JPH03100438A - 基板表面の調製方法、物質結合装置、測定装置及び質量センサー - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （発明の技術分野） 本発明は分析化学に関し、さらに詳しくは基板に化学種
を選択的に結合させるための装置および方法に関する。

（従来技術とその問題点） 環境を侃４丁するために陸上または水中での様々ｃＬ＆ な汚染物質の量を測定することが必要である。これらの
汚染物質を測定する実験室は多くの異なる微量の化学物
質を測定しなければならない。質量バイオセンサーは医
療用その他の用途と同様にこの用途においても貴重な手
段を提供する。

質量バイオセンサーは微量の生物学的成分を測定するの
に利用されており、極微量の生物学的および化学的成分
を検出する潜在能力を持っている。

一つの型の質量バイオセンサーは音響導波管として圧電
結晶を使用する。入カドランスジューサーは周期的な入
力電気信号から周期的な音波を発生させる。その音波は
結晶を通って出カドランスジューサーに伝播し出カドラ
ンスジューサーは受は入れた音波を出力電気信号に変換
する。音波は結晶の表面に結合した質量に応じて伝播速
度が変化する。入力電気信号と出力電気信号の周波数と
相対的位相を測定することによって、結晶の表面におけ
る質量の変化を測定することができる。

試料溶液中の特定の化学成分の量を測定するためには、
結晶の表面はその成分を選択的に結合するように調製さ
れなければならない。一つの解決法においては、科学者
は未処理の結晶を取得して問題の成分に対する親和力が
得られるように測定の直前に前述の結晶を調製する。た
とえば、結晶の表面に抗体を結合させて対応する抗原の
量を測定するように質量バイオセンサーを調製すること
ができる。

これまでの圧電結晶バイオセンサーは抗原を結合する抗
体蛋白質あるいは抗体を結合する抗体結合蛋白質が直接
的に結晶表面に結合するように構成されていた。この方
法の主要な欠点は、これらの蛋白質を表面に結合させる
のに長い時間を必要とし、操作に何時間もかかることで
ある。ある場合にはこの調製操作に２４時間あるいはそ
れ以上の時間がかかった。

もう一つの欠点は、結晶表面に結合している蛋白質の安
定性によってセンサーの貯蔵（保管）寿命が制約される
ことである。抗体および抗体結合蛋白質は低温貯蔵が必
要であり時間の経過とともに結合活性を失う、さらにも
う一つの欠点は、ある種の蛋白質は配向して表面に結合
する可能性があり、このことによって問題の化合物に対
する結合部位が不明確にはことである。その上、表面に
結合した蛋白質を固定化する操作により、結合部位が化
学薬品にさらされて結合部位の官能基に影響を及ぼすこ
とによって結合活性が低下する可能性がある。さらにま
た、この操作は個々の特定の蛋白質系の改質を必要とす
る場合がある。そしてもう一つの問題は、表面に対する
高度の非特異的な（ｎｏｎｓｐｅｃｉｆｉｃ）吸着、す
なわち溶液中の多くの分子は弱い静電気的結合および水
素結合によって表面に結合するということである。質量
バイオセンサーにおいては、この非特異的結合は測定に
影響を及ぼし、機器の感度とその分析的および臨床的存
用性を制約する。

（発明の目的） 本発明の目的は、所望の化学物質を迅速で簡便な操作で
結合できるセンサーを提供することである。さらに本発
明の目的は極微量の化学物質の検出に利用できるように
、非特異的な結合の少ないセンサーを提供することであ
る。

（発明の概要） 本発明によれば、測定装置は測定表面、表面上のリガン
ド結合層およびリガンド結合層に結合されたリガンドを
有する層を含んでいる。リガンドを有する層は測定され
るべき化学物質に対する結合親和力のために選ばれる。

たとえば、選ばれたビチオン結合抗体（ｂｉｏｔｉｎｙ
　ｆａｔｅｄ　ａｎｔｉｂｏｄｙ）の層はアビジン層に
結合させ、アビジン層は質量バイオセンサーの圧電結晶
基板に結合させることができる。

