JPH0288526A - 血糖低下剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は血糖低下剤に関する。

従来の技術 糖尿病は主としてインスリン依存型糖尿病とインスリン
非依存型糖尿病とに分類される。前者は自己免疫的機序
によりランゲルハンス氏島のβ細胞が破壊され、インス
リン分泌が極端に低下するものである。そして生命の維
持のためには毎日インスリン注射を行なうことが必須で
ある。一方式が国の全塘尿病患者の９５チを占めるとい
われるインスリン非依存型糖尿病でも、膵β細胞機能の
障害が存在する。すなわちインスリ／非依存型糖尿病患
者の膵β細胞は、グルコースに対する反応性が低下して
いることが特徴で、その結果血糖のホメオスターシスを
維持するに十分な量のインスリン分泌を行なうことが出
来ない。なぜインスリン非依存型糖尿病の膵β細胞にそ
のような機能障害が起こるのかは全く分かりていない。

インスリンは血糖値のホメオスターシスを維持するうえ
で最も重要なホルモンであり、膵内分泌腺のβ細胞から
分泌される。膵内分泌組織にはα、β、δおよびＰＰの
４種類の細胞があり、それぞレクルカゴン、インスリン
、ソマトスタチン、パンクレアティクポリイプチドを分
泌していることが知られている。これら４種類の細胞が
多数集まってランｒルハンス氏島と呼ばれる膵内分泌組
織を構成する。ランｒルノ・ンス氏島は膜外分泌組織の
間に散在し、豊富な神経および血管支配を受けている。

膵β細胞からのインスリン分泌の刺激因子として最も重
要なものがグルコースであることは疑う余地がないが、
　ＧＩＰなどに代表される消化管ホルモンや自律神経系
による調節も生理的意義が少なくないと考えられる。さ
らに他の膵うンダルノ・ンス氏島ホルモン、すなわちソ
マトスタチンなどの関与も無視できない。

このようにインスリン分泌に影響を与える因子は少なく
ないが、それらの膵β細胞における作用機序は不明な点
が極めて多い。

さて、このような糖尿病治療には、経口糖尿病薬及びイ
ンスリン療法が用いられている。経口糖尿病薬としては
主としてインスリン分泌促進を介して血糖降下作用を発
現するスルフォニル尿素剤と、主として糖代謝系を介し
て血糖降下作用を示すピグアナイド剤とが汎用されてい
るが、副作用の点等から必ずしも満足すべきものではな
い。また、インスリン療法は、厳密な血清制御を必要と
する糖尿病患者に用いられている。インスリンは血糖降
下作用の持続時間が短いため、臨床的にはインスリン唄
口注射療法およびインスリン皮下持続注入療法がインス
リン療法として使用されている。しかし、これは患者に
とって苦痛であるうえ、低血糖、アレルギー、注射部位
の脂肪の萎縮などの副作用を伴うことが知られている。

血糖低下剤として、持効性に優れ、副作用の少ないもの
が望まれている。本発明の課題は、このような条件を満
たし、糖尿病の治療に役立つ有効因子を見つけ出し、新
規な血糖低下剤を提供することにある。

本発明者等は叙上の課題を解決するため血糖降下作用物
質を検索した結果、４リベプチドＢＵＦ−３もしくはそ
の類縁体であるＢＵＦ−４及びＢＵＦ−５が血糖を低下
する作用を有することを見出し、本発明を完成するに至
った。

即ち、本発明は、ポリ４プチドＢＵＦ−３、ＢＵＦ−４
及びＢＵＦ−５の内少なくとも１種類以上の物質を有効
成分として含有する血糖低下剤である。、ｉ？　リーｅ
プチドＢＵＦ−３、ＢＵＦ−４及びＢＵＦ−５の理化学
的性質は以下の通りである。

（１）　　ポリペプチドＢＵＦ−３（以下ＢＵＦ−３と
する）の理化学的性質 （ａ）　　構　造：単量体Ａ（第１図参照）のホモダイ
マー （ｂ）　　分子量：単量体として１６±１　ｋｄ　（１
，０チメルカデトエタノール存在下、 ５ＤＳ−電気泳動法） ホモダイマーとして２５±１　ｋｄ （メルカプトエタノール非存在下、 ５ＤＳ−電気泳動法） （ｃ）　　等電点：　　ｐＩ　６．３±０．２（クロマ
トフォーカミフグ法）ｐＨ７，３（等電点電気泳動法） （ａ）　　−安定性：ｐＨ２，０〜１０．０の範囲で安
定（、）　　熱安定性＝６０℃、６０分の加熱で安定（
ｆ）　　有機溶媒安定性：低級アルコール、アセト−ニ
トリルに対し安定 （ｇ）　　グロテアーゼ耐性ニア°ロナーゼ処理で完全
に失活する。

