JPH06153936A

JPH06153936A - アリルスルホトランスフェラーゼおよびその製造法

Info

Publication number: JPH06153936A
Application number: JP23994192A
Authority: JP
Inventors: Kyoichi Kobashi; 恭一小橋; Kimu Donnhiyun; キムドン−ヒュン
Original assignee: Fuji Yakuhin Kogyo KK
Current assignee: Fuji Yakuhin Kogyo KK
Priority date: 1992-07-23
Filing date: 1992-07-23
Publication date: 1994-06-03

Abstract

(57)【要約】【目的】芳香族硫酸エステルを硫酸供与体とし、その
硫酸基をフェノール化合物に移転する反応を触媒するア
リルスルホトランスフェラーゼ及びその産生菌によるア
リルスルホトランスフェラーゼの製造法。【構成】３７℃以上の温度でも安定で耐アルカリ性に
優れた新規なアリルスルホトランスフェラーゼ及びその
産生菌であるクラブシェラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）Ｋ
−３６（ＦＥＲＭＰ−１２９７６）。この菌は、ラッ
ト糞便より分離された腸内細菌である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は新規なアリルスルホトラ
ンスフェラーゼ及びクラブシェラ属に属する菌株による
アリルスルホトランスフェラーゼの製造法に関する。ア
リルスルホトランスフェラーゼ（Ａｒｙｌｓｕｌｆｏｔ
ｒａｎｓｆｅｒａｓｅ、ＥＣ２．８．２．１）は硫酸供
与体から硫酸基をフェノール化合物に転移しフェノール
化合物の硫酸抱合体を形成する反応を触媒する酵素であ
り、フェノール化合物の解毒経路に関する酵素として重
要である。また、生体内で重要な役割をもつコレシスト
キニンパンクレオザイミンの合成において、チロシンを
特異的に硫酸エステル化するためにアリルスルホトラン
スフェラーゼが有用であることが見出されている（特開
昭６４−８０３００号）。

【０００２】

【従来の技術】従来アリルスルホトランスフェラーゼは
肝、小腸、腎、脳などの動物組織中および糸状菌類に存
在することが知られている。例えば、ラット肝には四つ
のタイプのアリルスルホトランスフェラーゼが存在し
［ジャーナルオブバイオロジカルケミストリー
（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）第２５４巻、５６５８ペ
ージ、１９７９年、アーカイブスオブバイオケミス
トリーアンドバイオフィジクス（Ａｒｃｈ．Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．）第２１１巻、３５２ペー
ジ、１９８１年およびユーロピアンジャーナルオブ
バイオケミストリー（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ）
第１０４巻、３ページ、１９８０年］、これらはいずれ
も硫酸供与体として３′−ホスホアデニル５′−硫酸
（以下「ＰＡＰＳ」という）を必要とし、ＰＡＰＳがな
いと反応は進行しない。糸状菌類では、アスペルギルス
（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属菌の産生するアリルスル
ホランスフェラーゼはＰＡＰＳを介さずに硫酸基を転移
することが知られている［ザバイオケミカルジャー
ナル（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ）第１４９巻、６９７ペー
ジ、１９７５年］。

【０００３】また、細菌類ではＰＡＰＳを介さずに芳香
族硫酸エステルを基質硫酸供与体とし、その硫酸基をフ
ェノール化合物に転移する反応を触媒するアリルスルホ
トランスフェラーゼがヒト糞便より分離した嫌気性細菌
であるユウバクテリウム・レクタルＡ−４４株から見い
だされている（特公平３−６３３５１号）。しかしなが
ら、ユウバクテリウム・レクタルＡ−４４株は嫌気的培
養が必要なため大量培養に適さず、またその産生するア
リルスルホトランスフェラーゼは安定性の面でも３７℃
以上の温度や塩基性溶液中において活性が低下するため
それらの改善が望まれていた。

【０００４】

【発明の開示】本発明者らは、３７℃以上の温度でも安
定で耐アルカリ性に優れた新規なアリルスルホトランス
フェラーゼを得ることを目的に酵素及び酵素産生用微生
物の探索を行った。その結果、新たにラット糞便より腸
内細菌の一種であるクラブシェラ属菌が新規なアリルス
ルホトランスフェラーゼを産生することを見い出した。
これらの菌は通性嫌気性菌であるため好気的大量培養も
可能であり、またこれら菌から産生される新規なアリル
スルホトランスフェラーゼは、ＰＡＰＳを硫酸供与体と
しない性質を有する酵素であり、安定性の面でも温度に
対しては５０℃でも安定であり、塩基性溶液において活
性が高いなどの特徴をもつ。以下に本発明で用いる菌株
のスクリーニング法ならびに性質およびそれらから得ら
れるアリルスルホトランスフェラーゼの製法、性質につ
いて説明する。