測定装置の調製は、問題の化学物質と結合親和力を有す
るリガンド共役（ｌｒｇａｎｄ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）
化合物を利用すること、および相互にリガンド結合部位
を有する物質を利用することによって測定表面の結合特
性を化学的に改良することを含む。この調製工程はリガ
ンド結合物質を層として表面に結合すること、リガンド
を有する化合物を層としてリガンド結合物質に結合する
こと、および非特異的吸着を減少させるために遊離の活
性部位を被覆する遮断剤で洗浄することを含んでいる。

生成した複合表面は問題の化学物質を選択的に結合する
ために使用することができる。実施例として、アビジン
がシリカ基板に結合され、ビチオン結合抗体がアビジン
に結合され、ビオチンが未被覆の活性部位を遮断するた
めに添加される。この複合表面は最小の非特異的吸着で
抗原にしっかりと結合する。

前述のように、アビジンはリガンド結合層として好まし
い物質であり、ビオチン結合抗体はリガンドを有する層
として好適である。ビチオン結合抗体は直接にあるいは
スペーサー分子を介してビオチンに結合された抗体によ
って構成されている。

ビオチンは１分子当り１個のアビジン結合部位を有し、
アビジンは１分子当り４個のビオチン結合部位を有する
。アビジンとビオチンは、これらがさらに他の分子と複
合していても高い親和力を有する結合部位が遮断されて
いない限り、それらの相互の結合部位によって互いにし
っかりと結合し合っている。

本発明は１．液体に浸漬されると選択された化学物質を
結合するような装置を提供する。この装置の表面はリガ
ンド結合物質とリガンド複合化合物より構成された表面
被覆層を有し、後者は問題の化学物質に対して強力な結
合親和力を有するものである。リガンド結合物質は結合
剤を使用して基板に結合することができる。非特異的結
合は遮断剤、緩衝剤または他のレジメン（ｒｅｇｉｍｅ
ｎ）によって処理することにより抑制することができる
。遮断剤は装置に結合して弱い結合の生成に起因する非
特異的結合を立体的に妨害する化学物質である。

適当なｐｉを有する緩衝剤は表面の電荷を有する部位を
中和することによって非特異的結合を妨害することがで
きる。

本発明によって提供される質量バイオセンサーは、電気
信号発生器、電気−音響入力トランスジューサー、圧電
結晶導波管、電気−音響出力トランスジューサーおよび
信号発生器からの電気信号と出カドランスジューサーと
の間の位相変化を測定する手段を備えている。この場合
は導波管が液体に浸漬され、信号が供給されて導波管か
らの出力信号の位相または周波数が測定される。導波管
の表面の質量の変化は出力信号に影響を及ぼし、これら
のデータから分析対象の質量または濃度を算出すること
ができる。

本発明では調製時間が過度に長くなる点、生成物が不安
定になるという問題を解消するために二段階で測定表面
の調製をおこなう。好ましい実施態様によれば調製の第
１段階はセンサーの表面にアビジンを結合させることを
含む。この段階は時間が長くかかるが装置の製造者によ
って能率的に行うことができる。アビジンは室温におい
ては結合活性を保持するのでアビジンで被覆された装置
は比較的長い貯蔵寿命を有しており、製造の目的のため
には担当の経費を節減して低温貯蔵を行わないで梱包お
よび配送することが可能である。製造者にとってもう一
つの利点は、卵白の成分であるアビジンは低コストで豊
富に供給できるということである。殺菌条件を必要とす
る用途に対してさらにもう一つの利点は、アビジンは１
２０°Ｃまでの温度に耐えるのでアビジン修飾センサー
は殺菌することができるということである。

第２の段階はビオチン結合化合物をアビジンに結合させ
ること、および表面の弱い結合部位を遮断することを含
む。この段階は利用者によって約３０分間で容易に行う
ことができる。ビオチン結合抗体はアビジンよりは不安
定であるが、この成分は使用直前まで表面に添加する必
要がない。利用者にとってもう一つの利点は、調製の第
２段階は高価な装置や化学薬品を必要としないというこ
とである。また、操作のこの段階は生理学的条件の下で
室温で行われるので、ビオチン結合化合物の結合活性が
過酷な化学薬品や高温度によって低下することがない、
利用者にとって非常に便利なことはビオチン結合化合物
は商業的に入手可能であるか、あるいは以下に記載する
公表された操作によって調製することができるという事
実である。

