JPH03108486A - ヘパリナーゼをコードするプラスミド、このプラスミドを保持するヘパリナーゼ生産株及びヘパリナーゼの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、ヘパリナーゼをコードする新規プラスミド、
このプラスミドを含む新規ヘパリナーゼ生産株、及びヘ
パリナーゼの新規製法に関する。

（従来の技術〕 ヘパリナーゼは、ヘパリン、つまり、主要繰り返し単位
として、−４）−２−デオキシ−２−スルファミノ−α
−Ｄ−グルコビラノース−６−サルフェート−（１，４
）　　−α−Ｌ−イドピラノシルウロン酸−２−硫酸−
（１−を有する硫酸化ゲルコサミノグリカンのある種の
グリコシド結合を切断する酵素である。この酵素活性の
生産物はヘパリンの鎖の短くなった断片である。ヘパリ
ナーゼ、又、ヘパリチン（ヘパラン硫酸として知られて
いる）、つまり、ヘパリンに類似の化学構造を有する硫
酸化ポリマーを切断し、ヘパリチンの鎖が短くなった断
片を生成するものである。

基質であるヘパリンは抗凝血剤として広く使用されてお
り、このため、ヘパリナーゼはヘパリンの構造研究、血
液凝固メカニズムの研究、及び体組織と体液中のヘパリ
ンの酵素において多様な用途がある。

また、ヘパリナーゼは、抗トロンビン剤又は抗腫瘍剤と
して潜在的な治療上の価値がある低分子ヘパリン断片の
調製にも用いられる。

比較的少ない種類の微生物が、ヘパリンを分解できる酵
素を生産することが知られている。ヘパリナーゼ（ヘパ
リン　リアーゼ、ＥＣ４，２，２，７）の製造は、フラ
ボバクテリウム　へバリナム、フラボバクテリウムｓｐ
、、バクテロイデスｓｐ、、バクテロイデス　ヘパリノ
リティカス、ペプトストレプトコッカス及びニーバクテ
リウムの培養において見い出されている。これらのヘパ
リナーゼは、ジャーナル・オブ・バイオケミストリー［
第２３３巻第８５３頁（１９５６年）１、エクスベリエ
ンティア　［第４１巻　第１５４１頁（１９８５年）１
、松本歯科大学報（日本）［第８巻　第１５頁（１９８
２年）１、ジャーナル・オブ・アプライド・アミド・エ
ンバイロメニタル　マイクロバイオロジー［第４６巻　
第１２５２頁（１９８３年）１、ジャーナル・オブ・ク
リニカル・マイクロバイオロジー　［第２６巻　第１０
７０頁（１９８８年）１、及びジャーナル・オプ・サウ
ス・アフリカン・ベテリナリー・アソシエージョン　［
第５３巻　第２１４頁（１９８２年）１に開示されてい
る。加えて、本発明者のうちの２名は、最近、ヘパリナ
ーゼを生産しうる唯一の既知のバチルス属を見い出した
。バチルス属ｓｐ、　Ｂ１１１００株と命名されたこの
菌は工業技術院微生物工業技術研究所に寄託され、寄託
番号ＦＥＲＭ　Ｐ−１０４０８（微工研菌寄第１０４０
８号）が与えられた。この株は、特願昭６３−２９７８
０７号（１９８８年１１月２５日）に開示されているよ
うに、ヘパリナーゼを製造する新規方法において使用さ
れる。

「プラスミド」は、微生物細胞内に見い出されるデオキ
シリポ核酸の環状分子から構成される、非染色体遺伝因
子である。常用の遺伝子クローン化手法を使用すること
により、有用な蛋白又はペプチドの生産のための遺伝子
情報を有するＤＮＡの断片を、「ベクター」プラスミド
と呼ばれる適当なプラスミド中に導入することができる
。生成した組換えプラスミドが適当な宿主生物体中に導
入されると、形質転換宿主生物体は、しばしば有用なプ
ラスミドのコードする蛋白又はペプチドを生産する。通
常、大腸菌が宿主生物体として使用される。ヘパリナー
ゼ遺伝子を持つプラスミドは新規であり、かかるプラス
ミドを保持する大腸菌のヘパリナーゼ生産株も新規であ
り、かつ、ヘパリナーゼをコードするプラスミドを保持
する大腸菌株を使用するヘパリナーゼの製法も新規であ
る。

