JPH01117790A - プレアルブミンをコードする遺伝子を組込んだ組換えプラスミドおよびこれを用いたプレアルブミンの製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、ヒトのプレアルブミンをコードするｃＤＮＡ
を組込んだ組換えプラスミド、およびこれを酵母に導入
して得られた形質転換酵母によるプレアルブミンの製法
に間する．すなわち、ヒトの正常プレアルブミン、更に
は、ＦＡＰ患者の持つ異型プレアルブミンをコードする
ｃＤＮＡ断片を大腸菌および酵母の両方で増殖しつるシ
ャトルベクターに担われた形質発現調節領域（、プロモ
ーター）の下流に絹込んだ組換えプラスミドを得、これ
を酵母に与えて形質転換を起こさせて形質転換酵母とし
、これを培養させて産生されるプレアルブミン（正常プ
レアルブミンもしくは異型プレアルブミン）を得る方法
に関する。

プレアルブミンは血液中に、約３００μｇ／ｍ　Ｉ程度
存在する血清蛋白のひとつであり、血中ではこれが４分
子集合し分子量５５　、　０００の複合体として存在し
ている。この複合体は甲状腺ホルモンとの結合部位を２
ケ所持ち、同ホルモンの輸送に関与している、さらに、
この複合体はビタミンＡ結合蛋白の結合部位を４ケ所持
ち同ビタミンの輸送にも関与している。その他、プレア
ルブミンの詳細な機能に間してはまだ正確には解明され
ておらず、今後の研究成果が期待されている。

最近、Ｎ末端より３０番目のバリンがメチオニンに変異
した異型プレアルブミンが遺伝病家族性アミロイドニュ
ーロバチ−（ＦＡＰ）の病因と深くかかわっていること
が明らかにされ、そのＤＮＡを解析することで遺伝子診
断も可能となっている。

この中で、特にＦＡＰの病因と考えられる異型プレアル
ブミンはＦＡＰ患者の血液を原材料とせざるを得す、そ
の機能と病因との関連を解明する上で大きな制約がある
。

このような状況において、プレアルブミン特に異型プレ
アルアミンの原材料の入手における制約を解決できる有
力な手がかりとなるのは、遺伝子組換えを応用し量産を
可能にする技術の開発であろう。しかしながら、これま
でに遺伝子組換え等の技術を用いてプレアルブミンもし
くは異型プレアルブミンの発現を試みたような報告はま
だ見あたらず、勿論発現に成功した報告もない。

このような事情のもとに、本発明者らは、先に熊本大学
医学部の前出らがクローニングに成功したヒト由来のプ
レアルブミン遺伝子、異型プレアルブミン遺伝子（Ｍｉ
ｔａ　ｅｔ　ａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ
。

Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｎ＋ｕｎ、　１２４．５５８−５６４
１９８４）を用い、最初に大腸菌を宿主としてプレアル
ブミンの発現を試みた。しかしながらその結果としては
、好ましい成果は得られず、大ＭＷを宿主とした発現の
試みは失敗に終った。その後さらに本発明者らは酵母を
宿主として用いたプレアルブミンの量産について検討を
重ねた結果、酵母の遺伝子と大腸菌の遺伝子とを含みか
つ酵母のプロモーターの制御下にプレアルブミン遺伝子
を組込んだ新しい組換えＤＮＡを調製し、それによって
酵母を形質転換させ、かかる形質転換酵母を用いてヒト
由来のプレアルブミンと同じ分子量、免疫学的性質を有
するプレアルブミンを量産させることに成功し、本発明
を完成するに至った。

すなわち、本発明は、プレアルブミン遺伝子を組込んだ
新規な組換えプラスミド、それによる形質転換酵母およ
び該酵母によるプレアルブミンの生産方法を提供するも
のである。また、本発明はこれまでヒト血液からの分離
が難しく、試料の人手に問題があった異型プレアルブミ
ンに関してもこれを限界なく大量に供給することを可能
にするものである。

本発明のプレアルブミンの製法においては、大腸菌およ
び酵母の両方の遺伝子を備え、それらのいずれでも増殖
しうるシャトルベクターを用い、そのベクターに担われ
た酵母のプロモーターの下流にプレアルブミン遺伝子を
組込むことによりプレアルブミン遺伝子発現ベクターを
得る。このようにして得られるプレアルブミン遺伝子発
現プラスミドを常法により酵母に作用させて形質転換を
起こさせることにより所望の形質転換酵母が得られる。

この形質転換酵母を、使用した発現用プロモーターが効
率よく働く条件下に培養することにより所望のプレアル
ブミンが量産される。

本発明の完成によって、ｉｎ　ｖｉｔｒｏで人為的に任
意の部位のアミノ酸を変異させたプレアルブミンが容易
にかつ量的に入手し得る手段が解決されたもので、本新
技術はきわめて興味ある知見を今後生み出す可能性を提
供するものである。

本技術は、ヒト血液を原材料とせず、ヒトプレアルブミ
ンを容易に入手し得る手段も同時に与えるものであり、
今後の該蛋白の医薬品化において、従来の方法でヒト血
液から精製した場合のようにヒト血液に由来する未知の
感染性因子の混入を考慮することのない極めて安全かつ
低コストでのプレアルブミン製剤を供給することを可能
にするものである。さらには、試料の人手に間して制約
があった、異型プレアルブミンについても、本発明によ
りその制約が解決され、これを容易にしかも無限に提供
することが可能となり、今後のＦＡＰに間する研究に大
きく貢献するものと考えられる。

