JPH029310B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は一般に分析化学特に流体中の予め定め
られた特定成分を分析する為の分析素子に関し、
更に詳しくは、生物学的流体試料中のカルシウム
を分析する為の定量分析素子に関する。 従来、流体試料中の検体成分を分析する方法
は、多数開発がなされてきたが、それらは大別し
て溶液系での分析反応（以下、ウエツトケミスト
リーと略す）と固相系の分析反応（以下、ドライ
ケミストリーと略す）の二種類に分けられる。 ウエツトケミストリーは、用手法と呼ばれる全
く機械を用いない分析方法から、近年病院の臨床
検査室等において多用されている自動定量分析装
置まで多く知られている。 ウエツトケミストリーにおける生体試料中のカ
ルシウムの測定法には、シユウ酸塩沈澱―過マン
ガン酸カリウム滴定法、キレート滴定法等があ
る。 シユウ酸塩沈澱―過マンガン酸カリウム滴定法
はカルシウムをシユウ酸カルシウムとして沈澱さ
せ、これを流酸に溶解して遊離するシユウ酸を過
マンガン酸カルシウム滴定によつて測定する方法
である。然し該方法は操作が煩雑で非能率的な欠
点がある。 キレート滴定法はエチレンジアミン四酢酸など
によつてカルシウムをキレートさせカルシウムの
消失を指示薬の変色から測定しカルシウムの濃度
を求める方法である。然し該方法も共存するマグ
ネシウムの影響を避ける為の煩雑な操作が必要で
あり、逆滴定で間接的にカルシウム濃度を求める
ために精度に対する問題も生じてくる。 一般的に上記の方法等は煩雑であり、熟練した
操作技術を必要とし莫大な時間と労力が浪費され
るという欠点を有する。 一方、ドライケミストリーも広範に用いられて
いる。例えば、米国特許第3050373号あるいは同
第3061523号等に記載の如く濾紙の如き吸水性担
体に試薬溶液を含浸させ、乾燥して作られるもの
である。 これらは一般に分析試験紙又は単に試験片上に
流体試料を滴下するか、又は流体試料中へ試験片
を浸潰させ、試験片の色変色又は濃度変化を肉眼
判定か又は反射濃度計計により測定し、流体試料
中の特定成分の濃度レベルを決定するものであ
る。 これらの試験法はその取扱いが簡便でありかつ
短時間で結果が得られるために有用であるが定量
性に乏しく、以然定性分析の領域にとどまつてい
る状態である。 前述の如き従来の分析方法に対して操作法が簡
便なドライマミストリーを用い、且つ高い定量性
を有するものとして米国特許第4166093号に記載
の如く液体分析用要素が提案されている。これは
光透過性、液体不浸透性支持体上の一側に位置し
流体試料中の成分と反応する少なくとも一種の試
薬を含む試薬層と流体試料中の成分を該試薬層へ
透過させることができる多孔質輻射線ブロツキン
グ層との間に輻射線透過性な検知可能物質マイグ
レーシヨン阻止層を介在せしめた分析要素であ
る。 上記構成によれば流体試料中のカルシウムは、
試薬層中に存在する指示薬例えばナトリウム―
３，６―ビス（４―クロロ―２―ホスホノフエニ
ルアゾ）―４，５―ジヒドロキシ―２，７―ナフ
タレンジスルフオネート又は１，８―ジヒドロキ
シナフタレン―３，６―ジスルフオン酸―２，７
―ビス（（アゾ―２）―フエニルアルソン酸等に
よつてキレートを形成し着色するというものであ
る。 該方法はウエツトケミストリーとは異なり簡便
で二価金属イオン一般に対する定量性を有してい
るが、カルシウムに対する特異性に乏しくカルシ
ウム量測定の精度を著しく低下させるという大き
な欠点を有している。 更に１，８―ジヒドロキシナフタレン―３，６
―ジスルフオン酸―２，７―ビス（（アゾ―２）
フエニルアルソン酸を用いた前述の特許記載の分
析素子は650nm付近まで吸収を有しておりカルシ
ウムとキレートを形成した際生成する680nmの吸
光度によりカルシウム濃度を判定するものであ
り、その判別は測定波長の多少のズレにより大き
い誤差を生ずるという欠点を有する。 上記欠点を克服する為に、本発明者らは鋭意検
討を重ねた結果、以下の構成を有する分析素子を