〔発明が解決しようとする課題〕

フラボバクテリウム　へバリナム、バクテロイデス　ヘ
バリノリティカス又はバチルスｓｐ、　８１１１００株
を使用するヘパリナーゼの従来の生産法では、ヘパリナ
ーゼの合成を誘導するために増殖培地にヘパリンを添加
することが必要であった。誘導物質としてヘパリンを加
えることの必要性は、従来のヘパリナーゼ生産法にかな
りの費用の増大をもたらしていた。木質的にヘパリナー
ゼを生産する、即ち、誘導物質としてヘパリンを添加す
る必要のないプラスミド保持大腸菌株を使用する方法は
、より低コストで酵素生産を行うのに有利である。

本質的にヘパリナーゼを生産する菌株を創製する意図を
もって、本発明者らは、バチルス属ｓｐ。

Ｂ１１１００株（ＦＢＲＭ　Ｐ−１０４０８）の染色体
からのヘパリナーゼ遺伝子ＤＮＡとベクタープラスミド
ｐＢＲ３２９より成る新規組換えプラスミドを構成し、
次に、この新規組換えプラスミドを宿主細菌である大腸
菌ＩＩ　Ｂ　１０１株に導入した。組換えプラスミドに
より形質転換された宿主細菌は、誘導物質としてのヘパ
リンの添加を必要とすることなく、ヘパリナーゼを生産
し、その結果、本発明者はこの発明を完成した。

本発明の目的は、ヘパリナーゼ遺伝子を持った新規プラ
スミドを提供することにある。

本発明の他の目的は、ヘパリナーゼ遺伝子を持ったプラ
スミドを保持する新規な菌株を提供することにある。

本発明の別の目的は、プラスミドを保持する菌株を使用
するヘパリナーゼ生産のための新規方法を提供すること
にある。

〔課題を解決するための手段〕

本発明による新規プラスミドは、宿主細菌にヘパリナー
ゼを生産する能力を提供するものであり、そして、ベク
タープラスミドとヘパリナーゼ遺伝子ＤＮＡより構成さ
れるものである。

このプラスミドは、制限酵素で染色体ＤＮＡからヘパリ
ナーゼ遺伝子ＤＮＡ断片を切り出し、プラスミド複製に
とって必須のプラスミド遺伝情報に干渉しない適当な制
限酵素でベクタープラスミドを切断し、この染色体断片
と制限酵素で切断されたベクタープラスミドをＤＮＡリ
ガーゼで処理して組換えプラスミドを形成させ、そして
、この組換えプラスミドを分離することから成る方法に
より、生産することができる。

本発明による新規な菌株は、新規なプラスミドを含有し
、かつ、ヘパリナーゼを生産するエシェリヒア属に属す
るものであり、例えば、大腸菌Ｈ８１０１株（ｐＰＤＦ
１６）（ＦＥＲＭ　Ｐ−１１０１１）　ｉ？ある。

本発明は、また、ヘパリナーゼ遺伝子を持つプラスミド
を保持し、かつ、ヘパリナーゼを生産する大腸菌の菌株
を培養し、ヘパリナーゼを取得することを特徴とするヘ
パリナーゼの新規製法を提供する。

以下、本発明の詳細な説明する。

■、新規プラスミド及びその構成 本発明により、宿主にヘパリナーゼを生産する能力を提
供する新規プラスミドを構成することができる。この新
規プラスミドはベクタープラスミドとヘパリナーゼ遺伝
子ＤＮＡの断片から構成される。

本発明において使用しうるベクタープラスミドは、大腸
菌内で複製しうるいかなるプラスミドをも包含する。典
型的な例として、ｐＢＲ３２２゜ｐＢＲ３２９，Ｃｏｔ
　Ｅｌ、　ｐＭＢ９．　ｐｓｃｌｏＬ、　ｐＨｃ７９が
列挙される。

本発明において使用しうるＤＮＡの断片は、ヘパリナー
ゼをコードする染色体遺伝子を含み、バチルス属ｓｐ、
　ＢＩＩ１００株（ＦＥＲＭ　Ｐ−１０４０８）からの
ＤＮＡを制限酵素切断して生産されるものである。土壌
から分離されたバチルス属ｓｐ、　８８１００株は第１
表に示す分類学的性質を示す。