以下に本発明の組換えプラスミド、形質転換酵母、およ
びそれによるプレアルブミンの生産についてさらに詳細
に説明する。

（１）プレアルブミン遺伝子 本発明で用いられるプレアルブミンをコードするｃＤＮ
Ａは、ヒトの肝臓より調製したｍＲＮＡを出発材料とし
て、常法に従い逆転写酵素により二本鎖ｃＤＮＡを合成
し、これを大腸菌によりクローニングしたものである。

クローニングされたプレアルブミン遺伝子はプレアルブ
ミン蛋白をコードする全領域を含み、第２図に示す塩基
配列を有する。

本発明において調製されたプレアルブミンｃＤＮＡは、
６６９塩基対からなり、アミノ酸をコードする領域の完
全な配列を含む、さらに、プレアルブミンｃＤＮＡは５
ξ非翻訳領域に２６．３′−非翻訳領域に１６１の塩基
対を含む。

第１図の制限酵素図および第２図に示す塩基配列を有す
るＤＮＡ断片が大腸菌プラスミドＯｋａｙａｍａ−Ｂｅ
ｒｙベクターにオリゴｄＧ、　ｄＣ法により挿入された
ものを、通常はＰｓｔ　Ｉ　−Ｐｙｕ　ＩＩで処理して
プレアルブミン遺伝子断片を得、後述のプラスミド構築
に供する。必要に応じ、成熟プレアルブミンを直接組換
え酵母に発現させるために、翻訳される第１番目から２
０番目までのアミノ酸、すなわちシグナルペプチドの部
分をコードする遺伝子を予め除去しておくこともできる
。この場合には、開始コドンのＡＴＧも同時に除去され
るため、後に述べるシャトルベクターにプレアルブミン
遺伝子を組み込む際に開始コドンとなるＡＴＧを付は加
える工夫が必要となる。

なお、本発明で述べるプレアルブミン遺伝子は、第２図
に示す塩基配列を有するものに限定されるものではない
。

また、異型プレアルブミンをコードする遺伝子も、ＦＡ
Ｐ患者の肝臓よりｌＷ製したｗＲＮＡより同様にして異
型プレアルブミンをコードするｃＤＮＡを調製すること
ができる。このようにして得られた異型プレアルブミン
遺伝子は、正常のプレアルブミン遺伝子配列と比較して
、１塩基の違シ）シかなく、プレアルブミン遺伝子の翻
訳開始コドンを＋１とした場合に第１４９番目（＋１４
９）のシトシンがアデニンに変異しているだけである。

また、異型プレアルブミンの遺伝子は、正常プレアルブ
ミン遺伝子を用い、この遺伝子にポイントミューチージ
ョンを起こさせ必要な箇所のみ塩基を変換することによ
っても調製することができる。

（２）シャトルベクター 本発明で用いられるシャトルベクターは、酵母の遺伝子
と大腸菌の遺伝子とを含みかつ酵母の形質発現調節領域
を担ったプラスミドベクターである。

この酵母の遺伝子としては、一般に、プラスミドが酵母
中で染色体と独立して増殖するのに必要なりＮＡ配列、
例えば酵母染色体の複製に必要なりＮＡ配列（ａｒｓｌ
）、２μｍＤＮＡの複製に必要なりＮＡ配列（２μｏｒ
ｉ）があり、所望により、さらに形質転換酵母の選択マ
ーカーとなる遺伝子が含まれる。この選択マーカーとし
ては、ロイシン産生遺伝子、ヒスチジン産生遺伝子、ト
リプトファン産生遺伝子、ウラシル産生遺伝子、アデニ
ン産生遺伝子などが含まれ、これらの１種または２種以
上が用いられる。

大腸菌側の遺伝子としては大腸菌体内においてプラスミ
ドが増殖するために必要なりＮＡ配列、例えばＣｏ１Ｅ
ｌ系のプラスミドの複製起点のＤＮＡ配列（ｏｒｉ）を
有し、好ましくはさらに形質転換大腸菌の選択マーカー
となる遺伝子を含む、この選択マーカーの遺伝子として
はアンピシリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、
テトラサイクリン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐
性遺伝子などが挙げられ、これらの遺伝子の１種または
２種以上が用いられる。このような大ｌｉ菌［ＩＮＡと
してアンピシリン耐性遺伝子とテトラサイクリン耐性遺
伝子を有するｐＢＲ３２２が一般に汎用されている。

紐換え酵母によりプレアルブミンを産生させるために必
要な形質発現調節領域（プロモーター）には酵母由来の
ものが用いられる。好ましいプロモーターの例としては
、酸性フｔスファターセプロモーターやグルタルアルデ
ハイドデヒドロゲナーゼプロモーターのように本来酵母
に必要な酵素等の形質発現を行うプロモーター等が挙げ
られる。

