JPH06153960A - Ｃ型肝炎ウィルスのコア抗原タンパク質及びそれを用いての診断方法及びキット - Google Patents
Ｃ型肝炎ウィルスのコア抗原タンパク質及びそれを用いての診断方法及びキットInfo
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 ＤＮＡ分子、その分子により発現されるポリ
ペプチド及び診断へのそれらの使用並びにそれらの生成
方法に関する。 【構成】 ＨＣＶのヌクレオカプシド及び一部のエンベ
ロープ領域のゲノムに由来するＨＣＶコア抗原タンパク
質の抗原性を示すポリペプチド及びその変性配列をコー
ドするＤＮＡ分子に関する。
ペプチド及び診断へのそれらの使用並びにそれらの生成
方法に関する。 【構成】 ＨＣＶのヌクレオカプシド及び一部のエンベ
ロープ領域のゲノムに由来するＨＣＶコア抗原タンパク
質の抗原性を示すポリペプチド及びその変性配列をコー
ドするＤＮＡ分子に関する。
Description
【０００１】発明の技術分野 本発明は、ＤＮＡ分子、その分子により発現されるポリ
ペプチド及び診断へのそれらの使用並びにそれらの生成
方法に関する。より詳しくは、それはＣ型肝炎ウィルス
のための診断用ＤＮＡ分子、診断用タンパク質、診断用
抗体及び保護ポリペプチドに関する。
ペプチド及び診断へのそれらの使用並びにそれらの生成
方法に関する。より詳しくは、それはＣ型肝炎ウィルス
のための診断用ＤＮＡ分子、診断用タンパク質、診断用
抗体及び保護ポリペプチドに関する。
【０００２】発明の背景 輸血から生じる肝炎のほとんどの場合は、ウィルス誘発
され、そして既知の肝炎ウィルス、たとえばＡ型肝炎ウ
ィルス（ＨＡＶ）及びＢ型肝炎ウィルス（ＨＢＶ）によ
り引き起こされる他の形のウィルス関連肝臓疾患とは区
別できる。前記非−Ａ、非−Ｂ肝炎（ＮＡＮＢＨ）の病
因性物質は、多くの研究グループによりこれまでずっと
研究されており、そして現在、Ｃ型肝炎ウィルス（ＨＣ
Ｖ）と思われている。後輸血肝炎（ＰＴＨ）は輸血患者
の約１０％に生じ、そしてＮＡＮＢＨはそれらの患者の
９０％以上に発生する。この疾患における主問題は、慢
性肝臓損傷への頻繁な進行である（２５〜５０％）。従
って、汚染された血液又は血液製品におけるＨＣＶを検
出するための感度の高く且つ特異的な方法が要求されて
いる。
され、そして既知の肝炎ウィルス、たとえばＡ型肝炎ウ
ィルス（ＨＡＶ）及びＢ型肝炎ウィルス（ＨＢＶ）によ
り引き起こされる他の形のウィルス関連肝臓疾患とは区
別できる。前記非−Ａ、非−Ｂ肝炎（ＮＡＮＢＨ）の病
因性物質は、多くの研究グループによりこれまでずっと
研究されており、そして現在、Ｃ型肝炎ウィルス（ＨＣ
Ｖ）と思われている。後輸血肝炎（ＰＴＨ）は輸血患者
の約１０％に生じ、そしてＮＡＮＢＨはそれらの患者の
９０％以上に発生する。この疾患における主問題は、慢
性肝臓損傷への頻繁な進行である（２５〜５０％）。従
って、汚染された血液又は血液製品におけるＨＣＶを検
出するための感度の高く且つ特異的な方法が要求されて
いる。
【０００３】Ｃ型肝炎ウィルス（ＨＣＶ）は初め、分子
クローニング及びそのＲＮＡゲノムの特徴化によりＣｈ
ｏｏ，など．（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：３５９〜３６
２，１９８９）によって同定された。酵母において組換
えＤＮＡ法により合成された、Ｃ１００−３と命名され
た前記ＨＣＶ抗原を用いることによる特異的アッセイ
が、またＨＣＶの抗体の検出のために開発された（Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ ２４４：３６２〜３６４）。ＨＣＶのゲノ
ム、それに由来するｃＤＮＡ配列及び前記ＨＣＶゲノム
又はＨＣＶ ｃＤＮＡに由来するポリペプチド並びに方
法論に関する詳細な説明は、Ｃｈｉｒｏｎ Ｃｏｒｐｏ
ｒａｔｉｏｎの名でＥＰ第０３１８２１６号に記載され
ている。特にそのヨーロッパ特許は、ＨＣＶ抗体の検出
のために使用され得る、合成されたポリペプチド、すな
わち３６３個のウィルス性アミノ酸を含むＣ１００−３
を提供する。現在、Ｃ１００−３に基づくＨＣＶ抗体の
検出のためのキットは、Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｉｅｓにより商品化されている。
クローニング及びそのＲＮＡゲノムの特徴化によりＣｈ
ｏｏ，など．（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：３５９〜３６
２，１９８９）によって同定された。酵母において組換
えＤＮＡ法により合成された、Ｃ１００−３と命名され
た前記ＨＣＶ抗原を用いることによる特異的アッセイ
が、またＨＣＶの抗体の検出のために開発された（Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ ２４４：３６２〜３６４）。ＨＣＶのゲノ
ム、それに由来するｃＤＮＡ配列及び前記ＨＣＶゲノム
又はＨＣＶ ｃＤＮＡに由来するポリペプチド並びに方
法論に関する詳細な説明は、Ｃｈｉｒｏｎ Ｃｏｒｐｏ
ｒａｔｉｏｎの名でＥＰ第０３１８２１６号に記載され
ている。特にそのヨーロッパ特許は、ＨＣＶ抗体の検出
のために使用され得る、合成されたポリペプチド、すな
わち３６３個のウィルス性アミノ酸を含むＣ１００−３
を提供する。現在、Ｃ１００−３に基づくＨＣＶ抗体の
検出のためのキットは、Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｉｅｓにより商品化されている。
【０００４】上記ヨーロッパ特許に示唆されるように、
ＨＣＶはフラビウィルス又はフラビ様ウィルスである。
一般的に、形態学的には、フラビウィルスは脂質の二層
によりとり囲まれる中央ヌクレオキャプシドを含む。Ｃ
型肝炎ウィルスタンパク質は、ヌクレオキャプシド（コ
ア）タンパク質（Ｃ）及び２種のグリコシル化されたエ
ンベロープタンパク質（Ｅ１，Ｅ２）を含む構造タンパ
ク質及び非構造タンパク質（ＮＳ１−５）から成ると思
われる。しかしながら、その対応するウィルスはまだ単
離されても又は特徴づけられてもいない。Ｃｈｏｏな
ど．により開示された前記Ｃ１００−３はＨＣＶゲノム
の非構造領域３−４の部分によりコードされるタンパク
質であることのみが確かめられている。
ＨＣＶはフラビウィルス又はフラビ様ウィルスである。
一般的に、形態学的には、フラビウィルスは脂質の二層
によりとり囲まれる中央ヌクレオキャプシドを含む。Ｃ
型肝炎ウィルスタンパク質は、ヌクレオキャプシド（コ
ア）タンパク質（Ｃ）及び２種のグリコシル化されたエ
ンベロープタンパク質（Ｅ１，Ｅ２）を含む構造タンパ
ク質及び非構造タンパク質（ＮＳ１−５）から成ると思
われる。しかしながら、その対応するウィルスはまだ単
離されても又は特徴づけられてもいない。Ｃｈｏｏな
ど．により開示された前記Ｃ１００−３はＨＣＶゲノム
の非構造領域３−４の部分によりコードされるタンパク
質であることのみが確かめられている。
【０００５】さらに、酵素結合イムノソルベントアッセ
イ（ＥＬＩＳＡ）が、Ｃｈｉｂａ，など．（Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８８：４６４１〜
４６４５，１９９１）により、組換えバキュロウィルス
により合成されたＨＣＶコアタンパク質（ｐ２２）を用
いて、Ｃ型肝炎ウィルス（ＨＣＶ）感染の血清学的診断
のために開発された。Ｃ１００−３抗体は、たぶんＣ１
００−３抗原に対する遅延された応答のために、すべて
の後−輸血ＮＡＮＢＨ患者に検出されなかったことが見
出された。そのような遅延された応答は、Ｃ１００−３
がＨＣＶ非構造タンパク質である事実によると思われ
る。しかしながら、Ｃｈｉｂａなどは、グルコシル化さ
れていない２２−ＫＤａヌクレオカプシド（コア）タン
パク質を用い、そしてＨＣＶ感染を診断するための特異
的感受性の方法を開発するために抗体検出システムを確
立した。本発明は、ＨＣＶコアタンパク質をコードする
ＤＮＡ分子を開発し、そしてさらにＨＣＶ抗体アッセイ
手段を提供する。
イ（ＥＬＩＳＡ）が、Ｃｈｉｂａ，など．（Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８８：４６４１〜
４６４５，１９９１）により、組換えバキュロウィルス
により合成されたＨＣＶコアタンパク質（ｐ２２）を用
