン
サートが単一のＩＯＡ抗原に相当することが可能である
。例えば、ＡＴＣＣ４０７０３中のインサートはＡＴＣ
Ｃ４０５５０およびＡＴＣＣ４０５５４の両者のだめの
インサートを包含するように思われ、こうしてこれらの
３つのインサートはすべて単一のｘｃＡ抗ｆＫの異なる
および／またはオーバーラツプする部分に相当すること
ができる。

クローニングしたＩＯＡ抗原の配列の調製一般に、本発
明のクローニングした抗原の配列は、ヒト遺伝子を適当
な組み換えクローニングベヒクル、例えば、バクテリオ
ファージ中で発現させ、そして生ずる遺伝子ライブラリ
ーをＩ　ＤＤＭ血清でプロービングして、ＩＯＡ抗体に
より認識される抗原を選択する。次いで、組み換え抗原
を糖尿病および正常の血清のパネルでスクリーニングし
て、同定したクローンの病気の特異性を決定する。

特定の沈着したクローンは、次の方法でとくに得られる
（それ以上の詳細は下の実施例中に記載され、ている）
。ヒトｃ　ＤＮＡライブラリーは、精製したヒト小島か
らＲＮＡを抽出することによって発生させた。このＲＮ
Ａはクロマトグラフィーにより分画して、他のＲＮＡ、
例えば、リポソームのＲＮＡおよび変性したＲＮＡの断
片からポリＡ　　ｍＲＮＡを分離した。分離したｍ　Ｒ
Ｎ　Ａを商業的に入手可能なｃＤＮＡキット（Ｂｅｔｈ
ｅｓｄａ　　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｉｅｓ）で逆転写し、ＥｃｏＲＩ　　ＤＮＡリンカ−に
結合し、そして生体外パッケージングのためにラムダｇ
ｔ−１１アーム中に結合した。結合したラムダを商用キ
ット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用してパッケージン
グし、次いで平板フォーマットでバクテリア菌叢上で増
幅した。

ファージライブラリーを、■型糖尿病の自己免疫患者か
らの抗体でスクリーニングした。アガロースの平板をフ
ァージで感染バクテリアで広げ、そして組み換えタンパ
ク質の発現を化学的に誘発した。このタンパク質はフィ
ルター上へ沈積させ、次いで血清でプロービングした。

陽性であると思われるプラークをアガロース平板から分
離し、そして２ラウンドの分離により精製した。クロー
ニングに引き続いて、ｇｔ−１１フアージを大規模の発
現のためにバクテリア宿主中に感染させた。

クローニングしたｃＤＮＡにより発現されるタンパク質
の特異性は、クローニングしたヒトタンパク質を含有す
るバクテリア抽出物のウェスタン・プロッティングによ
り評価した。調製用ポリアクリルアミドゲルを展開し、
そして膜上に電気ブロンティングし、膜をストリップに
切断し、次いでｌ系列の正常思われる糖尿病の血清と反
応させた。

糖尿病の血清ともっばらまたは主として反応するタンパ
ク質を発生したクローンを選択した。

組み換えクローニングベヒクルおよび サブクローニング 従来この分野において知られているように、本発明のｃ
ＤＮＡ転写体、例えば、クローニングベヒクルから切除
したライブラリーｃＤＮＡまたはｃＤＮＡインサートは
、問題の配列の増幅および問題の［ＣＡ抗原の発現のた
めに、種々の組み換えクローニングベヒクル中に組み込
むことができる。組み換えクローニングベヒクルは、生
化学的分子または構造体、例えば、ＤＮＡであり、これ
はポリヌクレオチドの配列の挿入およびベヒクルが宿主
細胞中に適当に組み込まれたとき、挿入されたポリヌク
レオチド配列の複製を可能とする。

発現ベヒクルは、さらに、挿入されたポリヌクレオチド
によりエンコードされるタンパク質を発現する性質を包
含する。発現ベクターにおいて、挿入されたＩＣＡ抗原
は、適当な宿主中でＩＣＡ抗原を発現することができる
適当な対照配列に操作的に結合する。含まれる対照配列
は、選択した宿主および形質転換方法に従い変化するで
あろう。

これらの物質は当業者の範囲内である。

適当な組み換えクローニングベヒクルは、プラスミド、
ウィルスおよびバクテリオ７アージ、およびＤＮＡの組
み込み可能な断片（すなわち、組み換えにより宿主ゲノ
ム中に組み込み可能な断片）を包含する。発現ベヒクル
は、とくに好ましく、そして限定なしに、バクテリアの
ｐＥＭＢＬ、Ｉ）ＭＭＢ、およびｐＵＫ１酵母ｐＡＡＨ
％、ｐＹＥ４、およびＩ）ＡＢ１１２、哺乳動物のｐＲ
３Ｖ、ワタシニア誘導ベクター、乳頭腫誘導ベクターレ
トロウィルスのベクター、およびシャトルベクター、例
えば、ｐＣＤＭ８により例示される。外観については、
参照り、Ｍ、Ｇｌｏｖｅ　ｒ’、ＤＮＡのクローニング
：実際のアプローチ（ＤＮＡＣｌｏｎｉｎｇ：Ａ　　Ｐ
ｒａｃｔｉｃａｌ　　Ａｐｐｒｏａｃｈ）（１９８５）
ＩＲＬ　　ＰｒｅｓｓＬｉｄ、。適当な宿主細胞は、原
核細胞、酵母、および哺乳動物を包含する、より高等の
真核細胞を包含する。