具体的な一例として酵母の抑制性酸性ホスファターゼプ
ロモーターが挙げられるが、酸性ホスファターゼプロモ
ーターは通常ホスファターゼを構成する６０，０００ダ
ルトンのポリペプチド（ｐ６０）のプロモーターであり
、そのプロモーター活性もかなり強力で、且つ培地中の
リンｗＳ度をコントロールすることによってプロモータ
ー活性を制御できることに大きなメリットがある。

このようなシャトルベクターの代表的な例は、本発明者
らにより調製された。酵母側の遺伝子としてａｒｓｌ、
２μｏｒｉおよびロイシン耐性遺伝子（Ｌｅｕ２）を有
する酵母ＤＮＡと大腸菌プラスミドｐＢＲ３２２とを絹
み合わせたシャトルベクターＰＡＭ８２　（特開昭５９
−３６６９９）であり、これはつぎのようにして構築さ
れる。

酵母５２８８Ｇ　ＤＮＡバンクより得られた抑制性酸性
ホスファターゼを構成する６０　、０００ダルトンのポ
リペプチド（ｐ６０）の遺伝子を含む約８０００塩基対
（８にｂ）の制限酵素ＥｃｏＲＩ断片［ＰＮＡＳ、　７
７巻、６５４１〜６５４５頁、（＋９８０）およびＰＮ
ＡＳ、　７９巻、２１５７〜２１６１頁、（１９８２）
を参Ｎ］を公知の大腸菌プラスミドｐＢＲ３２２［５ｕ
ｔｃｌｉｆｆｅ、Ｊ、Ｇ、、Ｃｏ１ｄ　５ｐｒｉｎ８Ｈ
ａｒｂｏｒ　Ｓｙ＋ｍｐｏｓｉｕｍ、４３巻、７７〜９
０頁、（１９７９）を参照］のＥｃｏＲ１部位に挿入し
て得られるプラスミドを出発材料とする。

なおこの８にｂＤＮＡ断片は制限酵素５ａｌＩの認識部
位を約２．８にｂと約５．２にｂに分ける位置に１個所
有し、２．８Ｋｂ側がｐＢＲ３２２のアンピシリン耐性
遺伝子側になるように挿入されている。

このプラスミドを制限酵素Ｓａｌ　Ｉで切断し、さらに
Ｔ４ＤＮＡリガーゼにより再アニールさせてｐＢＲ３２
２の５ａ１１部位から酸性ホスファターゼ遺伝子断片の
５．２Ｋｂ側を失ったプラスミドを得、これをｐＡＴ２
５と称する。このρＡＴ２５はｐＢＲ３２２のアンピシ
リン耐性遺伝子を含むＥｃｏＲ１部位から５ａｌＩ部位
までの約３．７にｂの断片と酵母の酸性ホスファターゼ
遺伝子のＥｃｏＲＩ部位から５ａｌ１部位までの約２．
８にｂの断片がそれぞれ対応する末端同志で結合したプ
ラスミドである。つぎに、上記ｐＡＴ２５のＥｃｏＲ１
部位に、酵母の自律増殖に必要なりＮＡ配列（ａｒｓｌ
）および酵母のＴｒｐｌ遺伝子を含む１．４にｂのＥｃ
ｏＲＩ断片［Ｐｒｏ、　ＮＡＳ。

７６巻、１０３５〜１０３９頁、（１９７９）を参照コ
を挿入する。

得られたプラスミドをｐＡＴ２６と称する。なおこのａ
ｒｓｌ−Ｔｒｐｌを含む断片は、そのＴｒｐｌ遺伝子内
に制限酵素旧ｎｄｍの認識部位を１個所有する。

上記ｐＡＴ２６の旧ｎｄｍ部位に酵母のロイシン産生遺
伝子（Ｌｅｕ２）と２μｍＤＮＡの複製に必要なりＮＡ
配列（２μｏｒｉ）を含むＨｊｎｄｍ断片（Ｔｏｈｅ、
　Ａ、、　Ｇｕｅｒｒｙ。

Ｐ、、　Ｗｉｃｈｅｎｅｒ、　Ｒ，Ｂ、；　Ｊ、　Ｂａ
ｃｈｔｅｒｉｏｌ、　１４１．４１：３−４１６、１９
８０を参ｐｊりを挿入する。このようにして得られるプ
ラスミドがシャトルベクターｐＡＴ？？　（特開昭５９
−３６６９９を参照）である。

このｐＡＴ７７は、大腸菌の遺伝子としてｐＢＲ３２２
のアンピシリン耐性遺伝子（Ａｐ’　）を含むＥＣＯＲ
Ｉ部位から５ａｌ１部位までを有し、一方酵母の遺伝子
として、ｐＢＲ３２２と結合したＥｃｏＲ１部位よりａ
ｒｓｌ、２μｏｒｉ。

しｅｕ２遺伝子の順に位置し、さらにそのつぎに酸性ホ
スファターゼ遺伝子の上流から５ａｌ１部位までを有す
る。そしてそのＥｃｏＲＩおよび５ａｌＩ部位でこれら
大腸菌遺伝子と酵母遺伝子が結合した構造となっている
。このｐＡＴ７７は大腸菌内においてはｐＢＲ３２２の
複製起点ＤＮＡ配列（ｏｒｉ）により増殖、し、また酵
母内においてはａｒｓｌおよＵ２μｏｒｉにより増殖可
能となる。さらにこのプラスミドは、選択マーカーとし
てアンピシリン耐性遺伝子（Ａｐ’　）およびロイシン
産生遺伝子（Ｌｅｕ２）を有しており、大腸菌、酵母菌
のいずれの細胞内でも増殖でき、シャトルベクターとし
ての条件を充分に満たしている。