（ｈ）　　アミノ酸配列：単量体Ａのアミノ酸配列は第
１図に示す。

（２）　　ポリ４７′チドＢＵＦ−４（以下ＢＵＦ’−
４とする）の理化学的性質 （ａ）　　構　造：単量体Ａ及び単量体Ｂ（第２図参照
）のへテロダイマ （ｂ）　　分子４１ｔ：単１体Ａ及び単量体Ｂともに１
６±１ｋｄ（１，０チメルカデトエタノール存在下、５
ＤＳ−電気泳動法） へテロダイマーとして２５±Ｉｋｄ（メルカプトエタノ
ール非存在下、５ＤＳ− 電気泳動法） （ｃ）等′上点：ｐＩ７．３±０．５（等電点電気泳動
法）（ｄ）　　ＰＩ（安定値：　ｐＨ２，０〜１０．０
の範囲で安定（、）　　熱安定性＝６５℃、６０分の加
熱で安定（ｆ）　　有機溶媒安定性：低級アルコール、
アセトニトリルに対し安定 （ｇ）　　プロテアーゼ耐性：プロナーゼ処理で完全に
失活するう（ｈ）　　アミノ酸配列：単量体Ａのアミノ
酸配列は第１図に、単１体Ｂのアミノ酸配列は第２図に
示す。

（３）？すにデチドＢＵＦ−５（以下ＢＵＦ−５とする
）の理化学的性質 （ａ）　　ｍ　　造：単量体Ｂのホモダイマー構造（ｂ
）　　分子ｔ：単全全体して１６±１　ｋｄ　（１，０
チメルカゾトエタノール存在下、 ５ＤＳ−電気泳動法） ホモダイマーとして２５±１　ｋｄ （メルカグトエタノール非存在下、 ５Ｏ８−電気泳動法） （ｃ）　　等電点：ｐＨ７，３±０．５（等電点電気泳
動法）（ｄ）　　−安定性：ｐＨ２，０〜１０．０の範
囲で安定（、）　　熱安定性：６５℃、６０分の加熱で
安定（ｆ）　　有機溶媒安定性：低級アルコール、アセ
トニトリルに対し安定 （ｇ）　　プロテアーゼ耐性：プロナーゼ処理で完全に
失活する。

（ｈ）　　アミノ酸配列：単量体Ｂのアミノ酸配列は第
２図に示す。

本発明に係るＢＵＦ−３，４及び５は第１図、第２図に
示すアミノ酸配列と全く同一のアミノ酸配列を有しなく
とも血糖低下作用を有すれば、その物質は本発明のＢＵ
Ｆ−３，４及び５に含有される。

即ち、第１図又は第２図に示すアミノ酸配列中の１個若
しくは複数のアミノ酸を他のアミノ酸に置換した構造を
有する物質並びに、当該配列において１個もしくは複数
個のアミノ酸がＮ末端又はＣ末端に付加された構造を有
する物質、更には、当該配列のＮ末端又はＣ末端よ、９
１個もしくは複数のアミノ酸が欠損し、かつ連続してい
るアミノ酸配列よりなる構造を有する物質も本発明のＢ
ＵＦ−３，４及び５に含まれる。

ＢＵＦ−３はマウスフレンドウィルス誘発白血病細胞Ｆ
５−５に対する分化誘導作用を指標に精製されたポリＲ
プチドである。

また、ＢＵＦ−３はマウス白血病細胞を正常細胞に分化
成熟せしめる活性（特開昭６２−２３４０９７、特開昭
６２−２４０７０）以外にも貧血治療効果（％開田６２
−２３４０９７、特開昭６２−２４０７０）及び卵胞刺
激ホルモン分泌作用（Ｎａｔｕｒｅ、　３２Ｌ７７６−
７７９　、　（１９８６）　）を合せもつ有用な物質で
ある。

尚、ＢＵＦ−３はＥＤＦ　（Ｅｒｙｔｈｒｏｌｄ　Ｄｌ
ｆｆ＠ｒｓｎｔ１ａｔｌｏｎＦａｃｔｏｒ　）ともＦＲ
Ｐ　（ＦＳＨＲｅｌ＠ａｓｌｎｇ　Ｐｒｏｔｅｌｎ　）
とも呼ばれるが本発明においては従来から用いられてい
るＢＵＦ−３という名称を用いることにする。

一方、ＢＵＦ−４が卵胞刺激ホルモン分泌作用を有する
ことは既に報告されている（　Ｖａｌｓ、　ｗ、ＩＲｉ
ｖｅｒ、　Ｊ、、　Ｖａｕｇｈａｎ、　Ｊ、、　ＭｃＣ
ｌｌｎｔｏｃｋ、　Ｒ，。