用いることにより克服する事が出来た。 即ち、液体不浸透性、且つ光透過性支持体と該
支持体の一側に位置する液体試料中の成分と反応
する少なくとも一種の試薬を含有する少なくとも
一層の試薬層と該試薬層の該支持体とは反対側に
位置する液体試料中の成分を該料薬層へ透過させ
る為のの少なくとも一層の多孔性展開層から成る
多層分析素子において、 下記一般式〔〕で示される塩基性物質 一般式〔〕 M_vH_wPO₄・zH₂O （式中Ｍはリチウム、ナトリウム又はカリウムを
表わし、Ｖは２又は３の整数、ｗは0Xは１の整
数、ｚは０乃至12の整数を表わす。） を該試薬層及び該展開層の少なくとも一層に含有
し、且つ３，3′―ビス〔Ｎ，Ｎ―ジ（カルボキシ
メチル）アミノメチル〕―Ｏ―クレゾールフタレ
イン及び８―ヒドロキシキノリン及びその誘導体
を該試薬層に含有した事を特徴とするカルシウム
分析用素子を用いることにより欠点を解消するこ
とができた。 以下に本発明を更に詳細に説明する。 本発明に係るカルシウム検出反応は３，3′―ビ
ス〔Ｎ，Ｎ―ジ（カルボキシメチル）アミノメチ
ル〕―Ｏ―クレゾールフタレインとカルシウムに
よるキレート形成によりカルシウム濃度を測定す
るものである。しかしながら通常生物学的流体試
料、例えば血液、尿、リンパ液等においてはカル
シウムのみ単独で存在する事はない。即ち、カル
シウムと同族のアルカリ土類金属が存在する事は
自明である。特にマグネシウムはカルシウム測定
の際、その検出反応と競争阻害を起こし、正の誤
差を与える事は周知の事実である。 このマグネシウムによる正の誤差を排除する為
に本発明においては、マグネシウム陰蔽剤即ち８
―ヒドロキシキノリン及びその誘導体を上記化合
物と共存させ、かつ反応条件を塩基性とする事に
より精度の高いカルシウム濃度測定が可能とな
る。 しかしながら通常、反応条件を塩基性とするた
めに乾燥皮膜内にアルカリを含有させる事が困難
である事は写真業界においてよく知られている。 即ち、皮膜形成の為のバインダー中にアルカリ
を含有させる事によりバインダーの特性を劣化さ
せると共に他層に対して悪影響を与えることが生
じる。 しかし、本発明の塩基性物質を用いる事により
皮膜に悪影響を与える事なく層内のPHをアルカリ
性にする事が可能である。 本発明に用いられる塩基性物質は、前記一般式
で示される如く、リン酸二重塩及びリン酸三重塩
の中から選択されるものである。 以下に本発明の塩基性物質の具体例を示すが、
本発明はこれによつて限定されるものではない。 (1) Li₃PO₄・1/2H₂O (2) Na₂HPO₄・7H₂O (3) Na₂HPO₄・12H₂O (4) Na₂HPO₄・2H₂O (5) Na₃PO₄・12H₂O (6) K₂HPO₄ (7) K₃PO₄ (8) K₃PO₄・8H₂O 上記化合物の具体例のうち特に好ましい塩基性
物質としては、金属がカリウム又はナトリウムで
あつて、塩の形式としては、リン酸二重塩、リン
酸三重塩いずれの場合も好ましく用いる事が出来
る。 本発明の塩基性化合物は緩衝剤を形成し、緩衝
作用を示すものではない。即ち、緩衝剤は通常、
塩基又は酸と塩の混合溶液を言うが、本発明の化
合物は塩基性物質のみで構成され、緩衝作用を示
さない事は自明である。即ち、当量の酸を加えた
場合、水素イオン濃度（PHと略す）は中性へ変化
し一定のPHを保つ事はない。 本発明の化合物を分析素子内に添加する目的
は、分析素子のPHを高アルカリ性下に保存する事
である。 本発明の分析素子は、PHが約9.0乃至約13.5の
範囲に該素子内を該試料適用時に保持する事が可
能である量本発明の塩基性化合物を添加されれば
良い。更に好ましくはPHが約9.5乃至12.5である
量添加する必要がある。 本発明の塩基性物質は種々のバインダー中に分
散又は溶解する事が出来る。例えばポリスチレン
等のスチレン及びその誘導体類、ポリアクリル酸
メチル、ポリアクリル酸エチル等のポリアクリル
酸エステル類、ポリメタアクリル酸メチル、ポリ
メタアクリル酸エチル等のポリメタアクリル酸エ
ステル類、ポリビニルピロリドン等のポリビニル
複素環誘導体類、ポリビニルブチラール、ポリア