ｃＤＮＡインサートのサブクローニングは、結合のため
にインサートを異なるクローニングベヒクルに切除する
ことを包含することができる。インサートは、ものと挿
入において使用するリンカ−に相当する制限酵素を使用
するか、あるいはインサートの制限地図から選択される
制限酵素を使用して切除することができる。切除したｃ
　ＤＮＡは、必要に応じて配列決定、増幅、または発現
のために他の適当なベクター中に挿入することができる
。もとのクローニングベヒクル中の末端制限部位が破壊
されたとき、他の酵素を使用して、インサートおよび生
ずるフランキング領域を、普通の手段により欠失したク
ローニングベヒクルから回収することができる。

全長の遺伝子のクローニング 本発明のｃＤＮＡインサートの断片は、標準の方法によ
り適当なライブラリーから、全長のｃＤＮＡまたはゲノ
ムのＤＮＡのクローンを分離するために使用することが
できる。標的ライブラリーを平板上に広げ、増殖させ、
フィルターに移し、そしてＤＮＡプローブと反応させる
。このようなりＮＡグローブを、末端標識つけ、ニック
翻訳、ランダムプライムド転写、または光化学的手段の
ような方法により、ｃＤＮＡインサートの制限断片から
発生させる。オリゴヌクレオチドを合成し、標識し、そ
してハイブリダイゼーションプローブとして使用するこ
とができる。ＲＮＡプローブは、また、適当な鋳型から
の転写によりサブクローニングしたｃＤＮＡから発生さ
せることができる。

部分的ｃＤＮＡクローンと反応すると思われる、組み換
えクローニングベヒクル、例えば、ファージまたはプラ
スミドを再クローニングし、次いで制限マツピングする
。次いで、有望なりローンを配列決定して、もとのプロ
ーブのハイブリダイゼーションを確証しかつより大きい
断片上の伸長した配列の情報を得る。全長のクローンが
この方法において得られない場合、ヒト遺伝子の遺伝情
報を指定する核酸の完全な配列をクローニングした断片
のオーバーラッピングする配列から一緒に断片化するこ
とができる。

より長い断片、および可能ならば全長のクローンを得る
別の方法は、部分的クローンにより発現されたＩＯＡ抗
原に対してレイズ（ｒａｉｓｅ）された抗体を使用する
。問題の抗原を同定した後、それは免疫原として使用し
て、高い力価および親相性のモノクローナル抗体または
ポリクローナル抗体をレイズすることができる。このよ
うな抗体は、より長いｃＤＮＡクローン、およびライブ
ラリー中により少ない量で存在するｃＤＮＡクローンの
検出を可能とする。

抗原およびペプチドの試料 ここで定義するＩＯＡ抗原は、ある数の異なる方法で、
本発明により提供されるクローンおよび配列の情報から
調製することができる。１つの方法は本発明に従い得ら
れたＩＣＡ抗原のクローンから、とくに沈積したクロー
ンからタンパク質を単に発現することができる。このよ
うな発現されたタンパク質、またはそれらの断片または
消化産生物は、小島細胞の抗体へ結合するために抗原と
して使用することができる。しかしながら、バクテリア
の発現の抽出物の直接使用はある場合において可能でな
いことがある。なぜなら、ヒト血清は通常Ｅ、ｃｏｌｉ
タンパク質と非特異的に反応するからである。このよう
な場合において、発現されたＩＯＡ抗原は、普通の方法
８例えば、電気泳動の分離および引き続く膜上の固定化
（ウェスタン・プロッティング）によるか、あるいはカ
ラムクロマトグラフィーまたは親和精製（例えば、抗ベ
ータガラクトシダーゼ親和制限クロマトグラフィーまた
は他の普通の生化学的手段、例えば、塩または温度の沈
澱）により分離することができる。

あるいは、ペプチド断片は、よく知られた方法により、
ＩＯＡ抗原のクローンの実験的に決定されたＤＮＡ配列
から推定されたアミノ酸配列から合成することができる
。オーバーランピングするペプチドを合成し、そしてＩ
ＯＡ血清との反応性について試験することができる。反
応性ペプチドが発見されたとき、より小さいペプチドを
調製して最小の反応性単位、すなわち、エピトープをマ
ツピングすることができる。

方法 本発明により提供されるＩＯＡ抗原の主な使用は、ＩＤ
ＤＭの診断および予測である。このような方法において
、血液試料、通常血清試料を選択した１つまたはｌ系列
のＩＯＡ抗原と反応させ、そして普通の技術により免疫
反応性を決定する。

さらに、異なるＩＯＡ抗原との免疫反応性のプロフィル
は病気の性質、例えば、サブタイプ、病気の状態、病気
の開始の接近性、治療の効能、例えば、免疫治療などに
関する診断的に有意の情報を提供することができる。

本発明のＩＯＡ抗原のそれ以上の使用は、自己反応性Ｂ
細胞の同定、マーキング、または特異的破壊においてで
ある。自己抗体がＩＤＤＭにおいて悪い作用を有する場
合、抗Ｂ細胞治療は前糖尿病から臨床的ＩＤＤＭへの病
気の進行を遅くするか、あるいは止めることができるこ
とが考えられる。