したがって、本発明は選択された化学物質の量を査定す
るために質量バイオセンサーを専用化することを可能に
する便利さを著しく高めるものである。

本発明の重要な特徴は非特異的結合を減少させることが
できることである。シリカ表面の遊離した活性な領域は
結合されたアビジンによって立体的に（ｓｔｅｒｉｃａ
ｌｌｙ）遮断されている。アビジンの遊離した未結合の
に部位はビオチンによる最終の洗浄段階において遮断さ
れる。ビオチンは分子が小さくて分子量が低いので、も
っと大きな遮断剤では立体障害のため接近することので
きないような未結合の結合部位に接近できる。

また本発明のもう一つの特徴は結合部位が多くなること
である。アビジンの単分子は４個のビオチン結合部位を
持っているので、シリカの表面がアビジンで被覆される
ときにはビオチン結合誘導体についての可能性のある結
合部位の数はアビジンについての結合部位の数の４倍で
ある。次の層にそれぞれが２個の抗原結合部位を有する
ビオチン結合抗体を使用するときには、抗原種の可能性
のある結合部位はやはり増加する。本発明のこれらの特
徴および他の特徴と利点は以下に図面を参照して説明す
ることにより、より明らかになるであろう。

（好ましい実施ｙ１４様の説明） 本発明によれば第１図に示されるように質量バイオセン
サー１００は上面１１４に入カドランスジューサー１１
２と出カドランスジューサー１１３を備えた表面横波（
ＳＴＷ）装置１１０を含んでいる。オルガノシラン化合
物から生成された結合Ｎ１１６が上面１１４を被覆して
いる。結合層１１６はアビジン層１１８を結合させる部
位として役立ち、アビジン層１１８はビオチン結合抗体
層１２０にしっかりと結合している。ビオチン結合抗体
層１２０はパイオサ−の特定の用途に適当な他のビオチ
ン結合化合物によって代替えすることができる。信号発
生器１２１によって発生する周期的な信号は人カドラン
スジューサー１１２を通過して周期的な音波に変換され
、表面横波装置１１０を通って出カドランスジューサー
１１３に伝播される。

センサーを試料１２２に浸漬すると、抗原１２４はビオ
チン結合抗体層１２０に結合する。抗原１２４の結合は
表面１１４に結合した質量を変化させる。この変化はト
ランスジューサー１１２と１１３の間の音波の伝播速度
の変化に反映される。出カドランスジューサー１１３に
おいて、周期的な音波は周期的な電気信号に変換され、
この信号は信号処理装置１２５に至る。このようにして
周波数または相対位相を示す信号が試料１２２中の抗原
１２４の量を算出するのに利用される。

測定を行った後に、抗原１２４は１．５Ｍの食塩水など
の高いイオン強度を有する塩溶液で洗浄することによっ
てビオチン結合抗体層１２０から取除かれる。他のビオ
チン結合複合体の使用に対しては異なる除去方法が適当
である。抗原が抗体層から取除かれた後、バイオセンサ
ーは再使用することができる。

石英基板に対してアビジンを固定化する方法の概略が第
２図に示されている。基板はＳｉｎ、を５００人の厚み
にスパッタ蒸着することによって前処理されて多数の活
性水酸基（−ＯＲ）を付与される。第１の段階２１にお
いては、他の適当なカップリング剤も使用できるがカッ
プリング剤としての有機シランが基板に添加される。カ
ップリング剤の有機シランはＲ＋ｌ５ｉＸ　（ａ−、、
＋　なる一般式を有する。この式においてＸは加水分解
可能な基、たとえばアルコキシ基、アシロキシ基、アミ
ンまたは塩素を示す。Ｒは第１級アルコール基を含む非
加水分解性の有機の基を示す。整数ｎは１．２または３
であるが、最も代表的な場合は１である。Ｒ基およびＸ
基は中央のケイ素原子（Ｓｉ）に結合している。

