JPH03101601A - 植物胚芽の保存方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業の利用分野］ 本発明は植物胚芽の保存方法に関する。

（従来の技術］ 多数の植物の種はＩＩ胞懸濁液（　ＳＬＩＳＤｅｎＳｉ
Ｏｎ）の形憇で保存、貯蔵される。

植物胚芽の貯ｊａは多くの場合、例えばある季節タｓｔ
　必ｉ　ｒ　ア８小植物（　ｐｌａｎＮｅｔ）　（７）
−生産をｉｌ！１節したり、栄養系を維持するために正
当化される。

植物胚芽の保存は、例えば一時的に胚芽の戒長を止める
可能性、苗床に運んだり貯蔵するのに必要な時間及び人
工種子を生産するという可能性を含む様々な利点を持ち
つる。

体細胞胚芽は、植物の増頬について特定の利点を有する
。原則的にそれらは単細胞から生じ遺伝学的に同一の植
物を産するその形成の初期段階から休細胞胚芽は両極端
の構造を有し、すなわち植物を産するのに必要な茎と根
の二つの分裂組織を右する。したがって体細胞胚形戒【
よ植物増殖に輿味深い選択を表している。それは生産す
るのに高価な秤や試験管内培養で生じる高性能な個体や
、例えば有性的に増殆するのが困難な形質転換植物の急
速な増殖に利用できる。

低温および／または低酸素症で未分化組織を貯蔵する様
女な既知の方法がある。一般的に４組織を半固体媒体上
に維持するか、温度Ｏ℃以下で貯蔵する。

ある既知の方法は、ぶどうのカルスを１０℃が１５℃で
貯蔵することからなる。貯蔵寿命を増大するためにカル
スはその養分繕質上に残るがシリコン油の居をカルスに
加える。酵母や細胞に適用できるもう１つの方法は、細
胞を油状媒質を用いて水性混濁液にし水が過冷却のまま
であるように全体を−２０℃／−３０℃に冷却すること
からなる。このような油は細胞や酵母にスシして凍結防
止剤として作用する。

［課題を解決するための手段］ 本発明の目的は、培蕎基からｒｔｉ離した胚芽の戒長が
前もっ゛〔決定された時間に関して著しく遅くなり、次
いで、２次的な胚形成が現れずに回復するという植物胚
芽の保存方法を提供することである。

この目的のために、本発明による方法は、胚芽を冷却し
、問題の胚芽の低温感受性しきい値のわずかに上の温度
で貯蔵した後、油の層で被膜することによって低酸素症
のもとに雑持づることを特徴とする。

驚くべきことに、胚芽を低瀉の油の中で低酸素症のちと
に雑持することで、胚芽の或良が、部分的にロつ安定的
に、発月や戒長力に対して如何なる影響も与えず抑制さ
れ、それと同時に引き続ぎ起こる成長の間、胚芽の構造
の完全無欠の状態が明ル＜　Ｔ−ｔ）ＩＱ　！ＦＡ　”
Ｑ　モ、力ｌｍ　ケネシス（ｃａｌｌｏｇ！ｓ）や２次
的胚形成のような他のどんな形態形成の形Ｌあらわれず
に雑持されることがわかった。

言いかえれば、一方で、植物胚芽の保存のための本発明
による方法は、胚芽を形態的に完全無欠の状態に生き残
ることを河能にし、他方では、胚芽に右効に小植物を発
達させる能力を保持させることがでぎる。

従って、この方法での他の利点は、相対的に艮１０１間
胚芽を貯蔵づ゛ることをＤＪ能にすることである。

この方法の他の利点は高価な設備を必要としないで、容
易に入手できる温度（例えば冷蔵庫中の温度）で胚芽を
貯蔵可能にすることである。この発明の他の利点は、明
るくても暗くても素早く容易に行える方法を提仇するこ
とである。