本発明のＩＣＡ抗原の他の使用は、小島反応性Ｔ細胞の
集団の同定においてである。ＩＣＡ抗厚はＴ細胞の培養
のための抗原を刺激し、有意に改良されたＴ細胞のクロ
ーニング、同定、および増殖を可能とする。ＩＯＡのＴ
細胞の検出は前糖尿病の状態の診断において意味がある
こと、および自己反応性Ｔ細胞のレベルの監視は病気の
進行の指示および免疫変調治療の利用を与えることが考
えられる。さらに、ＩＣＡ　　Ｔ細胞の培養物の批代は
糖尿病の治療の設計のための生体外モデルを提供する。

最後に、Ｔ細胞の免疫化は自己破壊要素に対する体液の
応答を発生させることによって、自己免疫性を停止また
は遅延することができる。

ヒトＩＯＡ免疫グロブリンおよびＴ細胞に結合するＩＣ
Ａ抗原の能力を使用して、生体内の小島細胞および小島
細胞成分へのＩＣＡの結合をブロッキングすることがで
き、したがって直接の治療効果を提供することが考えら
れる。

次の実施例によって、本発明をさらに説明する。

本発明は、次の実施例により限定されることを意図しな
い。

実施例 １、ｃＤＮＡライブラリー ランゲルハンス島は、ワシントン大学においてポール・
レイシー（Ｐａｕｌ　　Ｌａｃｙ）およびデイピッド俳
シャープ（Ｄａｖｉｄ　　Ｓｃｈａｒｒｐ）博士により
、発表された手順従い精製された［Ｃ，Ｒｉｃｏｒｄｉ
、　Ｐ、　Ｅ、　Ｌａｃｙ、　Ｅ。

Ｈ，Ｆ　ｉ　ｎｋｅ、Ｂ、Ｊ、Ｏｌ　ａｃｋ、およびり
。

Ｗ、５ｃｈａｒｐ：ヒトランゲルハンス島の分離の自動
化された方法（Ａｎ　　ＡｕｔｏｍａｔｅｄＭｅｔｈｏ
ｄ　　ｆｏｒ　　ｌ５ｏｌａｔｉｉｏｎｏｆ　　Ｈｕｍ
ａｎ　　ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ　　ｒｓｌｅｔｓ）、Ｄ
ｉａｂｅｔｅｓ　　　３７：４１３−４２０　（１９８
８）］。簡潔的には、ヒト膵臓をコラゲナーゼで潅流し
、次いで粉砕した。フィコール勾配遠心を使用して、小
島を分離し、次いでこれを室温において１週間培養した
。小島を凍結し、そして輸送した。

受は取ったとき、小島を融解し、プールし、そして洗浄
した。ＲＮＡをグアニジニウムチオシアネートで抽出し
、そして塩化リチウムで沈澱させｆ：　　　［Ｇ、　　
　Ｃａｔｈａｌａ、　　　Ｊ、　　　Ｆ、　　　５ａｖ
ｏｕｒｅｔ、Ｂ、Ｍｅｎｄｅｚｓ　Ｂ、Ｌ、Ｗｅｓｔ、
Ｍ。

ＫａｒｉｎｌＪ、Ａ、Ｍａｒｔｉａ＋、およびＪ。

Ｄ、Ｂａｘｔｅｒ：完全な、ツランステイシ鰭ナリーに
活性なリボ核酸の分離の方法（ＡＭｅｔｈｏｄ　　ｆｏ
ｒ　　ｌ５ｏｌａｔｉｏｎ　　ｏｆ　　１ｎｔａｃｔ、
ＴｒａｎｓｔａｔｉｏｎａｌｌｙＡｃｔｉｖｅ　　Ｒｉ
ｂｏｎｕｃｌｅｉｃ　　Ａｃ１ｄ）、ＤＮＡ　　２：３
．２９−３３５（１９８３）］。

約７７０μｇの全体のＲＮＡを各１ｍ（＋の遠心した小
島から得た。メツセンジャーＲＮＡをファーマシア・オ
リゴ（ｄｔ）−セルロース７型（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　
　Ｆｉｎｅ　　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ。

米国ニュージャーシイ州ピッツバーグ）を使用して、マ
ニアチス（Ｍａｎｉａむｉｓ）ら、の手順［Ｔ、Ｍａｎ
ｉａｔｉｓｌＥ、Ｆ、Ｆｒ１ｔｓｅ１１およびＪ、Ｓａ
ｍｂｒｏｏ　ｌ　：モレキュラー・クローニング（Ｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒ　　Ｃｌｏｎｉｎｇ）、：実験室のマニ
ュアル（Ａ　　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　　Ｍａｎｕａ＋
）、（１９８２）、コールド・スプリング・ハーバ−・
ラボラトリ−コールド・ハーバ−（Ｃｏｌｄ　　Ｓｐｒ
ｉｎｇＨａｒｂｏｒ　　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、９．
　１９７−１９８１に従いで精製した。約３０μｇのＲ
ＮＡをクロマトグラフィーにより得た。ＢＲＬキット＃
８１１０　（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　　Ｒｅ５ｅａｃｈ　　
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、米国マリイランド州ガイサース
バーグ）および５ｓＳ−メチオニンを使用する生体外翻
訳は、産生される分子量の広い範囲を示した。

ＢＲＬ＃８２６７ＳＡキットをｃＤＮＡの合成のために
使用した。１０．ｕｇのポリ−ＡゝＲＮＡを反応におい
て使用した。末端を７４−ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｈａ
ｒｍａｃｉａ）で平滑にし、そしてｃＤＮＡをＥｃｏＲ
Ｉメチラーゼ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄ　　Ｂｉｏｌａｂ
ｓ、米国マサチュセッツ州）およびＳ−アデノシルメチ
オニンでメチル化し、そしてＥｃｏＲＩりンカーに結合
した。

