JPH0565155B2 - - Google Patents
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- JPH0565155B2 JPH0565155B2 JP3138041A JP13804191A JPH0565155B2 JP H0565155 B2 JPH0565155 B2 JP H0565155B2 JP 3138041 A JP3138041 A JP 3138041A JP 13804191 A JP13804191 A JP 13804191A JP H0565155 B2 JPH0565155 B2 JP H0565155B2
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Description
【発明の詳細な説明】
【0001】
【産業上の利用分野】 本発明はモノクローナル
抗体の分野に関する。さらに詳しくは、本発明の
トリオーマ（trioma）およびクアドローマ
（quadroma）と称される新しい生物学的単位の
創製に関し、これらはここで組換えモノクローナ
ル抗体と称する新しい、二重性の機能を有する
（bifuctional）抗体を製造する。組換えモノクロ
ーナル抗体（以下RMAと呼ぶ）は、ここに詳述
する診断上、および治療上の広範な用途を有す
る。 【0002】 【従来の技術】 抗体は、骨髄のＢリンパ球に由
来するリンパ系細胞により通常合成される。非常
に多くの違つた抗体特異性は、多くの構造上の特
徴を共通に有する免疫グロブリン分子により達成
される。異質な結合特異性を有する個々の抗体分
子はその細目にわたるアミノ酸配列において異な
り、そして、通常、同じ特異性の抗体でさえも異
なるアミノ酸配列（そのような配列は実質的に同
質であるかもしれないが）の免疫グロブリンの混
合物である。「抗体」と「免疫グロブリン」とい
う用語は、ここでは同じ意味で用いる。 【0003】 個々のリンパ球は単一のアミノ酸配列
の免疫グロブリンを製造する。リンパ球を直接培
養して特定の抗体を製造することはできない。し
かし、Kohler等、Nature256，495（1975）によ
れば、体細胞融合、詳細にはリンパ球と骨髄細胞
との間の融合プロセスによりハイブリツド細胞が
得られ、この細胞は培地で成長し特定の抗体を製
造することが示されている。骨髄腫瘍細胞はリン
パ球腫瘍細胞であり、これら細胞は細胞株によつ
ては（若干の非製造株は知られているけれども）
しばしば抗体自体を製造する。 【0004】 リンパ球と骨髄腫細胞との体細胞融合
から得られるハイブリツドは、ここおよび当該技
術分野では一般に「ハイブリドーマ」細胞と称さ
れる。代表的な融合操作においては、ある選択さ
れた抗体に対し免疫を与えられた動物からのひ臓
リンパ球が骨髄腫細胞と融合される。得られるハ
イブリドーマは、次いで、一組の別々の培養管も
しくはマイクロタイマー板のウエルにて分散され
所望の抗体を製造する培養物が検索される。陽性
培養物はさらに希釈され単一細胞（クローン）か
ら生ずるコロニーを得る。コロニーは所望の抗体
の製造用に再度検索される。クローン化されたハ
イブリドーマにより製造される抗体は、ここおよ
び当該技術分野では「モノクローナル」と称され
る。 【0005】 リンパ球およびハイブリドーマに関す
る遺伝学研究から、DNAセグメントにより特定
に抗体が暗号化されこれらDNAセグメントは生
殖系細胞に当初から存在する種々の可能な暗号セ
グメントから選択されるということが知られてい
る。分化の結果として、暗号セグメントのいくつ
かが再配列もしくは削除されその結果十分に分化
したリンパ球が単一抗体の製造に遺伝学的に制限
される。Science212，1015（1981）を参照のこと。
単一細胞もしくはクローンによる一つを越える抗
体の合成を示す試みがすでになされ、骨髄腫と骨
髄腫の融合細胞が混合骨髄腫蛋白を製造すること
を示したという程度においは成功している
（Cotton，R.G.H.等、Nature，244，42（1973））。 【0006】 モノクローナル抗体は高度に特異的で
あり、単一抗原のみに対応している。さらに、典
型的には同一の抗原上の異なる組の決定基に対応
する異なる抗体を含む従来の抗体調製物とは対照
的に、モノクローナル抗体は抗原上の単一の決定
基にのみ対応する。モノクローナル抗体は、抗原
抗体結合を用いる診断用および分析用定量法の選
択性と特異性を向上させるのに有用である。モノ
クローナル抗体の第二の利点は、これら抗体がハ
イブリドーマ培養により純粋な形で合成され他の
免疫グロブリンにより汚染されないという事実で
ある。モノクローナル抗体は培養したハイブリド
ーマ細胞の上澄みからもしくはハイブリドーマ細
胞をマウスの腹腔内へ接種することにより誘導さ
れる腹水から調製され得る。 【0007】 免疫グロブリンの蛋白構造はよく知ら
れている。免疫グロブリンＧ（IgG）は二つの重
蛋白鎖（分子量約64000）と二つの軽蛋白鎖（分
子量約22500）からなる。これら重鎖はジスルフ
イド結合により共有結合で結合し、各軽鎖はジス
ルフイド結合により重鎖に結合している。IgMは
IgGと同じ基本構造を有し、マルチマー形である
点に特徴がある。骨髄腫細胞は、骨髄腫蛋白もし
くはBence−Jones蛋白とも称される軽鎖モノマ
ーもしくはダイマーを分泌する。そのうちのいく
つかは抗原を結合する能力を有する。正常な抗原
の軽鎖および重鎖は、細胞での一般的な蛋白合成
機構により合成される。これら重鎖と軽鎖は別々
に合成されその後結合される。 【0008】 抗体鎖の化学的再分類はすでに先行技
術において試みられている。Stevenson等
（Biochm.J.108，375（1968））による早期の試み
においては、異種結合が少ない割合で得られてい
たにすぎない。最近では、Peabody，D.S.等、
Biochemistry19，2827（1980）により、異なる骨
髄腫源から軽鎖の特定の異種結合が示された。こ
れらハイブリツド分子は両方の親分子ではなく親
分子のうちの一方が結合し得るリガンドに結合親
和性を示した。重鎖の軽鎖との異種結合、もしく
は重・軽対の異種結合は報告されていなかつた。
Raso，V.，Cancer Res.41，2073（1981）は二つ
の配位子に結合親和性を備えた抗体フラグメント
（Ｆ（ab′）2フラグメント）のインビトロでの構造
を報告している。この報告された操作において
は、抗体分子のそのフラグメントの再分類の前に
ペプシンで部分的に分解する必要があり、それゆ
え、得られた二元の特異性結合蛋白は抗体分子の
フラグメントであつた。 【0009】 種々の治療目的にモノクローナル抗体
を用いることがすでに示唆されている。特に興味
ある応用は、腫瘍を含む特定の組織もしくは細胞
への特に狙いを定めた投薬である。例えば、
Gulliland等のProc.Nat.Acad.Sci.USA，77，
4539（1980）は、モノクローナル腫瘍抗体をジフ
テリア毒素と化学的に結合させること報告してい
る。モノクローナル抗体を目的とする細胞に特異
的に結合させることにより、所望の細胞への特定
の薬、阻害物質もしくは毒素を他の細胞との相互
のあらゆる影響を極小にしつつ供給できるように
なる。そのような技術は、薬もしくは毒素をモノ
クローナル抗体と結合させる化学結合反応に依存
しており、活性の低下、特異性の減少そして起こ
り得る好ましくない副反応という不利な事項を伴
う。それゆえ、抗体分子に化学的に決して連結す
ることのない活性物質との結合において有用なあ
る目的とする受渡し系を供給することは、非常に
有効である。 【0010】 【発明の要旨】 本発明は、単一の抗体分子内で
二つの異なる抗原に結合親和性を有するという意
味で二元性の機能を備える新規な組換えモノクロ
ーナル抗体（以下RMAとする）を提供する。
RMAは同時もしくは順次その抗原を結合し得
る。RMAは同じ抗体による二つの異なる抗原の
結合に依存する機能テストにより特徴づけられ
る。たとえば２本の親和性クロマトグラフイーカ
ラムの各々、すなわち、一方は第一の不動化抗原
を有し他方は第二の不動化抗原を有するカラムの
各々に順次結合する能力を有することにより特徴
づけられる。 【0011】 RMAはその目的のために構成された
新規な細胞型により製造される。一つのそのよう
な細胞はここでは「クアドローマ」と称され、二
つのハイブリドーマの体細胞融合により生成され