Ｃｏｒｒｌｇａｎ、　Ａ、、　Ｗｏｏ、　Ｗ、、　Ｋａ
ｒｒ、　Ｄ、　ａｎｄ　５ｐｌｓｑｓ。

Ｊ、　（１９８６）　Ｎａｔｕｒｅ　３２１．７７’６
−７７７）。

尚、ＢＵＦ−４はアクチビン（Ａｃｔｉｖｌｎ　）とも
称されるが、本発明においてＢＵＦ−４という名称を用
いることにする。

更に、ＢＵＦ−５は特開昭６３−１１９６７９号公報に
開示されている物質である。

上述のようにＢＵＦ−３、ＢＵＦ−４及びＢＵＦ−５に
は卵胞刺激ホルモン放出作用等の作用を有することは既
に知られているが、本発明の如き血糖低下作用について
は全く報告されていない。

さて、本発明のＢＵＦ−３、ＢＵＦ’−４及びＢＵＦ−
５のいずれの物質も動物実験で優れた持効性血糖低下作
用を有し、また、マウス及びヒトの培養細胞に対して毒
性を示さないことより、ヒトの糖尿病の予防、治療に安
全かつ有効であると考えられる。

本発明の血糖低下剤はＢＵＦ−３、ＢＵＦ−４及びＢＵ
Ｆ’−５の内少なくとも１種類以上の物質を有効成分と
して含有するものであるから、上記有効成分を単独で含
有するものでもよいし、また、２種類以上を組み合せて
含有するものでもよい。

更に本発明の血糖低下剤は膵、臓等の機能を診断する目
的でも用いることができる。

さて、本発明の血糖低下剤は主として非経口的（静脈内
、皮下、筋肉内、経皮、経粘膜）に投与される。

さて、前記有効成分の投与量であるが、　ＢＵＦ−３若
しくはＢＵＦ−４又はＢＵＦ−５のいずれか１つの物質
のみを単独で用いる場合は、いずれの物質を用いる場合
でも、通常成人１日あたり約０．０１ｍ９〜１００■で
あり、これを１回又は数回に分けて投与すれば良い。ま
た、２種類以上を組み合せて投与する場合（即ち、（ａ
）　ＢＵＦ−３とＢＵＦ−４、（ｂ）　ＢＵＦ−３とＢ
ＵＦ−５、（ｃ）ＢＵＦ−４と　ＢＵＦ−５、（ｄ）Ｂ
ＵＦ−３、ＢＵＦ−４及びＢＵＦ−５）も、各物質の薬
効はほぼ等しいことより、通常成人１日あたり約０．０
１ｍ９〜１００ＩＶを１回又は数回に分けて投与すれば
良い。もちろん、投与量は患者の血糖値、病状、患者の
体重及び当業者が認める他の因子によって変化するので
、上記投与量を厳守する必要はなく、臨機応変に決定す
ればよい。

本発明に使用するＢＵＦ−３等の有効成分の製剤化は通
常の方法によって行われ、主として注射剤とされるが、
他のカプセル剤、錠剤等の剤型へ製剤化される。注射剤
を調製する場合には主薬のＢＵＦ−３及び／又はＢＵＦ
−４及び／又はＢＵＦ−５に必要によりｐＨＰＡ整剤、
緩衝剤、安定化剤、保存剤などを添加し常法により静脈
内、皮下、筋肉内用注射剤とすればよい。又、経口用製
剤を調製する場合は主薬のＢＵＰ−３及び／又はＢＵＦ
’−４及び／又はＢＵＦ−５に賦形剤、さらに必要に応
じて、結合剤、崩壊剤、着色剤等を加え常法により錠剤
、カプセル剤等とする。

次に血糖低下作用を有するＢＵＦ−３、ＢＵＦ−４及び
ＢＵＦ−５の製造法について簡単に説明する。

まずＢＵＦ−３であるが、ＢＵＦ’−３は悪性白血病細
胞の細胞培養法又は、組換えＤＮＡ法のいずれを用いて
も生産できる。

まず、細胞培養法であるが、ＢＵＦ−３を産生ずるヒト
悪性単球細胞としては、ヒト白血病細胞又はヒト骨髄細
胞を人為的に悪性化させたもの、よシ具体的に例示すれ
ば次のようなものが有る。ヒト慢性骨髄性白血病細胞（
Ｕ−９３７ＡＴＣＣＣＲＬ　１５９３　。

Ｉｎｔ、Ｊ、　Ｃａｎｃｅｒ　１７　：　５６５（１９
７６）　、に５６２．Ｂｌｏｏｄ４５　：　３２１（１
９７５））、急性単球性白血病細胞（ＴＨＰ−１、Ｉｎ
ｔ、Ｊ、　Ｃａｎｃｅｒ　２６　：　１７１−１７６（
１９８０））。

