JPH03103188A - ヒト血清アルブミンの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は遺伝子操作により得られたヒト血清アルブミン
の精製方法に関する。

〔従来技術〕

アルプミン、特にヒト血清アルブミン（以下でＨＳＡと
呼称する）は血漿の主要な蛋白構成成分である。この蛋
白は肝臓中で作られ、主に血流中で正常な浸透圧を維持
する責を負う。

また種々の血清分子のキャリアーとしての機能を持って
いる。

ＨＳＡは種々の臨床上の状況において投与される。例え
ば、ショックや熱傷患者では血液量を元に戻し、それに
より外傷に関連するいくつかの症状を改善させるために
、通常はＩＳＡの頻回投与を必要とする。低蛋白血症や
胎児性赤芽球症に罹っている患者にもＨＳＡによる治療
を必要とすることがある。

従って、ＩＳＡを投与する基本的な治療上の意義は、外
科手術、ショック、火傷、浮腫を起こす低蛋白血症にお
けるがごとく、血管からの液体の損失がある様な状態を
治療する点に存する。

現在、ＩＳＡは、主として採取した血液の分画からの産
物として製造されている。この製造法の欠点は不経済で
あることと、血液の供給が困難であるということである
。また、血液は肝炎ウイルスのように好ましくない物質
を含んでいることがある。従って、ＨＳＡの代替の原料
を開発することが有益となろう。

ところで、組換ＤＮＡ技術の出現によって多種多様の有
用なポリペプチドの微生物による生産が可能となった。

多くの呻乳動物ポリベプチド類、例えばヒト戒長ホルモ
ン、インターフェロンが既に種々の微生物により生産さ
れている。この技術によって種々の有用なポリペプチド
の微生物による生産が可能となり、種々のワクチン、ホ
ルモン、酵素、抗体を微生物に生産させることができる
ようになった。

前述したＨＳＡの生産上の難点を克服するために、遺伝
子操作の技術によりＩＳＡを大量に得、それを高度精製
する方法が確立されつつある。

ところが、遺伝子操作を経た菌よりＩＳＡを精製製造す
る際には、原料中に蛋白質を主とする菌体或分が夾雑し
てくる。これらの夾雑物質は、従来の血漿由来ＨＳＡの
精製方法では充分に除去することができない。

〔発明が解決しようとする課題〕 そこで本発明者らは、かかる技術的背景の下に鋭意研究
を重ねた結果、遺伝子操作を経た菌体内または菌体外に
産生されたＩ　Ｓ　Ａを効率よく精製する方法を見出し
、本発明を完威した。

〔問題点を解決するための手段及び作用］本発明におい
て用いられるＨＳＡは遺伝子操作に由来して調製された
ものであれば、特に限定されない。従って遺伝子操作を
経てＨＳＡを発現する菌体（例えば、大腸菌、酵母、枯
草菌、動物細胞など）を、例えば菌体内発現であれば凍
結融解法、ガラスビーズ法、高圧法、超音波処理法、酵
素処理法等の公知の方法で処理し菌体外発現（分泌発現
）であれば培養上清から得られるＩＳＡ抽出画分、ある
いはこの抽出画分を各種分画法、吸着クロマトグラフィ
ー、アフィニティクロマトグラフィー、ゲル濾過、密度
勾配遠心分離法、透析等の公知の方法で部分精製した画
分などを用いることができる。

（ａ）具体的に宿主が酵母の場合に限って、Ｈ　ＳＡ産
生酵母の調製方法を説明する。

（１）まず、特願昭６３−３３６５７で記載された手段
が挙げられる。

本発明に関する組換えプラスミドは、シグナルベプチド
をコードするＤＮＡ配列、ＨＳＡをコードするＤＮＡ配
列、プロモーター、ターミネーターおよびプラスミドＤ
ＮＡからなる。