カップリング剤としての有機シランは３−グリシキトキ
シプロビルトリメトキシシラン（ＧＯＰＳ）である。こ
の段階の化学については、Ｒ、Ａｎｄｅｒｓｏｎ。

Ｂ、　Ａｒｋｌｅｓおよび（：、　、　　Ｌ、Ｌａｒｓ
ｏｎｉｇ集によるｐｅｔｒａｒｃｈ　　５ｙｓｔｅｖ＋
ｓ　　Ｒｅｇｉｓｔｅｒ　　ａｎｄ　　Ｒｅｖｉｅｗ　
　１９８７　　年版のＢａｒｒｙ　−Ａｒｋｌｅｓによ
る５ｉｌａｎｅ　ＣｏｕｐｌｉｎｇＡｇｅｎｔ　Ｃｈｅ
ｍｉｓｔｒｙ”に記載されている。その結果として、有
機ジヒドロキシシロキサンが基板を被覆する。第２段階
２２においては、過ヨウ素酸ナトリウムなどの適当な酸
化剤の添加により有機の基の第１級アルコール基が反応
性アルデヒド基に変えられる。第３段階２３においては
、アビジンが添加されてアルデヒドはアビジンの第１級
アミンと反応して不安定なシッフ塩基を生成する。第４
段階２４においては、シアノホウ化水素ナトリウムなど
の適当な還元剤が添加されてこの還元剤が不安定な複合
体を２５に示される安定な還元生成物に転化させる。

バクテリアによる蛋白質、ストレプトアビジンはアビジ
ンと同様のビオチン結合特性を持っているのでアビジン
の代りに使用することができる。

アビジンはグリコジル化された蛋白質であり、このこと
はアビジンが豊富な糖残基を結合させて持っており非特
異的結合の部位の可能性を提供することを意味する。ス
トレプトアビジンは非特異的結合を軽減するためのある
用途において有用なグリコジル化されていない中性蛋白
質である。アビジンあるいはストレプトアビジンのたと
えばアセチル化またはサクシニル化による修飾形態、あ
るいは遺伝学的に設計されたアビジンまたはストレプト
アビジンもビオチン結合部位がそっくりそのまま残って
いる限り使用することができる。

第３図は特定の抗原を結合させるためにアビジンで被覆
した基板にビオチン結合抗体を結合させる方法を示す概
略図である。アビジン被覆基板は段階３１においてビオ
チン結合抗体を使用して保育（ｉｎｃｕｂａｔｅ）され
る、それから段階３２においては基板はビオチンなどの
遮断剤（ｂｌｏｃｋｉｎｇ　ａｇｅｎｔ）で洗浄されて
、アビジン層のあらゆる未結合部位にビオチンが結合す
る。グリシンなどの他の遮断剤も使用することができる
。段階３３において基板が試料溶液中に浸漬されると、
段階３４に示されるように抗原は抗体分子を介して表面
に結合する。本発明による固定化法は以下の実施例を参
照してさらに詳細に説明される。

実施例１： ビオチン結合抗体によるシリカ表面の修飾１、　シリカ
基板のシラン化処理 ２．５ｄのＧＯＰＳ　（アルドリッチケミカル社）、２
０−のイソプロパツール、２．５ｄの水およびニーの酢
酸を使用してＰＨ３，０の３−グリシドキシプロビルト
リメトキシシラン（ＧＯＰＳ）　１０％溶液を調製する
。　Ｓｉｎｇで前処理したシリカ基板を溶液にさらす。

溶液を１時間加水分解した後、触媒として０．２５ｄの
トリエチルアミン（ＡｌｄｒｉｃｈＣｈｅｍｉｃａ１社
製）を添加する。３−５χを蒸留水で洗浄する。真空中
またはヘリウム雰囲気中または機械的な炉の中で１１０
℃において１０分間処理して表面を乾燥させる。