本発明で使用する胚芽は、例えばにんじんやコーヒーの
木のような如何なる系統、種類でもよい。

胚芽は、休細胞胚芽や接合体胚對でよい。

休細胞胚芽は、未分化細胞の懸濁液から得られる。この
場合に、例えば、雑種の親の種子は無菌的に発穿する。

胚軸を切り、成長ホルモンを含む培地にのせる。そして
得られたカルスを液体培地中で解離する。これは、いく
つかの副次培養の後、細胞を培地に移すことが可能な未
分化細胞の懸濁液を生じさせる。１　０旧ＬＨ胞懸濁液
を濾過すると、求める大きさのＩＩＩ胞塊だけが残るー
。これらのｉ胞集合体を２−３日、ホルモンの入ってい
ない培地で培養して、胚芽の形戊を引きおこψ。

接合体胚芽は、成熟した、もしくはわずかに未成熟な段
階で、種子を解剖して見本をとると得られる。

体細胞胚芽と接合体胚芽ロ、その発達段階によって分類
できる。好ましい胚芽は、大きさが１５０〜ｉ　ｏｏｏ
μ園の間の初１１１１発達段階にあるものである。これ
らの大ぎさは、発達のハート（ｈｅａｒｔ　）またはト
ルベド（ｔｏｒｐｅｄｏ　）段階に相当する。

得られた胚芽を次いで例えば５ｇ／１のスクロースを含
Ｉυでいるムラシゲとスクーグ媒質のような胚芽培養で
典型的に出会う型の戒長ホルモンの入っていない液体培
ａｉ！で洗浄する。洗浄した胚芽を、それから培￥Ｍｆ
ｆｉに移し、例えばビベットによる残留培！ｉ塁の回収
によって乾燥する。

それから胚芽は油の層で被ｍして低酸素症のもとに維持
する。油は、低酸素症を引き起こす能力づなわら、もし
あっても、外部の酸素を胚井へ少ししか転移させない能
力により選択する。油は防腐剤として作用し、胚芽を生
存さじるのに必要な最低吊の酸素を胚芽に供給する。低
酸素症を維持するために用いる油は、鉱油や植物油、合
成油、その他の胚芽に対して毒にならず低酸素症を維持
で・きるどのような油であってもよい。使用される油は
好ましくは液体パラフィン油である。油は、あらかじめ
，例えばオートクレープで２０分間１１５℃で脱気およ
び／または殺菌する。

添加する油の社は、胚芽を完全に被覆するのに十分な量
がいる。油は、好ましくは胚芽当り０　．　０　２−０
　．　５　ｒｄ加える。

それから胚芽を問題の胚芽の低温感受性しきい値の丁度
土の温度まで冷却する。ａ（温感受性しきい値とは胚芽
がちはヤ生育ぐきないという温度のことである。胚芽を
冷却し、次いで貯藏づる温度は、数度、好ましくは低温
感受性しきい値以上である１−１　０℃である。

貯ｊａ温度は、例えば、にんじんのようにわずかに低温
感受性の種の胚芽に対しては２〜８℃、好ましくは３〜
５℃の間である。例えばコーヒーの木のような熱帝牲の
植物胚芽のように、低温感受性の胚芽に対しては、１２
−２０℃、好ましくは１　５　−　１　７℃の間である
。

胚井を、例えば胚芽を含むＩ８養皿を冷蔵庫や空調チｌ
ンパーに移して冷却する。冷７，Ｉ１速度はがなり早く
たとえば１分当り１〜３℃程度で・ある。

油中の低Ｍ索症下の胚芽は、弱光（２’００ルクス程度
〉もしくは暗黒中で貯蔵する。

本発明による方法は、暗黒で貯藏した胚芽の生育を保証
する。これは人工の種子が胚芽をカブＱルで包んで、後
に生産される場合に実川上の利点がある。これ（．Ｌ全
く残余の照明がカプセルの内側の胚穿に届かないことが
確かであると思われるからである。胚芽を比較的長期間
すなわち人体２〜４ヶ月このような状態の下で貯蔵でき
る。