上記（１）でいう特定構造のシグナルペプチドは、以下
のアミノ酸配列（Ｉ）で示される。

Ｍｅｔ−Ａ，−八ｚ−Ｘ−Ｂ−Ｃ−Ｄ−Ｅ−Ｆ　　　　
　（　　１　　）（式中、Ａ，はｌ〜３個のＡｒｇ，Ｓ
ｅｒ，ＬｙＳまたはＨｉｓから選ばれたアミノ酸からな
るペプチド鎖を、Ａ２は１〜３個の任意のアミノ酸から
なるペプチド鎖を、Ｘは８〜１０個の疎水性アミノ酸か
らなるベプチド鎖を、ＢはＰｒｏまたはＳｅｒを、Ｃは
ｃｘｙまたはＰｒｏを、ＤはＣｙｓ，Ａｌａ，Ｌｅｕ，
Ｓｅｒ，ＴｈｒまたはＶａｌから選ばれたアミノ酸を、
ＥはＴｒｐまたはＧｌｎを、ＦはＡｌａまたはｃｔｙを
各々表わす）Ａ２中で表わされる任意のアミノ酸として
は、Ｇｌｙ，Ａｌａ，Ｌｅｕ，Ｉｌｅ，Ｓｅｒ，Ｔｈｒ
，Ｃｙｓ，ＭｅＬ．Ａｓｐ，Ａｓｎ，Ｇｌｕ，Ｇｉｎ，
　　ＬＹＳ，Ａｒ　ｇ，　　Ｐｈｅ，Ｔｙｒ，　　Ｈｉ
ｓ，Ｔｒｐ，Ｐｒｏ，ｌａ　ｌが挙げられる。Ｘ中で表
わされる疎水性アミノ酸としては、ＬｅｕＰｈｅ，Ａｌ
ａ，Ｉｌｅ，Ｖａｌ，Ｃｙｓ，ＭｅＬなどが例示される
。好ましくは、Ａ，はーＡｒｇ−Ｓｅｒ一を、Ａ２は−
Ｌ　ｅ　ｕ　−　Ｌ　ｅ　ｕ−を、Ｘはー（Ｌｅｕ）．
一を表わす。

より好ましくはシグナルペプチドは、一例として以下の
アミノ酸配列で示される。

ＭｅｔＡｒｇＳｅｒ（Ｌｅｕ）　ＩｏＰｒｏＧｌｙｃｙ
ｓＴｒｐＡｌａシグナルベブチド遺伝子は上述したアミ
ノ酸配列で表現できるＤＮＡ配列を有していればよいが
、各アミノ酸のコドンとしては以下のものが例示される
。ＡｌａはＧＣＴまたはＧＣＣ，ＣｙｓはＴＧＴ，Ａｓ
ｐはＧＡＣ，ＧｌｕはＧＡＡ，ＰｈｅはＴＴＣ．．Ｇｌ
ｙはＧＧＴ，ＨｉｓはＧＡＣ．．１ｌｅはＡＴＴまたは
ＡＴＣ，ＬｙｓはＡＡＧ，ＬｅｕはＴＴＧ，ＭｅｔはＡ
ＴＣ，ＡｓｎはＡＡＣ、ＰｒｏはＣＣＡ．．ＧｌｎはＣ
ＡＡ，ＡｒｇはＡＧＡ，ＳｅｔはＴＣＴまたはＴＣＣ，
ＴｈｒはＡＣＴまたはＡＣＣ，Ｖａ　１はＧＴＴまたは
ＧＴＣ，ＴｒｐはＴＧＧ，ＴｙｒはＴＡＣ，好ましくは
以下のようなＤＮＡ配列を有するものが用いられる。

ＡＴＧ　　ＡＧＡ　ＴＣＴ　ＴＴＧ　ＴＴＧ　ＴＴＧ　
ＴＴＧ　ＴＴＧ　ＴＴＧ　ＴＴＧ　ＴＴＧＴＴＧ　　Ｔ
ＴＧ　　ＣＣＡ　　ＧＧＴ　　ＴＧＴ　　ＴＧＧ　　Ｇ
ＣＴＨＳＡ遺伝子は、特開昭６２−２９９８５号公報な
どに記載されている。

上述の文献中では、ＨＳＡ遺伝子を含むプラス２ミドと
して開示されている。

本発明に用いられる酵母を形質転換するための組換えプ
ラスミドは、血清アルブミンシグナルペプチド遺伝子の
下流にＩＳＡ遺伝子を自体既知の手段で連結し、これら
を含むプラスミドとして自体既知の手段にて調製される
。

プロモーターおよびターミネーターは酵母で機能するも
のであれば特に限定されない。

プロモーターとしては、Ｐ（１，ＫプロモーターＡＤＨ
プロモーター、ｐｈｏＥ（５）プロモーターＧＡＬＩプ
ロモーター、Ｇ　Ａ　Ｌ　１０プロモーターＧＡＰ−Ｄ
Ｈプロモーターなどが好適に使用される。

プロモーターは設計アルプミンシグナルベプチド遺伝子
の上流に位置する。

ターミネーターとしてはｐｈｏＥ（５）夕一旦ネーター
、ＧＡＰＤＨター果ネーターなどが好適に使用される。

ターミネーターはＨＳＡ遺伝子の下流に位置する。

プロモーター、ターミネーターは各々プラスξドに組み
込まれた形で入手される。

プラスξドＤＮＡは酵母中で自律複製可能なものであれ
ば特に限定されない。具体的には、ｐＪＤＢ２０７、ｐ
ＪＤ８２１９などが例示される。

本発明に用いられる組換えプラスミドは、上述したプラ
スξド群から各々、血清アルブミンシグナルペプチド遺
伝子−｝ＩＳＡ遺伝子からなるＤＮＡ配列、プロモータ
ーを含むＤＮＡ配列およびター旦ネーターを含むＤＮＡ
配列を制限酵素により切り出した後に連結（接続）して
適当なプラスミドに組み込むか、または、一方のＤＮＡ
配列を切り出した後に他方のブラスミド中に組み込むか
のいずれかの方法により得られる。