【０００５】本発明法に用いるクラブシェラ属菌の例と
して、具体的には本発明者らが腸内菌より見いだしたク
ラブシェラＫ−３６があげられる。本菌株は次のように
光岡らの方法（臨床検査、第２３巻、３２２ページ、１
９７９年）に準じて分離した。即ち、ラット糞便を希釈
し４−メチルウンベリフェリル硫酸（以下「ＭＵＳ」と
いう。）を含んだＧＡＭ（ｇｅｎｅｒａｌａｎａｅｒ
ｏｂｉｃｍｅｄｉｕｍ）寒天平板培地（日水製薬社
製）、およびＭＵＳを含んだＴＳ（ｔｒｙｐｔｉｃｓ
ｏｙａｇａｒ）寒天平板培地（ディフコ社製）にそれ
ぞれ塗抹後、ＧＡＭ寒天平板培地は嫌気ジャー（ヒラヤ
マ製作所製）で３７℃ ３〜５日間培養し、ＴＳ寒天平
板培地は好気ジャー（ヒラヤマ製作所製）で３７℃ １
〜２日間培養した。培養した平板に紫外線（３２０ｎ
ｍ）を照射し蛍光を発したコロニーを釣菌し、それぞ
れ０．１ｍＭＭＵＳを含むＧＡＭ培地およびＢＨＩ
（ｂｒａｉｎｈｅａｒｔｉｎｆｕｓｉｏｎｂｒｏ
ｔｈ）培地（ディフコ社製）５ｍｌに接種したのち培養
し、アリルスルホトランスフェラーゼ陽性株Ｋ−３６を
得た。

【０００６】クラブシェラＫ−３６株は次のような性質
を有する。（１）形態的性質形：桿菌胞子：形成しないグラム染色性：陰性（２）培地における生育状態ＧＡＭ、ＬＢ（ＬｕｒｉａＢｅｒｔａｎｉｍｅｄｉ
ｕｍ）、ＥＧ（ＥｇｇｅｒｔｈａｎｄＧａｇｎｏｎ
ｂｒｏｔｈ）、ＢＨＩ、ＮＢ（ｎｕｔｒｉｅｎｔ
ｂｒｏｔｈ）およびＭＨ（Ｍｕｅｌｌｅｒ−Ｈｉｎｔｏ
ｎｂｒｏｔｈ）培地のうち、ＬＢ培地において最も生
育がよい。（３）生理学的性質オキシダーゼ生成：陰性硫化水素生成：陰性運動性：陰性インドール生成：陽性メチルレッド：陽性ＶＰテスト：陽性クエン酸塩（Ｃ源として）：陽性ウレアーゼ生成：陽性酸素に対する態度：通性嫌気性以上の性質を「腸内細菌の世界−嫌気性菌の分離と同
定」（光岡知足著、叢文社発行、１９８０年）および
「バージェイズマニュアルオブデイターミネイテ
ィブバクテリオロジー（Ｂｅｒｇｅｙ’ｓＭａｎｕ
ａｌｏｆＤｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅＢａｃｔｅ
ｒｉｏｌｏｇｙ）」（第８版、１９７４年）に従い検討
したところ、上記Ｋ−３６株は非運動性、通性嫌気性グ
ラム陰性無芽胞桿菌であり、ＶＰテストが陽性であるこ
とからクラブシェラ属に分類される。本菌株は工業技術
院微生物工業技術研究所にクラブシェラＫ−３６（微工
研菌寄第１２９７６号、ＦＥＲＭＰ−１２９７６）と
して寄託されている。

【０００７】本発明によりアリルスルホトランスフェラ
ーゼを採取するには、まず通常の好気性菌用培地または
嫌気性菌用培地にアリルスルホトランスフェラーゼを産
生するクラブシェラ属に属する菌株を植菌し、それぞれ
好気条件下または嫌気条件下約２５〜４５℃で培養し酵
素を蓄積せしめる。培養時間は酵素の生産が最大になっ
た時をとればよく、通常約１３〜１８時間である。本酵
素は公知の酵素精製方法を適宜組合せて精製される。即
ち、培養物をそのままか、または菌体のみを集めて超音
波、フレンチプレス、アルミナ磨砕などの方法により菌
体を破砕し酵素を抽出したのち、塩析、有機溶媒沈殿、
透析、限外ろ過、遠心分離、イオン交換クロマトグラフ
ィー、アフィニティクロマトグラフィー、濃縮、凍結乾
燥などの方法を適宜組合せ精製される。