いて、Ｃ型肝炎ウィルス（ＨＣＶ）感染の血清学的診断
のために開発された。Ｃ１００−３抗体は、たぶんＣ１
００−３抗原に対する遅延された応答のために、すべて
の後−輸血ＮＡＮＢＨ患者に検出されなかったことが見
出された。そのような遅延された応答は、Ｃ１００−３
がＨＣＶ非構造タンパク質である事実によると思われ
る。しかしながら、Ｃｈｉｂａなどは、グルコシル化さ
れていない２２−ＫＤａヌクレオカプシド（コア）タン
パク質を用い、そしてＨＣＶ感染を診断するための特異
的感受性の方法を開発するために抗体検出システムを確
立した。本発明は、ＨＣＶコアタンパク質をコードする
ＤＮＡ分子を開発し、そしてさらにＨＣＶ抗体アッセイ
手段を提供する。
【０００６】発明の要約 従って、Ｃ型肝炎ウィルス（ＨＣＶ）コア抗原タンパク
質の抗原性を示すポリペプチドをコードするＤＮＡ分子
を供給することが本発明の目的である。さらに詳しく
は、本発明は、ＨＣＶのゲノムに由来するＤＮＡ分子を
供給する。そのＤＮＡ分子は、ポリメラーゼ鎖反応（Ｐ
ＣＲ）技法により、Ｃ型肝炎を有する患者の血漿からク
ローンされた。
質の抗原性を示すポリペプチドをコードするＤＮＡ分子
を供給することが本発明の目的である。さらに詳しく
は、本発明は、ＨＣＶのゲノムに由来するＤＮＡ分子を
供給する。そのＤＮＡ分子は、ポリメラーゼ鎖反応（Ｐ
ＣＲ）技法により、Ｃ型肝炎を有する患者の血漿からク
ローンされた。
【０００７】前記ＤＮＡ分子の一部は、サンプルにおけ
るウィルスの存在を検出するためのプローブとして有用
である。同様に、本発明のＤＮＡ分子は、ＨＣＶコア抗
原タンパク質の抗原性を示すウィルスポリペプチドを適
切な宿主に生成できる。
るウィルスの存在を検出するためのプローブとして有用
である。同様に、本発明のＤＮＡ分子は、ＨＣＶコア抗
原タンパク質の抗原性を示すウィルスポリペプチドを適
切な宿主に生成できる。
【０００８】ＨＣＶコア抗原タンパク質の抗原性を示す
ポリペプチドを供給することが本発明のもう１つの目的
である。前記ポリペプチドは、本発明のＤＮＡ分子によ
り形質転換された適切な宿主により生成される。
ポリペプチドを供給することが本発明のもう１つの目的
である。前記ポリペプチドは、本発明のＤＮＡ分子によ
り形質転換された適切な宿主により生成される。
【０００９】また、ＨＣＶコア抗原タンパク質の抗原性
を示すポリペプチドを生成するための方法を提供するこ
とも本発明の目的である。その方法は、本発明のＤＮＡ
分子を含む発現ベクターにより形質転換された宿主細胞
をインキュベートすることを含んで成る。
を示すポリペプチドを生成するための方法を提供するこ
とも本発明の目的である。その方法は、本発明のＤＮＡ
分子を含む発現ベクターにより形質転換された宿主細胞
をインキュベートすることを含んで成る。
【００１０】さらに、プローブとして前記ＨＣＶコア抗
原タンパク質を用いることによってサンプル中のＨＣＶ
抗体を検出するための方法を提供することが本発明のも
う１つの目的である。その方法は、抗原−抗体複合体を
形成するために、サンプル中のＨＣＶに対して向けられ
る抗体に結合できるプローブとして前記ＨＣＶコア抗原
を用いることによって特徴づけられるイムノアッセイ又
はウェスターンブロットにより実施され得る。
原タンパク質を用いることによってサンプル中のＨＣＶ
抗体を検出するための方法を提供することが本発明のも
う１つの目的である。その方法は、抗原−抗体複合体を
形成するために、サンプル中のＨＣＶに対して向けられ
る抗体に結合できるプローブとして前記ＨＣＶコア抗原
を用いることによって特徴づけられるイムノアッセイ又
はウェスターンブロットにより実施され得る。
【００１１】本発明はまた、プローブとしてＨＣＶ非構
造タンパク質と組合された前記ＨＣＶコア抗原タンパク
質を用いることによってサンプル中のＨＣＶ抗体を検出
するための方法を包含する。
造タンパク質と組合された前記ＨＣＶコア抗原タンパク
質を用いることによってサンプル中のＨＣＶ抗体を検出
するための方法を包含する。
【００１２】前記ＨＣＶコア抗原タンパク質を含んで成
る、サンプル中のＨＣＶ抗体の存在についてサンプルを
分析するためのキットを提供することが本発明のもう１
つの目的である。特に、ＨＣＶ抗体を検出するためのイ
ムノアッセイのためのキットは、前記ＨＣＶコア抗原タ
ンパク質及び適切な固相を含んで成る。
る、サンプル中のＨＣＶ抗体の存在についてサンプルを
分析するためのキットを提供することが本発明のもう１
つの目的である。特に、ＨＣＶ抗体を検出するためのイ
ムノアッセイのためのキットは、前記ＨＣＶコア抗原タ
ンパク質及び適切な固相を含んで成る。
【００１３】前記ＨＣＶコア抗原タンパク質に対して向
けられるモノクローナル及びポリクローナル抗体を供給
することが本発明のもう１つの目的である。また、前記
ＨＣＶコア抗原タンパク質により動物を免疫化すること
によって前記抗体を生成するための方法も、本発明に包
含される。サンプル中のＨＣＶを分析するための方法
が、その獲得抗体を用いることによって確立され得る。
けられるモノクローナル及びポリクローナル抗体を供給
することが本発明のもう１つの目的である。また、前記
ＨＣＶコア抗原タンパク質により動物を免疫化すること
によって前記抗体を生成するための方法も、本発明に包
含される。サンプル中のＨＣＶを分析するための方法
が、その獲得抗体を用いることによって確立され得る。
【００１４】本発明の免疫原性ポリペプチド又は不活性
化された調製物又は弱められたその調製物を含んで成
る、ＨＣＶ感染の保護のためのワクチンを供給すること
が本発明のさらにもう１つの目的である。本発明のこれ
らの及び他の目的、利点及び特徴は、次の特定の記載及
び実施例からさらに十分に理解されるであろう。
化された調製物又は弱められたその調製物を含んで成
る、ＨＣＶ感染の保護のためのワクチンを供給すること
が本発明のさらにもう１つの目的である。本発明のこれ
らの及び他の目的、利点及び特徴は、次の特定の記載及
び実施例からさらに十分に理解されるであろう。
【００１５】発明の特定の記載 本発明は、ＨＣＶコア抗原タンパク質の抗原性を示すポ
リペプチドをコードするＤＮＡ分子を供給する。そのＤ
ＮＡ分子は、ＨＣＶ感染された患者の血漿に存在する核
酸配列から単離され、そして患者の血漿からウィルス粒
子を単離し、そのウィルス核酸配列を抽出し、そして精
製し、そしてポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）を通して所
望するＤＮＡ分子をクローン化する段階を包含する。Ｐ
ＣＲ技法は、特定のプライマーを用いることによる選択
及び逆転写酵素を用いることによる増幅の段階を含んで
成る。ＰＣＲに使用されるプライマーは、次のものであ
る： （ｉ）５′−GGATCCATGAGCACAAATCCTAAACCT −３′及び （ii）５′−GAATTCGGTGTGCATGATCATGTCCGC −３′。
リペプチドをコードするＤＮＡ分子を供給する。そのＤ
ＮＡ分子は、ＨＣＶ感染された患者の血漿に存在する核
酸配列から単離され、そして患者の血漿からウィルス粒
子を単離し、そのウィルス核酸配列を抽出し、そして精
製し、そしてポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）を通して所
望するＤＮＡ分子をクローン化する段階を包含する。Ｐ
ＣＲ技法は、特定のプライマーを用いることによる選択
及び逆転写酵素を用いることによる増幅の段階を含んで
成る。ＰＣＲに使用されるプライマーは、次のものであ
る： （ｉ）５′−GGATCCATGAGCACAAATCCTAAACCT −３′及び （ii）５′−GAATTCGGTGTGCATGATCATGTCCGC −３′。
【００１６】クローンされたＤＮＡ分子は、同定のため
に起源のＨＣＶ粒子とのハイブリダイゼーションを受け
やすい。このようにして得られた分子は、ＥＮ−８０−
２と命名される。 分子ＥＮ−８０−２のＤＮＡ配列は
図１に示される。そのＤＮＡ分子は、ＨＣＶヌクレオカ
プシドのゲノムに由来し、そして６６０bpを有する。
に起源のＨＣＶ粒子とのハイブリダイゼーションを受け
やすい。このようにして得られた分子は、ＥＮ−８０−
２と命名される。 分子ＥＮ−８０−２のＤＮＡ配列は
図１に示される。そのＤＮＡ分子は、ＨＣＶヌクレオカ
プシドのゲノムに由来し、そして６６０bpを有する。
【００１７】ＤＮＡ分子の一部は、サンプル中のＨＣＶ
核酸の存在を診断するためにプローブとして有用であ