その際、配列の順序は上流から下流に向かって、プロモ
ーター、血清アルブミンシグナルペプチド遺伝子、ＩＳ
Ａ遺伝子、ターミネーターとなるように調製する。

また、選別時のマーカーとして、抗生物質（テトラサイ
クリン、アンビシリン、カナマイシン）耐性遺伝子ある
いは宿主の栄養要求性を補う遺伝子を組み込むことも可
能である。

ＩＳＡをコードするＤＮＡ配列を用いて形質転換体を調
製する方法としては、当該ＤＮＡ配列を組み込んだ上述
の組換えプラスミドを用いる方法、あるいは当該ＤＮＡ
配列を宿主（酵母）の染色体上に挿入する方法などが挙
げられる。

この組換えプラスミドを用いて形質転換体を製作する方
法ひいてはＨＳＡを製造する方法は以下の通りである。

組換えプラスミドを宿主細胞に導入する。宿主細胞とし
ては酵母が用いられる。具体的には挿入されるプラス旦
ドが担持する選択マーカー遺伝子によって相補する変異
をもった変異株、たとえばロイシン要求性変異株である
サツ力ロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙ’
ｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）＾１１２２（ａ．ｈｉ
ｓ　Ｃ　ｌｅｕ　２＋　ｃａｎ　１）等に好適に用いら
れる。

宿主細胞（酵母）の形質転換は公知の方法、たとえば、
リン酸カルシウム沈澱法、プロトプラストポリエチレン
グリコール融合法、エレクトロボレーシゴン法などによ
り行う。

必要な形質転換体を選択する。

形質転換株は、宿主細胞の自体公知の培地で培養する。

培地としてはＹＮＢ液体培地〔０．７％Ｙｅａｓｔ　Ｎ
ｉｔｒｏｇｅｎ　Ｂａｓｅ　（Ｄｉｆｃｏ社）、２％グ
ルコース〕、およびＹＰＤ液体培地（１％イーストエキ
ストラクト（Ｄｉｆｃｏ社）、２％ポリペプトン（大五
栄養社）２％グルコース〕などが例示される。

培養は、通常１５〜４３゜Ｃ（好適には３０゜Ｃ程度）
で２０〜１００時間程度行い、必要により通気や撹拌を
加えることもできる。

（２）また、特願昭６２−３０６６７４で記載された手
段も挙げられる。

本発明に関する組換えＤＮＡは、血清アルブミンシグナ
ルベプチド遺伝子、ＨＳＡ遺伝子、プロモーター、ター
ミネーターおよびブラスミドＤＮＡ又は染色体ＤＮＡか
らなる。

血清アルブミンシグナルベプチド遺伝子は、例えば咄乳
動物に由来するものが好適に使用される。

具体的にはヒト由来、ラット由来、ウシ由来のものなど
が用いられる。また、その遺伝子は主要部を残して変異
させたものであってもよい。

ヒト由来のものとしては、 Ｍｅ　ｔＬｙｓＴ　ｒｐＶａ　ｌＴｈｒＰｈｅ　Ｉ　１
ｅＳｅｒＬｅｕＬｅｕＰｈｅＬｅｕ　ＰｈｅＳｅｒＳｅ
ｒＡｌａＴｙｓＳｅｒ ラット由来のものとしては、 Ｍｅ　ｔＬｙｓＴｒｐＶａ　ＩＴｈｒＰｈｅＬｅｕＬｅ
ｕＬｅｕＬｅｕＰｈｅ　Ｉ　１ｅＳｅｒＧ　ｌｙｓｅｒ
ＡＩａＰｈｅＳｅｒ ウシ由来のものとしては、 Ｍｅ　ｔＬｙｓＴｒｐＶａ　Ｉ　ＴｈｒＰｈｃ　Ｉ　ｌ
ｅｓｅｒＬｅｕ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　ＬｅｕＰ　ｈｅＳｅ
ｒＳｅｒ八ｌａＴｙｓｓｅｒ などのアミノ酸配列で表わされるＤＮＡが例示される。

当該血清アルブミンシグナルペプチド遺伝子は好ましく
は、ヒト由来のものが使用される。

さらに、本シグナルペブチド遺伝子は、一部変更するこ
とによって、より効率的な効果を得ることができ、それ
は次の一般式で示されるアミノ酸配列をコードする遺伝
子からなる。