る。この各親ハイブリドーマは二つの抗原のうち
の一方に対し特異的なモノクローナル抗体を製造
する。もう一つのそのような新規な細胞型はここ
では「トリオーマ」と称され、ハイブリドーマと
リンパ球の融合により生成される。ハイブリドー
マとリンパ球は各々二つの抗原の一方に対する抗
体を製造する。両親の型の軽鎖および重鎖は、ク
アドローマ細胞とトリオーマ細胞において合成さ
れる。両方の種類の細胞の軽鎖および重鎖が等量
生成されそして無作為に結合すること、IgG製造
細胞により製造される抗体の少なくとも1/8が二
元性機能のRMAである。IgM製造細胞から製造
される本質的にすべての抗体は、二つの抗原の
各々に少なくとも一つの結合部位を有するという
意味で二元性機能を有する。 【0012】 トリオーマとクアドローマの構成は、
所望の融合を自己融合および非融合親細胞型と区
別するための選択系（セレクシヨンシステム）の
使用に依る。ここに開示されるたいていの選択系
は、それ自身新規だと信じられる変異ハイブリド
ーマの構成もしくは単離に依る。この選択系は、
その大部分がRMAを製造する二つの親細胞型の
ハイブリドーマを選択的に成長させるよう設計さ
れる。 【0013】 クアドローマおよびトリオーマは、そ
の培養物が単一クローンにおいて二つの抗原を結
合する能力を検索されるということを除いて、ハ
イブリドーマをクローン処理する操作に本質的に
以た操作によりクローン処理される。RMA自身
の二元性機能の性質の分析は、さらに、二段階親
和性クロマトグラフイーによるかもしくは単一性
機能分子の二元性機能分子からの分離を容易にす
るために固相不動化抗原を含む分析技術により行
われる。 【0014】 クアドローマ、トリオーマおよび組換
えモノクローナル抗体の用途は多様である。これ
ら用途は、分析用および診断用技術、生物学的お
よび薬理学的活性物質の特定細胞への所定の供
給、そして特定抗原、受容体および細胞表面物質
の同定と位置確認を含む。RMAを使用すると、
親和性と特異性が単一機能抗体分子にある種の標
識を共有結合的に着けるのに用いる先行の化学処
理により影響されないので有利である。さらに、
RMAの使用は、染料、薬もしくは追跡化合物の
連続的投与が可能でありそれにより先行技術の利
用できる範囲が拡大する。例えば、RMAは一段
階において目的とする細胞のような第一抗原に結
合し得、そして次の段階においてその複合物に薬
や追跡物質のような第二抗原が結合し得る。該次
段階は第一段階とは異なる条件のもとで行われ得
る。 【0015】 RMAは、投与後の抗体の腎クリアラ
ンスが、迅速であることが望まれる場合の治療用
のために、二元性の特異性を有するＦ（ab′）2フラ
グメントへ転換され得る。 【0016】 【発明の構成】 本発明のクアドローマ細胞は、
第１の抗原決定基に対して特異的な結合部位を有
する抗体を製造するハイブリドーマと、第２の抗
原決定基に対して特異的な結合部位を有する抗体
を製造するハイブリドーマ細胞との融合生成物で
あり：Fab部分とFc部分とを有する抗体であり、
分子内に２種の抗体結合部位を有し、該抗原結合
部位がそれぞれ異なる抗体産生細胞に由来し、か
つ異なる抗原決定基に対して特異的である抗体を
製造する。 【0017】 本発明のクアドローマ細胞の製造方法
は、第１の抗原決定基に対して特異的な結合部位
を有する抗体を製造するハイブリドーマ細胞を、
第２の抗原決定基に対して特異的な結合部位を有
する抗体を製造するハイブリドーマ細胞に融合す
ることを包含する。 【0018】 以下に本発明を詳述する。 【0019】 組換えモノクローナル抗体の製造の最
初の工程は、所望抗体を製造するひ臓細胞の母集
団を準備するための免疫処置である。免疫処置
は、ひ臓細胞が結果的に得られるマウスのような
実験動物の従来の生体内免疫処置により達成され
得る。あるいは、Luben，A.R.等のProc.Second
Int.Lymphokine Workshop，Academic Press，
New York，N.Y.（1979）で述べられている方法
のような、ひ臓細胞を培地中で直接インビトロ免
疫処理することも効果がある。インビトロ免疫処
置は、大部分の免疫ひ臓細胞が従来の免疫処置に
より要求されるよりも短い時間で得られるという
こと、および人間を有害のおそれのある物質で免
疫処置に供することなく人間の細胞系が免疫処置
され得るとう利点を有する。さらに別の利点は、
数種の抗原に対するハイブリドーマを同時に調製
するのに数種の抗原がただちに用いられ得るとい
うことである。 【0020】 種々の骨髄腫細胞系がマウスもしくは
人間の細胞との雑種形成用に入手される。多くの
骨髄腫株は軽鎖モノマーもしくはダイマーを製造
し、そして常時ではないがしばしばそのような細
胞に由来のハイブリドーマがこれら蛋白を排せつ
し続ける。非製造骨髄腫株は、たいていの雑種形
成に好ましい。ハイブリドーマによる骨髄腫蛋白
の製造が回避されるためである。所望のハイブリ
ドーマだけを選択的に成長させるために遺伝学的
選択マーカーを有するハイブリドーマを用いるこ
とも好ましい。先行技術において既知の一般的な
選択系は、８−アザグアニンに耐性の変異株を利
用する。そのような変異体はヒポキサンチン、ア
ミノプテリンおよびチミジンを含有する培地
（HAT培地）で成長できない。８−アザグアニ
ン耐性変異体は、機能性のヒポキサンチン・ホス
ホリボシル転移酵素（HPRT）を欠く。そのよ
うな細胞はアミノプテリンの存在下では成長し得
ない。従来のハイブリドーマ技術では、８−アザ
グアニン耐性骨髄腫株は普通に用いられる。融合
の後、ハイブリツド細胞はひ臓細胞親から機能性
のHPRT遺伝子を受けとり、そしてそれゆえ
HAT培地で成長し得る。一方、親の骨髄腫細胞
および骨髄腫・骨髄腫融合細胞は死ぬ。親のひ臓
細胞とひ臓・ひ臓ハイブリドーマは培養において
複製しないので、これらに対しいかなる選択も必
要でない。機能性チミジン・キナーゼを欠く骨髄
腫株（TK-）もまた知られている。そのような
株もまたHAT培地で成長しない。 【0021】 抗体製造についての検索（スクリーニ
ング）は、ハイブリドーマ技術における重大な工
程である。抗体の機能属性は広範に変化する。モ
ノクローナル抗体は、結合親和性、抗原を沈殿さ
せる能力、抗原を不活性化する能力、補体を固定
する能力および交叉反応性の程度において相互に
異なり得る。好ましくは、検索定量法は、製造さ
れるべき抗体の望ましい機能特性に依存するよう
あるいは近づくよう選定される必要がある。しか
し、その定量法は多数の試料を検索できる十分に
単純なものであらねばならない。先行技術のおけ
るそれら技術は様々であるが、検索法は２サイク
ルで行われる。最初に、多数の培養物が成長する
ように融合培養物を細分する。その各々は比較的
少数のハイブリドーマから生ずる。例えば、
105／mlの濃度の細胞が融合され総計で10％のハ
イブリドーマ（104ハイブリドーマ／ml）が得ら
れる場合には、そのような培養試料10μには試
料当り平均100個のハイブリドーマが含まれる。
所望の抗体が103のうち１の頻度で現れる場合に
は、各10μが接種された100の培養物のうちの
約10が所望の抗体として選ばれる。この選ばれた
培養物は、次いで、再度細分される。この場合は
培養物当り平均0.1〜0.3のハイブリドーマ細胞の
レベルになるよう細分される。それは、各培養物
がクローン（そこでの全細胞は単一親細胞に由来
するもので、有糸分裂により繁殖する）であるこ
とを確実なものとするためである。継代培養およ
び検索操作が激しい労働であるかぎり、これら操
作を単純化するための種々の技術が開発されてい
える。例えば、抗原が蛍光マーカーで標識され得
れば、所望の抗体を製造する個々の細胞は、
Becton Dickinson，Inc.，Palo Alto，
Californiaにより製造されるフルオレツセンス・
アクチベイテツド・セル・ソーター（FACS）の
ような市販の細胞選別装置により分離され得る。
この装置は蛍光マーカーを有する細胞を混合細胞
集団から選択的に分離するとができる。他の有用
な手法は、ソフト・アガー・クローニング技術で
あり、Sharon，J.等のProc.Nat.Acad.Sci.USA
76，1420（1979）に記載されている。それによれ
ば、抗体製造テストがその部位で行える。 【0022】 トリオーマおよびクアドローマを得る
操作は原理的には単純であるが実際に行うに際し