る。本発明のＤＮＡ分子は、発現ベクターを形成するた
めに適切なベクター中に挿入される。そのベクターは、
宿主細胞中で複製できるプラスミド、バクテリオファジ
又はいづれか他のＤＮＡ配列であり得る。好ましいベク
ターは、プロモーターｌａｃを有するプラスミドであ
る。図２に関しては、ビークルプラスミド及び本発明の
ＤＮＡ分子により構成される発現プラスミド、ｐＥＮ−
２が図２に示される。
核酸の存在を診断するためにプローブとして有用であ
る。本発明のＤＮＡ分子は、発現ベクターを形成するた
めに適切なベクター中に挿入される。そのベクターは、
宿主細胞中で複製できるプラスミド、バクテリオファジ
又はいづれか他のＤＮＡ配列であり得る。好ましいベク
ターは、プロモーターｌａｃを有するプラスミドであ
る。図２に関しては、ビークルプラスミド及び本発明の
ＤＮＡ分子により構成される発現プラスミド、ｐＥＮ−
２が図２に示される。
【００１８】適切な宿主が、本発明のＤＮＡ分子を含む
発現ベクターにより形質転換され、そしてＨＣＶコア抗
原タンパク質の抗原性を示すポリペプチドがその形質転
換された宿主に生成され得る。ＨＣＶコア抗原タンパク
質の抗原性を示すポリペプチドを生成するための方法が
確立された。
発現ベクターにより形質転換され、そしてＨＣＶコア抗
原タンパク質の抗原性を示すポリペプチドがその形質転
換された宿主に生成され得る。ＨＣＶコア抗原タンパク
質の抗原性を示すポリペプチドを生成するための方法が
確立された。
【００１９】本発明はまた、ＨＣＶコア抗原タンパク質
の抗原性を示すポリペプチドも供給する。そのポリペプ
チドのアミノ酸配列は、図１に示される。そのポリペプ
チドは、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミド
ゲルを通しての電気泳動により測定される場合、約２
５，０００の分子量を有し、そして約２２０個のアミノ
酸を有することが推定される。その得られたポリペプチ
ドのＨＣＶ抗体への結合能力は、ウェスターンブロット
により確かめられる。明らかに、そのポリペプチドは、
Ｃ型肝炎を有する患者の血清と反応性であるが、しかし
Ｃ型肝炎を有さない人の血清とは反応性でない。この事
実は、サンプルにおけるＨＣＶ抗体の存在を検出できる
ポリペプチドがＣ型肝炎の診断において可能性を有する
ことを示唆する。さらに、ＨＣＶコア抗原タンパク質の
抗原性を示すポリペプチド又はその不活性化された調製
物又は弱められた調製物の免疫学的有効量が、ＨＣＶ感
染の防止のためにワクチンとして配合され得る。
の抗原性を示すポリペプチドも供給する。そのポリペプ
チドのアミノ酸配列は、図１に示される。そのポリペプ
チドは、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミド
ゲルを通しての電気泳動により測定される場合、約２
５，０００の分子量を有し、そして約２２０個のアミノ
酸を有することが推定される。その得られたポリペプチ
ドのＨＣＶ抗体への結合能力は、ウェスターンブロット
により確かめられる。明らかに、そのポリペプチドは、
Ｃ型肝炎を有する患者の血清と反応性であるが、しかし
Ｃ型肝炎を有さない人の血清とは反応性でない。この事
実は、サンプルにおけるＨＣＶ抗体の存在を検出できる
ポリペプチドがＣ型肝炎の診断において可能性を有する
ことを示唆する。さらに、ＨＣＶコア抗原タンパク質の
抗原性を示すポリペプチド又はその不活性化された調製
物又は弱められた調製物の免疫学的有効量が、ＨＣＶ感
染の防止のためにワクチンとして配合され得る。
【００２０】サンプル中のＨＣＶ抗体を検出するための
方法が、本発明に包含される。その方法は、プローブと
してＨＣＶ抗体に結合するＨＣＶコア抗原タンパク質の
能力により特徴づけられる。その方法は、イムノアッセ
イ又はウェスターンブロットにより実施され得る。好ま
しい方法は、固相イムノアッセイである。固相、たとえ
ばマイクロリッタープレート、ビーズ及び半透膜がその
イムノアッセイを行なうために使用され得る。ラベルと
しての物質は、酵素、同位体、螢光材料及び直接的に検
出され得るいづれか他の材料を包含する。イムノアッセ
イは便利には、サンドイッチ法により達成される。特
に、酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）
が確立された。ＥＬＩＳＡは、１）固相上にプローブと
して本発明のポリペプチドを被覆し、２）抗原−抗体複
合体の形成を可能にする条件下で前記固相上に被覆され
たポリペプチドと共にＨＣＶ抗体を含むと思われるサン
プルをインキュベートし、３）前記固相に結合されたそ
の抗原−抗体複合体により捕獲されるべきラベルにより
接合される抗−抗体（たとえば抗−ＩｇＧ）を添加し、
そして４）その捕獲されたラベルを測定し、そしてサン
プルがＨＣＶ抗体を有するかどうかを決定することを含
んで成る。
方法が、本発明に包含される。その方法は、プローブと
してＨＣＶ抗体に結合するＨＣＶコア抗原タンパク質の
能力により特徴づけられる。その方法は、イムノアッセ
イ又はウェスターンブロットにより実施され得る。好ま
しい方法は、固相イムノアッセイである。固相、たとえ
ばマイクロリッタープレート、ビーズ及び半透膜がその
イムノアッセイを行なうために使用され得る。ラベルと
しての物質は、酵素、同位体、螢光材料及び直接的に検
出され得るいづれか他の材料を包含する。イムノアッセ
イは便利には、サンドイッチ法により達成される。特
に、酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）
が確立された。ＥＬＩＳＡは、１）固相上にプローブと
して本発明のポリペプチドを被覆し、２）抗原−抗体複
合体の形成を可能にする条件下で前記固相上に被覆され
たポリペプチドと共にＨＣＶ抗体を含むと思われるサン
プルをインキュベートし、３）前記固相に結合されたそ
の抗原−抗体複合体により捕獲されるべきラベルにより
接合される抗−抗体（たとえば抗−ＩｇＧ）を添加し、
そして４）その捕獲されたラベルを測定し、そしてサン
プルがＨＣＶ抗体を有するかどうかを決定することを含
んで成る。
【００２１】他のアッセイ法は、プローブとしてＨＣＶ
非構造タンパク質と組合される本発明のポリペプチドを
用いることによって実施され得る。そのアッセイは、よ
り特異的で且つ高い感度を有すると思われる。
非構造タンパク質と組合される本発明のポリペプチドを
用いることによって実施され得る。そのアッセイは、よ
り特異的で且つ高い感度を有すると思われる。
【００２２】本発明は、さらにＨＣＶ抗体の存在につい
てサンプルを分析するためのキットを提供する。そのキ
ットは、本発明のポリペプチド及び適切な固相（ここ
で、好ましくは、前記ポリペプチドは前記固相に被覆さ
れる）を含んで成る。
てサンプルを分析するためのキットを提供する。そのキ
ットは、本発明のポリペプチド及び適切な固相（ここ
で、好ましくは、前記ポリペプチドは前記固相に被覆さ
れる）を含んで成る。
【００２３】本発明は、前記ＨＣＶコア抗原タンパク質
に対して向けられるモノクローナル及びポリクローナル
抗体を提供する。その抗体は、ハイブリドーマを調製す
るための標準の方法及び／又は従来の方法を通して、免
疫源として本発明のポリペプチドを用いることによって
調製される。得られた抗体は、ＨＣＶを検出するための
方法を開発する可能性を有する。次の例は例示的であっ
て、本発明を限定するものではない。
に対して向けられるモノクローナル及びポリクローナル
抗体を提供する。その抗体は、ハイブリドーマを調製す
るための標準の方法及び／又は従来の方法を通して、免
疫源として本発明のポリペプチドを用いることによって
調製される。得られた抗体は、ＨＣＶを検出するための
方法を開発する可能性を有する。次の例は例示的であっ
て、本発明を限定するものではない。
【００２４】
例 Ｉ．ＨＣＶ ｃＤＮＡのクローニング Ｃ型肝炎ウィルスにより感染された患者の血漿を集め、
そして４℃で超遠心分離し、そして次にウィルス粒子を
得る。続いて、ウィルス核酸（ＲＮＡ）を、ウィルス粒
子からグアニジンイソチオシアネート及び酸性フェノー
ルを用いて抽出し、そして精製する。
そして４℃で超遠心分離し、そして次にウィルス粒子を
得る。続いて、ウィルス核酸（ＲＮＡ）を、ウィルス粒
子からグアニジンイソチオシアネート及び酸性フェノー
ルを用いて抽出し、そして精製する。
【００２５】このようにして得られた核酸は、ポリメラ
ーゼ鎖反応（ＰＣＲ）を受けやすい。ｃＤＮＡ分子を前