貯蔵後、胚芽を冷蔵ルから取り出し周囲の温度に再加熱
する。胚芽が２０℃程度になったとき典型的な液体培養
も１で洗浄し、痕跡量の油を除去する。

それから胚芽をムラシグとスクーグ媒質のような代表的
な培地の中もしくは上に置き、そこで胚穿昧貯蔵しなか
った胚芽のそれに匹敵する通常の生育を取り戻づ。

苗床や畑での従来の秤まきをする目的で消費名に分配す
るために、天然の種子に匹敵する保護を与える、もっと
抵抗性のある物質の中に胚芽を包み込む。この場合、油
で被覆された胚芽を天然もしくは人工の重合体、例えば
アルギン酸ナトリウムのゲルの中に包み込む。これらの
カプセルは、胚芽に機械的および衛生学的保護を与え、
発芽の間中栄養分体に栄養を与えるために用いられる。

カプセルは、追加のフィルム、例えば水溶性樹ｆｌｉｔ
のフィルムで被われ、それは胚羽を破損や屹燥からある
程度保設寸る。この方法にＪ３いては、より長ｍ間すな
わち実際の利用に要求ざれる期間雑持づる人工種子を得
ることができる。

本発明は、以下の実施例でより詳しく説明リる、これら
の実施例は、体細胞胚拝の従来の調製の例、発芽テスト
の記述および使用した虹よしい培地の組成を示す、表１
によってはじまる。

［実施例］ 休ＩＩｌ胞胚芽の調製例 に／Ｖじ／ｖ細１ｔｄ　（Ｄａｕｃｕｓ　ｃａｒｏｔａ
　Ｌ．）の未分化細胞培養（１００ｎｅの媒体に対して
１９のバイオマス）は、１２日毎に２０’ｌ／１のスク
ロースど、０．　１１１９／１の２．４−ジク１］ロフ
ェノキシ酢酸を含むムラシゲとスクーグ液体培養Ｌ（に
ムン１次Ｉ８拾する。

全ての処理は層流のふたでおおった無ｘ１状態のもとで
行う。懸＋１１液をスターラーの上にのせ、１Ｑ　Ｑ　
ｒ．Ｐ．ｉの偏心回転運動をし、２３℃ｃ１６時間の明
＋１１１で２００ルクスの照明のもとに培ｉｔる。

８日〜１０日の培養後、細胞懸濁液を濾過すると５０〜
２００μ一め大きさの細胞集合体が残る。

これらの小さな集合体は、ハート（ｈｅａｒｔ　）　、
ｔ−ルベド（ｔＯｒｐｌｌｉｄＯ　）および小植物段階
に発育を続ける胚芽の前胚段階を表わづ。集合体を洗浄
し、１Ｉｄ媒体当り、ほぼ１．５Ｘ１０３集合体の槍で
２，４ジクＬ１１１フエノキシ酢酸を含まないムラシゲ
とスクーグ媒体中に難く。

１０日間の培養後、胚芽を形成した懸濁液を濾過リると
１５０〜１　０００μ一の大きさの胚芽のみが残る。

発芽テスト 素早く簡単な発芽テストを開発し冷凍後の胚芽の発割速
度を評価した。

胚芽の発芽速度を評価するのに使用される様々な判定基
準の中で、 胚芽の大きさの増大と クロロフィルの着色の出現 が特に適切である。

これらの判定基準は様々な方法、例えば目で見て数えた
り生物学的テスト（例えば着色テスト〉によって評価で
きる。

このテストの原理のもとで、胚芽は！ｌｌ！聖的な液体
もしくは半固体の培地の中に胃かれる。１０日間の培養
後、大きくなり、クロロフィルの着色の徴候を示す胚芽
の数を記録する。この数と存イｆ？１′る胚芽の総数の
比率は胚芽の発芽比率を決定ｉＪ能にする。