第１表 形態学的性質 ダラム染色 細胞サイズ 胞子量の膨潤 胞子位置 パラ胞子クリスタル 運動性 成育特性 好気的成育 嫌気的成育 成育温度　最高 最低 最適 リゾチーム（０，００１％） 陽性 ０．６−０．８μｔａ　Ｘ　３−６μ−陽性 末端 陰性 陽性 陽性 陽性 ５５°Ｃ ２０°Ｃ ４５°Ｃ 陽性 存在下での生育 アザイド（ａｚｉｄｅｓ、０．０２％）存在下での生育 ＮａＣｌ存在下での生育２％ ５％ ７％ １０％ ｐＨ６，８（栄養培地）での成育 ｐＨ５，７（サブロー培地）での成育 ＮａＣｌ及びＫＣＩの要求性 成育因子の要求性 生化学的性質 カタラーゼ ＶＰテスト シーＰ培地でのｐＨ 酸生成　Ｄ−リボースから Ｄ−キシロースから し一ラムノースから Ｄ−ガラクトースから Ｄ−フルクトースから 陰性 陽性 陰性 陰性 陰性 陽性 陽性 陰性 なし 陽性 陰性 ６．５−７．０ 陽性 陽性 陽性 陽性 陽性 Ｄ−アラビノースから し一アラビノースから ラフィノースから Ｄ−マンノースから マルトースから シュークロースから ラクトースから Ｄ−グルコースから Ｄ−トレハロースから グリセロールから Ｄ−マンニトールから ソルビトールから ｍ−エリトリトールから イノシトールから アドニトールから 発酵炭水化物からのガス生成 インドール生成 ジヒドロキシアセトン生成 結晶性デキストリン生成 硝酸塩の還元 陽性 陽性 陽性 陽性 陽性 陽性 陽性 陽性 陽性 陽性 陽性 陰性 陽性 陽性 陽性 陰性 陰性 陰性 陰性 陰性 クエン酸塩の資化性　　　　　　　　陽性プロピオン酸
塩の資化性　　　　　　陰性チロシンの分解　　　　　
　　　　　陰性デンプンの加水分解　　　　　　　　陰
性カゼインの加水分解　　　　　　　　陰性ヘパリンの
分解　　　　　　　　　　陽性ヘパラン硫酸の分解　　
　　　　　　陽性コンドロイチン−４−硫酸の分解　　
　陽性デルマタン硫酸の分解　　　　　　　陽性コンド
ロイチン−６−硫酸の分解　　　陽性ヒアルロン酸の分
解　　　　　　　　陽性ポリガラクツロン酸の分解　　
　　　陰性ＤＮＡ中のＧＣ含量　　　　　　　　　５７
モル％本発明のヘパリナーゼ遺伝子を持つプラスミドを
構成するために、通常の方法が用いられる。たとえば、
バチルス属ｓｐ、ＢＨ１００株（ＦＥＲＭ　Ｐ−１０４
０８）由来の染色体ＤＮＡは適当な制限酵素で切断され
、断片を生ずる１次に、この染色体ＤＮＡ断片はその大
きさに応じて、例えば、ショ糖密度勾配超遠心又はアガ
ロースゲル電気泳動により分画できる。

また、この断片はこのようなサイズによる分画を行うこ
となく使用することもできる。ベクタープラスミドは適
当な制限酵素で切断されて線状になり、そして、適当な
ホスファターゼにより処理され、脱リン酸することがで
きる。また、線状ベクタープラスミドは脱リン酸を行う
ことなく使用することもできる。このように処理された
後、ベクタープラスミドは染色体ＤＮＡ断片と混合され
、そして、この混合物は適当なりガーゼで処理されて組
換え体を作る。この組換え体ＤＮＡは、次に、適当な宿
主細菌、例えば、大腸菌ＨＢ　１０１株中に導入される
。ヘパリナーゼを生産する形質転換された宿主細菌は、
例えば、精製したバチルスのヘパリナーゼに対して特異
的な抗血清による酵素結合イムノアッセイを使用するか
、又は宿主細胞のヘパリナーゼ活性を試験する、どちら
か一方又は両方を用いることにより検出される。ヘパリ
ナーゼ生産のための遺伝子情報を有するプラスミドＤＮ
Ａは、ヘパリナーゼ生産宿主細菌から通常の方法により
分離される。