記ＰＣＲによりクローン化し、ここで次のオリゴヌクレ
オチド配列がプライマーとして使用され： （ｉ）５′−GGATCCATGAGCACAAATCCTAAACCT −３′及び （ii）５′−GAATTCGGTGTGCATGATCATGTCCGC −３′ そしてそのクローン化されたＤＮＡを、逆転写酵素を用
いて増幅する。
ーゼ鎖反応（ＰＣＲ）を受けやすい。ｃＤＮＡ分子を前
記ＰＣＲによりクローン化し、ここで次のオリゴヌクレ
オチド配列がプライマーとして使用され： （ｉ）５′−GGATCCATGAGCACAAATCCTAAACCT −３′及び （ii）５′−GAATTCGGTGTGCATGATCATGTCCGC −３′ そしてそのクローン化されたＤＮＡを、逆転写酵素を用
いて増幅する。
【００２６】クローン化されたＤＮＡ分子は、同定のた
めに起源のＨＣＶ粒子によるハイブリダイゼーションを
受けやすい。得られた分子を、ＥＮ−８０−２と命名す
る。分子ＥＮ−８０−２のＤＮＡ分子は図１に示され
る。ＤＮＡ分子は、ＨＣＶヌクレオカプシド及びエンベ
ロープのゲノムに由来し、そして６６０bpを有する。
めに起源のＨＣＶ粒子によるハイブリダイゼーションを
受けやすい。得られた分子を、ＥＮ−８０−２と命名す
る。分子ＥＮ−８０−２のＤＮＡ分子は図１に示され
る。ＤＮＡ分子は、ＨＣＶヌクレオカプシド及びエンベ
ロープのゲノムに由来し、そして６６０bpを有する。
【００２７】II．ＨＣＶ ｃＤＮＡを含むプラスミドの
構成 分子ＥＮ−８０−２を、前記ＨＣＶ ｃＤＮＡを含むト
ランスポゾンを得るために制限エンドヌクレアーゼＢａ
ｍＨＩ及びＥｃｏＲＩにより処理する。得られたトラン
スポゾンを、ｐＥＮ−２と命名される発現プラスミドを
得るために制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩ及びＥｃ
ｏＲＩにより初めに切断されたプラスミド中に挿入す
る。ＨＣＶ ｃＤＮＡの発現はプロモーターｌａｃの制
御下にある。その発現プラスミドｐＥＮ−２の構造及び
制限地図は図２に示される。
構成 分子ＥＮ−８０−２を、前記ＨＣＶ ｃＤＮＡを含むト
ランスポゾンを得るために制限エンドヌクレアーゼＢａ
ｍＨＩ及びＥｃｏＲＩにより処理する。得られたトラン
スポゾンを、ｐＥＮ−２と命名される発現プラスミドを
得るために制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩ及びＥｃ
ｏＲＩにより初めに切断されたプラスミド中に挿入す
る。ＨＣＶ ｃＤＮＡの発現はプロモーターｌａｃの制
御下にある。その発現プラスミドｐＥＮ−２の構造及び
制限地図は図２に示される。
【００２８】III ．Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）の形質転
換 発現プラスミドｐＥＮ−２を、Ｅ．コリＪＭ１０９（Ｄ
Ｅ３）と共に３７℃で一晩インキュベートする。ＨＣＶ
コア抗原タンパク質を生成するＥ．コリコロニーを、ウ
ェスターンブロットによりそれらの発現生成物をスクリ
ーンすることによって選択する。
換 発現プラスミドｐＥＮ−２を、Ｅ．コリＪＭ１０９（Ｄ
Ｅ３）と共に３７℃で一晩インキュベートする。ＨＣＶ
コア抗原タンパク質を生成するＥ．コリコロニーを、ウ
ェスターンブロットによりそれらの発現生成物をスクリ
ーンすることによって選択する。
【００２９】IV．ＨＣＶコア抗原の生成 形質転換されたＥ．コリコロニーを、ならし培地におい
てインキュベートする。コロニーを遠心分離し、そして
凍結−解凍サイクル及び酵素消化により溶解する。その
タンパク質生成物をその溶解された細胞により開放し、
そしてクロマトグラフィーにより精製する。得られたポ
リペプチドの純度は９０％以上である。ポリペプチド
は、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル
を通しての電気泳動により測定される場合、約２５，０
００の分子量を有する。
てインキュベートする。コロニーを遠心分離し、そして
凍結−解凍サイクル及び酵素消化により溶解する。その
タンパク質生成物をその溶解された細胞により開放し、
そしてクロマトグラフィーにより精製する。得られたポ
リペプチドの純度は９０％以上である。ポリペプチド
は、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル
を通しての電気泳動により測定される場合、約２５，０
００の分子量を有する。
【００３０】Ｖ．ウェスターンブロットによるＨＣＶ抗
体とＨＣＶコア抗原タンパク質との免疫学的反応性 精製されたポリペプチドは、標準方法によるＳＤＳ電気
泳動を受けやすい。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを脱イオン水
により４℃で１５分間洗浄し、そしてブロット用緩衝液
（０．１５Ｍのリン酸ナトリウム緩衝液、pH６．７）に
より４℃で２０分間洗浄する。次に、ゲル上のペプチド
地図を、ブロット用緩衝液下でニトロセルロース紙上に
１．３Ａで１〜１．５時間、エレクトロブロットする。
その紙を洗浄用緩衝液（ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０，pH
７．４）により洗浄し、そしてブロッキング緩衝液
（０．１ＭのＮａＣｌ、５mMのＥＤＴＡ、５０mMのトリ
ス、pH７．２〜７．４、０．２％のウシ胎児血清アルブ
ミン、０．０５％のＮｏｎｉｄｅｔ ｐ−４０、１Ｍの
尿素）により一晩ブロックする。
体とＨＣＶコア抗原タンパク質との免疫学的反応性 精製されたポリペプチドは、標準方法によるＳＤＳ電気
泳動を受けやすい。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを脱イオン水
により４℃で１５分間洗浄し、そしてブロット用緩衝液
（０．１５Ｍのリン酸ナトリウム緩衝液、pH６．７）に
より４℃で２０分間洗浄する。次に、ゲル上のペプチド
地図を、ブロット用緩衝液下でニトロセルロース紙上に
１．３Ａで１〜１．５時間、エレクトロブロットする。
その紙を洗浄用緩衝液（ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０，pH
７．４）により洗浄し、そしてブロッキング緩衝液
（０．１ＭのＮａＣｌ、５mMのＥＤＴＡ、５０mMのトリ
ス、pH７．２〜７．４、０．２％のウシ胎児血清アルブ
ミン、０．０５％のＮｏｎｉｄｅｔ ｐ−４０、１Ｍの
尿素）により一晩ブロックする。
【００３１】前記紙と、初めに４０％ ＮＢＢＳ／トリ
ス−ＨＣｌ（pH７．４）により１０倍に希釈されたＣ型
肝炎を有するか又は有さない対象の血清とを４０℃で２
時間反応せしめる。その反応の後、紙を洗浄用緩衝液に
より３度洗浄する。前記紙と抗−ｈＩｇＧ：ＨＲＰＯ接
合体（この後に記載されるようにして調製される）とを
４０℃で２時間、反応せしめる。その反応の後、紙を洗
浄用緩衝液により３度洗浄し、そして次に１０mlの基質
溶液（０．０１％の４−ｅｔｈｌｏｒｏ−１−Ｎａｐｔ
ｈｏｌ、１８％のメタノール、０．０４Ｍのトリス、pH
７．２〜７．４、０．１ＭのＮａＣｌ及び０．０１％の
Ｈ2 Ｏ2 ）と２０分間反応せしめる。本発明のポリペプ
チドは、ＨＣＶにより感染された患者の血清と反応性で
あるが、しかし健康な人の血清とは反応性でない。
ス−ＨＣｌ（pH７．４）により１０倍に希釈されたＣ型
肝炎を有するか又は有さない対象の血清とを４０℃で２
時間反応せしめる。その反応の後、紙を洗浄用緩衝液に
より３度洗浄する。前記紙と抗−ｈＩｇＧ：ＨＲＰＯ接
合体（この後に記載されるようにして調製される）とを
４０℃で２時間、反応せしめる。その反応の後、紙を洗
浄用緩衝液により３度洗浄し、そして次に１０mlの基質
溶液（０．０１％の４−ｅｔｈｌｏｒｏ−１−Ｎａｐｔ
ｈｏｌ、１８％のメタノール、０．０４Ｍのトリス、pH
７．２〜７．４、０．１ＭのＮａＣｌ及び０．０１％の
Ｈ2 Ｏ2 ）と２０分間反応せしめる。本発明のポリペプ
チドは、ＨＣＶにより感染された患者の血清と反応性で
あるが、しかし健康な人の血清とは反応性でない。
【００３２】VI．ＨＣＶ抗体についてのＥＬＩＳＡ （１）マイクロリッタープレートの処理 マイクロリッタープレートを、本発明の精製されたポリ
ペプチドにより適切な濃度で被覆し、そしてウシ血清ア
ルブミンを含む緩衝液によりブロックする。その処理さ
れたマイクロリッタープレートを、２〜８℃で貯蔵す