なお、このシャトルベクターを用いるのは、後記組換え
プラスミドを大腸菌を用いて調製するためであり、該組
換えプラスミドで酵母を形質転換する段階に至っては、
大腸菌の遺伝子は除去されても問題はない。

このようなシャトルベクターｐＡＴ７７を制限酵素５ａ
ｌｌで処理して開裂させ、ついでこれをエキソヌクレア
ーゼＢＡＬ３１で処理することにより酸性ホスファター
ゼ構造遺伝子の一部または全部と、所望によりさらにそ
の上流の種々の部分まで除去する。

この除去は酸性ホスファターゼ構造遺伝子の上流−５０
ｂｐＯ前までの適当な部位まで行われ、エキソヌクレア
ーゼ処理条件により適宜調節される。

上記のようにして酸性ホスファターゼ構造遺伝子全部も
しくはさらにその上流部分を除去したのち、この部位に
合成または天然のリンカ−１例えば５ａｌｌリンカ−ま
たはＸｈｏ　Ｉリンカ−を組込み再び環状プラスミドに
戻すことにより、酸性ホスファターゼプロモーターの制
御下に外来性遺伝子を純粋な形で発現させ得るシャトル
ベクターが得られる。このようにして酸性フォスファタ
ーゼ構造遺伝子の上流−３３ｂｐまで除去したシャトル
ベクターが、ｐＡＭ８２である。

このシャトルベクターは、通常の制限酵素５ａｌＩまた
はＸｈｏ　Ｉで処理することにより容易にその鞘込み部
位を開裂させることができるため、所望の遺伝子を組込
むのに好適である。このようなシャトルベクターｐＡＭ
８２に間しては本発明者らにより特開昭５９−３６６９
９として特許出願されており、なお、このｐＡＭ８２を
サツカロミセス・セレビシェＡＨ２２に組込んだもの（
サツカロミセス争セレビシェＡＨ２２／ｐＡＭ８２）は
微工研条寄第３１３号として寄託されている。

（３）プレアルブミン遺伝子発現プラスミドの構築本発
明の組換えプラスミド、すなわちプレアルブミン遺伝子
を組込んだプラスミドの調製は、まず前記シャトルベク
ターを使用したリンカ−に対応する制限酵素、例えば５
ａｌｌまたはＸｈｏ　Ｉにて処理して開裂させ、これに
上記プレアルブミンＤＮＡを作用させて連結させる。こ
れを大腸菌にて増幅し、各種制限酵素分析によって正し
い配位に組込まれたもののみを選択し、目的とする組換
えプラスミドを得る。

（４）酵母の形質転換 形質転換されるべき酵母としては、プラスミドで担われ
た形質転換酵母の選択マーカー遺伝子によって相補され
る変異を持った変異株、例えばロイシン要求性変異株で
あるサツカロミセス・セレビシｘ　（Ｓａｃｃｈａｒｏ
ｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）　　ＡＨ２２（ａ
ｌｅｕ２　ｈｉｓ４　Ｃａｎ１　（Ｃｉｒ”））、サツ
カロミセス争セレビシェ（Ｓａｃｃｈａｒｏａ＋ｙｃｅ
ｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）　ＡＨ２２ｐｈｏ８０（ａ
　Ｉｅｕ２　ｈｉｓ４　Ｃａｎ１　（Ｃｉｒ”″）　ｐ
ｈｏ１３０）などを用いる。上記組換えプラスミドを大
腸菌にて増殖させたのち、該酵母変異株に常法により作
用させ、例えばスフェロプラスト化したのちカルシウム
処理した菌体とプラスミドＤＮＡを混合して形質転換を
起こさせる。このように処理された酵母をベクター上に
担われている宿主酵母の変異を相補する遺伝子、例えば
ロイシン産生遺伝子の発現を指標として形質転換酵母を
選択し、分離する。

なお、酵母としてはロイシン要求性変異株のほかに、ヒ
スチジン要求性変異株、トリプトファン要求性変異株、
ウラシル要求性変異株、アデニン要求性変異株などが挙
げられる。

（５）形質転換酵母の培養およびプレアルブミンの生産 上記の方法で得られた形質転換酵母を培養し目的のプレ
アルブミンを得る。この場合、用いたプロモーターに応
じて培養条件を工夫することが好ましい０例えば、酸性
ホスファターゼプロモーターを使用した場合には、得ら
れた形質転換酵母をリン酸を含む培地にて通常の培養条
件下に前培養し、対数増殖期にある面体をリン酸を含ま
ない培地に移しかえて酸性ホスファターゼプロモーター
が抑制されない条件下に培養する。培養後、シグナルペ
プチド領域を除去したプレアルブミン遺伝子を用いた場
合には菌体内に、またシグナルペプチド領域を含む全プ
レアルブミン遺伝子を用いた場合には、その培ＩＩ液中
および画体膜表面に分泌されたプレアルブミンが多量に
集積される。なお、用いる酵母の種類により、例えばＰ
ｈｏ８０変異株を用いた場合には、酸性ホスファターゼ
プロモーターを抑制しない条件をとくに採用する必要は
なく、該形質転換酵母を直接培養して所望のプレアルブ
ミンを大量に産生させることができる。