てはもつと複雑である。その理由は、選択にさら
に別の技術を駆使せねばならないからである。例
えば、始めのハイブリドーマがHAT選択により
単離されると、それは機能性HPRTを有しそれ
ゆえに２回目の融合においては適切な親ではな
い。ただし、別の選択マーカーが存在しないかも
しくはハイブリドーマが再び変異せずそして８−
アザグアニン耐性として選択されない場合であ
る。クアドローマを生成するために二つのハイブ
リドーマを融合する場合には、両方の親細胞系に
対し選択するための手段がなければならない。一
般に実施可能な技術と原理の代表として、三つの
選択系が記述される。他の選択技術は、他の形の
遺伝学的修飾もしくは生化学的抑制に基づくもの
であり、当業者に自明のものである。 【0023】 HAT選択は二つの別の遺伝学的マー
カーを用いて採用され、両マーカーがアミノプテ
リンへ感受性をもたらす。一方の親ハイブリドー
マが機能性HPRTを欠き（HPRT-）そして他方
が機能性チミジン・キナーゼを欠く（TK-）場
合、その二つの親ハイブリドーマの融合により製
造されるクアドローマのみがHAT培地で生き残
る。HPRT-変異ハイブリドーマは、濃度を徐々
に挙げて100μMまでに調製される８−アザグア
ニンもしくは６−チオグアニンの存在下で成育す
るものから選択されて得られうる。TK-変異体
は、徐々に濃度を増大した５−ブロモー2′−デオ
キシウリジンで成長したものから選択される。
HPRT-およびTK-変異ハイブリドーマの選択技
術は、従来の細胞でのそのような変異体の選択に
ついてすでに記述されている技術（Littlefield，
J.W.，Proc.Nat.Acad.Sci.USA，50，568
（1963））に本質的には類似する。 【0024】 選択はまたウアバインに耐性の変異ハ
イブリドーマの使用にもとづき得る。ウアバイン
は、正常細胞での能動輸送に必須のNa+，K+依
存性ATPアーゼの阻害物質である。ウアバイン
耐性細胞は、正常なウアバイン感受性細胞を殺す
レベルのウアバインにもかかわらず生き残ること
ができる。ウアバイン耐性はそれ自身で、あるい
は他のマーカーと結合して選択マーカーとして用
いられ得る。好ましい実施態様では、単一ハイブ
リドーマかウアバイン耐性と、８−アザグアニン
耐性（HPRT-）か５−ブロモー2′−デオキシウ
リジン耐性（TK-）のいずれかとの両方に関し
て選択される。二重の変異ハイブリドーマは共通
融合体として用いられ、所望のどんなハイブリド
ーマとも結合してHAT−ウアバイン培地で選択
的に成長し得るクアドローマを製造する。そのよ
うな培地では、その共通融合体の親ハイブリドー
マは死ぬ。その理由は、それはTK-かHPRT-の
変異体であるのでHAT培地では成長し得ないか
らである。他方の親ハイブリドーマはウアバイン
耐性を欠くので死ぬ。ウアバイン耐性であると共
にすでに機能性TKもしくはHPRT遺伝子を保持
するクアドローマはいずれもHAT−ウアバイン
培地で選択的に成長する。共通融合体は次の理由
のために特に有益である。その理由は、RMAを
このような目的で用いる場合に抗体分子の二つの
結合親和性のうちの一つに対する単一の共通な結
合特異性が用いられるからである。例えば、種々
の異なる抗原についてのenzyme−linked
immunosorbent essay（ELISA）での組換えモノ
クローナル抗体に使用には指示薬酵素に対する共
通の結合特異性が要求される。同様に、目標とす
る薬供給系も治療用活性物質を結合するための共
通の特異性部位および組織特異もしくは細胞特異
抗原を結合する種々の特異性を使うことができ
る。 【0025】 前記の選択技術は変異ハイブリドーマ
株の構成を必要としかつクアドローマ融合生成物
にある遺伝子を保有することに依存するけれど
も、第三の技術は不可逆性の生化学的阻害物質に
もとづき変異を必要としない。不可逆性の生化学
的阻害物質は、化学的に結合するものであり、か
つそれがすでに処理された細胞において特定の阻
害活性を示すものである。二つの別々の阻害物質
で処理された親細胞同志を結合してできる融合生
成物は、相補性の故に阻害されない。例えば、一
方の親ハイブリドーマはジエチルピルコカーボネ
ートで処理され、他方のヨードアセトアミドで処
理される。両方の親株は最終的に死ぬ。しかし、
両者の間の結合生成物は生き残る（Wringt，W.
E.，Exptl.Cell Res.112，395（1978）を参照）。 【0026】 従来のハイブリドーマに適用され得る
トリオーマおよびクアドローマを選択しクローニ
ングする技術は、また、本発明のクアドローマお
よびトリオーマにも適用できる。好ましくは、蛍
光標識された抗原は検出系とクローニング系にお
いて用いられる。蛍光抗原を結合する個々の細胞
は、蛍光活性細胞の選別器により分離され得る。
そのような設備により単一細胞は個々のマイクロ
タイマーウエルに沈降し、それにより、従来の選
択やクローニングに要した労力が大幅に軽減され
る。 【0027】 二つの異なる抗原に結合特異性をもつ
た抗体を製造するトリオーマおよびクアドローマ
クローンの検出は、RMAを製造したという強力
な推定証拠である。多くの場合に、他の抗体を有
しないRMAを単離する工程がさらに必要であ
る。これら他の抗体は、例えば単一特異性を有す
る抗体分子、不活性抗体分子および骨髄腫蛋白を
含む同じ細胞により製造され得る。真のRMA分
子は、二元性結合特異性を有する免疫グロブリン
である。RMAは連続した二段階の親和性クロマ
トグラフイーにより特別に精製される。第一段階
は、不動の第一抗原を有する親和性カラムに特定
の結合を行う。第一段階で結合しない抗体分子
は、カラムを通り捨てられる。第一カラムに結合
する抗体は、次いで、カオトロピツクイオン
（chaotropic ion）緩衝液と共に溶離し、そして
第二段階において第二抗原を有する第二親和性カ
ラムにかけられる。いずれのカラムにも結合でき
る組換えモノクローナル抗体のみが第二の抗原に
結合する。適当な溶離工程の後、組換えモノクロ
ーナル抗体が本質的に純粋な形で得られる。 【0028】 RMAの存在は、二段階親和性クロマ
トグラフイーに頼ることなく、固相定量法により
検出されそして定量され得る。例えば、第１抗原
は固相担体に結合することにより固定される。
種々のそのような固相担体および結合技術は当該
技術分野で周知である。抗体試料は次いで固相担
体とインキユベートされ、その固定抗原に親和性
を有する抗体を結合させる。その担体は次いで洗
浄され非結合抗体を除去し、そして第二抗原とイ
ンキユベートされる。この第二抗原は、ラジオア
イソトープ、蛍光リカンドもしくは結合酵素のよ
うな適当なマーカーで標識される。二元性特異性
のRMAおよび第一抗原に対する従来の抗体の両
者は、固定化された第一抗原を結合できるが、
RMAだけが標識された第二抗原を結合できる。
第二抗原を結合できるが第一抗原を結合できない
すべての抗体は洗浄段階で除去され、そしてそれ
ゆえその定量法をそこねない。それゆえある他の
特異性の抗体の存在のもとでの組換えモノクロー
ナル抗体の定性と定量の両方が達成される。 RMAについて考えられる用途のうちのいくつか
を以下に述べる。 【0029】 モノクローナル抗体を腫瘍特異性抗原
に供給するハイブリドーマは、Ricinus
communisからの60000m.w.毒素の毒性サブユニ
ツトに対しモノクローナル抗体を作るハイブリド
ーマと融合される。そのクアドローマはRMAを
製造する。このRMAは毒素を有することが可能
であり、そして腫瘍細胞に結合するべく用いられ
得る。この腫瘍細胞は、これら腫瘍細胞を殺す毒
素を内蔵する。 【0030】 腫瘍特異抗原の対するモノクローナル
抗体を作るハイブリドーマは、トリニトロフエノ
ール（TNP）に対しモノクローナル抗体を作る
ハイブリドーマと融合される。TNPはリポソー
ムの外表面のアミノグループに共有結合し得る。
これらリポソームは、特に、腫瘍細胞への薬の供
給に用いられ得る。その理由は、リポソームが化
学治療薬をカプセル化するために作られ得るから
である。リポソームはTNPに結合するRMAで被
覆され、そしてそのRMAもまたその腫瘍に結合
し、その結果、これらリポソームが腫瘍細胞と融
合しそしてその薬を腫瘍細胞へ供給する。あるい
は、薬やホルモンのような細胞特異抗原およびハ
プテンに対するRMAが、そのハプテンを所望細