る。
ペプチドにより適切な濃度で被覆し、そしてウシ血清ア
ルブミンを含む緩衝液によりブロックする。その処理さ
れたマイクロリッタープレートを、２〜８℃で貯蔵す
る。
【００３３】（２）抗−ｈＩｇＧ：ＨＲＰＯ接合体の調
製 精製された抗−ヒト免疫グロブリンＧ（抗−ｈＩｇＧ）
を、ホースラディシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）に
より接合し、抗−ｈＩｇＧ：ＨＲＰＯ接合体を得る。そ
の接合体をクロマトグラフィーにより精製する。
製 精製された抗−ヒト免疫グロブリンＧ（抗−ｈＩｇＧ）
を、ホースラディシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）に
より接合し、抗−ｈＩｇＧ：ＨＲＰＯ接合体を得る。そ
の接合体をクロマトグラフィーにより精製する。
【００３４】（３）試薬の成分 （ａ）洗浄用溶液：０．９％ ＮａＣｌ及びＴｈｉｍｅ
ｒｏｓａｌを含むリン酸緩衝液。 （ｂ）抗−ｈＩｇＧ：ＨＲＰＯ接合体溶液：タンパク質
安定剤及び防腐薬を含むトリス緩衝液に溶解された上記
のようにして調製された抗−ｈＩｇＧ：ＨＲＰＯ接合
体。 （ｃ）サンプル希釈剤：タンパク質安定剤及び防腐薬を
含むトリス緩衝液。 （ｄ）ＯＰＤ基質溶液：Ｈ2 Ｏ2 を含むクエン酸塩−リ
ン酸塩緩衝液に溶解されたｏ−フェニレンジアミン（Ｏ
ＰＤ）（その溶液がオレンジ色になる場合、その溶液は
汚染され、そしてこれ以上使用され得ないことを意味す
る）。 （ｅ）停止溶液：２Ｎの硫酸溶液。 （ｆ）陽性／陰性の対照：適切な濃度でタンパク質安定
剤及び防腐剤を含むリン酸緩衝液により希釈されたＣ型
肝炎を有する又は有さない人の血清サンプル。
ｒｏｓａｌを含むリン酸緩衝液。 （ｂ）抗−ｈＩｇＧ：ＨＲＰＯ接合体溶液：タンパク質
安定剤及び防腐薬を含むトリス緩衝液に溶解された上記
のようにして調製された抗−ｈＩｇＧ：ＨＲＰＯ接合
体。 （ｃ）サンプル希釈剤：タンパク質安定剤及び防腐薬を
含むトリス緩衝液。 （ｄ）ＯＰＤ基質溶液：Ｈ2 Ｏ2 を含むクエン酸塩−リ
ン酸塩緩衝液に溶解されたｏ−フェニレンジアミン（Ｏ
ＰＤ）（その溶液がオレンジ色になる場合、その溶液は
汚染され、そしてこれ以上使用され得ないことを意味す
る）。 （ｅ）停止溶液：２Ｎの硫酸溶液。 （ｆ）陽性／陰性の対照：適切な濃度でタンパク質安定
剤及び防腐剤を含むリン酸緩衝液により希釈されたＣ型
肝炎を有する又は有さない人の血清サンプル。
【００３５】（４）方法： （ａ）サンプル希釈剤により希釈された（１：１０）試
験サンプル１５０μｌ及び陽性／陰性の対照を、処理さ
れたマイクロリッタープレートのウェル中に添加する。
いくつかのウェルは、基質ブランクとして保持されるべ
きである。 （ｂ）前記プレートを振盪により軽く混合し、そして３
７〜４０℃で１時間インキュベートする。 （ｃ）プレートをウェル当たり３mlの洗浄用溶液により
３度洗浄する。 （ｄ）抗−ｈＩｇＧ：ＨＲＰＯ接合体溶液１００μｌを
個々のウェルに添加する。 （ｅ）プレートを３７〜４０℃で３０分間、振盪しなが
らインキュベートする。 （ｆ）プレートを５度洗浄する。 （ｇ）ＯＰＤ基質溶液１００μｌを個々のウェルに添加
し、そしてプレートを１５〜３０℃で３０分間、暗室で
インキュベートする。 （ｈ）停止溶液１００μｌを個々のウェルに添加し、そ
して軽く混合し、反応を停止する。 （ｉ）ウェル当たりのＯＤ値を、４９２nmで分光計によ
り測定する。
験サンプル１５０μｌ及び陽性／陰性の対照を、処理さ
れたマイクロリッタープレートのウェル中に添加する。
いくつかのウェルは、基質ブランクとして保持されるべ
きである。 （ｂ）前記プレートを振盪により軽く混合し、そして３
７〜４０℃で１時間インキュベートする。 （ｃ）プレートをウェル当たり３mlの洗浄用溶液により
３度洗浄する。 （ｄ）抗−ｈＩｇＧ：ＨＲＰＯ接合体溶液１００μｌを
個々のウェルに添加する。 （ｅ）プレートを３７〜４０℃で３０分間、振盪しなが
らインキュベートする。 （ｆ）プレートを５度洗浄する。 （ｇ）ＯＰＤ基質溶液１００μｌを個々のウェルに添加
し、そしてプレートを１５〜３０℃で３０分間、暗室で
インキュベートする。 （ｈ）停止溶液１００μｌを個々のウェルに添加し、そ
して軽く混合し、反応を停止する。 （ｉ）ウェル当たりのＯＤ値を、４９２nmで分光計によ
り測定する。
【００３６】（５）決定：ウェル当たりのＯＤ492 nm値
は、ブランク（バックグラウンド）の読取りの平均を引
き算する。陽性対照（ＰＣx ）の読取りの平均と陰性対
照（ＮＣx ）の読取りの平均との間の差異（ＰＣx −Ｎ
Ｃx ）は、０．５に等しいか又はそれ以上である。
は、ブランク（バックグラウンド）の読取りの平均を引
き算する。陽性対照（ＰＣx ）の読取りの平均と陰性対
照（ＮＣx ）の読取りの平均との間の差異（ＰＣx −Ｎ
Ｃx ）は、０．５に等しいか又はそれ以上である。
【００３７】カット−オフ（ＣＯ）他は、次の式により
計算される： ＣＯ＝ＰＣx ×０．１５＋ＮＣx 試験サンプルの読取りがＣＯ値以下である場合、サンプ
ルは陰性であると思われる（すなわち、ＨＣＶ抗体はサ
ンプルに検出されない）。
計算される： ＣＯ＝ＰＣx ×０．１５＋ＮＣx 試験サンプルの読取りがＣＯ値以下である場合、サンプ
ルは陰性であると思われる（すなわち、ＨＣＶ抗体はサ
ンプルに検出されない）。
【００３８】試験サンプルの読取りがＣＯ値に等しいか
又はそれ以上である場合、サンプルは陽性であることが
予測されるが；しかしながら、サンプルについてのアッ
セイを二重反復する必要がある。いづれかの二重反復サ
ンプルの読取りがＣＯ値以下である場合、サンプルは陰
性であろう。二重反復サンプルがＣＯ値以上か又はそれ
に等しい場合、それらのサンプルは陽性であろう。
又はそれ以上である場合、サンプルは陽性であることが
予測されるが；しかしながら、サンプルについてのアッ
セイを二重反復する必要がある。いづれかの二重反復サ
ンプルの読取りがＣＯ値以下である場合、サンプルは陰
性であろう。二重反復サンプルがＣＯ値以上か又はそれ
に等しい場合、それらのサンプルは陽性であろう。
【００３９】試験サンプルの読取りがＮＣx 以上である
が、しかしＣＯ値よりも２０％低い場合、そのサンプル
は疑わしいサンプルとして見なされるべきであり、そし
てアッセイをサンプルについてくり返えすべきである。
が、しかしＣＯ値よりも２０％低い場合、そのサンプル
は疑わしいサンプルとして見なされるべきであり、そし
てアッセイをサンプルについてくり返えすべきである。
【００４０】２７種のサンプルを、本発明に従ってＥＬ
ＩＳＡにより試験した。同時に、サンプルをまた、プロ
ーブとしてＣ１００−３を用いることによってＨＣＶ抗
体アッセイにより試験した（すなわちＡｂｂｏｔｔ’ｓ
キット（II））。Ａｂｂｏｔｔ’ｓキットの試験結果と
本発明のアッセイの試験結果との間の比較を、表１に示
す。サンプルＧ２２９の結果はＡｂｂｏｔｔ’ｓキット
（II）により陰性であるが、しかし本発明のアッセイに
よれば陽性であることが注目される。ＨＣＶにより感染
されたサンプルはＡｂｂｏｔｔ’ｓアッセイによりすべ
て検出され得ないことが示唆される。
ＩＳＡにより試験した。同時に、サンプルをまた、プロ
ーブとしてＣ１００−３を用いることによってＨＣＶ抗
体アッセイにより試験した（すなわちＡｂｂｏｔｔ’ｓ
キット（II））。Ａｂｂｏｔｔ’ｓキットの試験結果と
本発明のアッセイの試験結果との間の比較を、表１に示
す。サンプルＧ２２９の結果はＡｂｂｏｔｔ’ｓキット
（II）により陰性であるが、しかし本発明のアッセイに
よれば陽性であることが注目される。ＨＣＶにより感染
されたサンプルはＡｂｂｏｔｔ’ｓアッセイによりすべ
て検出され得ないことが示唆される。
【００４１】
【表１】
【００４２】VII ．ＨＣＶ非構造タンパク質と組合され
たＨＣＶコア抗原タンパク質によるＨＣＶ抗体の検出 この方法は、上記ＥＬＩＳＡに類似するが、しかしＨＣ
Ｖ非構造タンパク質と組合された（１：９）本発明のＨ
ＣＶコア抗原タンパク質がプレート上に被覆されるべき
ＨＣＶコア抗原タンパク質と交換されている。
たＨＣＶコア抗原タンパク質によるＨＣＶ抗体の検出 この方法は、上記ＥＬＩＳＡに類似するが、しかしＨＣ
Ｖ非構造タンパク質と組合された（１：９）本発明のＨ
ＣＶコア抗原タンパク質がプレート上に被覆されるべき
ＨＣＶコア抗原タンパク質と交換されている。
【００４３】２４種のサンプルを上記方法により試験し