２、　　ＧＯＰＳのエポキシド基またはジオール基の過
ヨウ素酸塩による酸化 １ｇのＨ５１０＆、２００Ｈ１の水、８００ｄの酢酸を
使用して０．１％の過ヨウ素酸塩溶液を調製する。

シラン処理された基板を室温で３０分間保育する。水で
洗浄する。

３、　アビジンを使用した基板の保育 ホウ酸塩で緩衝されたサリーン（ＢＢＳ）にアビジンを
０．１■／ｌｌ１１の濃度で溶解したＰＨ８，５の溶液
を使用して、前記の洗浄された基板を保育する。

４℃において２０〜２４時間静かに反転することによっ
て混合する。

４、　シッフ塩基の安定な生成物への還元保育に続いて
ＮａＣＮＢＩＩ＊を１５分間隔で４回添加してＮａＣＮ
ＢＨａの最終濃度が０．０１Ｍになるようにする。

５、　ビオチン結合抗体の結合 ビオチン複合抗体をＰＢＳに溶解した溶液を使用して室
温で３０分間アビジン被覆基板を保育する。　ＰＢＳで
洗浄する。

アビジンで被覆された表面は利用者によって広範囲の様
々の用途に専用化することができる。

基本的な手法はリガンドに化学的に結合した生物学的活
性分子よりなる混合複合体を利用することであり、この
ことによって得られた生成物はリガンド結合蛋白質に対
する生物学的活性とその親和力の両方を保持している。

互いに強力な結合親和力を示すような化学的な対であれ
ば候補に上げられる。たとえば、ビオチン結合抗体は抗
原を結合し、ビオチン結合ポリヌクレオチドのストラン
ドはＤＮＡ、　ＣＤＮＡまたはＲＮＡを結合し、ビオチ
ン結合ＤＮＡ−結合蛋白質は遺伝子の調節配列を結合し
、ビオチン結合蛋白質Ｇおよび蛋白質Ａは免疫グロブリ
ンを結合し、ビオチン結合レクチンはｔｉＨＭを結合し
、ビオチン結合酵素はそれらの基板、補因子または阻害
剤を結合し、ビオチン結合細胞受容体蛋白質はホルモン
、神経伝達物質またはウィルスを結合する。遺伝学的に
設計されるか、または化学的に修飾されたビオチンはア
ビジン結合部位が有効なまま残っている限り供役体（ｃ
ｏｎｊｕｇａｔｅ）中のビオチンの代りに、あるいは遮
断剤として使用することができる。

本発明の方法は特定の用途に従って様々の基板に対して
利用することができる。精製が目的であるときには、ク
ロマトグラフの支持体マトリックスまたはシリカビーズ
を使用するこ、とができる。本発明の方法によって取扱
われるガラス管、ペトリ皿その他の実験器具は時間を節
約する段階および標準の実験操作に対する便利さを導入
するために使用することができる。

アビジン層を結合させる別の方法も利用できる。たとえ
ば、非加水分解性有機基がアミン基を含む有機シラン・
カップリング剤、すなわち（γ−アミノプロピル）トリ
エトキシシラン（略称：γ−ＡＰＴＥＳ）は、グルタル
アルデヒドと反応させ、次にアビジンと反応させること
ができる。セファロースなどの一部の基板は活性化させ
て直接にアビジンに結合させることができる。

本発明の装置はどんな種類のセンサーでも供給するので
、音響センサー、光センサ−、重量センサー、電気化学
センサー、光電化学センサー、キャパシタンスセンサー
およびサーミスターセンサーはすべて本発明の範囲内の
ものである。圧９電結晶を利用した重量センサーはレイ
リー表面音波装置、ラム音波装置および表面横波装置を
含んでいる。可能性のある光センサーの中にはファイバ
ー光学エバエッセントセンサーおよびエバネッセント平
面導波管センサーがある。電気化学の分野でのセンサー
の中には電位差センサー、電流センサーおよび電界効果
トランジスター（ＦＨＴ）センサーがある。