それから胚芽は、同じ液体媒質の上に維持するかもしく
は、前述の液体媒質と同じ組成の固体培地上に置かれ、
そのため小植物段階へ発育し続Ｇづる。この媒体上で１
０日間培＠後、転換レベル【よ小植物段階にまで発育し
た発芽の数ど、胚芽の全数との比率として決定される。

表　　１ ムラシゲとスクーグ媒体の組成（１）１１５．８−６）
人吊成分 Ｎ　ト１　４　　Ｎ　Ｏ　３ ＣａＣＡ　　−２目，Ｏ ２ ＭＱＳＯ　　　　　−７　　Ｆ１．２０４ ＫＮＯ３ Ｋｌ１２１）０４ ■１−１ １６５０ ４４０ ３７０ １９００ １７０ 小１ｄ戚分 ＣＯＣ１２ ｃｕｓｏ　　−５口，Ｏ ４ ＦｅＳＯ　　−７目，Ｏ ４ Ｎ　ａ　２　　　１：　Ｄ　’ｒ　Ａ ＭｎＳＯ　　−４口２０ ４ ＫＩ Ｎａ２Ｍ００４ ｚｎｓｏ　　−７口，Ｏ ４ ｉ−１３ＢＯ３ ０．０２５ ０．０２５ ２７，８ ３７．３ ２２，３ ０，８３ ０．２５ １０．６ ６．２ ほかの成分 ニコチンａ５ チアミン（ビタミンＢ１〉　　　　　　　　　５アデニ
ン　　　　　　　　　　　　　　　　　２スクロース　
　　　　　　　　　　　　　５０００実施例　１ 前述のように得られたトルベド（ｔｏｒｐｅｄｏ　）段
階の休細胞にんじん胚芽−（平均サイズ６−７０ｕｍ）
を液体のムラシゲとスクーグ培￥１基で洗浄した。

それから胚芽を１カップ当り２０／３０胚芽を含む６カ
ップからなる培養皿にのせ、ピペツ１・で液体を回収し
て少社の残余ｔ８１基を除去した。

胚芽の（Ａ）と（Ｂ）の２つの群は、あらかじめ、オー
トクレープで１１５℃、２０分間殺菌した流動パラフィ
ン油の層で被覆した。それから１一の油を５〜８の胚芽
に加えた。胚芽の２つのス・１照群（Ｃ）と（Ｄ）を液
体の培養暴で被覆した。

それから培？＆■にふたをして密封した。油中で低濱素
症のもとに胚芽の第１の群（Ａ）を４℃に冷却したチェ
ンバーの中に置いた。比較のために、油中で低酸素症の
下に第２の群（・Ｂ）を２３℃に維持した。低酸素症の
下ではない胚芽の第１の対照群（Ｃ）を４℃で貯蔵し、
一方第２の対照群（Ｄ）を２３℃で貯蔵した。

様々な群を２００ルクスの照明のもとに貯蔵した。

ある貯ｉａＩＸ１間の後に、胚芽を周聞の温度に再加熱
し、液体の培養基を培１１に可能な限り多数の胚芽を移
すために低酸素症のもとで胚芽をとりまく浦の胴の下側
に注入した。

′ｄ１１の廟を除去した後、胚芽を培Ｖ＆基の浴液で何
度ら連続しで洗浄し痕跡最の残留油を除去した。

貯蔵１１１１間中の胚オの大きさの進展は測定接眼レン
ズを備えた拡大鏡で大きさを測定しで観察した。

以下の結果が得られた。

２３℃で貯蔵した胚芽は、低酸素症のちとであろうとな
かろうと、かなり早く成育ずることがわかった。１４日
後これらの胚芽は３イ８以上の大きさになるのに反して
４℃で貯蔵した胚芽ｔよ、ほんとんど生育しなかった。