ｃＤＮＡをＥｃｏＲＩで消化し、バイオゲル（Ｂｉｏｇ
ｅｌ）Ａ１５Ｍカラム（ＢｉｏＲａｄ　　Ｌａｂｏｌａ
ｔｏｒｉｅｓ、米国ニューヨーク州ロックビレ・センタ
ー）で展開してりンカーおよび断片を分離した。

ｃＤＮＡをラムダｇ　ｉ　−１１アームに結合し、そし
てストラタジーン・ジガパック・プラス（Ｓｔｒａｔａ
ｇｅｎｅ　　Ｇｉｇａｐａｃｋ　　ＦｌｕＳ）キット（
Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ　　Ｃｌｏｎｉｎｇ　　Ｓｙｓｔ
ｅｍ、米国カリフォルニア州うジβリア）でパッケージ
ングした。はぼ８．５Ｘ１０５のインサート含有クロー
ンのライブラリー（５ブロモ−４−クロロ−３−インド
リル−β−Ｄガラクトピラノシドで測定した）が得られ
、そしてＥ、ｃｏｌｉ　　Ｙ１０９０（Ｓｔｒａｔａｇ
ｅｎｅ）で増幅した。

２、血清 新しく診断した糖尿病の個体からの血清を、フロリダ大
学（米国フロリダ州ガインスビレ）のウィリアム・リレ
ー（Ｗｉ　Ｉ　Ｉ　ｉａｍ　　Ｒｉ　１ｅｙ）博士およ
びピッツバーグ子供病院（米国ペンシルバニア州ピッツ
バーグ）のアラン・ドラッシュ（Ａｌａｎ　　Ｄｒａｓ
ｈ）から得た。正常血清は実験室の個体から集めた。血
清はフィルターで多数回吸収した。フィルターは、（ａ
）ラムダ感染Ｅ。

ｃｏｌｉをクロロホルムで溶菌し、そしてこのすゼイト
中でニトロセルロースのフィルターをソキングするか、
あるいは（ｂ）本質的にライブラリーのスクリーニング
と同一の方法で、平板の７オーマント中でラムダ感染Ｅ
、ｃｏｌｉ上でイソプロピル−β−チオガラクトピラノ
シド（ＩＰＴＧ）でンーキングしたフィルターをオーバ
ーレイしてフィルターを調製することによって調製した
。下に記載するように大まかな分画後、血清をプロット
（ｂｌｏｔｔｏ）溶液１５％のカーネイション（Ｃａｒ
ｎａｔｉｏｎ）−脱脂牛乳、１０５９モルのトリスｐＨ
８，０，１５０ミリモルのＮａＣ１，０，０５％ツイー
ン−２０、および０．０５％のアジ化ナトリウム）中に
ｌ／２０〜１／２００に希釈した。

３、スクリーニング スクリーニング手順は、標準のプロトコル［Ｔ。

Ｖ、Ｈｕｙｎｈ、Ｒ，Ａ、ＹｏｕｎｇおよびＲ９〜Ｖ、
Ｄａ　ｖｕ　ｓ　：　ＤＮＡクローニングにおいてＦｇ
ｔｔｏおよびＧｆ　ｔ　ｌ　ｌにおけるｃＤＮＡｌｂｔ
の構成およびスクリーニング（Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｎ
ｇ　　　ａｎｄ　　　Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ　　　ｃＤＮ
Ａ　　Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ　　ｉｎ　　ＦｇｔｌＯおよ
びＧｆｔｌｌ）、Ｄ、Ｍ、ＧＩｏｖｅｒ編（１９８５）
ＩＲＬ　　　Ｐｒｅｓｓ　　　Ｐ、４９０−７８］　　
。

フィルターは、ｌＯの１５０ｍｍのアガロース平板の各
々上に約５０，０００プラ一ク形成単位（ｐ　ｆ　ｕ）
のライブラリーを平板培養することによって調製した。

４２℃において約３時間増殖させた後、ＩＰＴＧを含有
するフィルターにトロセルロース、５ｃｈｌｅｉｃｈｅ
ｒ　　ａｎｄＳｃｈｕｅｌｌ、米国ニューハンプシャイ
ヤー州）を平板上に横たえ、そして増殖を３７°Ｃにお
いて３〜４時間または一夜続けた。フィルターをプロッ
ト溶液でブロッキングし、そして４℃において貯蔵した
。

最初に、フィルターとのすべての抗体の反応は室温にお
いて３時間実施した。後の実験において、血清のインキ
ュベーションはツイーン−２０を含まないプロット溶液
中で４℃において一夜実施し、その間第２抗体反応を室
温において１．５時間実施した。すべてのインキュベー
ションおよび洗浄はプラットホームの農産装置でおだや
かに回転しなから実施した。

ライブラリーはヒト抗体のプローブで数回スクリーニン
グした。第１の場合において、抗体を糖尿病の血清から
ＨＰＬＣにより精製した。第２および第３の場合におい
て、血清を５０％の硫酸アンモニウムで沈澱させ、そし
て透析した。第１および第３のスクリーニングについて
、２つの血清の混合物を精製のすべてのラウンドのため
に使用した。第２、のスクリーニングについて、２０の
糖尿病の混合物を予備的精製のために使用した。それ以
上のスクリーニングにおいて、２２の血清をプールし、
硫酸アンモニウムで沈澱させ、そして透析し、各血清の
最終使用希釈はツイーン２０を含まないプロット溶液中
で１１５００であった。