アビジン化合物およびビオチン結合化合物は広く入手可
能なために利用するのに便利な結合物質であるが、他の
相互結合物質が本発明の方法に基づいて使用できる。第
１の結合層として使用されるレクチンとその相互結合層
としてのグリコジル化受容体蛋白質はウィルス粒子、生
長因子、ホルモンおよび他の細胞モジュレータ−の固定
化に利用できる。これ以外に、抗原の濃度が測定できる
ように、蛋白質Ａあるいは蛋白質Ｇを第２の結合層とし
ての抗体とともに第１の結合層中に含ませることができ
る。前述の実施態様に対するこれらおよびその他の部分
的な修飾および変更は本発明によって準備されているも
のであり、本発明の範囲に含まれる。

〔発明の効果〕

本発明の実施により、非特異的結合の少ない特定物質の
選択的結合の可能な基板が提供される。

また、本発明を実施した基板の調整では、前もって、工
場において第−層を結合して、使用者が使用前に第二層
を添加することができる。従って保管貯蔵期間の長い第
一層結合基板を用意しておくことにより、使用者が広汎
な用途に合うように容易に修飾して基板を完成すること
ができる。

また、本発明を実施した基板は多種類のセンサー構成で
使用できる。

また、一実施例では結合部位の増加がみられる。

【図面の簡単な説明】

第１図は上表面を化学修飾した表面横波装置を用いたセ
ンサーの概略図である。 第２図は基板にアビジンを固定化する工程の概略を示す
フロー図である。 第３図はアビジン被覆基板にビオチン結合抗体を添付す
るプロセスの概略を示すフロー図である。 １００：質量バイオセンサー 表面横波装置 入カドランスジューサー 出カドランスジューサー 結合層 アビジン層 ビオチン結合抗体層 信号発生器 試料 抗原 信号処理装置

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、後記（イ）、（ロ）から成る所定の物質を結合する
   ための基板表面の調製方法。 （イ）第１層高親和性結合部位を有する第１の結合層を
   前記基板表面に添付する工程。 （ロ）第２の結合層を該第２の結合層上の逆高親和性結
   合部位を介して前記第１層高親和 性結合部位に結合する工程、前記第２の結 合層は前記所定物質を結合する第２層結合 部位を有する。 ２、後記（イ）及至（ニ）より成り、液体中の所定の化
   学物質を結合する物質結合装置。 （イ）基板。 （ロ）前記基板に添付され、官能基を有するカップリン
   グ層。 （ハ）前記官能基によって前記基板に添付されたリガン
   ド結合層、該リガンド結合層はリ ガンドに対する高親和性部位を有する。 （ニ）前記リガンド結合層に強固に付着せしめられたリ
   ガンド含有層、該リガンド含有層 は前記所定の化学物質に対する化学的選択 性を有する。 ３、後記（イ）及至（ニ）より成る測定装置。 （イ）化学物質が添付される表面を有し、該添付された
   化学物質の特性量の値を測定する 測定手段。 （ロ）官能基を有し前記表面に結合させたカップリング
   層。 （ハ）前記官能基によって前記表面に添付されたリガン
   ド結合層。 （ニ）前記化学物質に対して化学的に選択性を有し、前
   記リガンド結合層に強固に付着せ しめられたリガンド含有層。 ４、後記（イ）及至（チ）より成る溶液中の分析対象の
   質量を測定するための質量セン サー。 （イ）前記分析対象が付着する表面を有する基板。 （ロ）周期信号を発生する信号発生器。 （ハ）前記周期信号を前記基板に沿って伝播する音響波
   に変換するための入力変換器。 （ニ）前記音響波を受信信号に変換するための出力変換
   器、該受信信号は前記表面に付着 した前記分析対象の質量に応答する。 （ホ）前記質量を決定するため、前記受信信号を解析す
   るための信号処理手段。 （へ）前記表面に添付され、官能基を有するカップリン
   グ層。 （ト）前記官能基によって前記表面に添付されたリガン
   ド結合層。 （チ）前記分析対象に対して化学的に選択性を有し、前
   記リガンド結合層に強固に付着せ しめられたリガンド含有層。