新規なプラスミドｐＰＤＨ６は、次のようにして構成さ
れる。バチルス属ｓｐ、　８８１００株から分離された
染色体ＤＮＡは制限酵素Ｓａｕ　３　Ａで部分切断され
、そして、ショ糖密度勾配超遠心によりサイズ分画され
る。約５〜７キロ塩基対の断片を回収する。このＤＮＡ
は制限酵素でＢａｍＨｒ切断し、脱リン酸化されたベク
タープラスミドρＢＲ３２９に組換えられ、そして大腸
菌１８１０１株中に導入する。ヘパリナーゼを生産する
形質転換された宿主細菌は、精製したバチルスのヘパリ
ナーゼに特異的な抗血清による酵素結合イムノアッセイ
を使用するが、又は宿主細菌のヘパリナーゼ活性を試験
する、どちらか一方又は両方を用いることにより検出さ
れる。プラスミドｐＰＤＲ６は通常の方法によりヘパリ
ナーゼ生産宿主細菌から分離される。第１図に示したよ
うに、新規なプラスミドｐＰＤ）１６の制限酵素地図は
、プラスミドｐＰＤ）１６が約９．７キロ塩基対から成
るＤＮＡの環状分子であり、バチルス属ｓｐ、ＢＨ１０
１株由来の染色体ＤＮＡの断片が挿入されたベクタープ
ラスミドｐＢＲ３２９より構成されていることを示して
いる。

２、ヘパリナーゼ生産株の製造 本発明により、エシェリヒア属の新規ヘパリナーゼ生産
株が得られた。バチルス属ｓｐ、　８１１００株由来の
染色体ＤＮＡとベクタープラスミドとの組換えにより構
成された組換えプラスミドは通常の形質転換法によりエ
シェリヒア属の宿主細菌中に導入される。本発明で使用
することのできる宿主細菌は、エシェリヒア属のいかな
る菌株でもよい。

使用される典型的な宿主細菌は大腸菌に一１２株と大Ｉ
！ａ菌Ｂ株のＨ種株（ｈｙｂｒｉｄ　５ｔｒａｉｎ）で
ある大腸ｉ１　）１８１０１株である。エシェリヒア属
の株にヘパリナーゼをコードするプラスミドを導入する
ことにより生産された形質転換株は、抗生物質に対する
耐性やヘパリナーゼを生産する能力等のプラスミドがコ
ードした特性を除き、宿主と同一の微生物学的特性を有
する。例えば、プラスミドｐＰＤＨ６を大腸菌１８１０
１株に導入することにより生産される形質転換大腸菌Ｉ
Ｉ　Ｂ　１０１株（ｐＰＤＨ６）は、大腸菌Ｈ８１旧株
と同一の微生物学的特性を有し〔遺伝子型：　Ｆ”　、
　ｈｓｄｓ２０　（ｒＢ−＋　ｍＢ−）、ｒｅｃｔ　１
３＋　ａｒａ−１４，ＰｒｏＡ２．１ａｃＹｉ　ｇａｌ
に２．　ｒｐｓＬ２０（Ｓｍ）、　ｘｙｌ−５，ｍｔｌ
−１，５ｕｐＥ４４　λ）、そして、さらに、プラスミ
ドｐＰＤＨ６によりコードされる特性、即ち、アンピシ
リン耐性、クロラムフェニコール耐性及びヘパリナーゼ
生産により特徴づけられる。

本発明のヘパリナーゼ生産株の培養用培地としては、炭
素源、窒素源及び無機塩類を含有する通常の培地が用い
られる。炭素源としては、資化できるものいずれのもの
も用いることができる。例えば、Ｄ−グルコース、シュ
クロース、ラクトース、トリプトン又はペプトンが典型
例として例示できる。窒素源としては多種の通常のもの
が使用でき、たとえば、イーストエキス、ペプトン、ト
リプトン、肉エキス、コーンステイープリカーアミノ酸
溶液等、又は、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム等
の無機窒素源が容易に入手できるものとして例示できる
。さらに、上述の炭素源及び窒素源に加えて、塩化マグ
ネシウム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、塩化カ
リウム、塩化カルシウム等の種々の塩類を添加すること
も可能である。ビタミンや他の生長因子である葉酸、パ
ントテン酸カルシウム、ビオチン、リボフラビン、チア
ミン等を添加することも可能である。さらに、必要なら
ば、寒天末、ゼラチン等のゲル化剤を添加することも可
能である。培地は適宜酸又はアルカリを添加して、ｐｒ
ｔ５．ｏ〜８．０の範囲内に調節し、オートクレーブに
より滅菌する。