もちろん、ＢＵＦ−３を生産していれば、上記以外のヒ
ト白血病細胞を用いてもかまわない。さて特定の分化誘
導物質は、悪性化単球細胞と接触させた時、この細胞を
マクロファージ、顆粒球の単球細胞に分化誘導させると
共に、ＢＵＦ−３を生産せしめる作用を有する物質であ
り、具体的にはアクチノマイシンＤ１マイトマイシンＣ
１コンカナバリンＡ及びホルデールエステル（ＴＰＡ　
）　”Ｊの特定の分化誘導物質である。

本発明のＢＵＦ−３を生成せしめる方法は、悪性化単球
細胞を少くとも１種又は２種以上の上記特定の分化誘導
物質の共存下で培養することによりなされ、ＢＵＦ−３
は培養液中（細胞外）に産生される。

悪性化単球細胞を培養する培地は、動物細胞を培養する
通常の培地が用いられる。例を挙げれば、ローズウェル
・パーク・メモリアル・インスティテ、−）１６４０培
地（Ｒｏｓｗｅｌｌ　Ｐａｒｋ　ＭｅｍｏｒｉａｌＩｎ
ｓｔｌｔｕｔｓ＋　１６４０　、以下ＲＰＭＩ−１６４
０と略す。）が好適である。

悪性化単球細胞の培養は、通常１〜５Ｘ１０’個／ゴの
細胞密度で、３５〜３８℃にて４〜６チの炭酸ガス気流
中でゆるやかに攪拌しつつ行われる。

特定の分化誘導物質は、通常培養の最初より培地に添加
しても良く又培養の途中から添加しても良い。添加量は
分化誘導物質の種類によって異なるがアクチノマイシン
Ｄ、マイトマイシンＣ等の場合には０．１〜１０μｍ７
／ｍ１％ＴＰＡの場合には１〜５００μ／ｌ／ｍｌであ
る。このようにして１〜５日間培養するとＢＵＦ−３は
培養液中に蓄積される。

ＢＵＦ−３は、血糖低下作用以外にもＦｒ１ｅｎｄウィ
ルス誘発白血病細胞Ｆ５−５　（Ｂｌｂｌ、　Ｈａｅｍ
ｓｔ、、　４３゜３７（１９７６））に対する分化誘導
作用を有するので、この作用を利用してＢＵＦ−３の定
性及び定量分析ができ、Ｆ５−５を用いる分析は、Ｐｒ
ｏｃ、　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ。

Ｓｅｔ、、　７１．９８．　（１９７５）に記載の方法
に従って行われる。又活性の表示はＦ５−５　ａｔ胞分
化が明嗅に確認される検体原液の稀釈率の逆数の値を原
液１．０ｄ当シの活性とする。この発明方法でＢＵＦ−
３を生産した時、培養液は４〜１０００単位／　ｉｔの
活性を示す。このようにして目的とするＢＵＦ−３が生
産される。

尚、本方法の詳細は特開昭６２−２３４０９７号公報、
特開昭６２−２４０７０号公報に記載されている。

組換えＤＮＡ法によるＢＵＦ−３の生産法、即ちＢＵＦ
−３をコードする遺伝子すなわち、単滑体Ａを含有する
プラスミドにより形質転換された真核物細胞（具体的に
はｒＦＯ−５０１４６等）を培養液中で培養し、培養液
中に該ＢＵＦ−３を製造せしめるという方法をもちいて
もかまわない（特願昭６２−２１０８１０、Ｍａｓａｈ
ｌｒｏ　Ｍｕｒａｔａ、　Ｋａｚｕｙａ　Ｏｎｏｍｌｃ
ｈｉ、　ＹｕｚｕｒｕＥｔｏ、Ｈ（ｒｏ！ｌｈｉｒｏＳ
ｈｌｂａｌａｎｄＭａｓａｍ１ＭｕｒａｍａｔｓｕＢＩ
ＯＣＨＥＭＩＣＡＬ　　ＡＮＤ　　ＢＩＯＰＨＹＳＩＣ
ＡＬ　　ＲＥＳＥＡＲＣＨＣＯＫＭｒＪＮＴＣＡＴｒＯ
ＮＳ　Ｖｏｌ、　１５１．　Ａ　Ｉ　、　Ｐａｇｅｓ　
２３０−２３５（１９８８）　）。

ＢＵＦ−４及びＢＵＦ−５の生産は組換えＤＮＡ法によ
るＢＵＦ−３の生産に準じておこなわれるので以下にそ
の概要のみを記載する。

ＢＵＦ−４を生成せしめる方法は、ＢＵＦ−４をコード
する遺伝子、すなわち単量体Ａ及び単量体Ｂを金含有す
るプラスミドにより形質転換された真核生物を培養液中
で培養し培養液中にＢＵＦ−４を製造させればよい（特
開昭６３−１１９６７９）。