クリルアミド、ポリビニルアセテート部分加水分
解物、ポリビニルアルコール等の合成高分子及び
その共重合体、ゼラチン、ゼラチン誘導体等のゼ
ラチン類、エチルセルロース、ヒドロキシエチル
セルロース、ジアセチルセルロース等のセルロー
ス誘導体類等の天然高分子及びその誘導体が挙げ
られる。 本発明の塩基性物質は上記バインダーを含有す
る有機溶媒又は水溶液中に添加し分散又は溶解せ
しめ、これをボールミル等により粉砕後、塗布す
る事が出来る。 また、上記バインダーを含有する溶液または分
散物における本発明の塩基性物質濃度はバインダ
ーに対して最高100重量％まで添加可能であり、
好ましくは80重量％を最大限として任意の割合で
添加する事が望ましい。 本発明の塩基性物質は、試薬層及び多孔性展開
層の少なくともいずれか一層に含有する事が出来
る。また塩基性物質は試薬層に含有する場合、本
発明の他の試薬類、即ち３，3′―ビス〔Ｎ，Ｎ―
ジ（カルボキシメチル）アミノメチル〕―Ｏ―ク
レゾールフタレイン及び８―ヒドロキシキノリン
及びその誘導体と同一層に含有する事も可能であ
り、又別層に含有させる事も可能である。 特に本発明の塩基性物質と他の試薬類を別層と
して用いる場合、支持体側から、第一の試薬層に
他の試薬類を、第二の試薬層に塩基性物質を含有
させる事も又その逆の場合も、本発明の多層分析
素子に好都合に用いる事が出来る。 上記の如く別層として用いる場合、３，3′−ビ
ス〔Ｎ，Ｎ−ジ（カルボキシメチル）アミノメチ
ル〕−Ｏ−クレゾールフタレインと８−ヒドロキ
シキノリン及びその誘導体を含有する層に好まし
く用いられるバインダーとしては、例えばゼラチ
ン、フタル化ゼラチンの如きゼラチン誘導体類、
ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、
ポリアクリルアミドの如き親水性コロイド物質が
用いられる。 本発明における８―ヒドロキシキノリン及びそ
の誘導体は下記の一般式〔〕に示されるもので
ある。 一般式〔〕 R₁及びR₂は水素原子、炭素数１乃至４の置換
及び未置換の低級アルキル基、アリール基、スル
ホン酸基及びその塩、ハロゲン原子等が挙げられ
る。又R₁及びR₂は同一であつても異なつていて
も良い。 好ましくは

【式】

【式】

【式】 （Ｒは例えば、Cl，Br等のハロゲン原子であり、
３，４，５，６又は７位に置換する）、

【式】である。 本発明に係る多孔性展開層は特公昭53−21677
号に記載された性能即ち、(1)一定容量の流体試料
を単位面積当り一定容量の料薬層に均一に配布
し、(2)流体試料中の分析反応を阻害する物質又は
要因を除去し、(3)分光光度分析を行なう際に支持
体を経て透過する測定光を反射するバツクグラン
ド作用を行なう機能を有するものであれば、任意
に選択する事が出来る。従つて本発明に係る展開
層は上記３つの機能を全て行ない得るが、又３つ
の機能を適宜分離し各機能毎に別の層を使用する
ことも可能である。更に、３つの機能のうち２つ
の機能を有する層と残りの他の機能を有する層を
組み合わせ使用することもできる。例えば同上特
許記載の二酸化チタン及び二酢酸セルロースから
成るブラツシユポリマーと呼称される非繊維多孔
質媒体の展開層、特開昭56−24576号、特願昭56
−13203号及び特願昭56−65446号等等に記載の繊
維構造展開層が挙げられる。特に上記繊維構造展
開層は、血球部分もすみやかに移送する事が可能
な素材として特に有用である。 更に前述の如く、上記多孔性展開層中に本発明
の塩基性物質を含有する事が出来る。この際の方
法は前述と同様にして容易に含有させる事が出来
る。 本発明の分析素子に係る前記の液体不浸透性の
光透過性支持体（以下、本発明に係る支持体と略
す。）は、液体不浸透性で且つ光透過性であれば
その種類を問わないが、例えば酢酸セルロース、
ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネー
ト、又はポリスチレンのような種々の重合体材料
及びガラスの如き無機材料がこの使用目的に適す