胞に特別かつ直接供給するのに用いられ得る。 【0031】 ホルモン（例えば、ヒト絨毛性ゴナド
トロピンのＢサブユニツト）、薬もしくは腫瘍特
異抗原に対するモノクローナル抗体を作るハイブ
リドーマは、放射性同位元素で高比活性に標識し
たラジオアイソトープハプテンに対するモノクロ
ーナル抗体を製造するハイブリドーマに融合され
る。そのクアドローマは、放射能をおび得る
RMAを製造する。そのようなRMAは定量、腫
瘍位置確認もしくは治療用に用いられ得る。同位
元素を用いるかどうかの選択は意図する最終の用
途の性質による。γ線放射同位元素は、薬、体液
中のホルモンおよび他のハプテン、組織試料、ウ
リンなどの免疫学的検定に用いられ得る。腫瘍特
異抗原、ホルモンもしくは薬が固相に結合する場
合には、そのRMAは一段階の競合放射性免疫学
的検定において用いられ得る。γ線放射同位元素
はまた腫瘍位置確認にも有用である。高熱量のα
線放射同位元素はα線放射が組織内で高熱量でか
つ短絡するため治療目的に特に有用である。β線
放射同位元素も同様に検定に用いられ得るが、臨
床実験室には通常見られないカウント設備を要す
る。 【0032】 前項の診断に役立つ抗原に対するモノ
クローナル抗体を製造するハイブリドーマは、酵
素西洋ワサビペルオキシダーゼに対するモノクロ
ーナル抗体を製造するハイブリドーマと融合され
る。そのクアドローマはRMAを製造する。この
RMAは一工程のenzyme−linked
immunosorbent assay（ELISA）に用いられ得
る。 【0033】 腫瘍特異抗原に対するモノクローナル
抗体を製造するハイブリドーマは、蛍光プローブ
に対するモノクローナル抗体を製造するハイブリ
ドーマと融合される。そのクアドローマはRMA
を製造する。そのRMAは、組織細片の腫瘍細胞
の蛍光顕微鏡検出に、もしくはフロー・ミクロフ
ルオリメトリー（FMF）を用いる細胞懸濁液の
腫瘍細胞の計数に用いられ得る。 【0034】 ここで用いる「腫瘍特異抗原」という
用語は、特別の腫瘍に特有な、もしくはそのよう
な腫瘍と互いに強く関連する抗原を意味すると解
釈される。しかし、腫瘍特異抗原に関する当該技
術分野における最近の理解によれば、これら抗原
は腫瘍組織に必ずしも独特ではないということ、
もしくはこれら抗原に対する抗体が正常組織の抗
原と交差反応し得るということである。腫瘍特異
抗原が腫瘍細胞に独特でない場合でさえも、実際
上のこととして、腫瘍特異抗原に結合する抗体は
交差反応のゆえのとんでもない危険もしくは干渉
なしに所望の操作を行うのに腫瘍細胞に十分に特
異的であるということがしばしば起こる。この実
際上の特異性には多くの要因が関係している。例
えば、腫瘍細胞上のある量の抗原は正常細胞上に
みられる量を大きく超過し、あるいは交差反応抗
原を有する正常細胞はその腫瘍とは無関係な位置
にあることが確認され得る。正常反応の抗原は腫
瘍特異抗原と部分的に交差反応し得るにすぎな
い。腫瘍を構成する細胞型に特異な生成物は、
時々、実際上の腫瘍特異抗原として働く。例え
ば、リンパ球白血病細胞により作られる抗体はそ
れ自体抗原として用いられ得る。この抗原に対
し、「抗イデイオ型」抗体がそのような細胞に特
別に結合するよう選択され得る。それゆえ、「腫
瘍特異抗原」という用語は実際的な利用の特異性
にここでは関係するのであつて、絶対的特異性を
意味したりあるいは腫瘍に独特な抗原を意味する
ものではない。 【0035】 さらに、腫瘍細胞以外の細胞は所定型
の細胞に特有かもしくはこれと互いに強く関連す
る細胞特異抗原を有することが理解される。所定
組織は組織特異抗原を有し得、これら抗原はある
所定組織に特有かもしくはこれと主として関連す
る。細胞特異で組織特異な抗原はまた、所望細胞
と組織に対し、もし独占的に結合しなければ、優
先的に結合することのできるRMAを製造するの
に有用である。 【0036】 次の実施例は、RMAを製造するクア
ドローマの製造に適用される技術を説明するクア
ドローマを調製しかつあらゆる所望のペアの抗原
を結合し得る組換えモノクローナル抗体を製造す
るために本質的には記述される所望の技術が適用
され得る。 【0037】 たいていのRMAは二つの異なる抗原
に結合親和性を有するが、同一の抗原上の二つの
異なるエピトープに結合するRMAは、適当に選
択されたクアドローマもしくはトリオーマクロー
ンから調製され得ることが理解される。他の
RMAを調製するための操作における重大な変更
は、免疫性を与えるために用いる抗原の性質、適
切なハイブリドーマとトリオーマとクアドローマ
による抗体生成を検出するのに用いる検索テス
ト、および用いる精製法にある。検索定量法は特
に重大である。その理由は、結合親和性の他に所
望の抗体特性、例えば抗体が抗原を沈降させるか
どうか、補体を結合するかどうか、他の抗原と交
差反応するかどうかなど、の選択がこの段階で行
われるからである。ここに開示された技術と機能
的に均等であると当該分野で知られかつ当業者に
理解されるタイプの技術上の変更を行つて便宜の
ためあるいは収率の最適化のため、あるいは単純
化のためあるいは全体の操作を改善して効果的な
コストにするために努め得る。 【0038】 【実施例】（実施例１） 次の抗原は、フルオレセインおよびローダミンと
いう二つの蛍光ハプテンに二元性の結合親和性を
有する組換えモノクローナル抗体を製造するため
に調製される。その抗原とは、フルオレセイン・
イソチオシアネートが結合された牛の血清アルブ
ミン（Ｆ−BSA）、フルオレセイン・イソチオシ
アネート標識した卵アルブミン（Ｆ−OVA）、ロ
ーダミン・イソチオシアネートが結合された牛の
血清アルブミン（Ｒ−BSA）、そしてローダミ
ン・イソチオシアネートが結合された卵アルブミ
ン（Ｒ−OVA）である。フルオレセインおよび
ローダミンはこれが蛍光によりただちに定量され
るのでハプテンとして選択され、そしてこれらは
その励起および放射極大が実質的に互いに異なる
ため相互の存在下で定量され得る。二つの異なる
蛋白に連結する同一ハプテンを用いることによ
り、そのハプテンに向く抗体とそのハプテンが結
合する該蛋白に向く抗体とを識別することが可能
になる。例えば、Ｆ−BSAが免疫処置に用いら
れる場合、検索はＦ−OVAで行われる。フルオ
レセインの一部に結合親和性をもつ抗体のみが検
索の定量において検出される。フルオレセインと
ローダミンのイソシアネート誘導体は、例えば、
ミズリー州セントルイスにあるSigma Chemical
Co.から、市販されている。 【0039】 カプリング反応を行うために、PH９の
0.1モルNaHCO310mlに溶かした50mgの蛋白を所
望のイソチオシアネート誘導体５mgと混合し、そ
してゆるやかに攪拌を行いつつ室温にて30分間イ
ンキユベートした。その生成物は、グラス・ウー
ルで濾過し沈殿蛋白と不溶性の未反応イソチオシ
アネートを除去して後、リン酸緩衝化生理食塩水
（PH7.4の10mM Na−Phosphate 0.15M NaCl）
のセフアデツクスＧ−25（スエーデン、ウプサラ
のPharmacia，Inc.の商標）クロマトにかけて、
標識蛋白を未反応生成物から分離しそしてバツフ
アー系を変えた。誘導蛋白のピークは視覚で同定
され、そしてそのカラムのポイド容積に等量のバ
ツフアー量で溶離する。この誘導蛋白は、それ以
上の精製を行うことなく、免疫処置とテスト用に
用いられる。 【0040】（実施例２） 免疫処置 生体内での免疫処置は、Vaitukaitis，
J.等のJ.Clin.Endocrin.33，998（1971）の免疫処
置に基づく方法を用いて行われる。完全フロイン
トアジユバントと生理食塩水の懸濁液の抗原100
mgが20部位に等量に皮内注射される。一週間後、
最初の注射により生ずる肉芽種に同じ抗原試料を
第二の注射として注射する。二週間後、100mgの
抗原が実際的に１：１の不完全フロイントアジユ
バントと生理食塩水を用いて肩と腰上の４箇所に
注射される。一週間後、尾から血液の試料が採ら
れそして抗体が測定される。この動物は、現在４
日間連続的に１回の注射当り1μｇの抗原が静脈
注射されている。この処理により、ひ臓にあるリ
ンパ芽球細胞の数が最大となる。そのため、融合
段階後に抗原特異ハイプリドーマの生成する頻度
が増大する。 【0041】 インビトロでの免疫処置の操作は、
Luben，R.A.等のProc.Second Int.Lymphokine
Workshop，Academic Press，New York，N.