糖尿病の血清中のインキュベーション後、フィルターを
各々トリス緩衝化塩類溶液（ＴＢＳ）、０６０５％のツ
イーン２０を含むＴＢＳ、次いでＴＢＳ中で５〜１０分
間洗浄した。フィルターに結合したヒト抗体を、アルカ
リ性ホスファ″ターゼに接合したウサギ抗ヒトＩｇＧと
の反応により検出した（プロット中の１１５００、Ｄａ
ｋｏｐａｔｔｓ抗体Ｄ−３３６、ＤＡＫＯＣｏｒｐ、、
米国カリフォルニア州すンタバーバラ）。フィルターを
ＴＢＳ／ツイーン２０、ＴＢＳ１次いで検出緩衝液（０
，１モルのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ９゜５．０．０１モル
のＮａＣｌ、０．０５モルＭｇＣ１，、それらのＤＮＡ
検出キットＮｏ、８２３９ＳＡにおける使用についてＢ
ＲＬにより推奨されている）中で洗浄した。発色性基質
にトロブルーテトラゾリウムおよび５−プロモー４−ク
ロロ−３−インドリルホスフェート）を添加し、そして
反応を光から保護した。色の発現後、フィルターを水、
次いで１０５９モルのトリス（ｐＨ８，０）、１ミリモ
ルのＥＤＴＡ　（ＴＥ）で洗浄し、そして乾燥した。プ
ラークの最良の観察は、フィルターがなおまだ濡れてい
るとき、行うことができた。

陽性のプラグは、フィルターとの整列によりもとの平板
上に配置させた。予備的スクリーニングのため、無菌の
パスツールピペットのバットの末端を使用して取り出し
た。個々のプラークを区別することができる引き続くス
クリーニングのため、ピペットの先端を使用した。プラ
ークをプラーク貯蔵緩衝液（Ｍａｎｉａｔｉｓ　　ｅｔ
　　ａｌ、、５ｕｐｒａ）中に溶離し、そして少なくと
も数時間溶離した。

上のスクリーニング法は、次のようにして分離したＩＣ
Ａ−１２，３を除外して、ここに記載する特別の受託さ
れたＩＣＡクローンを産生じた。

はぼ１０＠プラ一ク形成単位のファージライブラリーを
、ＩＣＡ−１２ｃＤＮＡと相同性の配列の存在について
ＤＮＡのハイブリダイゼーションによりスクリーニング
しｔ；。２０の寒天平板上のファージプラークを、普通
の手順［Ｂｅｎｔ。

ｎおよびＤａｖｉｓ　（１９７７）Ｓｃｉｅｎｃｅ１９
６：１８０１により、ナイロンフィルター上に複製し、
そしてファージＤＮＡを変性し、そしてハイブリダイゼ
ーションのために固定化した。

ハイブリダイゼーションプローブは、ＥｃｏＲＩ消化に
よりそのプラスミドベクターから分離した、クローニン
グしたＩ　ＣＡ−１２ｃＤＮＡのアガロースゲル精製し
た試料であった。ｃＤＮＡセグメントは、ランダムプラ
イマー標識付は法［ＦｅｉｎｂｅｒｇおよびＶｏｇｅｌ
ｓｔｅｉｎ　（１９８４）Ａｎａ　１．Ｂ　ｉ　ｏｃｈ
ｅｍ、１３３　：　２６６］により、３２Ｐで標識付け
した。ナイロンフィルターへのプローブのハイブリダイ
ゼーションは、ベレン）（Ｂｅｒｅｎｔ）　　ｅｔ　　
ａｔ、（１９８５）ＢｉｏＴｅｃｈ、３：２０８に従い
実施した。

Ｉ　ＣＡ−１２プローブと相同性のＤＮＡを含有すると
同定されたファージプラークをマスター平板から取り上
げ、そしてファージを７１イブリダイゼーシヨンスクリ
ーニングの第２ラウンドのために複製した。次いで、Ｉ
ＣＡ−１２について陽性のままである個々のプラークは
、ｃＤＮＡインサートの性質に関して特性決定した。ク
ローンｌ０Ａ−１２，３は、ＤＮＡ配列の分析により、
ｌ０Ａ−１２中で部分的に表されるｍＲＮＡの全体のタ
ンパク質解読配列を含有することが発見された。

４、発現 個々のクローンにより発現されたタンパク質は、Ｅ、ｃ
ｏｌｉ宿主中のクローンの発現により分析した。Ｉ　Ｏ
Ａ−１２およびＩ　ＯＡ−１３として同定されたクロー
ンを使用する最初の発現は、標準の手段（Ｈｕｙｎｈ　
　ｅｔ　　ａｌ、）によりクローンを使用して発生させ
たリソタンを使用して実施した。引き続く発現は、Ｅ、
ｃｏｌｉ　　ＣＡＧ−４５６中の感染の発現により実施
した［Ｍ、５ｎｙｄｅ　ｒ、Ｓ、Ｅ　ｌ　ｌｅｄｇｅ、
Ｄ、Ｓｗｅｅｔ　ｓｅ　ｒ％　Ｒ，Ａ、Ｙｏｕｎｇｓお
よびＲ，Ｗ。