適当な培地の具体例として、１１当たり、トリプトン１
０ｇ１イーストエキス５ｇ１グルコース１ｇ及びＮａＣ
１１０ｇを含有し、ｐＨ７，０に調整された液体培地を
例示できる。

本発明のヘパリナーゼ生産株は、２０〜３７°Ｃで培養
されるが、好気的条件下で３５〜３７°Ｃで培養される
ことが望ましい。

３、ヘパリナーゼの取得法 本発明のヘパリナーゼ生産株は、上述のような適当な培
地であれば、いずれにおいても、好気的に３５〜３７°
Ｃで１２〜７０時間で培養される。

ヘパリナーゼの分離及び精製は、例えば、次のようにし
て行われる。細胞は遠心分離、濾過又は他の通常の方法
により培養液より回収され、そして、超音波処理、フレ
ンチプレスによる加圧又は他の通常の方法により粉砕さ
れる。この段階で、核酸をデオキシリボヌクレアーゼ及
びリボヌクレアーゼによる処理、プロタミン硫酸による
沈澱等により除去してもよい。粗ヘパリナーゼ活性画分
は、蛋白精製の分野において周知の従来法である、通常
のイオン交換及びゲル濾過法のようなりロフトグラフィ
ー法、又は、クロマトフオーカシング、調製用等電点電
気泳動法、電気泳動法等の一方又は両方を用いることに
より分画され、それにより、ヘパリナーゼを取得する。

ヘパリナーゼを取得する好適な方法は、以下に例示され
る。

本発明の株は、上述のとおり、適当な培地中で、好気的
に３５〜３７°Ｃで２４〜３６時間培養する。得られた
培養液は細胞を回収するために８０００Ｘｇで３０分間
遠心分離する。さらに、回収した細胞は、超音波粉砕に
より、粗ヘパリナーゼ溶液とし、次の段階への試料とす
る。試料はｐＨ７，４１０ｍＭ　ＩＩＥＰＥＳ緩衝液中
で平衡化した硫酸化セルロファイン力ラムにかけ、吸着
された酵素を同緩衝液を用い、ＮａＣ１０〜０．３Ｍの
濃度勾配で溶出する。回収した活性画分は、アミコンＰ
ＭＩＯ膜を使用して限外濾過法により濃縮する。試料は
さらに、１００ｍＭ　ＮａＣｌを含む上記緩衝液で平衡
化した５ＨＯＤＥＸ　ＷＳ−２００３カラムを使用する
ゲル濾過クロマトグラフィーにより分画する。このよう
にして得られた活性画分、ＳＯ３−ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動法による分析で、１つの蛋白質バンドとし
て検出される、単一のヘパリナーゼのみを含有している
。

ヘパリナーゼ活性の定量分析に用いられる紫外線吸収に
よる活性測定法は、次のとおりである。

適宜希釈された２０μｌの酵素液とｐ）１７．４．５０
ｍＭＨＥＰＥＳ緩衝液に溶解した５■／滅のヘパリン溶
液を５０μ！含む反応混合液を４０°Ｃで４時間保持す
る。

その後、反応はｐＨ２，０，２０ｍＭ　ＫＣＩ−ＭＣＩ
溶液を２．０−添加して停止させ、この反応混合液の２
３２ｎｍでの吸光度を測定する。活性の１国際型位は二
重結合のモル吸光係数５１００ｃ＋ｒ’Ｍ　−’に基づ
き、・４０°Ｃで、１分間に、１Ｍモルの二重結合の生
成に必要な酵素量とした。

４、ヘパリナーゼの特性 本方法により生産されたヘパリナーゼの酵素学上の特性
は以下のとおりである。

）作用：ヘパリナーゼは、ヘパリン及びヘパラ硫酸の脱
離反応を触媒し、短鎖のグリコサミノグリカンの断片を
生成する。このとき同時に二重結合を生成するため、こ
れらは２３２ｎｍに紫外線吸収を示す。

ｉｉ）基質特異性：この酵素はヘパリンとヘパラン硫酸
を切断するが、コンドロイチン−６−硫酸、コンドロイ
チン−４−硫酸、デルマタン硫酸、ヒアルロン酸、デキ
ストラン硫酸及びポリガラクツロン酸は切断しない。

ｉｉｉ　）至適温度及び熱安定性：　５．ＯｍＭ　Ｃａ
Ｃｌ”存在下での反応至適温度は４５°Ｃ（３０分反応
）であり、４５°Ｃ６０分加熱後、８０％以上の活性が
残存した。