る。この場合、上記の支持体の厚さは任意である
が好ましくは、約50ミクロンから約250ミクロン
である。 更に本発明の多層分析素子を形成する各層中に
は他の添加剤もその目的に応じて含有する事が出
来る。例えば緩衝剤、保恒剤、界面活性剤等が挙
げられる。 特に界面活性剤は、流体試料を本発明の素子に
適用した際の浸透速度の調節等有効に用いる事が
できる。 使用可能な界面活性剤としては、イオン性（ア
ニオン性またはカチオン性）、非イオン性を問わ
ず界面活性剤を使用することが可能であるが、好
ましくは非イオン性界面活性剤が有効である。非
イオン性界面活性剤の例としては、例えば２，５
―ジ―ｔ―ブチルフエノキシポリエチレングリコ
ール、ｐ―オクチルフエノキシポリグリシジルエ
ーテル、ｐ―イソノニルフエノキシポリエチレン
グリコール等のアルキル置換フエノールのポリア
ルキレングリコール誘導体、高級脂肪酸のポリア
ルキレングリコールエステルなどが挙げられる。
これらの界面活性剤は流体試料の試薬層への浸透
速度を調節し、同時に好ましからざる「クロマト
グラフイ現象」発生を抑制する効果を有する。更
に界面活性剤の効果として生物学的流体試料中に
含まれる蛋白質による種々の好ましくない影響を
軽減する作用もある。 上記界面活性剤は広範に選択された量を用いる
ことが可能であるが、バインダーのの重量に対し
て10重量パーセント及至0.005重量パーセント、
好ましくは６重量パーセント乃至0.05重量パーセ
ント用いることができる。 また本発明に係る支持体の観察側の一側面は、
その目的に応じて任意に加工することは可能であ
る。更に試薬層を積層する側の支持体面に、場合
によつては光透過性の下塗り層を使用して試薬層
と支持体との接着性を改良する事が出来る。 本発明の試薬層は他の層も含めて本発明の支持
体上に例えば浸潰塗布法、エアーナイフ法、カー
テン塗布法又は米国特許第2681249号明細書に記
載の如きホツパーを用いる押し出し塗布法等各種
の塗布法で塗布する事が可能であり、所望により
二層又はそれ以上の層を米国特許第2761791号及
び英国特許第837095号に記載の方法で同時に塗布
する事も出来る。 更に本発明の試薬層は酵素を全く用いないもの
であるので、乾燥温度は任意に選択する事ができ
る。例えば室温乃至約100℃まで広範な温度範囲
で用いられる。 本発明の多層分析素子は種々の異なる配置のう
ち、任意の一つをとることが可能である。更に本
発明の試薬層と各種の機能層、試薬含有層及び部
材、例えば米国特許第3992158号記載の試薬層、
反射層、下塗り層、同第4042335号記載の放射線
ブロツキング層、同第4066403号記載のバリヤー
層、同第4144306号記載のレジストレーシヨン層、
同第4166093号記載のマイグレーシヨン阻止層、
同第4127449号記載のシンチレーシヨン層、特開
昭55−90859号記載の清掃層及び米国特許第
4110079号記載の破壊性ポツド状部材等を任意に
組合わせて、本発明の目的に合わせた分析素子を
構成する事が可能である。 本発明の分析素子は反射分光光度測定により比
色定量が可能である。即ち574nmにおける反射吸
光度を測定することでカルシウムの濃度レベルを
決定する事が出来る。 以上のように構成された本発明の分析素子は展
開層側から流体試料を供給した後、試薬層の分析
反応を透明支持体側から観察し反射濃度を測定
し、得られた測定値を予め作製しておいた検量線
にあてはめる事で未知被検物質の量を決定する事
が出来る。 本発明の分析素子に適用される流体試料の量は
任意に定める事が出来るが、好ましくは約50μlで
あり、更に好ましくは、約20μlから約5μlである。
通常約10μlの流体試料を適用するのが好ましい。 本発明の分析素子は種々の流体試料中に存在す
るカルシウムを定量分析する事が可能であるが、
例えば臨床化学の分野に有用に用いられ、特に生
物学的流体試料、例えば血液（全血、血漿、血
清）尿、髄液中の尿素及びその誘導体の分析に用
いられる。 以下に実施例を挙げて本発明を更に具体的に説
明するが、これによつて本発明の実施態様が限定