またＢＵＦ−５を生成せしめる方法はＢＵＦ−５をコド
する遺伝子、すな〜わち単量体Ｂを含有するプラスミド
により形質転換された真核生物細胞を培養液中で培養し
培養液中にＢＵＦ−５を製造せしめると旨う方法をもち
いればよい（特開昭６３−１１９６７９）。

さて、このように生産されたＢＵＦ−３もしくはＢＵＦ
−１１もしくはＢＵＦ’−５の精製は通常のポリペプチ
ドの精製法に準じて行われる。例えば培養液を限外濾過
法で濃縮し、この濃縮液からポリペプチドを塩析し、透
析後隅イオン交換体を使用するイオン交換クロマトグラ
フィーを行うことにより粗ポリペプチド標品が得られる
。この粗標品について疎水クロマトグラフィー又はクロ
マトフオーカシング法により殆んどの夾雑蛋白が除去さ
れる。又この両者を組合せると更に精製倍率を向上する
ことができる。このようにして精製した標品について逆
相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）又はスーツ
ぐ一ローズ又はＭｏｎｏ　Ｑ　ＨＲ５／　５カラムを装
備したＦＰＬＣ（ファルマシア製Ｆａｓｔ　Ｐｒｏｔｅ
ｉｎＰｅｐｔｉｄｅ　Ｐｏ１ｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　
Ｌｌｑｕｉｄ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）システ
ムによる高性能ｒル濾過法又はイオン交換クロマトグラ
フィーを行うことにより精製することができる。

また、上述のようなポリペプチドの一般的精製法とは別
に本発明者等が開発した所定の濃度の有機酸を含む有機
溶媒を駆使する精製法（特願昭６３−１３１２６８）を
用いて精製してもかまわない。

以下、本発明を実施例に従って具体的に説明する。

実施例　Ｉ ＢＤＦ１マウス（雄、１０週退会日本チャールズリパー
（株））を用い、１群６匹を被験動物として用いた。比
活性的２　Ｘ　１０’　ＵΔ９のＢＵＦ−３（賦形剤と
して６倍量の純化マウス血清アルブミンを添加した凍結
乾燥品）を生理的食塩水に溶解したのち、濾過滅菌し、
１００μｊｉ／ｍｌの注射用投与液を調製した。ＢＵＦ
−３投与群には上記投与液を１日１回ｏ、　１ｍｔ　（
ＢＵＦ−３１ｏｕｐ　）宛５日間、静脈内投与を行なっ
た。対照群には、純化マウス血清アルブミンのみを生理
的食塩水に溶解したのち濾過滅菌し、１日１回Ｑ、　ｌ
　ｍｌ宛５日間、静脈内投与を行なった。

ＢＵＦ’−３投与群及び対照群のどちらも５白目夕方よ
り絶食させ、６日目午前中に両群のマウスをエーテル麻
酔下で心臓採血し、全血中血糖値を常法により測定した
。また、血糖値以外のいくつかの血清成分についても同
時に常法により測定した。血糖値の測定結果を第３図に
示した。ＢＵＦ−３投与群の血糖値は平均１１５　ｍｔ
ｐ／ｄｌであり、対照群の平均１４８　ｍＱ／ｄｌに比
べて低値で、明らかな有意差が認められた。

血糖値以外の血清成分の測定結果を第１表に示した。調
べられた５ｆ！の血清成分はいずれもＢＵＦ’−３投与
群と対照群の間に有意な差はみられなかった。

尚、ＢＵＦ−４及びＢＵＦ−５についても前述のＢＵＦ
’−３と同様の実、険を行い、全血中血糖値を測定した
。

第３図に示したように、この場合も血糖値の有意の低下
が認められた。

実施例　２ ＢＤＦ　、マウス（雄、１０週退会日本チャールズリバ
ー（株））を用い１群６匹を被験動物として用いた。

実施例１で用いたものと同じＢＵＦ−３を用い、実施例
１と同じ方法で４００μｇ／ｍｌの投与液を調製し、ミ
ニ浸透圧ボンｆ（米国ＡＬＺＡ社製Ｍｏｄｅ１２００１
　）に充填した。ＢＵＦ−３投与群マウスを４ントパル
ビタール麻酔下で開腹ののち、腹腔内に上記ミニ浸透圧
ポンプを移入し、ただちに開腹部を縫合した。

対照群には、純化マウス血清アルブミンのみを含む投与
液を充填したミニ浸透圧ｒンゾを同じ方法で腹腔内に移
入した。ミニ浸透圧ポンプは、充填した投与液を一定速
度で７日間以上にわたって放出しつづける装置である。