本酵素の安定化には、カルシウムイオンが必要である。

なお、本酵素は、６０°Ｃ１５分間の加熱により完全に
不活化する。

ｉｖ）至適ｐＨ：反応至適ｐＨは、ｐＨ１，２〜７．８
の範囲である。

■）無機イオンの影響：酵素活性は、”””＋　Ｍｇ”
及びＢａ”の塩化物の存在下で、約５０％増加する。

０、５ｍＭのｃｏ”°＋　Ｚｎ”、　Ｆｅ”、　Ｈｇ”
、　Ｃｏ”及び１．０ｍＭのＮｉ”の塩化物の存在下で
活性は低下する。

Ｍｎ２Ｚ　Ｌｉ”及び八ｇ１の塩化物は５．０ｍＭまで
の濃度において、活性に実質的な影響を与えない。

実施例１ ヘパリナーゼ遺伝子を持つ新規プラスミドの構成及びヘ
パリナーゼ生産株の製造を以下に示す。

（１）ヘパリナーゼ遺伝子を有する染色体ＤＮＡの生産 ヘパリナーゼ生産バチルス属ｓｐ、　８８１００株（Ｆ
ＥＲＭ　Ｐ−１０４０８）より、フェノール抽出法によ
り染色体ＤＮＡが分離された。このＤＮＡの試料は、制
限酵素Ｓａｕ　３八で、３７°Ｃにて、５，１０゜２０
及び３０分間部分的に切断し、断片を生産した。

断片は５〜２０％のショ糖勾配を用いて、ショ糖密度勾
配超遠心によりサイズ分画を行った。４°Ｃで１７時間
２３０００ｒｐｍの遠心分離を行った後で、分画として
回収し、各分画中のＤＮＡ断片のサイズがアガロースゲ
ル電気泳動により確認された。

（２）ヘパリナーゼ遺伝子染色体ＤＮＡのベクタープラ
スミドへの挿入 ベクタープラスミドとして使用されるプラスミドｐＢＲ
３２９（インターナショナル　バイオテクノロジーｒｎ
ｃ、＋　ＵＳＡ；アンピシリン耐性、クロラムフェニコ
ール耐性及びテトラザイクリン耐性遺伝子を保持する。

）が、制限酵素ＢａｍＨＩで３７°Ｃにて１時間処理し
、次に、細菌性アルカリホスファターゼにて３７°Ｃで
１時間処理した。これらの酵素は、不活性化され、フェ
ノール抽出及びプラスミドのエタノール沈澱により除去
された。工程（１）で得られた約５〜７キロ塩基対（２
ｇｇ）の断片は、Ｂａｎ＋ＨＩ−切断の、脱リン酸化し
たベクタープラスミドｐＢＲ３２９（０，５μｇ）と混
合され、この混合物はバクテリオファージＴ４ＤＮＡリ
ガーゼで１６°Ｃにおいて１６時間処理した。

挿入された染色体ＤＮＡを含有する組換え体プラスミド
がこのようにして生産された。この反応は、試料を６５
°Ｃで５分間加熱することにより停止させた。組換え体
プラスミドは次にエタノールで沈澱させ、回収した。

（３）ヘパリナーゼ遺伝子を保持するプラスミドの宿主
細菌への形質転換 大腸菌Ｈ８１０１株は、１０ｍ１のＬＢ培地（リットル
当たり、トリプトン１０ｇ、イーストエキス５ｇ。

グルコースＩｇ、及びＮａＣ１１０ｇを含有し、ｐＨは
７．０）中、３７°Ｃで、対数増殖期後期まで振とうし
ながら培養した。細胞は遠心分離により回収し、コンピ
テント細胞を得るために０．１ｍｌの氷冷ＣａＣｌ□を
加え、最終濃度３０ｍＭのＣａＣ１ｚ　　１ｍ中に懸濁
した。この細胞懸濁液（５０μりと工程（２）より得ら
れた組換え体ＤＮＡ溶液（５μりを合わせ、氷上に２５
分間保持した。混合液は、宿主細胞中にプラスミドＤＮ
Ａを導入するため、１〜２分間４２°Ｃで加熱した。こ
の細胞懸濁液は、新鮮なＬＢ培地に接種し、培養液は３
７°Ｃで振とうしながら６０分間培養した。次に、細胞
は遠心分離により回収し、ＬＢ培地で適宜希釈し、そし
て、形質転換体を得るためにクロラムフェニコールを含
有する固体生育培地上に塗布された。