Ｍｅ　ｔＹＴｒｙＶａＩＴｈｒＰｈｅＩ　１ｅＳｅｒＬ
ｅｕＬｅｕＰｈｅＬｅｕＰｈｅＸＳＸ４Ｘ３Ｘ　２Ｘ好
ましい組合わせとしては第２表のごときものが例示され
る。

第２表 血清アルブミンシグナルペプチド遺伝子は上述したアξ
ノ酸配列で表現できるＤＮＡ配列を有していればよいが
、各アミノ酸のコドンとして好ましいものは次の通りで
ある。

Ａｌａ：ＧＣＴ又はＧＣＣ，　Ｃｙｓ：ＴＧＴ，　Ａｓ
ｐ：ＧＡＣ，　Ｇ１ｔ＋：ＧＡＡ，Ｐｈｅ：ＴＴＣ，　
Ｇｌｙ：ＧＧＴ，　Ｈｉｓ：ＧＡＣ，　　Ｉｌｅ：ＡＴ
Ｔ又は八ＴＣ，Ｌｙｓ　：＾ＡＧ，　　Ｌｅｕ：ＴＴＧ
，　　Ｍｅｔ：ＡＴＧ，　　Ａｓｎ：ＡＡＣ，　　Ｐｒ
ｏ：ＣＣＡＧｌｎ：ＣＡＡ，　　Ａｒｇ：ＡＧＡ，　　
Ｓｅｒ：ＴＣＴ　　又はＴＣＣ，　　Ｔｈｒ：ＡＣＴ又
はＡＣＣ，　Ｖａｌ：ＧＴＴ又はＧＴＣ，　Ｔｒｐ：Ｔ
ＧＧ，　Ｔｙｒ：ＴＡＣシグナルペプチド遺伝子以外は
全て（１）と同様である。

より具体的にブラスミドを酵母染色体に組込んで１｛Ｓ
Ａ産生酵母を調製する方法を説明する。

本発明に関するプラスミドは、宿主酵母染色体中に存在
する遺伝子の一部のＤＮＡ配列（例えば、ＬＥＵ２、Ｈ
ＩＳ４、ＴＲＰＩＳＵＲＡ３、ｒｉｂｏｓｏｍｅＤＮＡ
遺伝子等）を含有する。相同な配列により、全プラスミ
ドまたはその線状断片は組換により宿主染色体に安定に
導入することができる。即ち、増殖中、子孫細胞は選択
圧が存在しない場合でも導入された遺伝物質を安定に保
持する。

例えば、酵母染色体遺伝子中の天然に存在する配列およ
びＨＳＡ遺伝子を含むプラスミドは、前記染色体遺伝子
の座に安定に組み込まれ得る。

本発明に関する宿主酵母染色体配列に相同な配列は、特
にアミノ酸または核酸合成系遺伝子、ｒｉｂｏｓｏｍｅ
ＤＮＡ　、Ｔ　ｙ因子等が使用できる。特に、アミノ酸
または核酸合成系遺伝子は、宿主酵母がアξノ酸または
核酸栄養要求性株である時、すなわち、該ア旦ノ酸また
は核酸合成系遺伝子が欠損している株においては、宿主
の変異を補完する遺伝子であるので、形質転換体の選択
マーカーとして使用することができる。この際、宿主酵
母の栄養要求性に原栄養性をもたらすア稟ノ酸または核
酸合戊系遺伝子としては例えばＬＥＵ２、ＨＩＳ４、Ｔ
ＲＰＩまたはＵＲＡ３がある。

酵母用の選択遺伝子マーカーとしては、上記のように、
宿主酵母が栄養要求性株である時、アミノ酸または核酸
合戒系遺伝子のようなものが使用できるほか、宿主が抗
生物質感受性株である時は、該抗生物質耐性を発現する
遺伝子が使用できる。

例えばシクロヘキシド、０４１８、クロラムフエニコー
ル、プレオマイシンまたはハイグロマイシン等の抗生物
質に対して耐性を付与する遺伝子があげられる。

本発明に関するプラスξドが含有するアルブミンコード
領域は、特にヒト血清由来のアルブミン（ＩＳＡ）と同
一または相同なＤＮＡ配列であり、例えばＨＳＡを生産
することができる任意のヒト細胞から得られる。該ＤＮ
Ａは染色体ＤＮＡまたはｃＤＮＡである。染色体ＤＮＡ
はＨＳＡ遺伝子を含有する遺伝子ライブラリーから分離
することができ、そしてＨＳＡ　　ｃＤＮＡは公知の方
法を用いてｍＲＮＡ経路を介してｉ周製することができ
る。