Ｄａｖｉｓ：Ｆｇｔ−１１：抗体プローブを使用する遺
伝子の分離および他の応用（Ｇｅｎｅ　　１ｓｏｌａｔ
ｉｏｎ　　ｗｉｔｈ　　ＡｎｔｉｂｏｄｙＰｒｏｂｅｓ
　　ａｎｄ　　０ｔｈｅｒ　　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ
ｓ）、Ｍｏｔｈ、Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　　ｔ５４：１
０７−１２８（１９８７）］。

細胞を収穫し、そしてラエムリ（Ｌａｅｍｍｌｉ）の試
料の１１？＃液中の再懸濁により溶菌した［Ｕ。

Ｋ、Ｌａｅｍｍｌｉ、Ｎａｔｕｒｅ　　　２２７：６８
０（１９７０）］。試料を超音波処理してＤＮＡの大き
さを減少しよりすぐれた電気泳動の結果が得られた。

タンパク質のゲル電気泳動およびニトロセルロース（Ｓ
ｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　　ａｎｄ　　５ｈｕｅ１１）また
はインモビロン（Ｉｍｍｏｂ　ｉ　Ｉｏｎ）（Ｍｉ　Ｉ
　ｌ　１ｐｏｒｅ　　Ｃｏｍｐａｎｙ、米国マサチュセ
ッツ州ベトフォード）上への半乾燥の電子伝達を実施し
た。ゲルをクーマツシー（Ｃｏ。

ｍａｓｓｉｅ）ブルーで染色し、そしてフィルターを前
述のライブラリーのスクリーニングに使用したのと同一
の血清との免疫反応により検出した。

５、クローンの分析 Ｉ　ＤＤＭの診断のための個々のクローンの有用性をア
ッセイするｔ；めに、各クローンを糖尿病および正常の
血清のパネルとの反応性について試験した。これは各血
清を各クローンからのウェスタン・プロットのストリッ
プと反応させることによって実施した。調製用ゲル電気
泳動および引き続くタンパク質のフィルターへの半乾燥
電子伝達を実施しに。同一の３　ｍ　ｍのストリップを
フィルターから切断し、そして種々の血清に暴露した。

抗原のバンドの局在化を分析用ウェスタン・プロットを
参照して実施し、そしてストリップを抗−ベーターガラ
クトシダーゼ抗体（１／２０００モノクロ一ナル抗体、
Ｐｒｏｍｅｇａ、米国ウィスコンンン州マジソン）と反
応させた。抗体のインキュベーションおよび第２抗体を
使用する検出は、前述のようにした実施した。

ＩＣＡ−１２、ＩＣＡ−１３、ｌ０Ａ−２０８、ＩＣＡ
−３０２、ＩＣＡ−３１３、ｌ０Ａ−５０５、およびｌ
０Ａ−５２５と表示する化学発光体の反応性のプロフィ
ルは、図面の第１図〜第５図、第１４図および第１５図
に示す。同一のフィルターストリ／ブを調製用電子伝達
から切断し、モして糖尿病および正常の血清と反応させ
た（ＩＣＡ１２、Ｉ　ＣＡ−１３、ＩＣＡ−２０８、Ｉ
ＣＡ３０２、およびＩＣＡ−３１３について、ストリン
グを２０の糖尿病血清および６の正常血清と反応した；
これにに対して１４の糖尿病血清および６の正常の血清
をｌ０Ａ−５０５３よび５２５について使用した）。Ｄ
ＮＡインサートをもたないベクター（ラムダｇｔ−１１
）を使用する対照のプロフィルを第６図に示す。

フィルターのストリップは、また、強度に従って等級づ
けた、■＝弱い反応性、２．３および４−非常に強い反
応性。反応性の等級の要約は、図面の第７図および第１
６図に記載する。第７図において、接頭文字「Ｃ」を有
する血清２１〜３０は正常の対照の血清であり、これに
対して糖尿病血清はそれらの源の識別番号で表されてい
る。第１６図において、接頭文字「ＭＲＣ」を有する血
清１５〜２０は正常の対照の血清であり、これに対して
再び糖尿病血清はそれらの源の識別番号で表されている
。両者図面において、クローンのヘッディングの下に示
す番号は、視的解釈により割り当てた免疫反応性の強度
を表す。

最初のスクリーニングにおいで同定されたいくつかのク
ローンは、ウェスタン・プロットのフォーマットにおい
て非反応性であることが発見された。これらのクローン
の血清反応性を試験するために、ラムダｇｔ−１１７７
−ジをＥ、ｃｏｌｉＣＡＧ４５６中で前述のように発現
させ、そして抗原はバクテリアを４ｍｇ／ｍＱのリゾチ
ーム（Ｓ　ｉ　ｇｍａ、米国ミゾリー州セントルイス）
で２５ミリモルのトリス、ｐＨ８，１０３９モルのＥＤ
ＴＡ、５０ミリモルのグルコースおよび２ミリモルノ塩
化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）中で５分間室
温において処理することによって抽出した。細胞を４℃
においてベレット化し、そして水冷緩衝液（５００ミリ
モルの塩化ナトリウム、１％のＮＰ−４０，５０ミリモ
ルのＰＭＳＦ、２μｇ／ｒｒｌのキミスタチン（Ｓ　ｉ
　ｇｍａ）、２μｇ／ｍＱのアンチペイン（Ａｎｔｉｐ
ａｉｎ）（Ｓ　ｉ　ｇｍａ）および２ｔｔｇ／ｍＱのペ
プスタチン中に再懸濁した。抗原の抽出は３０分間氷上
で進行させ、その間溶液を超音波処理した。試料をエソ
ペンドル７マイクロフーグ中の５分間４℃において回転
させ、そして上澄み液を免疫沈澱のために使用した。