Y.（1979）に記述されている技術にもとづく。 【0042】 免疫処置のなされていない成体の
BALB／ｃマウスのひ臓は無菌的に取り出され、
そしてひ臓細胞の単一細胞懸濁液が調製される。
この細胞は、完全ダルベツコの修正イーグル培地
（以下DMEMという、ニユーヨーク州ダランドア
イランドのGrand Island Biological Company
から市販）で20mlに稀釈される。この培地は抗原
を30μｇ〜1000μｇ含有する。そして、10mlの胸
線細胞調整培地が加えられる。 【0043】 胸線細胞調整培地は生後10日の３匹の
マウスの胸線細胞からもしくは成体マウスから得
られる混合胸線細胞培養物から調製される。
BALB／ｃマウスからの胸線細胞と、主要組織
適合性部位（例えば、C57ブラツク）での異なる
株からのものとが完全DMEMにて２〜４×106胸
線細胞／mlで共培養される。37℃で48時間の培養
の後その細胞およびその破片は遠心分離され、そ
して培地はアスピレータで吸引され10mlづつの試
料の形で−70℃で凍結し保存される。 【0044】 免疫処置のなされていないひ臓細胞、
抗原および胸線細胞調製培地の混合物は、75cm2の
フラスコに入れ、そして組織培養器内に37℃にて
５日間触れないておく。５日後、大きなリンパ芽
球が位相差顕微鏡により観察され得、免疫処置が
うまく行つたことがわかる。これら細胞はついで
融合に供される。 【0045】（実施例３） リンパ球・骨髄腫融合およびハイブリドーマの単
離 Shulman，M.等のNature276，269（1978）に記
述されているSP2と称する骨髄腫株が融合に選ば
れる。このSP2細胞系は非製造型骨髄腫蛋白であ
る点に特徴があり、そしてHPRT活性を欠くた
めに８−アザグアニン耐性である。SP2細胞系は
すでに広く行きわたつており、例えば、カリフオ
ルニア州ラジオラのScripps Clinic and
Research FoundastionのKlinman教授から得ら
れうる。 【0046】 融合培地は、血清を含まない培地にポ
リエチレングリコール1540M.W.を47容量％でそ
してジメチルスルフオキシドを7.5容量％で含む。
ポリエチレングリコールはPontecorvo，G.の
Somatic Cell Genet.VOL.1397（1975）に記載さ
れているように細胞融合を誘発する。ジメチルス
ルフオキシドはNorwood，T.H.等のSomatic
Cell Genet.Vol.2263（1976）に記載されているよ
うに融合頻度を高める。これは膜相遷移温度を下
げることにより可能となる。 【0047】 生体内で免疫処置されるひ臓細胞し
て、単一細胞懸濁液が培養での免疫処置のために
記述のように過剰免疫性ひ臓から作られる。対数
増殖期でのSP2骨髄腫細胞（30ml、５〜８×105
細胞／ml）は50mlの円錐形ポリプロピレン遠心分
離管へ移され、ひ臓細胞懸濁液（５ml）が加えら
れる。粘着性リンパ芽球細胞を除去し、遠心分離
しそして培地を除いて後細胞がインビトロで免疫
処理されたひ臓細胞用に得られる。SP2細胞（30
ml）が上記のように加えられる。いずれかの試料
と共に、これら細胞は血清を含まない50mlの
DMEMを用い遠心分離により３回洗浄される。
３回目の洗浄物からのペレツトは、37℃水浴から
取り出されたばかりの融合培地１mlに再懸濁され
る。この培地は１分間にわたつて添加されそして
細胞はピペツト先端で連続的に攪拌される。攪拌
はさらに１分間続けられる。37℃の無血清
DMEMの２mlが攪拌しつつ次の３分間にわたつ
て添加される。10％のウサギ血清を含有する37℃
DMEMの数mlが攪拌しつつ次の３分間にわたつ
て添加される。細胞は遠心分離され、そして
HAT選択化学薬品と供給細胞を含有する10mlの
完全培地に再懸濁される。そして、マイクロタイ
マー板の96のウエルに分配される。 【0048】 フイーダー細胞は、0.5mlプリスタン
（２，６，10，14−テトラメチルペンタデカン）
の腹膜内注射後に得られる腹膜の浸出物細胞であ
る。４日後、細胞は処理マウスの腹膜腔をすすぐ
ことにより収集される。収量はマウス当り終始一
貫２〜４×107である。 【0049】 抗体生成細胞は、蛍光活性化細胞選別
器を用いて直接クローン処理される。陽性の細胞
はその装置の蛍光プローブに結合し陰性細胞から
分離される。プローブは、免疫処置において用い
る蛋白とは異なる蛋白に連結する蛍光ハプテンか
ら得られる。例えばＦ−BSAもしくはＲ−BSA
が免疫処置に用いられるとき、その蛋白に対する
抗体を製造するハイブリドーマの選択をさけるた
めに、Ｆ−OVAもしくはＲ−OVAがプローブと
して用いられる。 【0050】 非蛍光性抗原に適した別の検索操作
は、enzyme−linked immunosorbent assay
（Saunders，Ｇ，C.Immunoassays in the
Clinical Laboratory，99−118（1979）に基づく。 【0051】 可溶性抗原に対する抗体を検出するた
めに、水に溶かした抗原10〜100μｇ／mlがウエ
ル当り50μの割でポリスチレンの96ウエルの板
に加えられ、37℃培養器内での乾燥に供される。
使用直前に、これらの板は150mMNaCl中の
10mM Na2HPO4（PBS−９）で３回洗浄される。
細胞表面成分との反応性について抗体を検索する
ために、細胞を不動化レクチンを用いて固定化す
る。コンカナバリンＡは可溶なカーボジミドを用
いポリスチレンウエルに共有結合される
（Reading，C.L.等のJ.Natl，Cancer Inst.64，
1241（1980））。これら板はPBS−９で３回洗浄さ
れ、細胞は、100μの完全DMEMの各ウエル
（１×105〜２×105）に加えられる。板は細胞が
付着する１〜２時間37℃に保持される。その後、
板はPBS−９で６回洗浄されそしてPBS−９の
新鮮な１％ホルムアルデヒド50μが各ウエルへ
加えられる。板は室温に15分保持され、次いで
PBS−９で６回洗浄されそしてただちに使われ
る。 【0052】 各ハイブリドーマ培養物から50μの
培地が抗原を含有するウエルへ移される。これら
試料は室温で30分間培養され、板は0.05％トリト
ン−Ｘ−100水溶液（商標、ニユージヤージー州
ヌトレイのRohm ＆ Haas Company）で10
回洗浄される。酵素標識した抗マウス免疫グロブ
リン（ペンシルバニア州コークランビルの
Cappel Laboratories）は10mM Na2HPO4
0.05M NaCl、牛の血清アルブミン50μｇ／mlを
含有する0.5容量％トリトン−Ｘ−100に希釈され
る。 【0053】 接合体は各ウエルに加えられそして室
温で15分間培養される。板は0.5容量％トリト−
Ｘ−100で10回洗浄され100μの基質が加えられ
る。色素基質２，2′−アジノージー（３−エチ
ル）−ベンズチアゾリンスルフオン酸（ABTS）
が前記Saundersにより述べられているように用
いられる。着色した酵素生成物は、414mμでの吸
光度を測定することにより定量される。 【0054】 所望抗体を製造する培養物からの細胞
は、計数されそして希釈されて完全HT培地
（10-3Ｍ ヒポキサンチンと３×10-4Ｍチミジン
含有DMEMの１ml当り30〜50の生育し得るハイ
ブリドーマを得る。 【0055】 懸濁液の0.1mlずつが96ウエルのマイ
クロタイター板の各ウエルヘピペツトで注入され
る。この板には1.2×105の腹膜浸出物供給細胞が
含まれる。各ウエルは、ウエル当り平均３〜５の
ハイブリドーマ細胞を含有する。 【0056】 培養物は37℃で７日間組織培養培養器
にて培養され、次いで0.1mlの完全HT培地に各ウ
エルに加えられる。さらに14〜21日の培養の後
に、クローンは密に存在し、すぐにも検索に供さ
れ得る。この検索はELISA法かもしくは添加さ
れた蛍光性ハプテンを結合する抗体のゆえに蛍光
消光の測定かのいずれかによりなされる。特異性
制御のゆえに、フルオレセインと反応する抗体は
ローダミンを結合するはずがなく、その逆もまた
同じである。６つの最も強力な陽性培養物がより
広いウエルへ移され、そしてその培養物が再度密
になるまで培養した後再定量される。最も強力な
２つの培養物からの細胞に一部を限界稀釈法によ
り、すなわち（フイーダー層を用い）ウエル当り
約0.3細胞とすることにより再クローン化される。
この２つの最強の陽性培養物中の残留細胞は追加
培地にて培養され数が増える。そして凍結保存さ
れる。 【0057】 制限稀釈クローンが適当な細胞濃度に
達すると、存在する単一クローンを有する各ウエ
ルは定量される。６つの陽性クローンはより広い
ウエルへ移され、数を増やすために再び培養さ
れ、そして凍結存在される。２つの最強のウエル
について、限界稀釈クローニングをもう一度行つ
て安定性が検査される。FACSは既述のようなし