上記方法で得られるプレアルブミンは免疫学的にヒトの
血中に存在するものと区別し難く、また、プレアルブミ
ンが培地中に分泌、放出されることから、酵母における
蛋白質分泌研究のモデルとしても有用である。

つぎに実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明する
。

ｌ：　　　し　　ル　　ミゝ　の （１）プレーアルブミン遺伝子の￥［１（１）ｍＲＮＡ
の精製 ヒト肝臓は手術時に摘出し、液体窒素中にて直ちに凍結
し、これを用いて、チャーウィンら　（Ｃｈｉｒｇｗｉ
ｎ　ｅｔ　ａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　２４
５２９４−５２９９゜１９７９）の方法に従って、ｍＲ
ＮＡを調製した。

（Ｕ　）ｃＤＮＡの合成および大％１ｉｌｉＨＢ１０１
の形質転喚ヒト肝臓より得たｍＲＮＡをもとに０ｋａｙ
ａａ＋ａ−Ｂｅｒｇ法（Ｏｋａｙａｎ＋ａ、　Ｈ，ａｎ
ｄ　Ｂｅｒｇ、　Ｐ、、　Ｍｏ１．　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏ
ｌ、　２゜１６１−１７０．１９８２）により、ｃＤＮ
Ａを含むプラスミドを作製し、これを大腸菌Ｈ８１０１
に形質転換し、ＣＤＮＡライブラリーを調製した。

（ｍ）プレアルブミンｃＤＮＡの同定 Ｋａｎｄａら　（にａｎｄａ、　Ｙ、　ｅｔ　ａｌ、　
　Ｊ、　Ｒｉｏｔ、　Ｃｈｅ＋ｗ、。

２４９、６７９６−６８０５．１９７４）によって明ら
かにされているプレアルブミンのアミノ酸配列をもとに
Ａｓｐ６Ｌ−に１ｎ１１２に相当する部分の合成りＮＡ
ｌ６種を合成し、これをＷａｌｌａｃｅら（讐ａｌｌａ
ｃｅ、　Ｒ，Ｂ、　ｅｔ　ａｌ、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａ
ｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、　６．３５４３−３５５７．１９
７９）の方法により（ｒ−３２Ｐ）　ＡＴＰでラベルし
、これをプローブとしてｃＤＮＡライブラリーのスクリ
ーニングを行い、プレアルブミン遺伝子を含む大腸菌を
選び出した。

（ｍＶ）プラスミドＤＮＡの！！ｌｌ製プレアルブミン
遺伝子を含む大腸菌より松原ら（門ａｔｓｕｂａｒａ　
　ｅｔ　　ａｌ、　　Ｊ、　　Ｖｉｒｏｌ、、　　１６
．　４７９−４８５゜１９７５）の方法によりプラスミ
ドを調製した。

このプラスミドはＯｋａｙａｍａ−Ｂｅｒｇベクターに
プレアルブミンをコードする全領域のＣＤＮＡがクロー
ニングされたものであり、これをｐＰＡｌとした。

（２）　シ＋　）　ルヘ’）９−ｐＡＭ８２（７）ｒＡ
ｉ！酵母５２８８ＧＤＮＡバンクより得られた抑制性酸
性ホスファターゼを構成する５ｏｏｏｏダルトンのポリ
ペプチド（ｐ６０）の遺伝子を含む約８０００塩基対（
８Ｋｂ）の制限酵素ＥｃｏＲＩ断片を大腸菌プラスミド
ｐＢＲ３２２のＥｃｏＲ１部位に挿入して得られるプラ
スミドを出発材料とし、これを制限酵素５ａｌｌで切断
し、さらにＴ４ＤＮＡリガーゼにより再アニールさせて
ｐＢＲ３２２の５μ１１部位から酸性ホスファターゼ遺
伝子断片の５．２Ｋｂ側を失ったプラスミドｐＡＴ２５
　（これはｐ８Ｒ３２２のアンピシリン耐性遺伝子を含
むＥｃｏＲ１部位から５ａｌｌ部位までの約３．７Ｋｂ
の断片と酵母菌の酸性ホスファターゼ遺伝子のＥｃｏＲ
１部位から５μ１１部位までの約２．８Ｋｂの断片がそ
れぞれ対応する末端同士で結合したプラスミドである）
を得る。

つぎに、このｐＡＴ２５のＥｃｏＲＩ部位に、プラスミ
ドＹＲＰ７をＥｃｏＲＩ処理することによって得られる
ａｒｓｌおよびＴｒｐｌ遺伝子を含む１．４ＫｂのＥｃ
ｏＲ１断片を挿入してプラスミドＦＡＴ２６を得る（こ
のａｒｓｌ−Ｔｒｐｌを含む断片は、そのＴｒｐｌ遺伝
子遺伝側内酵素旧ｎｄｍの・認識部位を！固有する）。