【０００８】本発明によりクラブシェラＫ−３６より得
られたアリルスルホトランスフェラーゼの性質は次のと
おりである。（１）作用芳香族硫酸エステルを基質硫酸供与体とし、その硫酸基
をフェノール化合物に移転する反応を触媒する。（２）基質特異性各種芳香族硫酸エステルならびに生体内硫酸エステルを
硫酸供与体として、またフェノールを受容体として反応
させ生成されるフェノール硫酸の量を高速液体クロマト
グラフィーで定量した。すなわち、反応液をケムコソル
ブ７−ＯＤＳ−Ｈを担体とする高速液体クロマトグラフ
装置（島津製作所製）にかけ４５％メタノールで１．０
ｍｌ／分で溶出し、波長２５４ｎｍで検出した。ｐ−ニ
トロフェニル硫酸（以下「ＰＮＳ」という）を硫酸供与
体として、フェノールを受容体として反応させた時の比
活性（蛋白当りの活性）８．８２μｍｏｌ／ｍｉｎｍ
ｇ蛋白質を１００％としたときの活性を表１に示す。ま
たＰＮＳを硫酸供与体としたときの各種硫酸受容体の基
質特異性は表２のとおりである。

【０００９】

【表１】

【００１０】

【表２】

【００１１】（３）至適ｐＨ硫酸供与体としてＰＮＳを用い、受容体を各種変えて至
適ｐＨをみた。その結果本酵素は受容体にフェノール、
１−ナフトールを用いた場合はｐＨ約１０〜１０．５に
至適ｐＨが存在した。（図１）使用した緩衝液は、ｐＨ５〜６は０．１Ｍ酢酸緩衝液ｐ
Ｈ６〜７は０．１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ７〜９は０．１
Ｍトリス塩酸緩衝液、ｐＨ９〜１２．５は０．１Ｍグリ
シン−水酸化ナトリウム緩衝液である。（４）温度安定性５〜６０℃の各温度で１０分間処理したのち酵素活性を
測定したところ、５０℃以下で安定であった。（図２）（５）活性測定法硫酸供与体としてＰＮＳ、受容体としてフェノールを用
い、５０ｍＭＰＮＳ０．０３ｍｌ、１ｍＭフェノール
０．２９ｍｌを含むトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）
０．２１ｍｌおよび酵素溶液０．１ｍｌを混合し３７
℃、３０分間反応させる。１Ｎ水酸化ナトリウム０．４
ｍｌを加えて反応を止め、白濁したものについては遠心
したのち透明な上清の４０５ｎｍにおける吸光度を測定
し、別にｐ−ニトロフェノールの標準液を用いて作成し
た検量線にもとづいて定量する。１分間に１μｍｏｌの
ｐ−ニトロフェノールを生成する酵素量を１単位とし
た。またＰＮＳ以外の硫酸供与体を用いる場合は高速液
体クロマトグラフィーにて行った。

【００１２】（６）基質親和性受容体としてフェノールを用いたときＰＮＳに対するミ
カエリス定数（Ｋｍ値）は０．１１ｍＭ、硫酸供与体と
してＰＮＳを用いたときフェノールに対するミカエリス
定数（Ｋｍ値）は０．６６ｍＭであった。（７）安定剤と阻害剤本酵素に対する金属イオンの影響を表３に示した。マグ
ネシウムイオン、コバルトイオンは２ｍＭ添加すること
により活性はそれぞれ６５％、３０％上昇するが、カド
ミウムイオンは活性を強く阻害し、エチレンジアミン四
酢酸（２ｍＭ）は元の活性の５３％にまで減少させる。
なおユウバクテリウム・レクタルＡ−４４株由来硫酸基
転移酵素の阻害剤であったｐ−ニトロフェノールリン
酸、アデノシン三リン酸、ピロリン酸による阻害は認め
られなかった。

【００１３】

【表３】

【００１４】（８）等電点等電点カラムクロマトグラフィーにより、本酵素の等電
点は５．３であった。（９）分子量セファクリルＳ−３００スーパーファイン（ファルマシ
ア社製）を用いたゲルろ過法により測定したところ、約
１６００００であった（図３）。またＳＤＳ−ポリアク
リルアミドゲル電気泳動法により約７３０００の２つの
サブユニットから成なることが示された。