本実検に用いたＭｏｄｅｌ　２００１は、放出速度１μ
ＩＩＡ　ｏ　ｕ　ｒなので、ＢＵＦ−３は、４００　ｎ
ｇ／ｈｏｕｒの速度で連続的に腹腔内に投与される。投
与開始５日目の夕方より絶食し、６日目午前に両群のマ
ウスをエーテル麻酔下で心（採血し、全血中血糖値を常
法により測定した。測定結果を第４図に示した。　ＢＵ
Ｆ−３投与群の血糖値は平均６７　’ｎＱ／ｄｉで、対
照群の平均１４４ｍＱＡｌｌに比べて有意に低（、ＢＵ
Ｆ’−３を静脈内に投与したときよりもさらに顕著な血
清の低下作用が見られた。

実施例　３ ラット膵よりランダルハンス氏島を以下のように単離し
た。

ウィスター系雄うッ）２０ＯＮ程度を断頭、断点後開腹
した。

総胆管の十二指腸開口部を結さつし、肝臓側からカニシ
レー・ン］ンし、ＨＡＮＫＳ−Ｉ（ＥＰＥＳバッファー
で膵を膨潤させ、膵臓をとり出した。

膵をバッファー入りのシャーレ上で脂肪、リン・２節、
膵管等をとりのぞき小ビーカー内で０．５闇程度の均一
な状聾になるように中ばさみで細断した。リンスを数回
行ない、脂肪組織等を除去した。

コラｒナーぜ（和光細胞分散用）を２０００１ＪＡｔの
割合（１パンクレアスあたり２５ｍ９コラダナーゼ／　
２．５　ｅｃ　ＫＲＢ）々ツファー（３７℃、ｐＨ７，
４））で添加し、３７℃インキュベーター中で６分間激
しく撮とうした。コラゲナーゼ消化後ＨＡＮＫＳ　−Ｈ
ＥＰＥＳバッファー（室温でＰｌ（７，４）で希釈し、
沈降静置させた。６０秒後に上清を２５ｃｃ除去した。

同様に計８回行ない、最後上清除去後沈殿物をチューブ
にとりｌｏｏＯｒｐｍで１０分間遠心を行なった。

上清をデカンテーションにより除去後、ペレットに２７
チフイコールを加えホルテノクスにかけ均一にした。そ
こに２３チ、２０．５チ、１１％のフィコールを順次層
を乱さぬように重層し、２００Ｏｒｐｍ　＋　１５分間
遠心した。

２０．５’ｌと１１％の間の浮遊物をパスツールでとり
出し、実体顕微鏡下でランダルハンス氏島のみをマイク
ロビイノドですばやくひろった。集めたランデルハンス
氏島はＫＲＢ−バッファーで遠沈管５Ｑｃｃ内で洗い、
フィコールを完全にとり除いた（計３回）。

洗浄後は潅流測定用としては、３０コずつ、形大きさの
同じもののみをひろいなおした。

スタティックインキュベーション用としては、０、５　
ｃｃの培地（グルコース濃度５０号包）を入れたチュー
ブに、１コずつマイクロビにットでひろいなおした。

この際、いずれのチーーブについても同じ形、大きさの
ｌ５ｌｅｔになるようにした。

使用した培地（Ｈａｎｋｓ−ＨＥＰＥＳ　）の組成はＮ
ａ　ＣＬｌ　３６．９　ｍＭ　、　ＫＣＬ　５．３６　
ｍＭ　、　Ｎａ２Ｔ（ＰＯ４・１２Ｈ２００，３３８ｍ
Ｍ　、ＫＨ２ＰＯ４０，４４１ｍＭ　ｌＭｇ５Ｏａ　４
Ｈ２００，８１１ｍＭ。

ＣａＣ４・２ＨＯ１，２５８ｍＭ　、　ＮａＨＣＯ３３
，５７ｍＭ　。

ＨＥＰＥＳ　２５　ｍＭ　、である。

実施例　４ 潅流測定法として以下の方法を用いた。

基本培地としてクレプス−リンガ−パイカーボネイトノ
ぐラフｙ　−（Ｋｒｅｂｓ−Ｒｌｎｇｅｒ　ｂｌｃａｒ
ｂｏｎａｔｅｂｕｆｆｅｒ）を用いた。

クレプス−リンガ−ノ々イカーゼネイトノ々ツフア−の
組成はＮａＣｌ２１５　ｍＭ　、　ＫＣＬ　５　ｍＭ　
、　Ｎａ２）（ＰＯ４１ｍＭ　、　Ｍｇ５０４１　ｍＭ
　、　ＣａＣｌ２２．２　ｍＭ　、　ＮａＨＣＯ３２４
ｍＭ　、　ＨＥＰＥＳ　２０　ｍＭ　、　ＢＳＡ　Ｏ，
１７％である。