（４）　　プラスミドｐＰＤＩ＋６を保持するヘパリナ
ーゼ生産株の分離 形質転換された宿主細菌は、バチルス属ｓｐ。

８１１１００株（ＦＥＲＭ　Ｐ−１０４０８）由来の精
製したヘパリナーゼに特異的なウナギポリクローナル抗
血清を使用する酵素結合イムノアンセイ法によりヘパリ
ナーゼの生産を試験した。

使用法に従い、ピコブルー　イムノデイテクションキッ
ト［ｐｉｃｏＢＬＵＥ　Ｉｍｍｕ−ｎｏＤＥＴＥｃＴＩ
ＯＮ　ＫＩＴ（Ｓ、ｔｒａ　ｔａｇｅｎｅ）　］　を使
用して、ニトロセルロースフィルター上で、コロニーア
ッセイを実施した。

プラスミドベクターのテトラサイクリン遺伝子の挿入失
活を示す１２００のコロニーの中で、強い免疫シグナル
を示す７個の組換えクローンが得られた。これらの形質
転換の１例である、プラスミドｐＰＤ）Ｉ　６を有し、
酵素的に活性なヘパリナーゼを生産する大腸菌１１ＢＩ
ＯＩ株（ｐＰＤＨ６）が単一の株として分離された。こ
の株は、工業技術院微生物工業技術研究所に寄託され、
寄託番号ＦＥＲＭ　Ｐ−１１０１１号が与えられた。

実施例２ プラスミ）”ｐＰＤｌ１６の製造及び精製を以下に例示
する。

大腸菌ＨＢＩＯＩ　（ｐＰＤＨＩ６）（ＦＥＲＭ　Ｐ−
１１０１１号）を、５００ｍＮのしＢ培地（リットル当
たり、トリプトン１０．０ｇ、イーストエキス５．０ｇ
グル］−ス１．Ｏｇ及びＮａＣ１１０、Ｏｇを含有し、
ｐＨは７．０）中テ３７°Ｃで振とうしながら、対数増
殖期後期まで培養した。この菌体は４°ＣＣ１５０００
Ｘでの２０分間の遠心分離により回収され、５０ｍＭグ
ルコース、２５ｍＭトリフ！、　ｔｌｃＩ（ｐＨ８，０
）、　１０ｍＭ　ＥＤＴＡ、　　５　ｍｇ／ｍｌｌのリ
ゾチームを含有する？容液１０ｍ１に懸濁された。

懸濁液は室温で５分間保持し、次に、１％のドデシル硫
酸ナトリウムを含有する２０ｍ１の０．２ＮＮａＯＨを
ゆっくり攪拌しつつ加えた。試料は氷上で１０分間保持
し、次に、１５　ｔｔｔｌの５Ｍ酢酸カリウムｐＨ４，
８を添加した。ゆるやかに攪拌した後、試料を氷上に１
０分間保持した。試料は、４°Ｃ，２０００Ｘｇで２０
分間遠心分離され、細胞砕片及び染色体ＤＮＡを含む沈
澱は取りのぞいた。上清画分に０．６容積のイソプロパ
ツールを加え、試料は室温で１５分装いた。プラスミド
ＤＮＡは１２０００ｘ　ｇで３０分遠心分離することで
回収した。沈澱はエタノールで洗浄し、真空デシケータ
中にて乾燥し、１０１１１Ｍトリス１１Ｃ＋、　　１　
ｍＭ　ＥＤＴＡ　　ｐＨ８，０溶液中に溶解した。ＲＮ
Ａは室温にて最終濃度が１０μｇ／ｍｌのデオキシリボ
ヌクレアーゼを含まないリボヌクレアーゼにより処理し
て除去した。このように処理してから、試料は１．０ｄ
のＩ　Ｍ　ＮａＣ１上に重層し、４００００　Ｘ　ｇで
６時間遠心分離した。沈澱を１０ｍＭ　）リスＨＣＩ。

１　ｍＭ　ＥＤＴＡ　　ｐＨ８，０溶液に溶解し回収し
た、同容量のバッファー飽和フェノールで抽出した。

プラスミドＤＮＡは、１０ｍＭ　　）リスＨＣＩ、　　
１　ｍＭＥＤＴＡ　（ｐＨ８，０）の緩衝液で平衡化し
たＢｌｏ−Ｇｅ１　Ａ１５０　（１ｃｕ＋　Ｘ　ｌｏｃ
ｍ）のカラムを使用するクロマトグラフィーにより更に
精製し、同緩衝液で溶出した。