【００１５】次に本発明法を実施例をもって具体的に説
明する。実施例１０．１５％寒天を含んだＬＢ培地３１を滅菌したのち、
あらかじめ上記と同様の培地にクラブシェラＫ−３６を
培養して得た種培養液６０ｍｌを植菌し、好気的に３７
℃、１５時間培養した。培養液を遠心分離して菌体を集
めたのち超音波破砕機（ヒートシステムズ社製）にて菌
体を破砕し、さらに遠心分離により上清を集め粗酵素抽
出液を得た。これに最終濃度６０％になるよう硫安を加
え、沈殿物を０．１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）
に溶解し、同緩衝液に１５時間透析した。次いであらか
じめ同緩衝液で平衡化したＤＥＡＥセルロース（ファル
マシア社製）カラム（２．５×３０ｃｍ）に通し酵素を
吸着させたのち、０〜０．５Ｍ塩化カリウムでグラジエ
ントに溶出し活性画分を集めた。これをＵＭ−１０メン
ブラン（アミコン社製）を用いた限外ろ過により濃縮、
２５ｍＭイミダゾール緩衝液（ｐＨ７．４）に溶解し同
緩衝液に透析した。次にあらかじめ同緩衝液で平衡化し
たクロマトフォーカシングカラム（１．５×１５ｃｍ）
に通し酵素を吸着させたのち、酢酸でｐＨ４までグラジ
エントに溶出し活性画分を集め、ＵＭ−１０メンブラン
で濃縮した。最後にこれを０．１Ｍトリス塩酸緩衝液
（ｐＨ７．０）で平衡化したセファクリルＳ−３００ス
ーパーファインカラム（２×８６ｃｍ）に通し精製酵素
標品を得た。図４にＤＥＡＥセルロースカラムクロマト
グラフィーの溶出パターン、図５にクロマトフォーカシ
ングカラムクロマトグラフィーの溶出パターンを、また
表４には精製過程の結果を示す。なお蛋白量はフォーリ
ン−ロウリィ（Ｆｏｌｉｎ−Ｌｏｗｒｙ）法により牛血
清アルブミン（フラクションＶ）を標準として測定し
た。

【００１６】

【表４】

【図面の簡単な説明】

【図１】アリルスルホトランスフェラーゼの至適ｐＨを
表す図である。

【図２】アリルスルホトランスフェラーゼの温度安定性
を表す図である。

【図３】同酵素のゲルろ過法による分子量の測定を表す
図である。

【図４】同酵素のＤＥＡＥセルロースカラムクロマトグ
ラフィーの溶出パターンを表す図である。

【図５】同酵素のクロマトフォーカシングカラムクロマ
トグラフィーの溶出パターンを表す図である。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】下記性質を有するアリルスルホトランス
フェラーゼ（ａ）作用芳香族硫酸エステルを硫酸供与体とし、その硫酸基をフ
ェノール化合物に移転する反応を触媒する。（ｂ）至適ｐＨ１０〜１０．５（ｃ）温度安定性５０℃以下で安定（ｄ）各種金属イオン、阻害剤の影響Ｍｇ^２＋、Ｃｏ^２＋により活性は上昇し、Ｃｄ^２＋、Ｅ
ＤＴＡにより阻害される。
【請求項２】クラブシェラ属に属する下記性質を有す
るアリルスルホトランスフェラーゼ産生菌を培養し、該
アリルスルホトランスフェラーゼを生成蓄積せしめ、こ
れを採取することを特徴とするアリルスルホトランスフ
ェラーゼの製造法。（ａ）作用芳香族硫酸エステルを硫酸供与体とし、その硫酸基をフ
ェノール化合物に移転する反応を触媒する。（ｂ）至適ｐＨ１０〜１０．５（ｃ）温度安定性５０℃以下で安定（ｄ）各種金属イオン、阻害剤の影響Ｍｇ^２＋、Ｃｏ^２＋により活性は上昇し、Ｃｄ^２＋、Ｅ
ＤＴＡにより阻害される。
【請求項３】クラブシェラ属に属するアリルスルホト
ランスフェラーゼ産生菌がクラブシェラＫ−３６である
ことを特徴とする特許請求の範囲第２項記載のアリルス
ルホトランスフェラーゼの製造法。