基本培地はあらかじめフィルター（ポアサイズ０．４５
μｍ）に２度かけた。

基本培地はＣｏ　　５％−０２９５％混合ガスでみたし
、３７℃インキュベーター中で保温した。

次に上記基本培地にグルコース５０　ｍｑ／ｄｉ含有さ
せた培地とグルコース３００　ｍＱｌｄｉ含有させた培
地をそれぞれ別のチューブに流しておいた。流速を０、
５　ｍ４７ｍ　Ｉ　ｎに調節した。

チェンバーにフィルター（ミリポアフィルタ−日本ミリ
ポア工業　ポアサイズ１０μｍ）をセットし、チェンバ
ー上部から実施例３で得たラングルノ・ンスダル３０個
を注射器（針は不要）を使って入れた後、チェンバーを
回路に接続した。ランｒルノ・ンス氏島の安定を保つた
め、２０分間グルコース５０　ｍ９７ｄｉを含む培地を
流しつづけた。洗滌終了の５分前に１分ごとサンプリン
グを行なった。ＢＵＦ−３をグルコース５０　ｍＱ／ｄ
ｌを含む培地に１０　　Ｍもしくは１０−９Ｍ濃度にな
るように加え、それぞれ２０分（ｌ３ＵＦ−３１０−８
Ｍの時）又は４０分（ＢＵＦ−３，１０−９Ｍの時）流
した。その間５分ごともしくは１分ごとにサンプリング
を行なった。

２０分ないし４０分後からグルコース３００１ｎ９７ｄ
ｉを含有する培地を流した。ＢＵＦ−３（１）側にはＢ
ＵＦ−３を加えた。１分ごとに１０分間、その後は５分
ごとに３０分から最大２００分サンプリングを行なった
。

サンプリングした培地中のインスリン濃度を１２５１イ
ンスリンＲＩＡキツト（第１ラジオアイソトープ社）で
測定した。

ＢＵＦ〜３の濃度が１０−９Ｍの時の結果を第５図に、
１０−８Ｍの時の結果を第６図に示した。

いずれの場合でも、インスリン分泌の上昇は観察された
。

実施例　５ ＢＵＦ−３の濃度依存性についてスタティックインキュ
ベーション法を用いてしらべた。培地は実施例４と同じ
ものを用いた。グルコース５０　！ｎＱ／ｄｌの培地を
試験管Ｋ　ｌ　ｍｌ入れ、実施例３で得たランゲルハン
ス成鳥を１個加えた。種々の濃度になるようにＢＵＦ−
３を１０μｌ加え、Ｃ０２５チ混合ガスを封入し、ゴム
栓をした。２時間後に上７ｆｔ２００μｌをサンプリン
グし、　　■でインスリン濃度を測定した。結果は第７
図に示した。

第７図に示すようにＢＵＦ−３の濃度に従って、インス
リンの分泌が観察された。

実施例　６ ＢＵＦ−４、ＢＵＦ−５の活性についても実施例５に準
じた方法を用いて調べた。

ＢＵＦ−４、ＢＵＦ−５ともに１００　ｎｆ／／ｍｌの
濃度になるようにランゲルハフス氏島１個を含む反応液
中に加え、２時間後に上清中のインスリン濃度を測定し
た。尚、培地は実施例４で示すグルコース５０　ｍＱ／
ｄｌおよび３００　ｍｇ／ｄｔの濃度で含む培地を用い
て行った。また、比較の為にＢＵＦ−３についても同じ
条件で実験した。結果は第８図に示した。

第８図に示すように、ＢＵＦ−３，４，５はいずれもイ
ンスリン分泌を促進した。

本発明に係るＢＵＦ−３、ＢＵＦ’−４及びＢＵＦ−５
の内、少なくとも１１類以上の物質を有効成分とする血
糖低下剤は持効性に優れている。従来、臨床で用いられ
ているインスリン頻回注射療法では、皮下注射での血糖
低下作用持続時間が２ないし４、時間であるのに対し、
ＢＵＦ’−３若しくはＢＵＦ−４又はＢＵＦ−５は、動
物実験で静脈内投与２４時間後でも血糖低下作用が持続
している。このため、ＢＵＦ−３若しくはＢＵＦ−４又
はＢＵＦ−５は、従来用いられているインスリン療法に
替る糖尿病治療剤として使用できる。また、王妃ポリ４
７″チド類はヒト由来蛋白なので、抗″Ｊ、性が低く、
アレルギーを起こしにくい為、で長期間の使用が可能で
ある。