されるものではない。 実施例 １ 透明な膜厚180ミクロンの下引き済ポリエチレ
ンテレフタレート支持体上に下記組成の層を順次
塗布を行ない、多層分析素子を作製した。 (1) 試薬層 ポリビニルピロリドン 21.5ｇ／m² 例示化合物(1) 74.9ｇ／m² ８―ヒドロキシキノリン 1.6ｇ／m² ３，3′―ビス〔Ｎ，Ｎ―ジ（カルボキシメチ
ル）アミノメチル〕―Ｏ―クレゾールフタレイ
ン 0.81ｇ／m² ポリオキシエチレンラウリルエーテル（花王ア
トラス(株) 商品名エマルゲン120） 0.8ｇ／m² から成る乾燥膜厚約31ミクロンの試薬層 (2) 繊維構造展開層 粉末濾紙(C)（東洋濾紙(株) 300メツシユ以上）
91ｇ／m² コポリ（スチレン―グリシジルメタアクリレー
ト）（重量比95：５） 13.0ｇ／m² ポリオキシエチレンラウリルエーテル（花王ア
ストラス(株)商品名エマルゲン120） 0.3ｇ／m² から成る乾燥膜厚約160ミクロンの繊維構造
展開層又比較の多層分析素子として前述の試薬
層から本発明の例示化合物(2)を除いたものを作
製した。 上記の本発明の分析素子及び比較分析素子に対
し、カルシウム濃度１、２、５、８、10、12、16
mg／dlの各々の濃度でかつマグネシウム濃度２
mg／dlを含むウシ血清アルブミン５重量パーセン
ト水溶液から成るモデル血清を用意し、その各々
を本発明の分析素子及び比較分析素子の繊維構造
展開層上へ10μl滴下し、37℃10分間インキユベー
シヨンを行なつた後、575nmにおける反射濃度を
測定した。以下の表に結果を示す。

【表】 上記の結果から明らかなように比較分析素子
は、共存するマグネシウムの影響をうけモデル血
清中のカルシウム濃度との相関が認められなかつ
た。 一方、本発明の分析素子は、カルシウム濃度と
非常に良好な相関をするものである事が認められ
た。 実施例 ２ 試薬層中のポリビニルピロリドンの代わりにカ
ルボキシメチルセルロースを16ｇ／m²、例示化合
物(1)の代わりに例示化合物(7)を35.5ｇ／m²をそれ
ぞれ用いた以外は実施例１と同様な試薬組成で本
発明の分析素子−１を作成した。 更に試薬層中のポリビニルピロリドンの代わり
にヒドロキシエチルセルロースを13ｇ／m²、例示
化合物(5)を24.7ｇ／m²をそれぞれ用いた以外は実
施例１と同様な試薬組成で分析素子を作成し本発
明の分析素子−２とした。一方、本発明の分析素
子−１から例示化合物(7)を除いたもの及び、本発
明の分析素子−２から例示化合物(5)を除いたもの
を作成し、それぞれ比較の分析素子−１及び−２
とした。 上記各分析素子について実施例１と同様な方法
で反応を行い、575nmにおける反射濃度を測定し
た。

【表】 上記の結果から明らかなように比較分析素子−
１及び−２は共存するマグネシウムの影響を受け
モデル血清中のカルシウム濃度との相関が認めら
れなかつた。 一方、本発明の分析素子−１及び−２は、カル
シウム濃度と非常に良好な相関をするものである
事が認められた。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 液体不浸透性且つ光透過性支持体と該支持体
   の一側に位置する液体試料中の成分と反応する少
   なくとも一種の試薬を含有する少なくとも一層の
   試薬層と、該試薬層の該支持体とは反対側に位置
   する液体試料中の成分を該試薬層へ透過させるた
   めの少なくとも一層の多孔性展開層から成る多層
   分析素子において、下記一般式で示される塩基性
   物質 一般式 M_vH_w PO₄ ・zH₂O 〔式中Ｍはリチウム、ナトリウム、又はカリウム
   を表わし、ｖは２又は３の整数、、ｗは０又は１
   の整数、ｚは０乃至12の整数を表わす。〕 を該試薬層及び該展開層の少なくとも一層に含有
   し、且つ３，3′―ビス〔Ｎ，Ｎ―ジ（カルボキシ
   メチル）アミノメチル〕―Ｏ―クレゾールフタレ
   イン及び８―ヒドロキシキノリン及びその誘導体
   を該試薬層に含有した事を特徴とするカルシウム
   分析用素子。