た。同時に、サンプルをまたＡｂｂｏｔｔ’ｓキット
（II）により試験した。結果は下記表２に示される。Ａ
ｂｂｏｔｔ’ｓアッセイの結果は上記方法と同じである
ことが示唆される。
た。同時に、サンプルをまたＡｂｂｏｔｔ’ｓキット
（II）により試験した。結果は下記表２に示される。Ａ
ｂｂｏｔｔ’ｓアッセイの結果は上記方法と同じである
ことが示唆される。
【００４４】
【表２】
【００４５】本発明の１つの態様のみがここに記載され
ているが、その修飾が当業者により容易に行なわれ得る
であろう。従って、本明細書に言及される修飾及び本発
明の範囲内でのすべての他の修飾は、本発明の特許請求
の範囲内に包含される。
ているが、その修飾が当業者により容易に行なわれ得る
であろう。従って、本明細書に言及される修飾及び本発
明の範囲内でのすべての他の修飾は、本発明の特許請求
の範囲内に包含される。
【図１】これは、本発明のＨＣＶヌクレオカプシド領域
及び一部のエンベロープ領域のゲノムに由来するＤＮＡ
配列及びそこにコードされるポリペプチドのアミノ酸配
列を示す。
及び一部のエンベロープ領域のゲノムに由来するＤＮＡ
配列及びそこにコードされるポリペプチドのアミノ酸配
列を示す。
【図２】これは、ＨＣＶコア抗原タンパク質をコードす
るｃＤＮＡをプラスミド中に挿入することによって構成
される発現ベクター、ｐＥＮ−２の構造を示す。この図
はまた、ベクターｐＥＮ−２の有意な特徴を示す制限地
図も示す。
るｃＤＮＡをプラスミド中に挿入することによって構成
される発現ベクター、ｐＥＮ−２の構造を示す。この図
はまた、ベクターｐＥＮ−２の有意な特徴を示す制限地
図も示す。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成５年５月２５日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】請求項５
【補正方法】変更
【補正内容】
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】請求項１９
【補正方法】変更
【補正内容】
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２０
【補正方法】変更
【補正内容】
【００２０】サンプル中のＨＣＶ抗体を検出するための
方法が、本発明に包含される。その方法は、プローブと
してＨＣＶ抗体に結合するＨＣＶコア抗原タンパク質の
能力により特徴づけられる。その方法は、イムノアッセ
イ又はウェスターンブロットにより実施され得る。好ま
しい方法は、固相イムノアッセイである。固相、たとえ
ばマイクロタイタープレート、ビーズ及び半透膜がその
イムノアッセイを行なうために使用され得る。ラベルと
しての物質は、酵素、同位体、螢光材料及び直接的に検
出され得るいづれか他の材料を包含する。イムノアッセ
イは便利には、サンドイッチ法により達成される。特
に、酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）
が確立された。ＥＬＩＳＡは、１）固相上にプローブと
して本発明のポリペプチドを被覆し、２）抗原−抗体複
合体の形成を可能にする条件下で前記固相上に被覆され
たポリペプチドと共にＨＣＶ抗体を含むと思われるサン
プルをインキュベートし、３）前記固相に結合されたそ
の抗原−抗体複合体により捕獲されるべきラベルにより
接合される抗−抗体（たとえば抗−ＩｇＧ）を添加し、
そして４）その捕獲されたラベルを測定し、そしてサン
プルがＨＣＶ抗体を有するかどうかを決定することを含
んで成る。
方法が、本発明に包含される。その方法は、プローブと
してＨＣＶ抗体に結合するＨＣＶコア抗原タンパク質の
能力により特徴づけられる。その方法は、イムノアッセ
イ又はウェスターンブロットにより実施され得る。好ま
しい方法は、固相イムノアッセイである。固相、たとえ
ばマイクロタイタープレート、ビーズ及び半透膜がその
イムノアッセイを行なうために使用され得る。ラベルと
しての物質は、酵素、同位体、螢光材料及び直接的に検
出され得るいづれか他の材料を包含する。イムノアッセ
イは便利には、サンドイッチ法により達成される。特
に、酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）
が確立された。ＥＬＩＳＡは、１）固相上にプローブと
して本発明のポリペプチドを被覆し、２）抗原−抗体複
合体の形成を可能にする条件下で前記固相上に被覆され
たポリペプチドと共にＨＣＶ抗体を含むと思われるサン
プルをインキュベートし、３）前記固相に結合されたそ
の抗原−抗体複合体により捕獲されるべきラベルにより
接合される抗−抗体（たとえば抗−ＩｇＧ）を添加し、
そして４）その捕獲されたラベルを測定し、そしてサン
プルがＨＣＶ抗体を有するかどうかを決定することを含
んで成る。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２７
【補正方法】変更
【補正内容】
【００２７】II．ＨＣＶ ｃＤＮＡを含むプラスミドの
構成 分子ＥＮ−８０−１を、前記ＨＣＶ ｃＤＮＡを含むト
ランスポゾンを得るために制限エンドヌクレアーゼＢａ
ｍＨＩ及びＥｃｏＲＩにより処理する。得られたトラン
スポゾンを、ｐＥＮ−１と命名される発現プラスミドを
得るために制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩ及びＥｃ
ｏＲＩにより初めに切断されたビークルプラスミド中に
挿入する。ＨＣＶ ｃＤＮＡの発現はプロモーターｌａ
ｃの制御下にある。その発現プラスミドｐＥＮ−１の構
造及び制限地図は図２に示される。
構成 分子ＥＮ−８０−１を、前記ＨＣＶ ｃＤＮＡを含むト
ランスポゾンを得るために制限エンドヌクレアーゼＢａ
ｍＨＩ及びＥｃｏＲＩにより処理する。得られたトラン
スポゾンを、ｐＥＮ−１と命名される発現プラスミドを
得るために制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩ及びＥｃ
ｏＲＩにより初めに切断されたビークルプラスミド中に
挿入する。ＨＣＶ ｃＤＮＡの発現はプロモーターｌａ
ｃの制御下にある。その発現プラスミドｐＥＮ−１の構
造及び制限地図は図２に示される。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３１
【補正方法】変更
【補正内容】
【００３１】前記紙と、初めに４０％ＮＢＢＳ／トリス
−ＨＣｌ（pH７．４）により１０倍に希釈されたＣ型肝
炎により感染された／感染されていない個人の血清とを
４０℃で２時間反応せしめる。その反応の後、紙を洗浄
用緩衝液により３度洗浄する。前記紙と抗−ｈＩｇＧ：
ＨＲＰＯ接合体（この後に記載されるようにして調製さ
れる）とを４０℃で２時間、反応せしめる。その反応の
後、紙を洗浄用緩衝液により３度洗浄し、そして次に１
０mlの基質溶液（０．０１％の４−ｅｔｈｌｏｒｏ−１
−Ｎａｐｔｈｏｌ，１８％のメタノール、０．０４Ｍの
トリス、pH７．２〜７．４，０．１ＭのＮａＣｌ及び
０．０１％のＨ2 Ｏ2 ）と２０分間反応せしめる。本発
明のポリペプチドは、ＨＣＶにより感染された患者の血
清と反応性であるが、しかし健康な人の血清とは反応性
でない。
−ＨＣｌ（pH７．４）により１０倍に希釈されたＣ型肝
炎により感染された／感染されていない個人の血清とを
４０℃で２時間反応せしめる。その反応の後、紙を洗浄
用緩衝液により３度洗浄する。前記紙と抗−ｈＩｇＧ：
ＨＲＰＯ接合体（この後に記載されるようにして調製さ
れる）とを４０℃で２時間、反応せしめる。その反応の
後、紙を洗浄用緩衝液により３度洗浄し、そして次に１
０mlの基質溶液（０．０１％の４−ｅｔｈｌｏｒｏ−１
−Ｎａｐｔｈｏｌ，１８％のメタノール、０．０４Ｍの
トリス、pH７．２〜７．４，０．１ＭのＮａＣｌ及び
０．０１％のＨ2 Ｏ2 ）と２０分間反応せしめる。本発
明のポリペプチドは、ＨＣＶにより感染された患者の血
清と反応性であるが、しかし健康な人の血清とは反応性
でない。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３２
【補正方法】変更
【補正内容】
【００３２】VI．ＨＣＶ抗体についてのＥＬＩＳＡ （１）マイクロタイタープレートの処理マイクロタイター プレートを、本発明の精製されたポリ
ペプチドにより適切な濃度で被覆し、そしてウシ血清ア