方でこれら選択と再クローニング工程において有
用である。これらのプロセスは激しい労働である
ため、該細胞選別器を適用できるどの段階におい
ても用いることは有効である。90％を上まわる陽
性クローンを生むクローンは、安定であると考え
られる。90％を下まわる陽性クローンを生むクロ
ーンは安定性を得るまで再クローン処理される。 【0058】（実施例４） クアドローマ生成 クアドローマ生成の第一段階
は、親ハイブリドーマの存在下でクアドローマ融
合生成物を優先的に成長させるのにふさわしい変
異ハイブリドーマ株の選択である。この実施例で
は、フルオレセインに対する抗体を製造するハイ
ブリドーマ株が８−アザグアニンおよびアバイン
耐性になるようさらに修飾される。修飾ハイブリ
ドーマは、既述のように、一つの共通融合体とし
て用いられる。 【0059】 ８−アザグアニン耐性の選択は、阻害
物質の濃度を徐々に増加させることにより順応成
長させる工程を含む。阻害物質濃度は約1μMか
ら始める。数世代を経た細胞は、次いで、さらに
数世代の成長期間にわたつて3μMの８−アザグ
アニンへ移される。この工程は、100μMの８−
アザグアニンの存在下で成長する株が得られるま
で、阻害物質の量を少しずつ増やしながら繰り返
し行われる。この操作により自然にもしくは８−
アザグアニン誘発変異により生ずる変異株が選択
される。これら変異株は機能HPRT活性が欠落
している。８−アザグアニン耐性ハイブリドーマ
株は、次いで、Bakar，T.M.等のCell１，９
（1979）に記述されている方法を本質的に用いて
同様な順応成長工程によりウアバイン阻害に耐性
にされる。 【0060】 対数増殖期の親ハイブリドーマ（30
ml、５×105〜８×105細胞／ml）のそれぞれを、
50mlのポリプロピレンのコニカル遠心管に移し、
50ml無血清DMEMで３回遠心によつて洗浄する。
３回目の洗浄により得られるペレツトを37℃ウオ
ーターバスから取出したばかりの融合培地１mlに
再懸濁する。この培地は１分以上にわたつて加え
られ、細胞をピペツトの先でかきまわし続ける。
さらに１分間かきまわす。さらに37℃で無血清培
地を２ml、３分間にわたつてかきまぜながら加え
る。次に10％ウサギ血清を含む37℃のDMEM7ml
を、かきまぜながら３分間にわたつて加える。 【0061】 両方の抗原に対する抗体を製造するク
アドローマの収量は、従来の融合に比較して高
く、その数は、安定した融合１回につき1000〜
10000である。これは個々の親細胞が望ましい型
であるためである。 【0062】 融合工程を完了し、細胞をマイクロタ
イタープレートのウエルに分配した後、10-3Ｍの
ウアバインを含有するHAT培地（３×10-6Ｍチ
ミジン、４×10-7Ｍアミノプテリンおよび３×
10-5Ｍヒポキサンチンを含有するDMEM）中で、
インキユベートする。前述のように、両方の親ハ
イブリドーマ株は、HAT−ウアバイン培地中の
培養で死滅する。これに対して、機能性HPRT
およびウアバイン耐性変異を保持するクアドロー
マは、生き残つて増殖する。 【0063】 選択の後、両抗原を同時に結合するク
アドローマは、個々のマイクロタイターウエルに
おいてクローン処理される。このとき、蛍光活性
化細胞選別器に単一細胞付着アタツチメンを用い
る。この単一細胞は10〜14日のうちに密な培養物
になる。 【0064】 あるいは、これらクアドローマは軟寒
天培地において平板培養することにより検出され
クローン処理される。10〜14日の成育の後、現れ
るクローンは前記Sharon等により述べられる固
相定量法によりその位置でテストされる。 【0065】 最初は一方の抗原と次いで他方の抗原
との反復テストが必要である。両方の抗原と反応
するクローンは所望のクアドローマを含む。ある
いは、クアドローマを一方の抗原で被覆された表
面に結合され他方の抗原との結合能をテストする
ことにより、検索を行うこともできる。 【0066】 ハイブリドーマについて前述したよう
に、最も活性でかつ安定なクローンは、安定性を
確実なものとするために再クローン処理される。
90％を上まわる陽性クローンを得るクローンは安
定であると考えられるが、他方、90％を下まわる
収量のクローンは安定性が達成されるまで再クロ
ーン処理される。推定RAMを製造するクアドロ
ーマクローンは抗体を製造するクローンであり、
その抗体は免疫を与える抗原すなわちフルオレセ
インおよびローダミンの両方を結合する。 【0067】 上記のようにしてクアドローマ細胞が
得られる。上記２種の親ハイブリドーマの代わり
にハイブリドーマとリンパ球とを用い、同様に操
作を行うことによりトリオーマ細胞が得られる。
このようにして、例えば上記と同様の方法で得た
トリオーマ細胞もまた、フルオレセインおよびロ
ーダミンに対して結合親和性を有する抗体を生成
する。 【0068】（実施例５） 組換えモノクローナル抗体の調製および精製 RMAは、クアドローマ培養物の上澄みからかも
しくはクアドローマ細胞を腹膜内注射されたマウ
スの腹水から単離される。後者の場合には、
BALB／ｃマウスは0.5mlプリスタンを腹膜内注
射することにより前処理される。一つの安定クロ
ーンについて１×106〜２×106クアドローマ細胞
が腹膜内注射される。腹水腫瘍は10〜21日間まで
に明白となり、そして腹水液は腹膜腔が膨張する
と収集される。細胞は遠心分離により除去され、
抗体は60％の飽和硫酸アンモニウムにより沈殿さ
せられる。抗体は次いで透析されそして凍結され
る。抗体収量は、通常、マウス当り約30〜50mgで
ある。 【0069】 組換えモノクローナル抗体は、二段の
親和性クロマトグラフイーにより、抗体調製物か
らさらに精製される。最初のカラムにおいては、
Ｆ−BSAがCNBr活性セフアロース4B（商標、ス
エーデン、ウプサラのPharmacia Fine
Chemicals Ａ Ｂ）に連結される。このとき、
March，S.C.等のAnal.Biochem.60，149（1974）
により述べられている標準カプリング法を用い
る。第二のカラムは、CNBr活性化セフアロース
4Bに連結するＲ−BSAで充填される。これらの
カラムはPBS−９で平衡化される。そして抗原
試料が第一カラムにかけられ、２〜３カラム量の
PBS−９で溶離される。第一カラムは、次いで、
3Mポタシウムイソチオシアネート含有のPBS−
９で溶離される。溶離蛋白はPBS−９に対し透
析されそして第二カラムにかけられる。これも第
１カラムと同じ方法で溶離される。ポタシウムイ
ソトシアネート溶離後に第二カラムから回収され
る蛋白は、組換えモノクローナル抗体であり、こ
れは分子当り二つの別の結合部位を有する。一つ
はフルオレセインに対するものであり、一つはロ
ーダミンに対するものである。このRMA試料
は、透析され、濃縮されそして凍結保存される。 【0070】 本明細書は、組換えモノクローナル抗
体を製造し得る新規な細胞型、クアドローマおよ
びトリオーマ、の生成を述べている。この抗体の
分子種は今までに知られておらず、この抗体は二
つの異なる抗原に結合親和性を有し、（つまり、
分子内に２種の抗原結合部位を有し）かつ両方の
抗原を同時に結合し得る。そのような新しい物質
を製造するための技術が特に実施例という方法を
含む特定の実施態様を挙げて詳述されている。本
発明の生成物および技術は想像以上に意味深くか
つあらゆる対の抗原特異性を単一抗体に結合する
広範囲のRMA型を包含することが理解できる。
さらに、ここに用いる技術の多くの変更は当業者
が容易になし得ることであり、そしてそのような
変更は本発明の範囲内にあると考えられることが
理解できる。 【0071】 【発明の要約】 本発明は、２つの所望の抗原に
対して結合親和性を有する（分子内に２種の抗原
結合部位を有する）抗体（以下、「組換えモノク
ローナル抗体」と称する）を製造するクアドロー
マ細胞：および該クアドローマ細胞の製造方法を
提供する。クアドローマ細胞とは、第１の抗原決
定基に対して特異的な結合部位を有する抗体を製
造するハイブリドーマ細胞と、第２の抗原決定基
に対して特異的な結合部位を有する抗体を製造す
るハイブリドーマ細胞との融合生成物である。
抗体の分野に関する。さらに詳しくは、本発明の
トリオーマ（trioma）およびクアドローマ
（quadroma）と称される新しい生物学的単位の
創製に関し、これらはここで組換えモノクローナ
ル抗体と称する新しい、二重性の機能を有する
（bifuctional）抗体を製造する。組換えモノクロ
ーナル抗体（以下RMAと呼ぶ）は、ここに詳述
する診断上、および治療上の広範な用途を有す
る。 【0002】 【従来の技術】 抗体は、骨髄のＢリンパ球に由
来するリンパ系細胞により通常合成される。非常
に多くの違つた抗体特異性は、多くの構造上の特
徴を共通に有する免疫グロブリン分子により達成
される。異質な結合特異性を有する個々の抗体分
子はその細目にわたるアミノ酸配列において異な