０．５ｒｔｒｆｌの画分が集められた。プラスミドを含
有する両分を集め、そして、プラスミドＤＮＡはエタノ
ール沈澱により集めた。プラスミドの純度はアガロース
ゲル電気泳動により確認した。約３５μｇの精製された
プラスミドｐＰＤＨ６ＤＮＡが回収された。

実施例３ ヘパリナーゼの生産は、次のように例示される。

大腸菌ＨＢＩＯＩ　（ｐＰＤＨ６）（ＦＥＲＭ　Ｐ−１
１０１１）を、３７°Ｃで、振とう培養し、対数増殖期
後期まで、ＬＢ培地〔リットル当たり、トリプトン１０
．Ｏｇ、　　イーストエキス５．０ｇ、グル：７−ス１
．Ｏｇ及びＮａＣ１１０，Ｏｇを含有する、ｐＨ７，０
）　３　ｆ中で培養した。細胞は４°Ｃ，５０００Ｘｇ
で２０分間遠心分離して回収し、５０Ｉｎ１の１０ｍＭ
　ＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７，４に懸濁し、２０’Ｃで
凍結した。室温で解凍した後、細胞懸濁液は、ＴＯＭＹ
　Ｍｏｄｅｌ　ＵＲ１００Ｐ超音波発生装置を用い、氷
冷しながら２０秒間隔で１０分間超音波破砕し、粗ヘパ
リナーゼ溶液を得た。

この粗ヘパリナーゼ溶液はｌｌ当り、０．６１．０のヘ
パリナーゼ活性を有していた。

【図面の簡単な説明】

第１図は、プラスミドｐＰＤＨ６の制限酵素地図である
。 第 図

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、エシェリヒア属に属する宿主細菌にヘパリナーゼを
   生産する能力を与え、かつ、ヘパリナーゼ遺伝子ＤＮＡ
   とベクタープラスミドから構成される組換え体プラスミ
   ド。 ２、ＤＮＡがバチルス属ｓｐ．ＢＨ１００株（ＦＥＲＭ
   Ｐ−１０４０８）に由来するＤＮＡであることを特徴と
   する請求項１記載のプラスミド。 ３、プラスミドがｐＰＤＨ６であることを特徴とする請
   求項１記載のプラスミド。 ４、ヘパリナーゼ遺伝子ＤＮＡとベクタープラスミドか
   ら構成される組換え体プラスミドを保持する、エシェリ
   ヒア属に属するヘパリナーゼ生産株 ５、ヘパリナーゼ生産株がヘパリナーゼ遺伝子を有する
   バチルス属ｓｐ．ＢＨ１００株（ＦＥＲＭＰ−１０４０
   ８）由来のＤＮＡを含有する組換え体プラスミドを保持
   することを特徴とする請求項４記載のヘパリナーゼ生産
   株。 ６、ヘパリナーゼ生産株がプラスミドｐＰＤＨ６を保持
   することを特徴とする請求項４記載のヘパリナーゼ生産
   株。 ７、ヘパリナーゼ生産株が大腸菌ＨＢ１０１株（ｐＰＤ
   Ｈ６）（ＦＥＲＭＰ−１１０１１）であることを特徴と
   する請求項４記載のヘパリナーゼ生産株。 ８、ヘパリナーゼ遺伝子ＤＮＡとベクタープラスミドか
   ら構成された組換え体プラスミドを保持しているエシェ
   リヒア属に属するヘパリナーゼ生産株を培地に培養し、
   培養物からヘパリナーゼを採取することを特徴とするヘ
   パリナーゼの製造方法。 ９、ヘパリナーゼ生産株がヘパリナーゼ遺伝子を有する
   バチルス属ｓｐ．ＨＢ１００株（ＦＥＲＭＰ−１０４０
   ８）由来のＤＮＡを含有する組換え体プラスミドを保持
   するものであることを特徴とする請求項８記載の製造方
   法。 １０、ヘパリナーゼ生産株が大腸菌ＨＢ１０１（ｐＰＤ
   Ｈ６）（ＦＥＲＭＰ−１１０１１）であることを特徴と
   する請求項８記載の製造方法。