１０５日後油中で｛ｌｉ素症のらとに４℃で貯蔵した胚
芽は、まだ比較的小さいサイズであるのに反して培養基
中に４℃でＷ？蔵した対照胚芽は成育し続けた。

同時に、４℃で浦中で但酸素庁のらとでの貯蔵は、胚芽
の発＃に影響を及ぼすことがわかった。

この目的のため油の層がなく、周［ＩＪ！温度に再加熱
した胚芽を、ムラシゲとスクーグの液体１Ｂ　３’ｔ　
’；！．中でｉａｍした。

胚芽の発芽を液体媒体中でのその成育の再開や継続で評
価した。

１０日間の培養後、胚芽の発芽レベルを測定した。

以下の結果を得た。

発芽レベル： （成長再開の％で表示した。） しなかった。

４℃で貯蔵した対照胚芽もまた１０５日後良い発芽性を
示したが、そのあとｔまあまりに大きすぎて（約３３０
０μｍ）、重合体中にカブヒルて゛包ｂ込むことによる
貯蔵を可能κよらしめるに【よ大きすぎた。

液体媒質中で２０日間培養後、通常の小１ｉｌ′ｉ物に
発育した胚芽の数を測定した。

以下のような結果を得た： 転換度（成長した小植物の％で示した〉４℃で浦中に低
ｌｌｌ！ＩＩＭ症のもとで貯蔵した胚芽は１０５日の貯
蔵後、適正な発芽レベルを保持しているのに反して、２
３℃で低酸素症のもとに貯蔵した胚芽は３５日の貯蔵期
間後では、もはや発芽油中で低酸素症のもとに４℃で貯
蔵した胚芽は対照胚芽と全く同様に偶発的な増加を法ざ
ず生長し続けた。

４℃で油中に低酸素症のもとに維持し続【ノることによ
り体細胞胚芽の成長を部分的に抑制すること（ま、胚芽
の発芽や戒良を再開する能力に（よ影マ量を及ぼさ４Ｔ
かった。

実施例　２ 体ｍｔｎにんじｌυ胚芽（平均リ−イズ４６０μｍ）を
実施例１に記述した方法で４℃ぐ貯蔵した。胚芽（よ一
部は聞黒で貯蔵し、比較のために一部は２００ルクスの
照明のもとで貯蔵した。

貯蔵期間中胚芽の大さざの進展が観察された。

以トの結果が１ξｌられた。

胚封の大きさ（μｍ） 油中、低酸素症のもとに維持した胚芽は、照明下で貯蔵
したものであろうと皓黒で貯蔵したものであろうとほと
んど大きさの進展がないことがわかった。

胚芽の貯蔵中、光にさらすことは、その発芽に影響を示
さなかった。光の欠如は油巾の低酸素症と低潟の組み含
ね吐によって引き起こされる抑制の程度になんの影響も
ドｆだなかった。

実施例　３ 発育したｌ−ルペド（ｔｏｒｐｅｄｏ　＞段階のコーヒ
ーの木、ＣｏＨｅｅａ　ａｒａｂｉｃａの体細胞胚芽、
（平均サイズ１５９０μＩＩ１）を実施例１に記述した
方法で洗浄し培養皿上にむいた。

胚芽の３組（Ａ）．（Ｂ）．（Ｃ）を５から８胚芽につ
き、ぽぼ１ｄの油階の殺菌しｌ，：流動パラフィン油の
層で被覆した。３つの対照胚芽群はムラシゲとスクーグ
の液体媒ｖｘ　ｒ：被覆した。

油中、低酸素症のもとの胚芽の群八を４℃で貯蔵し、第
２の群Ｂは１０℃で第３の群Ｃは１５℃で貯蔵した。最
初の対照群は４℃で第２群は１０℃で第３群は１５゜Ｃ
で貯蔵した。

１カ月間これらの群を１１？４黒中におき、そして周１
１１１の調度に戻した。胚芽を実施例１に記述した方法
で洗浄し、次いでムラシゲとスクーグの半固体媒体士で
培養した。