り、そして、通常、同じ特異性の抗体でさえも異
なるアミノ酸配列（そのような配列は実質的に同
質であるかもしれないが）の免疫グロブリンの混
合物である。「抗体」と「免疫グロブリン」とい
う用語は、ここでは同じ意味で用いる。 【0003】 個々のリンパ球は単一のアミノ酸配列
の免疫グロブリンを製造する。リンパ球を直接培
養して特定の抗体を製造することはできない。し
かし、Kohler等、Nature256，495（1975）によ
れば、体細胞融合、詳細にはリンパ球と骨髄細胞
との間の融合プロセスによりハイブリツド細胞が
得られ、この細胞は培地で成長し特定の抗体を製
造することが示されている。骨髄腫瘍細胞はリン
パ球腫瘍細胞であり、これら細胞は細胞株によつ
ては（若干の非製造株は知られているけれども）
しばしば抗体自体を製造する。 【0004】 リンパ球と骨髄腫細胞との体細胞融合
から得られるハイブリツドは、ここおよび当該技
術分野では一般に「ハイブリドーマ」細胞と称さ
れる。代表的な融合操作においては、ある選択さ
れた抗体に対し免疫を与えられた動物からのひ臓
リンパ球が骨髄腫細胞と融合される。得られるハ
イブリドーマは、次いで、一組の別々の培養管も
しくはマイクロタイマー板のウエルにて分散され
所望の抗体を製造する培養物が検索される。陽性
培養物はさらに希釈され単一細胞（クローン）か
ら生ずるコロニーを得る。コロニーは所望の抗体
の製造用に再度検索される。クローン化されたハ
イブリドーマにより製造される抗体は、ここおよ
び当該技術分野では「モノクローナル」と称され
る。 【0005】 リンパ球およびハイブリドーマに関す
る遺伝学研究から、DNAセグメントにより特定
に抗体が暗号化されこれらDNAセグメントは生
殖系細胞に当初から存在する種々の可能な暗号セ
グメントから選択されるということが知られてい
る。分化の結果として、暗号セグメントのいくつ
かが再配列もしくは削除されその結果十分に分化
したリンパ球が単一抗体の製造に遺伝学的に制限
される。Science212，1015（1981）を参照のこと。
単一細胞もしくはクローンによる一つを越える抗
体の合成を示す試みがすでになされ、骨髄腫と骨
髄腫の融合細胞が混合骨髄腫蛋白を製造すること
を示したという程度においは成功している
（Cotton，R.G.H.等、Nature，244，42（1973））。 【0006】 モノクローナル抗体は高度に特異的で
あり、単一抗原のみに対応している。さらに、典
型的には同一の抗原上の異なる組の決定基に対応
する異なる抗体を含む従来の抗体調製物とは対照
的に、モノクローナル抗体は抗原上の単一の決定
基にのみ対応する。モノクローナル抗体は、抗原
抗体結合を用いる診断用および分析用定量法の選
択性と特異性を向上させるのに有用である。モノ
クローナル抗体の第二の利点は、これら抗体がハ
イブリドーマ培養により純粋な形で合成され他の
免疫グロブリンにより汚染されないという事実で
ある。モノクローナル抗体は培養したハイブリド
ーマ細胞の上澄みからもしくはハイブリドーマ細
胞をマウスの腹腔内へ接種することにより誘導さ
れる腹水から調製され得る。 【0007】 免疫グロブリンの蛋白構造はよく知ら
れている。免疫グロブリンＧ（IgG）は二つの重
蛋白鎖（分子量約64000）と二つの軽蛋白鎖（分
子量約22500）からなる。これら重鎖はジスルフ
イド結合により共有結合で結合し、各軽鎖はジス
ルフイド結合により重鎖に結合している。IgMは
IgGと同じ基本構造を有し、マルチマー形である
点に特徴がある。骨髄腫細胞は、骨髄腫蛋白もし
くはBence−Jones蛋白とも称される軽鎖モノマ
ーもしくはダイマーを分泌する。そのうちのいく
つかは抗原を結合する能力を有する。正常な抗原
の軽鎖および重鎖は、細胞での一般的な蛋白合成
機構により合成される。これら重鎖と軽鎖は別々
に合成されその後結合される。 【0008】 抗体鎖の化学的再分類はすでに先行技
術において試みられている。Stevenson等
（Biochm.J.108，375（1968））による早期の試み
においては、異種結合が少ない割合で得られてい
たにすぎない。最近では、Peabody，D.S.等、
Biochemistry19，2827（1980）により、異なる骨
髄腫源から軽鎖の特定の異種結合が示された。こ
れらハイブリツド分子は両方の親分子ではなく親
分子のうちの一方が結合し得るリガンドに結合親
和性を示した。重鎖の軽鎖との異種結合、もしく
は重・軽対の異種結合は報告されていなかつた。
Raso，V.，Cancer Res.41，2073（1981）は二つ
の配位子に結合親和性を備えた抗体フラグメント
（Ｆ（ab′）2フラグメント）のインビトロでの構造
を報告している。この報告された操作において
は、抗体分子のそのフラグメントの再分類の前に
ペプシンで部分的に分解する必要があり、それゆ
え、得られた二元の特異性結合蛋白は抗体分子の
フラグメントであつた。 【0009】 種々の治療目的にモノクローナル抗体
を用いることがすでに示唆されている。特に興味
ある応用は、腫瘍を含む特定の組織もしくは細胞
への特に狙いを定めた投薬である。例えば、
Gulliland等のProc.Nat.Acad.Sci.USA，77，
4539（1980）は、モノクローナル腫瘍抗体をジフ
テリア毒素と化学的に結合させること報告してい
る。モノクローナル抗体を目的とする細胞に特異
的に結合させることにより、所望の細胞への特定
の薬、阻害物質もしくは毒素を他の細胞との相互
のあらゆる影響を極小にしつつ供給できるように
なる。そのような技術は、薬もしくは毒素をモノ
クローナル抗体と結合させる化学結合反応に依存
しており、活性の低下、特異性の減少そして起こ
り得る好ましくない副反応という不利な事項を伴
う。それゆえ、抗体分子に化学的に決して連結す
ることのない活性物質との結合において有用なあ
る目的とする受渡し系を供給することは、非常に
有効である。 【0010】 【発明の要旨】 本発明は、単一の抗体分子内で
二つの異なる抗原に結合親和性を有するという意
味で二元性の機能を備える新規な組換えモノクロ
ーナル抗体（以下RMAとする）を提供する。
RMAは同時もしくは順次その抗原を結合し得
る。RMAは同じ抗体による二つの異なる抗原の
結合に依存する機能テストにより特徴づけられ
る。たとえば２本の親和性クロマトグラフイーカ
ラムの各々、すなわち、一方は第一の不動化抗原
を有し他方は第二の不動化抗原を有するカラムの
各々に順次結合する能力を有することにより特徴
づけられる。 【0011】 RMAはその目的のために構成された
新規な細胞型により製造される。一つのそのよう
な細胞はここでは「クアドローマ」と称され、二
つのハイブリドーマの体細胞融合により生成され
る。この各親ハイブリドーマは二つの抗原のうち
の一方に対し特異的なモノクローナル抗体を製造
する。もう一つのそのような新規な細胞型はここ
では「トリオーマ」と称され、ハイブリドーマと
リンパ球の融合により生成される。ハイブリドー
マとリンパ球は各々二つの抗原の一方に対する抗
体を製造する。両親の型の軽鎖および重鎖は、ク
アドローマ細胞とトリオーマ細胞において合成さ
れる。両方の種類の細胞の軽鎖および重鎖が等量
生成されそして無作為に結合すること、IgG製造
細胞により製造される抗体の少なくとも1/8が二
元性機能のRMAである。IgM製造細胞から製造
される本質的にすべての抗体は、二つの抗原の
各々に少なくとも一つの結合部位を有するという
意味で二元性機能を有する。 【0012】 トリオーマとクアドローマの構成は、
所望の融合を自己融合および非融合親細胞型と区
別するための選択系（セレクシヨンシステム）の
使用に依る。ここに開示されるたいていの選択系
は、それ自身新規だと信じられる変異ハイブリド
ーマの構成もしくは単離に依る。この選択系は、
その大部分がRMAを製造する二つの親細胞型の
ハイブリドーマを選択的に成長させるよう設計さ
れる。 【0013】 クアドローマおよびトリオーマは、そ
の培養物が単一クローンにおいて二つの抗原を結
合する能力を検索されるということを除いて、ハ
イブリドーマをクローン処理する操作に本質的に
以た操作によりクローン処理される。RMA自身
の二元性機能の性質の分析は、さらに、二段階親
和性クロマトグラフイーによるかもしくは単一性
機能分子の二元性機能分子からの分離を容易にす
るために固相不動化抗原を含む分析技術により行
われる。 【0014】 クアドローマ、トリオーマおよび組換
えモノクローナル抗体の用途は多様である。これ
ら用途は、分析用および診断用技術、生物学的お
よび薬理学的活性物質の特定細胞への所定の供
給、そして特定抗原、受容体および細胞表面物質
の同定と位置確認を含む。RMAを使用すると、
親和性と特異性が単一機能抗体分子にある種の標
識を共有結合的に着けるのに用いる先行の化学処
理により影響されないので有利である。さらに、
RMAの使用は、染料、薬もしくは追跡化合物の