本発明に関するプロモーターは酵母、好適にはサ　カロ
マイセス・セレビシエー　Ｓａｃｃｈａｒｏｍ　ｃｅｓ
ｅｅｒｅｖｉｓｉａｅ’）のゲノムＤＮＡに由来する。

好ましくは、高発現酵母遺伝子のプロモーターをＩＳＡ
の発現のために使用する。即ち、ＴＲＰＩ遺伝子、ＡＤ
Ｈ　ＩもしくはＡＤＨＩＩ遺伝子、酸性ホスファターゼ
（ＰＨ０３もしくはＰＨ０５）遺伝子、またはイソチト
クロームＣ遺伝子のプロモーターガラクトース代謝系の
プロモーター（ＧＡＬＬ、ＧＡＬＩＯもしくはＧＡＬ７
）、インベルターゼのプロモーター（ＳＵＣ２）あるい
は解糖系酵素をコードする遺伝子のプロモーター、例え
ばエノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−ホスフェート
デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）　、３−ホスホグリセ
レートキナーゼ（ＰＧＫ）　、ヘキソキナーゼ、ビルベ
ートデカルボキシラーゼ、ホスホフラクトキナーゼ、グ
ルコース−６−ホスフヱートイソメラーゼ、３−ホスホ
グリセレートムターゼ、ピルベートキナーゼ、トリホス
フエートイソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ
およびグルコキナーゼの遺伝子のプロモーター、あるい
はａ−ファクターまたはα−ファクターをコードする酵
母接合フエ口モン遺伝子のプロモーターを使用すること
ができる。

また、プラスξドは、宿主酵母内で自律的に複製できな
い。すなわち、宿主酵母内での自律複製開始領域、例え
ば２μｍ　　ＤＮＡの複製開始領域やＡＲＳ領域（Ａｕ
ｔｏｎｏｍｏｕｓ　ｒｅｐｌｉｃａｔｉｎｇ　ｓｅｑｕ
ｅｎｃｅ）を実質的に含まない。

本発明における遺伝子操作の他の好ましい態様において
は、構或物プラスξド中にシグナル配列を導入すること
もできる。シグナル配列は、酵母インベルターゼ、α−
ファクター遺伝子のような酵母由来のシグナル配列を使
用することができる。

また、ＨＳＡのシグナル配列は好適であり、好ましくは
酵母での分泌発現のために特に合威されたシグナル配列
（特願昭６２−３０６６７４号または特願昭６３−３３
６５７号）を用いることもできる。

このシグナル配列の導入により、Ｉ　Ｓ　Ａ遺伝子の発
現の後、遺伝子産物は分泌経路に入り、そしてペリプラ
ズム空間に輸送される。さらに細胞壁を通しての培地中
への分泌を達戒することができる。これはより収量の相
当な増加が可能となる。

さらに、細胞を破壊する必要がないので回収工程を単純
化することが可能である。

また、本発明に関するプラスミドは転写停止のための適
当なターミネークー、例えばＰＨ０５もしくはＧＡＰ−
ＤＨターξネーターを含有する。

このプラスミドはプロモーター、ＨＳＡコード領域およ
び宿主染色体相同領域とは別に、細菌宿主、特に大腸菌
のための複製開始点および遺伝的選択マーカーを含有す
ることもできる。大腸菌複製開始点および大腸菌のため
の選択マーカーを酵母ハイブリドベクター中に使用する
ことに関して有用な特徴が存在する。まず、大腸菌にお
ける増殖および複製により大量のハイプリドベクターＤ
ＮＡを得ることができ、そして第２に、大腸菌に基礎を
置くクローニング技法のすべてを用いてハイブリドベク
ターの構築を容易に行うことができる。大腸菌プラスご
ド、例えばｐＢＲ３２２等は大腸菌複製開始点、および
抗生物質、例えばテトラサイクリンおよびアンビシリン
に対する耐性をもたらす大腸菌遺伝マーカーを含有し、
そして酵母ハイブリドベクターの部分として有利に使用
される。

従って、該プラスξドは、プロモーター、該プロモータ
ーに制御されるＩＳＡコード領域、それに続く転写停止
のためのターξネーターを含み、かつ宿主酵母染色体配
列に相同な配列を含むものである。また、該プラスξド
は、所望により、分泌生産のためのシグナル配列、酵母
用の選択遺伝子マーカー、大腸菌の複製開始領域、大腸
菌用選択遺伝子マーカーを含有することができる。そし
て、酵母の複製開始領域は実質的に含まないものである
。

本発明において、宿主としては酵母、特にサッカロマイ
セス属もしくはビキア属が使用される。

好ましくは、栄養要求性株や、抗生物質感受性株が使用
できる。

この組換えプラスξドを用いて形質転換体を作製する方
法、ひいてはアルブミンを製造する方法は以下の通りで
ある。

組換えプラスくドを宿主酵母細胞の染色体上に導入する
。具体的には、挿入するプラスξドの有する、宿主酵母
細胞の染色体に相同な配列中の任意の部位を制限酵素処
理により切断し、直線化したプラスミドを宿主に導入す
ることが望ましい。