上記ｐＡ７２６の旧ｎｄｕＩに、プラスミドｐｓＬＥ１
を旧ｎｄｍで処理して得られる酵母のＬｅｕ２および２
μ０「１を含む旧ｎｄｍ断片を挿入してシャトルベクタ
ーｐＡＴ７７を得る。このｐＡＴ７７をサツカロミセス
・セレビシェＡＨ２２に組込んだもの（サツカロミセス
・セレビシェＡＨ２２／ｐＡＴ？？）は微工研条寄第３
２４号として寄託されている。

上記の方法で得られたｐＡＴ７７　（１Ｍｇ）を５ａｌ
ｌで開裂したのち、２０ｎ＋Ｍ　）リス−ＩＣ＋（ｐＨ
８，２）、１２ｍＭＣａＣｌ２．１２−Ｍ　ＭｇＣｌ２
．０．２Ｍ　ＮａＣｌ、１ｍＭ　ＥＤＴＡ溶液５溶液５
巾 ！分間作用させる．ついでフェノール抽出、エタノール
沈澱を行ったのち、Ｘｈｏ　Ｉリンカ−１ｐｍｏｌとＴ
４ＤＮＡリガーゼの反応条件下で１２時間結合を行う．
この反応溶液で大腸菌ｘ　１７７Ｂを形質転換し、得ら
れたアンピシリン耐性の形質転換体よりプラスミドＤＮ
Ａ′Ｉｔｌｌ１１シ、各θＨＡについてマキサム−ギル
バートの方法（Ｍａｘａｍ，　Ａ，　＆　Ｇ１１ｂｅｒ
ｔ，　Ｗ．；　Ｐｒｏ．　Ｎ．Ａ．Ｓ。

、　７４，　５６０〜５６４を参照）に従い、塩基配列
を調べ、ＢＡＬ３１処理により除去された酸性ホスファ
ターゼ遺伝子領域を決定する．これら中からホスファタ
ーゼ構造遺伝子領域が完全に除去されたプラスミドｐＡ
Ｍ８２　（第３図）を得る。

ホスファターゼ構造遺伝子の産物ｐ６０の最初のアミノ
酸であるメチオニンをコードするコドンＡＴＧのＡを÷
１として、ｐＡＭ８２は−３３まで除去されたものであ
る．なお、このｐＡＭ８２をサツカロミセス中セレビシ
ェＡＨ２２に組込んだもの（サツカロミセス・セレビシ
ェＡＨ２２／ｌ）ＡＭ８２）は微工研条寄第３１３号と
して寄託されている。

（３）プレアルブミン遺伝子発現プラスミド（　ｐＮＰ
Ａｌ）の調製 プレアルブミンをコードする全領域（第１図参照）を含
むＤＮＡ断片が挿入されているプラスミドｐＰＡ１（３
μｇ）を制限酵素Ｈａｅｍ、Ｘｂａ　１で切断処理し、
６３−１０８番目の４６ｂｐよりなるＤＮＡ断片を精製
し、これに、ＥｃｏＲＩの切断端を持つ合成りＮＡを結
合し、これをさらに、ＥｃｏＲＬ　Ｘｂａ　Ｉで切断処
理したプラスミドｐυＣ１９のＥｃｏＲ１−Ｘｂａ　Ｉ
サイドに挿入した。ついで、このプラスミドをＸｂａ　
Ｉ、Ｈｉｎｃ■切断処理し、これに、ｐＰＡ　１をＸｂ
ａ　Ｉ、Ｐ、ｖｎ■切断処理して得た５７０６ｂｐのＤ
ＮＡ断片を挿入した。このようにして得たプラスミドは
、プレアルブミンのシグナル領域が除去され、さらに両
駅開始コドンとしてＡＴＧが、即ちＮ末端メチオニンが
付加されたプレアルブミンｃＤＮＡを持ったことになる
。つぎに、このプラスミドをＥｃｏＲＩ　、Ｈｉｎｄｍ
て切断処理してプレアルブミンのｃＤＮ八部へを切り出
し、これにＸｈｏ　Ｉリンカ−を結合した。

このようにして末端がＸｈｏ　Ｉ切断末端となったプレ
アルブミン遺伝子断片を得た。このＤＮＡ断片とＸｈｏ
　Ｉで開裂されたシャトルベクターｐＡＭ８２を、分子
比５：１で混ぜＴ４ＤＮＡにより結合させた後、この反
応液で大腸菌Ｈ８１０１を形質転換した。得られたアン
ピシリン耐性の形質転換体よりプラスミドＤＮＡを調製
し、それらについて、ＥｃｏＲＩ、Ｘｂａ　Ｉ、Ｘｈｏ
　Ｉで分析することにより、ベクターへのプレアルブミ
ン遺伝子の組込みおよびその方向を確認した。

選び出されたプラスミドはベクターのホスファターゼプ
ロモーターの下流にプレアルブミン遺伝子が正しい向き
に挿入されたものであり、これをプレアルブミン遺伝子
発現プラスミドρＮＰＡＩと称する。