免疫反応は、１５μＱの洗浄緩衝液（５０ミＩＪモルの
トリス、１５０ミリモルの塩化ナトリウム、１％のＮＰ
−４り、５ミリモルのＥＤＴＡ、２ミリモルのＰＭＳＦ
、２．５μＱのヒト血清、およびｌＯμａの抽出液）か
ら成っていた。反応を一夜放置した。抗原−抗体の複合
体を、２０μＱのプロティンＡセファローズ（Ｓｅｐｈ
ａｒｏｓｅ＞ＣＬ−４Ｂ　（Ｐｈａｒｍａｃ　ｉａ）の
５０％スラリーで氷上で１時間回収した。樹脂を６回５
００μａの洗浄緩衝液で洗浄し、そして１回水で洗浄し
た。ＰＡＧＥのための試料緩衝液を添加し、そして試料
を５分間沸騰させ、５分間遠心し、そして８％のゲル上
で展開した。エレクトロブロッティングを実施し、そし
てプロットを抗−ベーターガラクトシダーゼ抗体（プロ
ット溶液中のＳｉｇｍａ　　＃Ｇ４６４４の１／１００
０希釈）と反応させ、次いでアルカリ性ホスファターゼ
にカップリングした抗マウスＩｇ（ＤＡＫＯ＃Ｄ３１４
）と反応させ、そして染料中で顕色した。結果をＩＣＡ
−５１２の抽出物について第１９図に示す。

矢印は組み換え抗原の位置を示す。

種々のクローンについてのＤＮＡインサートの大きさは
、それらを平板リゼイトまたは液体リゼイトの発酵にお
いて増殖させることによって決定し　ｊこ　（Ｍａｎｉ
ａｔｉｓ　　　　ｅｔ　　　　　ａｌ、　　、　　５ｕ
ｐｒａ）。ラムダＤＮＡを抽出し、そしてＥｃｏＲＩで
切断し、そしてアガロースゲルの電気泳動により大きさ
について分析した。

糖尿病血清と主として反応する上の同定したクローンは
、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ｔ
ｈｅ　　Ａｍｅｒｉｃａｎ　　Ｔｙｐｅ　　Ｃｕ１ｔｕ
ｒｅ　　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ、米国マリイランド州ロ
ックビレ）に受託された。受託の番号および決定したイ
ンサートの大きさを下表１に示す。

表１ クローン＃　　　　　ＡＴＣＣ＃ ＩＣＡ−１２４０５５０ ＩＣＡ−１３４０５５３ ＩＣＡ〜２０８　４０５５４ ＩＣＡ−３０２４０５５１ １ＣＡ−３１３４０５５２ ＩＣＡ−１２，３４０７０３ ＩＣＡ〜５２５　４０７０４ ＩＣＡ−５０５４０７０５ ＩＣＡ−５１２４０７０６ インサートの大きさ（ｋ　ｂ） １．４００ ５．０４３ ０．５７５ ０．７９４ ２．３９１ ３．２４３ ３．４ ０．３４６ １．８ ＤＮＡインサートをストラタジーン・ブルースクリプト
（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ　　Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ）ベ
クターに移した。配列決定は、Ｔ７配列決定キット（Ｐ
ｈ　ａ　ｒｍａ　ｃ　ｉ　ａ）をストラタジーンＥｘｏ
　　ＩＩＩ／ヤエナリヌクレアーゼキットと組み合わせ
使用する標準技術により実施して、グラスミドのオーバ
ーラッピングするネステツド（ｎｅｓｔｅｄ）欠失系列
を発生させた。

９つの上に同定したクローンのうちの８つについての入
手可能配列決定の情報を、図面の第８図〜第１３図、第
１７図および第１８図に記載する。

配列はｌ０Ａ−１２，３０２，３１３，２０８，５０５
，１２，３について完全であると考えられるが、部分的
配列決定のみがＩ　ＣＡ−１３および５２５について入
手可能である。ＤＮＡ配列は前述のように実験的に誘導
しｔ；ものである。両者の向きにおけるすべての３つの
可能なリーディングフレームを、タンパク質の解読能力
、すなわち、長いオーブンリーディングフレームについ
て検査した。各クローンについての最も可能性のあるタ
ンパク質配列を、ＤＮＡ配列より下に大文字で表す（入
手可能な情報がタンパク質抗原をエンコードするリーデ
ィングフレームの割り当てを可能としない、ｌ０Ａ−５
０５を除外する）。

本発明を上に記載しかつ例示した。多くの他の変化およ
び変更を本発明の精神および範囲から逸脱しないで行う
ことができることが考えられる。

本発明の主な特徴および態様は、次の通りである。

１１組み換えクローニングベヒクルＡＴＣＣ４０５５０
，４０５５１，５０４４２，４０５５３，４０５５４，
４０７０３，４０７０４，４０７０５、または４０７０
６のＤＮＡインサートによりエンコードされるアミノ酸
配列からなることを特徴とする、分離されたタンパク質
またはペプチド、またはこのようなタンパク質またはペ
プチドの断片。