直線化されたプラスξドは、宿主酵母細胞染色体上のプ
ラスミドに組み込まれた領域と相同な領域に組み込まれ
る。直線化されたプラスミドは環状プラス５ドより、宿
主染色体上に組み込まれる頻度が上昇する。この時使用
する宿主酵母は、挿入されるプラスミドが担持する酵母
用選択マーカー遺伝子によって相補する変異を持った変
異株、例えば、ロイシンおよびヒスチジン要求性変異株
でかつＧ４１８感受性株であるサッ力口マイセス・セレ
ビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓ
ｉａｅ）　Ａ　Ｈ　２２株（ａ．　ｈｉｓ　４，　Ｉｅ
ｕ　２，　ｃａｎ　１）等が好適に用いられる。

宿主酵母細胞の形質転換は公知の方法、例えばプロトプ
ラストポリエチレングリコール法、エレクトロポレーシ
ョン法などにより行う。

次に期待した部位へプラスξドが導入されているか否か
、および導入した遺伝子が安定であるか否かを調べる。

具体的には、サザンプ口ッティング法により、形質転換
に利用した宿主酵母細胞の染色体配列に相同な配列をプ
ローブとして、期待通りの部位へプラスミドが導入され
ていることを確認する。またアルブミンをコードする遺
伝子の安定性を、アルブミン産生量および栄養要求性の
回復維持を指標に調べ、形質転換体を非選択培地で数十
代培養した後でも、変化しないことを確認する。

以上、確認試験を行った株は、確かにＨＳＡコード領域
を含むプラスξドが、宿主酵母細胞染色体の所望の部位
に組み込まれた形質転換体である。

この形質転換体を宿主として使用し、再度、ＨＳＡコー
ド領域を含むプラスξドで形質転換させることができる
。この場合、酵母細胞染色体相同領域としては、初めの
形質転換で使用した領域以外の相同領域も使用できる。

この他、宿主酵母細胞の染色体配列に相同な配列として
、ｒｉｂｏｓｏｍｅ　ＤＮＡやＴｙ因子（Ｔｒａｎｓｐ
ｏｓｏｎｏｆ　Ｙｅａｓｔ　ｅｌｅｍｅｎｔ）　　も挙
げられる。これらの遺伝子は細胞当り、複数個存在する
ので、１回の形質転換で、複数個の目的遺伝子を宿主染
色体に組み込むことができる。

以下、具体的に組み込み方法を例示するが本例示は好適
な一手段を示すものであり、この手法に限定されるもの
ではない。相同配列部位は、選択的繰り返しにより代替
え可能である。

宿主としては、ロイシンおよびヒスチジン要求性変異株
でかつＧ４１８感受性株であるサツ力口マイセス・セレ
ビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓ
ｉａｅ）ＡＨ２２株（ロイシン合成系遺伝子のＬＥＵ２
およびヒスチジン合戊系遺伝子のＨＩＳ４に変異を持つ
株）を用いる。

まず、ロイシン非要求性とするための遺伝子、ＬＥＵ２
を宿主酵母細胞の染色体配列と相同の配列として持つプ
ラスミドで形質転換する。得られた形質転換体は、染色
体上のＬＥＵ２遺伝子部位にアルプミンコード領域を含
むプラスミドが挿入されたものであり、ロイシン非要求
性、すなわちロイシン不含培地でも増殖できる株である
。

次に、この形質転換体を宿主とし、ヒスチジン非要求性
とするための遺伝子、ＨＩＳ４を宿主酵母細胞の染色体
配列と相同の配列として持つプラス粟ド（もちろん、ア
ルプミンコード領域も含有する）で形質転換する。得ら
れた形質転換体は染色体上のＨＩＳ４遺伝子部位にアル
ブミンコード領域を含むプラスξドが挿入されたもので
あり、ヒスチジン非要求性、すなわちヒスチジン不合培
地でも増殖できる株である。この時点で、発現のための
目的遺伝子であるアルブミン遺伝子は、ＬＥＵ２および
ＨＩＳ４の２箇所に導入されている。

次に、上記ロイシンおよびヒスチジン非要求性になった
形質転換体を宿主として、ＴＲＰＩを宿主酵母細胞の染
色体配列と相同の配列として持つプラスミドで形質転換
する。このプラスミドは、アルブミンコード領域はもち
ろん、０４１８耐性遺伝子も含有するものである。得ら
れた形質転換体は染色体上のＴＲＰＩ遺伝子部位にアル
ブミンコード領域およびＧ４１８耐性遺伝子を含むプラ
スξドが挿入されたものであり、抗生物質Ｇ４１８に対
し耐性を示す。従って、この形質転換体は、アルブミン
遺伝子を染色体上のＬＥＵ２、ＨＩＳ４およびＴＲＰＩ
遺伝子部位の計３箇所に含有するものである。この時、
挿入の順序は特に問題ではない。