プレアルブミン遺伝子発現プラスミドの構築の流れを示
したものを第４図に示した。

（４）形質転換酵母の調製 酵母としてサツカロミセスφセレビシェＡｌＩ２２［ａ
Ｉｅｕ２　ｈｉｓ４　Ｃａｎｔ　（Ｃｉｒ”″）］（微
工研条寄第３１２号）を用い、これをＹＰＤ培地（２％
ポリペプトン、１ｚイーストエキス、２χグルコース）
　１００ｍ１に接種し、３０°Ｃで一晩培養したのち、
遠心して集菌する。滅苗水２０ｍ　ｌにて菌体を洗浄し
、ついで１．２Ｍソルビトールおよび１００μｇｅｍ　
Ｉチモリアーゼ６０，０００　（生化学工業製）の溶液
５１に懸濁させ、３０℃で約３０分間保ち、スフェロプ
ラスト化する。ついで、スフェロプラストを１．２Ｍソ
ルビトール溶液で３回洗浄したのち、２Ｍソルビトール
、ｌ０ｍＭＣａＣｌ２および１０ｄ）リス−１１ｃＩ　
（ｐＨ７，５）の溶液０．６１に懸濁させ、その６０μ
ｍずつを小試験管に分注する。これに前記（３）で調製
した組換えプラスミドｐＮＰＡ１溶液３０μ！を加え、
充分混合し、さらに０．１ＭＣａＣｌ２（３μｍ）加え
て最終濃度１０１１ＭＣＩ１０１ｌとし、室温に５〜１
０分間放置する。ついでこれに、２０χポリエチレング
リコール４０００．１０ｍＭＣａＣ１ｐおよび１０ｍＭ
　）リス−ＨＣＩ（ｆｌＨ７，５）ｌ液１１ずつを加え
て混合し、室温に約２０分間放置する。この混合液０．
２１ずつを４５℃に保温された再生培地（２２％ソルビ
トール、２ｘグルコース、０．７ｘイーストニトロゲン
ベースアミノ酸、２χＹＰＤ、　２０ｄｇ／ｍ　Ｉヒス
チジン、３χ寒天）１０１に加え、軽く混合させ、予め
準備された１、２Ｍソルビトール含有最小培地（０，７
＄イーストニトロゲンベースアミノ酸、２ｘグルコース
、２０ｄｇ／ｍｌヒスチジン、２χ寒天）プレートに重
層し、固化させたのち、３０℃で培養してロイシン非要
求性酵母のコロニーを得る。このコロニーを２０ｄｇ／
ｓ＋Ｉヒスチジンを含むバルクホルダーミニマルメディ
ウム（Ｔｏｈｅ、　Ａ、　ｅｔ　ａｌ；　Ｊ、　Ｂａｃ
ｈｔｅｒｏｌ、。

１１３、７２７〜７３８（１９７３）を参照）にて培養
して形質転換酵母サツカロミセス・セレビシェｐＮＰＡ
１を得る。

（５）形質転換酵母によるプレアルブミンの製法前記（
４）で得られた形質転換酵母の各コロニーをさらに２０
ｄｇ／ｍｌヒスチジンを含むバルクホルダーミニマルメ
ディウムの寒天プレート上に塗布し、３０℃にて培養し
てコロニーを形成させる（ロイシン非要求性となった形
質転換体の再確認のため）ついでこのコロニーから菌体
を分離し、２０μ８／渭１ヒスチジンを含むバルクホル
ダーミニマルディウム１０ｍ１に接種し、３０℃にて培
養を行う。約２４時間後、対数増殖期にある菌体を遠心
して集菌し、これをリン酸を含まない最小培地（バルク
ホルダーミニマルメディウムに含まれるＫＨ２ＰＯをＫ
ＣＩで置換し、さらに２０ｄｇ／ｍ　Ｉヒスチジンを加
えたもの）１０１に菌数約４Ｘ　１０’ｃｅｌｌｓ／ａ
＋ｌになるように懸濁し、３０℃にて培養を続けた。こ
のようにして酵母菌体内に産生されたプレアルブミンを
得た。

リン酸濃度を低下させ、プロモーター活性を誘導する前
後でのプレアルブミンの酵素免疫測定による測定値を後
記実施例２の第１表中に示した。

２：　　　リ　　し　　ル　　ミンの （１）異型プレアルブミン遺伝子の調製ＦＡＰ患者の肝
臓を手術時に摘出し、実施例１の場合と同様にして異型
プレアルブミンをコードするｃＤＮＡを調製し、これ−
をＯｋａｙａｍａ−Ｂｅｒｇベクターにクローニングし
、これをプラスミドｐＰＡ３とした。

（２）異型プレアルブミン遺伝子発現プラスミド（ｐＭ
ＰＡｌ）の調製 この異型プレアルブミンをコードする゛全領域を含むＤ
ＮＡ断片が挿入されているプラスミドｐＰＡ３　（３μ
ｇ）を用い、実施例１と同様にしてシャトルベクターｐ
ＡＭ８２の酸性ホスファターゼプロモーター下流に異型
プレアルブミン遺伝子が組み込まれている発現プラスミ
ドｐＭＰＡ１を得た。

（３）形質転換酵母による異型プレアルブミンの製法前
記のプラスミドｐＭＰＡ＋を実施例１と同様に酵母サツ
カロミセス・セレビシェＡｌ２２に導入し、形質転換酵
母を得、これを同様に培養した。第１表にリン酸濃度を
低下させ、プロモーター活性を導入する前後での異型プ
レアルブミンの酵素免疫測定の結果を示した。