２、ヒト遺伝子により発現された全長のタンパク質であ
り、そのｍ　ＲＮ　Ａが組み換えクローニングベヒクル
ＡＴＣＣ４０５５０，４０５５１，４０５５２，４０５
５３，４０５５４，４０７０３，４０７０４，４０７０
５、または４０７０６のＤＮＡインサート完全な配列と
部分的に相補的である、上記第１項記載の分離されたタ
ンパク質、またはこのようなタンパク質のタンパク質ま
たはペプチド断片。

３、組み換えクローニングベヒクルＡＴＣＣ４０５５０
，４０５５１，４０５５２，４０５５３、４０５５４、
４０７０３、４０７０４、４０７０５、または４０７０
６のＤＮＡインサートによりエンコードされるアミノ酸
配列を有するか、あるいは少なくとも３アミノ酸長さで
あるこのような配列のペプチド部分である、上記第１項
記載の分離されたタンパク質またはペプチド。

４、このようなタンパク質またはペプチドの遺伝情報を
指定するインサートからなる組み換えＤＮＡベクター中
の発現によるか、あるいはペプチド合成により得られた
、上記第１〜３項のいずれかに記載の分離されたタンパ
ク質またはペプチド。

５、患者から得られる血液試料を上記第１〜４項のいず
れかに記載のタンパク質またはペプチドからなる抗原試
薬と接触させ、そして抗原試薬への患者の血液試料から
の抗体の結合を決定することを特徴とする、患者におけ
るインスリン依存性真性糖尿病を診断する方法。

６、上記第１〜３項のいずれかに記載のタンパク質また
はペプチド、またはそれとハイブリダイゼーション可能
な分離された核酸の遺伝情報を指定することを特徴とす
る、分離された核酸。

７、上記第１〜３項のいずれかに記載のタンパク質また
はペプチドの遺伝情報を指定するインサートからなるこ
とを特徴とする、組み換えクローニングベヒクル。

８、上記第７項記載の組み換えクローニングベヒクルで
形質転換されたことを特徴とする、培養可能な細胞。

９、血液試料を上記第１〜４項のいずれかに記載のタン
パク質またはペプチドと接触させ、そしてこのようなタ
ンパク質またはペプチドと血液試料からのＴ細胞または
Ｂ細胞との間の結合を決定することを特徴とする、ヒト
血液試料中のインスリン依存性真性糖尿病において含ま
れるＴ細胞またはＢ細胞の存在を検出する方法。

ｌＯ１上記第１〜４項のいずれかに記載のタンパク質ま
たはペプチドからなることを特徴とする、インスリン依
存性真性糖尿病に含まれるヒト免疫グロブリン、Ｔ細胞
またはＢ細胞をブロッキングする製剤。

【図面の簡単な説明】

第１図〜第５図、第１４図および第１５図は、実施例に
記載されている条件下における、本発明に従い調製され
たＡＴＣＣ受託されたＩＯＡクローンと糖尿病および正
常の血清の反応性のプロフィルである。 第６図は、組み換えインサートをもたないクロニングフ
ァージを使用する対照プロフィルである。 第７図および第１６図は、それぞれ、第１図〜第５図お
よび第１４４１〜第１５図におけるプロフィルの視的解
釈により割り当てられた反応性の値を示す、［ＣＡクロ
ーンの血清プロフィルの要約である。 第８図〜第１３図、第１７図および第１８図は、特定の
ＩＣＡクローンのＤＮＡおよび推定したタンパク質配列
である。 第１９図は、糖尿病および正常の血清を使用するＩＯＡ
クローンの免疫沈澱の結果を示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、組み換えクローニングベヒクルＡＴＣＣ４０５５０
   、４０５５１、５０４４２、４０５５３、４０５５４、
   ４０７０３、４０７０４、４０７０５、または４０７０
   ６のＤＮＡインサートによりエンコードされるアミノ酸
   配列からなることを特徴とする、分離されたタンパク質
   またはペプチド、またはこのようなタンパク質またはペ
   プチドの断片。 ２、患者から得られる血液試料を特許請求の範囲第１項
   記載のタンパク質またはペプチドからなる抗原試薬と接
   触させ、そして抗原試薬への患者の血液試料からの抗体
   の結合を決定することを特徴とする、患者におけるイン
   スリン依存性真性糖尿病を診断する方法。 ３、特許請求の範囲第１記載のタンパク質またはペプチ
   ド、またはそれとハイブリダイゼーション可能な分離さ
   れた核酸の遺伝情報を指定することを特徴とする、分離
   された核酸。 ４、特許請求の範囲第１記載のタンパク質またはペプチ
   ドの遺伝情報を指定するインサートからなることを特徴
   とする、組み換えクローニングベヒクル。 ５、特許請求の範囲第４項記載の組み換えクローニング
   ベヒクルで形質転換されたことを特徴とする、培養可能
   な細胞。 ６、血液試料を特許請求の範囲第１記載のタンパク質ま
   たはペプチドと接触させ、そしてこのようなタンパク質
   またはペプチドと血液試料からのＴ細胞またはＢ細胞と
   の間の結合を決定することを特徴とする、ヒト血液試料
   中のインスリン依存性真性糖尿病において含まれるＴ細
   胞またはＢ細胞の存在を検出する方法。 ７、特許請求の範囲第１記載のタンパク質またはペプチ
   ドからなることを特徴とする、インスリン依存性真性糖
   尿病に含まれるヒト免疫グロブリン、Ｔ細胞またはＢ細
   胞をブロッキングする製剤。