ルブミンを含む緩衝液によりブロックする。その処理さ
れたマイクロタイタープレートを、２〜８℃で貯蔵す
る。
ペプチドにより適切な濃度で被覆し、そしてウシ血清ア
ルブミンを含む緩衝液によりブロックする。その処理さ
れたマイクロタイタープレートを、２〜８℃で貯蔵す
る。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３４
【補正方法】変更
【補正内容】
【００３４】（３）試薬の成分 （ａ）洗浄用溶液：０．９％ＮａＣｌ及びＴｈｉｍｅｒ
ｏｓａｌを含むリン酸緩衝液。 （ｂ）抗−ｈＩｇＧ：ＨＲＰＯ接合体溶液：タンパク質
安定剤及び防腐薬を含むトリス緩衝液に溶解された上記
のようにして調製された抗−ｈＩｇＧ：ＨＲＰＯ接合
体。 （ｃ）サンプル希釈剤：タンパク質安定剤及び防腐薬を
含むトリス緩衝液。 （ｄ）ＯＰＤ基質溶液：Ｈ2 Ｏ2 を含むクエン酸塩−リ
ン酸塩緩衝液に溶解されたｏ−フェニレンジアミン（Ｏ
ＰＤ）．（その溶液がオレンジ色になる場合、その溶液
は汚染され、そしてこれ以上使用され得ないことを意味
する）。 （ｅ）停止溶液：２Ｎの硫酸溶液。 （ｆ）陽性／陰性の対照：適切な濃度でタンパク質安定
剤及び防腐剤を含むリン酸緩衝液により希釈されたＣ型
肝炎により感染された／感染されていない個人の血清サ
ンプル。
ｏｓａｌを含むリン酸緩衝液。 （ｂ）抗−ｈＩｇＧ：ＨＲＰＯ接合体溶液：タンパク質
安定剤及び防腐薬を含むトリス緩衝液に溶解された上記
のようにして調製された抗−ｈＩｇＧ：ＨＲＰＯ接合
体。 （ｃ）サンプル希釈剤：タンパク質安定剤及び防腐薬を
含むトリス緩衝液。 （ｄ）ＯＰＤ基質溶液：Ｈ2 Ｏ2 を含むクエン酸塩−リ
ン酸塩緩衝液に溶解されたｏ−フェニレンジアミン（Ｏ
ＰＤ）．（その溶液がオレンジ色になる場合、その溶液
は汚染され、そしてこれ以上使用され得ないことを意味
する）。 （ｅ）停止溶液：２Ｎの硫酸溶液。 （ｆ）陽性／陰性の対照：適切な濃度でタンパク質安定
剤及び防腐剤を含むリン酸緩衝液により希釈されたＣ型
肝炎により感染された／感染されていない個人の血清サ
ンプル。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３５
【補正方法】変更
【補正内容】
【００３５】（４）方法： （ａ）サンプル希釈剤により希釈された（１：１０）の
試験サンプル１５０μｌ及び陽性／陰性の対照を、処理
されたマイクロタイタープレートのウェル中に添加す
る。いくつかのウェルは、基質ブランクとして保持され
るべきである。 （ｂ）前記プレートを振盪により軽く混合し、そして３
７〜４０℃で１時間インキュベートする。 （ｃ）プレートをウェル当たり３mlの洗浄用溶液により
３度洗浄する。 （ｄ）抗−ｈＩｇＧ：ＨＲＰＯ接合体溶液１００μｌを
個々のウェルに添加する。 （ｅ）プレートを振盪することにより軽く混合し、そし
て３７〜４０℃で３０分間インキュベートする。 （ｆ）プレートを５度洗浄する。 （ｇ）ＯＰＤ基質溶液１００μｌを個々のウェルに添加
し、そしてプレートを１５〜３０℃で３０分間、暗室で
インキュベートする。 （ｈ）停止溶液１００μｌを個々のウェルに添加し、そ
して軽く混合し、反応を停止する。 （ｉ）ウェル当たりのＯＤ値を、４９２nmで分光計によ
り測定する。
試験サンプル１５０μｌ及び陽性／陰性の対照を、処理
されたマイクロタイタープレートのウェル中に添加す
る。いくつかのウェルは、基質ブランクとして保持され
るべきである。 （ｂ）前記プレートを振盪により軽く混合し、そして３
７〜４０℃で１時間インキュベートする。 （ｃ）プレートをウェル当たり３mlの洗浄用溶液により
３度洗浄する。 （ｄ）抗−ｈＩｇＧ：ＨＲＰＯ接合体溶液１００μｌを
個々のウェルに添加する。 （ｅ）プレートを振盪することにより軽く混合し、そし
て３７〜４０℃で３０分間インキュベートする。 （ｆ）プレートを５度洗浄する。 （ｇ）ＯＰＤ基質溶液１００μｌを個々のウェルに添加
し、そしてプレートを１５〜３０℃で３０分間、暗室で
インキュベートする。 （ｈ）停止溶液１００μｌを個々のウェルに添加し、そ
して軽く混合し、反応を停止する。 （ｉ）ウェル当たりのＯＤ値を、４９２nmで分光計によ
り測定する。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４０
【補正方法】変更
【補正内容】
【００４０】２７種のサンプルを、本発明に従ってＥＬ
ＩＳＡにより試験した。同時に、サンプルをまた、プロ
ーブとして構造及び非構造タンパク質（すなわちＡｂｂ
ｏｔｔ’ｓキット（II））を用いることによってＨＣＶ
抗体アッセイにより試験した。Ａｂｂｏｔｔ’ｓキット
の試験結果と本発明のアッセイの試験結果との間の比較
を、表１に示す。サンプルＧ２２９の結果はＡｂｂｏｔ
ｔ’ｓキット（II）により陰性であるが、しかし本発明
のアッセイによれば陽性であることが注目される。ＨＣ
Ｖにより感染されたサンプルはＡｂｂｏｔｔ’ｓアッセ
イによりすべて検出され得ないことが示唆される。
ＩＳＡにより試験した。同時に、サンプルをまた、プロ
ーブとして構造及び非構造タンパク質（すなわちＡｂｂ
ｏｔｔ’ｓキット（II））を用いることによってＨＣＶ
抗体アッセイにより試験した。Ａｂｂｏｔｔ’ｓキット
の試験結果と本発明のアッセイの試験結果との間の比較
を、表１に示す。サンプルＧ２２９の結果はＡｂｂｏｔ
ｔ’ｓキット（II）により陰性であるが、しかし本発明
のアッセイによれば陽性であることが注目される。ＨＣ
Ｖにより感染されたサンプルはＡｂｂｏｔｔ’ｓアッセ
イによりすべて検出され得ないことが示唆される。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ０７Ｋ 13/00 8517−4Ｈ Ｃ１２Ｎ 1/21 7236−4Ｂ 15/10 Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ 8214−4Ｂ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ 7823−4Ｂ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ 8310−2Ｊ 33/576 Ｚ 9015−2Ｊ 33/577 Ｂ 9015−2Ｊ
Claims (42)
- 【請求項１】 Ｃ型肝炎ウィルス（ＨＣＶ）のヌクレオ
カプシド及び一部のエンベロープ領域のゲノムに由来す
るＨＣＶコア抗原タンパク質の抗原性を示すポリペプチ
ド及びその変性配列をコードするＤＮＡ分子。 - 【請求項２】 図１に示されるようなＤＮＡ配列を有す
るＨＣＶコア抗原タンパク質を示すポリペプチド及びそ
の変性配列をコードするＤＮＡ分子。 - 【請求項３】 ＨＣＶにより感染された患者の血漿から
クローンされる請求項１又は２記載のＤＮＡ分子。 - 【請求項４】 請求項１又は２記載のＤＮＡ分子に由来
するＣ型肝炎ウィルス（ＨＣＶ）ヌクレオチドのための
プローブ。 - 【請求項５】 適切な宿主においてＨＣＶコア抗原タン
パク質の抗原性を示すポリペプチドを生成できる請求項
１又は２記載のＤＮＡ分子。 - 【請求項６】 請求項１又は２記載のＤＮＡ分子をクロ
ーニングするための方法であって、Ｃ型肝炎患者の血清
からＲＮＡを単離し、そしてポリメラーゼ鎖反応（ＰＣ
Ｒ）技法を通して前記ＤＮＡ分子をクローニングするこ
とを含んで成る方法。 - 【請求項７】 下記配列がプライマーとして使用され
る： （ｉ）５′−GGATCCATGAGCACAAATCCTAAACCT −３′及び （ii）５′−GAATTCGGTGTGCATGATCATGTCCGC −３′ 請求項６記載の方法。 - 【請求項８】 Ｃ型肝炎ウィルスのヌクレオカプシド及
び一部のエンベロープ領域のゲノムによりコードされる
ＨＣＶコア抗原タンパク質の抗原性を示すポリヌクレオ
チド。 - 【請求項９】 図１に示されるアミノ酸配列を有するＨ
ＣＶコア抗原タンパク質の抗原性を示すポリペプチド、
及びその誘導体。 - 【請求項１０】 ２５，０００の分子量を有する請求項
８又は９記載のポリペプチド。 - 【請求項１１】 請求項１又は２記載のＤＮＡ分子によ
り形質転換された適切な宿主により生成されるポリペプ
チド。 - 【請求項１２】 請求項１又は２記載のＤＮＡ分子の発
現によりＨＣＶコア抗原タンパク質の抗原性を示すポリ
ペプチドを生成するための方法。 - 【請求項１３】 請求項１又は２記載のＤＮＡ分子を含
む発現ベクターにより形質転換された宿主細胞をインキ