本発明の血糖低下剤は、インスリン療法によって症状改
善のみられない糖尿病患者に対しても効果を発揮する可
能性を有する。

ＢＵＦ−３、ＢＵＦ−４、ＢＵＦ−５は新たに発見され
た強力なインスリン分泌刺激因子であり、その作用機序
の研究は膵β細胞におけるｓ　Ｉｇｎａ　１　ｔｒａｎ
３ｄｕｃｔｉｏｎの解明によって有望なアプローチであ
る。さらに重要なことは、ＢＵＦ−３等は膵うンゲルハ
ンス氏島内にインスリン分泌の１ｏｃａｌ　ｒｅｇｕｌ
ａｔｏｒとして存在し生理的にも重要な役割を果たし、
その何らかの機能異常がインスリン非依存型糖尿病の発
症に関与している可能性も考えられる。その場合ＢＵＦ
−３等の持つ強力なインスリ／分泌刺激作用と合せ、イ
ンスリン非依存型糖尿病の極めてユニークな治療薬とし
ての発展が期待できる。

【図面の簡単な説明】

第１図は単１体Ａのアミノ酸配列を示す。 第２図は単量体Ｂのアミノ酸配列を示す。 第３図はＢＵＦ−３を静脈内投与した場合の血糖低下作
用を示すものである。 第４図はＢＵＦ−３を腹腔内に投与した場合の血糖低下
作用を示すものである。 第５図は潅流法により測定したＢＵＦ−３のインスリン
分泌促進作用を示すものである。 第６図は丙流法により、長時間にわたり測定したＢＵＦ
−３のインスリン分泌促進作用を示すものである。 第７図はスタティック・インキエペーション法を用いて
測定したＢＵＦ−３のインスリン分泌促進作用の濃度依
存性を示すものである。 第８図はスタティック・インギーベーション法を用いて
測定したＢＵＦ−３、ＢＵＦ−４及びＢＵＦ−５のイン
スリン分泌促進作用を示すものである。 第１図 Ｇｌｙ　　Ｌｅｕ　　Ｇｌｕ　　Ｃｙｓ　　Ａｓｐ　　
Ｇｌｙ　　Ｌｙｓ　　Ｖａｔ　　Ａｓｎ　　ｌ　１ｅＣ
ｙｓ　　Ｃｙｓ　　Ｌｙｓ　　Ｌｙｓ　　Ｇｌｎ　　Ｐ
ｈｅ　　Ｐｈｅ　　Ｖａｌ　　Ｓｅｒ　　ＰｈｅＡｌａ
　　Ｐｒｏ　　Ｓｅｒ　　Ｇｌｙ　　Ｔｙｒ　　Ｈｉｓ
　　Ａｌａ　　Ａｓｎ　　Ｔｙｒ　　ＣｙｓＧｌｕ　　
Ｇｌｙ　　Ｇｌｕ　　Ｃｙｓ　　Ｐｒｏ　　Ｓｅｒ　　
Ｈｉｓ　　Ｉｌｅ　　Ａｌａ　ＧｌｙＴｈｒ　　Ｓｅｒ
　　Ｇｌｙ　　Ｓｓｒ　　Ｓｅｒ　Ｌ、ｅｕ　　Ｓｅｒ
　　Ｐｈｅ　　Ｈｉｓ　　５ｅｒ１１ｅ　　Ｌｙｓ　　
Ｌｙｓ　　Ａｓｐ　　Ｉｌｅ　　Ｇｌｎ　　Ａｓｎ　　
Ｍｅｔ　　１１ｅ　　Ｖ。 Ｇｌｕ　　Ｇｌｕ　　Ｃｙｓ　　Ｇｌｙ　　Ｃｙｓ　　
Ｓｅｒ第 図 −（３１ｙ ｅｕ ｌｕ Ｃｙｓ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ａｒｇ ｈｒ Ａｓｎ ｅｕ Ｃｙｓ　　Ｃｙｓ　Ａｒｇ　　Ｇｌｎ　Ｇｉｎ　Ｐｈｅ
　Ｐｈｅ　Ｉｌｅ　Ａｓｐ　ＰｈｅＡｌａ　　Ｖａｌ　
　Ｖａｔ　　Ａｓｎ　Ｇｌｎ　Ｔｙｒ　　Ａｒｇ　　Ｍ
ｅｔ　Ａｒｇ　　ＧｌｙＧｌｕ　　Ｃｙｓ　　Ｇｌｙ　
　Ｃｙｓ　　Ａｌａ第 図 対照群 ＵＦ−３ 投与群 ＵＦ−４ 投与群 ＵＦ−５ 投与群 ４゜ μＵ／祠 Ｏ 第 図 １０′ １０’　　　１Ｏ−７ ＢＬＩＦ−３ＣＭ） 第 図 、ｕＬｌ／ｍｇ １５可 コントロールａＪＦ−３ＢＵＦ−４ＢＵＦ−５コントロ
ールＢＬＩＦ−３ＢＵＦ−４ＢＬＩＦ−５グルコ一ス５
０ｍｇ／ｄｆ グル）−ｘ３００ｍｇ／ｇ

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. ポリペプチドＢＵＦ−３、ＢＵＦ−４及びＢＵＦ−５の
   内少なくとも１種類以上の物質を有効成分として含有す
   る血糖低下剤。