１０日間の培養後、胚井の発芽程度を測定した。

以下の結果が得られた。

発芽程度（成長再聞％） 群Ｃ（１５’Ｃ）　　　８０ の種の低諷感受性しきい偵を究慮するごどが重公である
。

実施例　４ 允育したトルベド（ｔｏｒｐＱｄＯ　）段階の体細胞コ
ーヒーの木胚罰（平均サイズ１　５９０Ｌｔｍ　）を実
施例１に記述した方法で抽中但酸累庁のもとに１５℃で
ｌｌ？蔵した。

１〜２カ月の貯蔵後、胚芽を周［１１１温度に再加熱し
洗浄した。

貯蔵！１１間中、胚芽の大きさの進展が認められた。

以下の結果が得られた。

胚芽の大きさくμｍ） 対照（１５℃）８４ ４℃または１０℃で貯蔵した胚芽は茶色くなり油中恢酸
素症であろうとも液体培養基中であろうとも枯死するこ
とがわかった。

コーヒーの木の胚芽は温度１５℃で良好に雑持ざれる。

最低限の貯Ｒ温度を決定づる目的のために問題油中低酸
素症のもとの胚芽は対照胚芽より、非常にゆっくり成長
した。

胚芽の生存度は、半固体媒質中で１０日間培養後測定し
た。

油中低酸素症の下で２ケ月間貯蔵した胚芽に対しで１１
７０％で液体の培養基中で２ケ月間貯蔵した対照胚タに
対しては８４％であった。油層で胚芽を被覆することは
、このように、その生存度に深刻に影胃を及ぼすことな
く、その成長を右効に抑制づることを可能ならしめた。

実施例　５ 均リイズ１３２０μｍ）の体細胞コーヒーの木の胚芽台
実施例１に記述した方法でパラフィン浦中、低酸素症の
下、或いは、液体の培養）１中のどららかで１ケ月間１
５℃で暗黒に貯蔵した。

貯蔵後、胚芽を周囲温度に戻し、洗浄した。貯蔵＋１Ｊ
間の間の胚芽の大きざの発展を観察した。

以下の結果が得られた。

胚芽の大きさ（μＭ） 実施例４のようにレ１１中俄酸素症のｂどでの胚井は対
照胚芽より戒長が遅いことがわかった。

胚芽をムラシゲとスクーグの半固体媒体上で１０日間培
養しその後生存度を測定した。

以下の結果が得られた。

戊長じたハート（　ｈｅａｒｔ　）胚芽浦中、低酸素症 対照 １〜ルペド（Ｔｏｒｐｅｄｏ　）胚Ｍ 浦中　低酸素症 ヌ・１照 生存度（Ｘ） ７６ ８４ ７１ ９５

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. （１）胚芽を油の層で被覆することによつて低酸素症の
   もとに維持し次いで冷却して問題の胚芽の低温感受牲し
   きい値以上の温度で貯蔵することを特徴とする植物胚芽
   の保存方法。
2. （２）胚芽が体細胞胚芽であることを特徴とする請求項
   １記載の方法。
3. （３）低酸素症を保持する油が鉱油、植物起源の油又は
   合成油であることを特徴とする請求項１記載の方法。
4. （４）低酸素症を保持する油が流動パラフィン油である
   ことを特徴とする請求項３記載の方法。
5. （５）油に包まれて低酸素症のもとの胚芽が問題の胚芽
   の低温感受性しきい値以上の温度１〜１０℃で貯蔵され
   ることを特徴とする請求項１記載の方法。
6. （６）胚芽が暗黒に貯蔵されることを特徴とする請求項
   １記載の方法。
7. （７）胚芽が体細胞にんじん胚芽であって２〜８℃の温
   度で貯蔵されることを特徴とする請求項１記載の方法。
8. （８）胚芽が体細胞コーヒーの木胚芽であって１２〜２
   ０℃の温度で貯蔵されることを特徴とする請求項１記載
   の方法。
9. （９）油被覆された胚芽が天然又は人造重合体のカプセ
   ルに包まれることを特徴とする植物胚芽の保存方法。
10. （１０）請求項９に従つて得られる人工種子。