第１表 前記実施例１および実施例２により得られたプレアルブ
ミン（正常）および異型プレアルブミンの免疫学的性状
をヒト血液由来のプレアルブミンのそれと比較すること
により調べた。

そ゛の結果、正常プレアルブミンを産生じている酵母菌
を破砕して得られる粗抽出液の酵素免疫測定における反
応性は、ヒト血液由来のプレアルブミンのそれと同一で
あることが確認されたく第５図）。ざらに、ウェスタン
プロットの結果からも、酵母産生正常プレアルブミンは
ヒト血液由来プレアルブミンと同一の分子量を有してい
ることが確認された。　（第６１！！Ｉ、　　レーンｌ
：ヒト血清由来プレアルブミン、レーン２：正常プレア
ルブミン発現酵母菌体破砕液、レーン３：異型プレアル
ブミン産生酵母面体破砕液、レーン４：陰性コントロー
ル用宿主酵母面体破砕液） また、実施例２における異型プレアルブミンも同様にＦ
ＡＰ患者血液由来の異型プレアルブミンと免疫学的に同
一であることが判明した。　（第５図、第６図参照） ４、図の簡単な説明 第１図は、プレアルブミン遺伝子の制限酵素切断地図、
第２図はプレアルブミン遺伝子の塩基配列とこれから予
想されるアミノ酸配列を示す。

第３図は、シャトルベクターｐＡＭ８２のプラスミド図
を示す。

第４図はプレアルブミン遺伝子発現プラスミドの構築図
を示す。

第５図は酵母産生正常プレアルブミン、異型プレアルブ
ミンおよびヒト血液由来プレアルブミンの酵素免疫測定
における反応性を示す。

第６図はヒト血液由来プレアルブミン（レーンｌ）、酵
母産生正常プレアルブミン（レーン２）、酵母産生異型
プレアルブミン（レーン３）および宿主酵母菌粗抽出液
（レーン４）のウェスタンプロット像を示す。

Ｅ；大腸菌由来遺伝子 ｉ４〇− 第４図 吸光度（ｏＤ４５ｏ）

Claims (14)

【特許請求の範囲】
1. （１）酵母の遺伝子と大腸菌の遺伝子を含み、かつ酵母
   の形質発現調節領域を担うシャトルベクターであり、そ
   の形質発現調節領域下流にヒトのプレアルブミンをコー
   ドするｃＤＮＡを組込んだことを特徴とする組換えプラ
   スミド。
2. （２）該ｃＤＮＡがヒトの正常プレアルブミンをコード
   する遺伝子である前記第（１）項記載の組換えプラスミ
   ド。
3. （３）該ｃＤＮＡがヒトの正常プレアルブミン遺伝子か
   ら翻訳される第１番目から第１４７番目アミノ酸までの
   ペプチドをコードする遺伝子を含む前記第（２）項記載
   の組換えプラスミド。
4. （４）該ｃＤＮＡが下記の遺伝子配列を含む遺伝子断片
   である前記第（３）項記載の組換えプラスミド。 【遺伝子配列があります】
5. （５）該ｃＤＮＡがヒトの正常プレアルブミン遺伝子か
   ら翻訳される第２１番目から第１４７番目アミノ酸まで
   のペプチドをコードする遺伝子を含む前記第（２）項記
   載の組換えプラスミド。
6. （６）該ｃＤＮＡが下記の遺伝子配列を含む遺伝子断片
   である前記第（５）項記載の組換えプラスミド。 【遺伝子配列があります】
7. （７）該ｃＤＮＡがＦＡＰ患者が持つ異型プレアルブミ
   ンをコードする遺伝子である前記第（１）項記載の組換
   えプラスミド。
8. （８）該ｃＤＮＡがＦＡＰ患者が持つ異型プレアルブミ
   ン遺伝子から翻訳される第１番目から第１４７番目アミ
   ノ酸までのペプチドをコードする遺伝子を含む前記第（
   ７）項記載の組換えプラスミド。
9. （９）該ｃＤＮＡが下記の遺伝子配列を含む遺伝子断片
   である前記第（８）項記載の組換えプラスミド。 【遺伝子配列があります】
10. （１０）該ｃＤＮＡがＦＡＰ患者が持つ異型プレアルブ
    ミン遺伝子から翻訳される第２１番目から第１４７番目
    アミノ酸までのペプチドをコードする遺伝子を含む前記
    第（７）項記載の組換えプラスミド。
11. （１１）該ｃＤＮＡが下記の遺伝子配列を含む遺伝子断
    片である前記第（１０）項記載の組換えプラスミド。 【遺伝子配列があります】
12. （１２）前記第（１）項の組換えプラスミドを酵母Ｓａ
    ｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに導入
    することにより形質転換酵母を得、この形質転換酵母を
    培養することを特徴とするヒトプレアルブミンの製法。
13. （１３）該プレアルブミンがヒトの正常プレアルブミン
    である前記第（１２）項記載の製法。
14. （１４）該プレアルブミンがヒトの異型プレアルブミン
    である前記第（１２）項記載の製法。