宿主として、何種類もの栄養要求変異株が取得できれば
、または何種類もの抗生物質に対して感受性を示す株が
取得できれば、それに応じた領域に有用遺伝子を複数導
入することができる。

このように、宿主染色体上の複数領域に目的遺伝子を挿
入することができる。これら染色体に組み込まれた遺伝
子は、脱落することなく、安定に維持され、かつ複数の
遺伝子を組み込むことにより、目的生産物を多量に取得
することが可能となる。

形質転換株は、公知の培地で培養する。ＹＰＤ液体培地
〔１％イーストエキストラクト（Ｄｉｆｃｏ社）、２％
バクトポリペプトン（Ｄｉｆｃｏ社）、２％グルコース
〕などが例示される。培養は通常ｌ５〜４３％（好適に
は３０゜Ｃ程度）で２０〜１００時間程度行い、必要に
より通気や撹拌を加えることもできる。

（ｂ）加熱処理 本工程は夾雑するプロテアーゼを不活化するために行う
。

添加剤としてはアセチルトリプトファンおよび／または
炭素数６′−１２の有機カルボン酸またはその塩が挙げ
られる。

アセチルトリプトファンの添加量としては１〜１００ｍ
Ｍ程度が例示される。

炭素数６〜１２の有機カルボン酸としてはカプロン酸（
炭素数６）、カプリル酸（炭素数８）、カプリン酸（炭
素数１０）　、ラウリン酸（炭素数１２）等が例示され
る。

また、その塩としてはアルカリ金属塩（例えば、ナトリ
ウム塩、カリウム塩等）、アルカリ土類金属塩（例えば
、カルシウム塩等）が例示される。

炭素数６〜１２の有機カルボン酸またはその塩の添加量
としては１〜１００ｍＭ程度が例示される。

加熱処理の条件としては５０〜７ｏ℃、１〜５時間程度
が例示される。

（ｂ）後処理 当該ＨＳＡは公知の手法によりさらに精製を行うことが
できる。例えば、分画処理、限外濾過、ゲル濾過、イオ
ン交換クロマト、アフィニティクロマト等が挙げられる
。

また、公知の製剤化技術を施すことによりＨＳＡ製剤を
調製することもできる。

（発明の効果） 本発明は夾雑したｐｒｏｔｅａｓｅを不活化，する事に
よりＩＳＡの低分子化を防ぐ事にある。

（実施例） ＨＳＡを産生するＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒ
ｅｖｉｓｉａｅ（ｐＹＮＯ２６／Ａ｝１２２　　＃６）
を培養し、培養上清液に５ｍＭアセチルトリブトファン
、５ｍＭカプリル酸ナトリウムを添加し、６０゜Ｃ３時
間加熱する。６０゜Ｃ３時間加熱後培養上清濃縮液と非
加熱培養上清液をｐｌｌ４．０に調整し室温で一昼夜放
置後、ゲルろ過分析を行った。

＊（各溶液の（ＩＳＡより低分子戒分の全面積比／ｊｎ
ｔａｃｔ　ＨＳＡと｝ＩＳＡより低分子戒分の全面積比
）加熱前液の（ＵＳＡより低分子戒分の全面積比／　ｉ
ｎｔａｃｔ　ＨＳＡとＩｓ＾より低分子戒分の全面積比
）ｘｌＯＯ 参考例　ＨＳＡ産生酵母の調製 １，プラス主ド 或熟ヒト血清アルブミン（ＩＳＡ）分泌発現用プラスミ
ドベクター、ｐＹＮＯ２６を用いた。本プラスミドは、
ＧＡＬＩプロモーター、ＨＳＡ改変シグナル配列、Ｈ　
Ｓ　ＡのｃＤＮＡ及びＰＨ０５ターミネーターの順に連
結された塩基配列を含み大腸菌でＡｍｐ耐性、Ｋｍ耐性
酵母でＧ−４１８耐性を示す遺伝子とＬＥＵ２−を補う
遺伝子を有する、全長約１１．２ｋｂの大腸菌／酵母シ
ャトルベクターである。

（１）　　シグナルペプチド ＨＳＡシグナルペプチドの−５〜一ｌのアミノ酸配列を
ＳＵＣ２シグナルペプチドの−５〜＝１と置換し、更に
−３位をＶａｌに置換したＨＳＡ／ＳＵＣ２ハイブリド
シグナルペブチド２．プラスミドの酵母への導入 ヒト血清アルブ旦ン分泌発現用ブラスミドを酵母サツ力
口ミセスセレビシエＡ｝ｌ　２２（（’ｒｏｃ．　Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　７５．　１９２
９−１９３３（１９７８））に以下の方法により導入し
た。