ュベートすることを含んで成る請求項１２記載の方法。 - 【請求項１４】 ＨＣＶコア抗原タンパク質の抗原性を
示すポリペプチドの発現のためのベクターを調製するた
めの方法であって、請求項１又は２記載のＤＮＡ分子を
適切なベクター中に挿入することを含んで成る方法。 - 【請求項１５】 前記適切なベクターを、プラスミド及
びバクテリオファージから選択する請求項１４記載の方
法。 - 【請求項１６】 ｐＥＮ−２と命名された、ＨＣＶコア
抗原タンパク質の抗原性を示すポリペプチドの発現のた
めのプラスミド。 - 【請求項１７】 ＨＣＶコア抗原タンパク質の抗原性を
示すポリペプチドを生成するための宿主を調製するため
の方法であって、請求項１又は２記載のＤＮＡ分子を含
む発現ベクターにより適切な宿主細胞を形質転換するこ
とを含んで成る方法。 - 【請求項１８】 前記適切な宿主がＥ．コリである請求
項１７記載の方法。 - 【請求項１９】 ＨＣＶコア抗原タンパク質の抗原性を
示すポリペプチドを生成するための宿主。 - 【請求項２０】 サンプル中のＨＣＶ抗体を検出するた
めの方法であって、抗原−抗体複合体を形成するために
サンプルにおけるＨＣＶ抗原に対して向けられた抗体に
結合できる請求項８又は９記載のポリペプチドをプロー
ブとして使用することを特徴とする方法。 - 【請求項２１】 イムノアッセイ又はウェスターンブロ
ットにより実施され得る請求項２０記載の方法。 - 【請求項２２】 イムノアッセイにより実施される請求
項２１記載の方法。 - 【請求項２３】 １）抗原−抗体複合体の形成を可能に
する条件下でプローブとしての請求項８又は９記載のポ
リペプチドと共にＨＣＶ抗体を含むと思われるサンプル
をインキュベートし；そして ２）前記抗原−抗体複合体を検出することを含んで成る
請求項２２記載の方法。 - 【請求項２４】 固相−イムノアッセイにより実施され
る請求項２３記載の方法。 - 【請求項２５】 固相としてマイクロリッタープレート
を用いることを特徴とする請求項２４記載の方法。 - 【請求項２６】 ラベルとして酵素又は同異体物質を用
いることを特徴とする請求項２２，２３又は２４記載の
方法。 - 【請求項２７】 プローブとしてＨＣＶ非構造タンパク
質と共に組合された請求項８又は９記載のポリペプチド
を用いることを特徴とする請求項２０記載の方法。 - 【請求項２８】 サンプル中のＨＣＶ抗体を検出するた
めの酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）
であって： １）固相上にプローブとしての請求項８又は９記載のポ
リペプチドを被覆し、 ２）抗原−抗体複合体の形成を可能にする条件下で前記
固相上に被覆されたポリペプチドと共にＨＣＶ抗体を含
むと思われるサンプルをインキュベートし、 ３）前記固相に結合された抗原−抗体複合体により捕獲
されるべきラベルにより接合された抗−抗体を添加し、
そして ４）前記捕獲されたラベルを測定し、そしてサンプルが
ＨＣＶ抗体を有するかどうかを測定することを含んで成
る方法。 - 【請求項２９】 前記固相がマイクロリッタープレート
である請求項２８記載のＥＬＩＳＡ。 - 【請求項３０】 前記ラベルが酵素である請求項２８記
載のＥＬＩＳＡ。 - 【請求項３１】 前記ラベルがホースラディシュペルオ
キシダーゼである請求項３０記載のＥＬＩＳＡ。 - 【請求項３２】 請求項８又は９記載のポリペプチドを
含んで成る、サンプル中のＨＣＶ抗体の存在についてサ
ンプルを分析するためのキット。 - 【請求項３３】 請求項８又は９記載のポリペプチド及
び適切な固相を含んで成る、サンプル中のＨＣＶ抗体を
検出するイムノアッセイのためのキット。 - 【請求項３４】 サンプル中のＨＣＶ抗体を検出するた
めの酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）
のためのキットであって、適切な固相上に被覆された請
求項８又は９記載のポリペプチド及びラベルにより接合
された抗−ヒト抗体を含んで成るキット。 - 【請求項３５】 前記ラベルが酵素である請求項３４記
載のキット。 - 【請求項３６】 前記ラベルがホースラディシュペルオ
キシダーゼである請求項３４又は３５記載のキット。 - 【請求項３７】 免疫源として請求項８又は９記載のポ
リペプチドを用いることによって誘発されるＨＣＶコア
抗原タンパク質に対して向けられた抗体。 - 【請求項３８】 ポリクローナル抗体を含んで成る請求
項３７記載の抗体。 - 【請求項３９】 モノクローナル抗体を含んで成る請求
項３７記載の抗体。 - 【請求項４０】 請求項８又は９記載のポリペプチドに
より動物を免疫化することを含んで成る、ＨＣＶコア抗
原タンパク質に対して向けられた抗体を生成するための
方法。 - 【請求項４１】 プローブとして請求項３７，３８又は
３９記載の抗体を用いることを特徴とする、サンプル中
のＨＣＶを分析するための方法。 - 【請求項４２】 請求項８又は９記載の免疫原性ポリペ
プチド、その不活性化された調製物及び弱められた調製
物を含んで成るＨＣＶ感染を防ぐためのワクチン。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4311615A JP2778886B2 (ja) | 1992-10-16 | 1992-11-20 | Ｃ型肝炎ウィルスのコア抗原タンパク質及びそれを用いての診断方法及びキット |
| EP93308185A EP0593290B1 (en) | 1992-10-16 | 1993-10-14 | Core antigen protein of hepatitis C virus, and diagnostic method and kit using the same |
| US08/143,578 US5645983A (en) | 1992-10-16 | 1993-10-26 | Core antigen protein of hepatitis C virus, and diagnostic method and kit using the same |
| US08/143,579 US5625034A (en) | 1992-10-16 | 1993-10-26 | Core antigen protein of hepatitis C virus, and diagnostic method and kit using the same |
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US96348392A | 1992-10-16 | 1992-10-16 | |
| JP4311615A JP2778886B2 (ja) | 1992-10-16 | 1992-11-20 | Ｃ型肝炎ウィルスのコア抗原タンパク質及びそれを用いての診断方法及びキット |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06153960A true JPH06153960A (ja) | 1994-06-03 |
| JP2778886B2 JP2778886B2 (ja) | 1998-07-23 |
Family
ID=26566825
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4311615A Expired - Lifetime JP2778886B2 (ja) | 1992-10-16 | 1992-11-20 | Ｃ型肝炎ウィルスのコア抗原タンパク質及びそれを用いての診断方法及びキット |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US5645983A (ja) |
| EP (1) | EP0593290B1 (ja) |
| JP (1) | JP2778886B2 (ja) |
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1992
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1993
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Patent Citations (4)
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