ＹＰＤメディウム（イーストエキストラクト１０ｇ、バ
タトベプトン２０ｇを水に溶解し９００ｍ　ｌとした後
オートクレープ滅菌し、別にオートクレープ滅菌した２
０％グルコース１００ｍｌと混合した。）５０ｍｌ中３
０゛Ｃ、一夜振盪培養したサッカロミセスセレビシエＡ
Ｈ２２を遠心し、得られた細胞を水２０ｍ　ｌに懸濁後
、再度遠心して細胞を得た。これを１０ｍｌの５０ｍＭ
ジチオスレイトール、１．２Ｍソルビトール、２５ｍＭ
　Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａ　，　ｐｔ｛８．５に懸濁し、３０゜
Ｃで１０分間穏やかに振盪した。遠心により細胞を集め
、１．２Ｍソルビトール１０ｍｌに懸濁し、再度遠心に
より細胞を集めた。細胞を１０ｍｌの１．２Ｍソルビト
ールに懸濁し、遠心により細胞を集めた。細胞を１０ｍ
ｌの０．２　ｍｇ／ｍｌザイモリアーゼ１００　Ｔ，　
１．２　Ｍソルビトール、１０ｍＭ　Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａ、
０．１Ｍクエン酸ナトリウム、ｐｌ＋５．８に懸濁後、
３０゜Ｃで１時間穏やかに振盪した。遠心で細胞を集め
、１．２Ｍソルビトール、次いで１０ｍＭ塩化カルシウ
ム、１．２Ｍソルビトール各１０ｍｌで洗浄し、遠心で
細胞を集めた。細胞を１ｍｌの１０ｍＭ塩化カルシウム
、１．２Ｍソルビトールに懸濁した。懸濁液１００μｌ
を滅菌試験管にとり、５μｆ（５μｇ）のプラス旦ドと
混合し、室温に１５分間静置した。更に、１．２　ｍｌ
の２０％ポリエチレングリコール４０００、１０ｍＭ塩
化カルシウム、ｌｏ＋ｎＭ　トリスー塩酸、ｐＨ　７．
５を加え穏やかに混合後、室温で２０分間静置した。遠
心で細胞を集め、０．１　ｍｌの１．２　Ｍソルビトー
ル、ＩＯｍＭ塩化カルシウム含有ＹＰＤメディウムに懸
濁し、３０゜Ｃで３０分間穏やかに振盪した。懸濁液１
，　　５，　１０，　２０，及び５０μ℃をそれぞれ４
５゜Ｃに保温した１０ｍｌの１．２　Ｍソルビトール、
３％ノーブルアガー　２％グルコース、０．７％イース
トナイト口ジヱンベースにｇ５し、１．２Ｍソルビトー
ル、３％バタトアガー、２％グルコース、０．７％イー
ストナイトロジエンベースカラ成るプレー１・に拡げた
。プレートが固化したら、３０゜Ｃで３日間静置培養し
た。形威したコロニーを爪揚技で採取し、３ｍｌの０．
７％イーストナイト口ジェンベース、２％グルコースに
怒濁後、３０゜Ｃで２日間振盪培養した。そのうちの１
．５　ｍｌを遠心し、細胞を集め３ｍｌのＹＰＧメディ
ウム（イーストエキストラクト１０ｇ、バクトペプトン
２０ｇを水に溶解し９００ｍ　ｌとした後オートクレー
プ滅菌し、別にオートクレープ滅菌した２０％ガラクト
ース１００ｍｌと混合した。）に懸濁し、３０゛Ｃで振
盪培養した。

３．ヒト血清アルブミン分泌発現酵母の培養形質転換さ
れたヒト血清アルブミン蛋白質を分泌発現する酵母サッ
カロξセスセレビシエＡＨ２２を以下のように培養した
。０．７％イーストナイト口ジエンベース、２％グルコ
ース、３％バクトアガーから成るプレートで生育した上
記組み換え酵母を白金耳で採取し、５０ｍ　ｌの０．７
％イーストナイトロジェンベース、２％グルコースから
威るＹＮＢメディウムに接種し、３０℃で２日間培養し
た。

これを、更に５００ｍ　ｌのＹＮＢメディウムに全量接
種し、３０゜Ｃで２日間培養した。遠心により細胞を集
め、５００ｍｌのＹＰＧメディウムに懸濁し、３０”Ｃ
（ばか３名ノ

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 遺伝子操作により調製されたヒト血清アルブミン産生宿
   主を培養して得られたヒト血清アルブミンを含む培養上
   清を、アセチルトリプトファンあるいは炭素数６〜１２
   の有機カルボン酸またはその塩の存在下に５０〜７０℃
   で１〜５時間加熱処理することを特徴とするヒト血清ア
   ルブミンの製造方法。