連続的投与が可能でありそれにより先行技術の利
用できる範囲が拡大する。例えば、RMAは一段
階において目的とする細胞のような第一抗原に結
合し得、そして次の段階においてその複合物に薬
や追跡物質のような第二抗原が結合し得る。該次
段階は第一段階とは異なる条件のもとで行われ得
る。 【0015】 RMAは、投与後の抗体の腎クリアラ
ンスが、迅速であることが望まれる場合の治療用
のために、二元性の特異性を有するＦ（ab′）2フラ
グメントへ転換され得る。 【0016】 【発明の構成】 本発明のクアドローマ細胞は、
第１の抗原決定基に対して特異的な結合部位を有
する抗体を製造するハイブリドーマと、第２の抗
原決定基に対して特異的な結合部位を有する抗体
を製造するハイブリドーマ細胞との融合生成物で
あり：Fab部分とFc部分とを有する抗体であり、
分子内に２種の抗体結合部位を有し、該抗原結合
部位がそれぞれ異なる抗体産生細胞に由来し、か
つ異なる抗原決定基に対して特異的である抗体を
製造する。 【0017】 本発明のクアドローマ細胞の製造方法
は、第１の抗原決定基に対して特異的な結合部位
を有する抗体を製造するハイブリドーマ細胞を、
第２の抗原決定基に対して特異的な結合部位を有
する抗体を製造するハイブリドーマ細胞に融合す
ることを包含する。 【0018】 以下に本発明を詳述する。 【0019】 組換えモノクローナル抗体の製造の最
初の工程は、所望抗体を製造するひ臓細胞の母集
団を準備するための免疫処置である。免疫処置
は、ひ臓細胞が結果的に得られるマウスのような
実験動物の従来の生体内免疫処置により達成され
得る。あるいは、Luben，A.R.等のProc.Second
Int.Lymphokine Workshop，Academic Press，
New York，N.Y.（1979）で述べられている方法
のような、ひ臓細胞を培地中で直接インビトロ免
疫処理することも効果がある。インビトロ免疫処
置は、大部分の免疫ひ臓細胞が従来の免疫処置に
より要求されるよりも短い時間で得られるという
こと、および人間を有害のおそれのある物質で免
疫処置に供することなく人間の細胞系が免疫処置
され得るとう利点を有する。さらに別の利点は、
数種の抗原に対するハイブリドーマを同時に調製
するのに数種の抗原がただちに用いられ得るとい
うことである。 【0020】 種々の骨髄腫細胞系がマウスもしくは
人間の細胞との雑種形成用に入手される。多くの
骨髄腫株は軽鎖モノマーもしくはダイマーを製造
し、そして常時ではないがしばしばそのような細
胞に由来のハイブリドーマがこれら蛋白を排せつ
し続ける。非製造骨髄腫株は、たいていの雑種形
成に好ましい。ハイブリドーマによる骨髄腫蛋白
の製造が回避されるためである。所望のハイブリ
ドーマだけを選択的に成長させるために遺伝学的
選択マーカーを有するハイブリドーマを用いるこ
とも好ましい。先行技術において既知の一般的な
選択系は、８−アザグアニンに耐性の変異株を利
用する。そのような変異体はヒポキサンチン、ア
ミノプテリンおよびチミジンを含有する培地
（HAT培地）で成長できない。８−アザグアニ
ン耐性変異体は、機能性のヒポキサンチン・ホス
ホリボシル転移酵素（HPRT）を欠く。そのよ
うな細胞はアミノプテリンの存在下では成長し得
ない。従来のハイブリドーマ技術では、８−アザ
グアニン耐性骨髄腫株は普通に用いられる。融合
の後、ハイブリツド細胞はひ臓細胞親から機能性
のHPRT遺伝子を受けとり、そしてそれゆえ
HAT培地で成長し得る。一方、親の骨髄腫細胞
および骨髄腫・骨髄腫融合細胞は死ぬ。親のひ臓
細胞とひ臓・ひ臓ハイブリドーマは培養において
複製しないので、これらに対しいかなる選択も必
要でない。機能性チミジン・キナーゼを欠く骨髄
腫株（TK-）もまた知られている。そのような
株もまたHAT培地で成長しない。 【0021】 抗体製造についての検索（スクリーニ
ング）は、ハイブリドーマ技術における重大な工
程である。抗体の機能属性は広範に変化する。モ
ノクローナル抗体は、結合親和性、抗原を沈殿さ
せる能力、抗原を不活性化する能力、補体を固定
する能力および交叉反応性の程度において相互に
異なり得る。好ましくは、検索定量法は、製造さ
れるべき抗体の望ましい機能特性に依存するよう
あるいは近づくよう選定される必要がある。しか
し、その定量法は多数の試料を検索できる十分に
単純なものであらねばならない。先行技術のおけ
るそれら技術は様々であるが、検索法は２サイク
ルで行われる。最初に、多数の培養物が成長する
ように融合培養物を細分する。その各々は比較的
少数のハイブリドーマから生ずる。例えば、
105／mlの濃度の細胞が融合され総計で10％のハ
イブリドーマ（104ハイブリドーマ／ml）が得ら
れる場合には、そのような培養試料10μには試
料当り平均100個のハイブリドーマが含まれる。
所望の抗体が103のうち１の頻度で現れる場合に
は、各10μが接種された100の培養物のうちの
約10が所望の抗体として選ばれる。この選ばれた
培養物は、次いで、再度細分される。この場合は
培養物当り平均0.1〜0.3のハイブリドーマ細胞の
レベルになるよう細分される。それは、各培養物
がクローン（そこでの全細胞は単一親細胞に由来
するもので、有糸分裂により繁殖する）であるこ
とを確実なものとするためである。継代培養およ
び検索操作が激しい労働であるかぎり、これら操
作を単純化するための種々の技術が開発されてい
える。例えば、抗原が蛍光マーカーで標識され得
れば、所望の抗体を製造する個々の細胞は、
Becton Dickinson，Inc.，Palo Alto，
Californiaにより製造されるフルオレツセンス・
アクチベイテツド・セル・ソーター（FACS）の
ような市販の細胞選別装置により分離され得る。
この装置は蛍光マーカーを有する細胞を混合細胞
集団から選択的に分離するとができる。他の有用
な手法は、ソフト・アガー・クローニング技術で
あり、Sharon，J.等のProc.Nat.Acad.Sci.USA
76，1420（1979）に記載されている。それによれ
ば、抗体製造テストがその部位で行える。 【0022】 トリオーマおよびクアドローマを得る
操作は原理的には単純であるが実際に行うに際し
てはもつと複雑である。その理由は、選択にさら
に別の技術を駆使せねばならないからである。例
えば、始めのハイブリドーマがHAT選択により
単離されると、それは機能性HPRTを有しそれ
ゆえに２回目の融合においては適切な親ではな
い。ただし、別の選択マーカーが存在しないかも
しくはハイブリドーマが再び変異せずそして８−
アザグアニン耐性として選択されない場合であ
る。クアドローマを生成するために二つのハイブ
リドーマを融合する場合には、両方の親細胞系に
対し選択するための手段がなければならない。一
般に実施可能な技術と原理の代表として、三つの
選択系が記述される。他の選択技術は、他の形の
遺伝学的修飾もしくは生化学的抑制に基づくもの
であり、当業者に自明のものである。 【0023】 HAT選択は二つの別の遺伝学的マー
カーを用いて採用され、両マーカーがアミノプテ
リンへ感受性をもたらす。一方の親ハイブリドー
マが機能性HPRTを欠き（HPRT-）そして他方
が機能性チミジン・キナーゼを欠く（TK-）場
合、その二つの親ハイブリドーマの融合により製
造されるクアドローマのみがHAT培地で生き残
る。HPRT-変異ハイブリドーマは、濃度を徐々
に挙げて100μMまでに調製される８−アザグア
ニンもしくは６−チオグアニンの存在下で成育す
るものから選択されて得られうる。TK-変異体
は、徐々に濃度を増大した５−ブロモー2′−デオ
キシウリジンで成長したものから選択される。
HPRT-およびTK-変異ハイブリドーマの選択技
術は、従来の細胞でのそのような変異体の選択に
ついてすでに記述されている技術（Littlefield，
J.W.，Proc.Nat.Acad.Sci.USA，50，568
（1963））に本質的には類似する。 【0024】 選択はまたウアバインに耐性の変異ハ
イブリドーマの使用にもとづき得る。ウアバイン
は、正常細胞での能動輸送に必須のNa+，K+依
存性ATPアーゼの阻害物質である。ウアバイン
耐性細胞は、正常なウアバイン感受性細胞を殺す
レベルのウアバインにもかかわらず生き残ること
ができる。ウアバイン耐性はそれ自身で、あるい
は他のマーカーと結合して選択マーカーとして用
いられ得る。好ましい実施態様では、単一ハイブ
リドーマかウアバイン耐性と、８−アザグアニン
耐性（HPRT-）か５−ブロモー2′−デオキシウ
リジン耐性（TK-）のいずれかとの両方に関し
て選択される。二重の変異ハイブリドーマは共通
融合体として用いられ、所望のどんなハイブリド
ーマとも結合してHAT−ウアバイン培地で選択
的に成長し得るクアドローマを製造する。そのよ
うな培地では、その共通融合体の親ハイブリドー
マは死ぬ。その理由は、それはTK-かHPRT-の
変異体であるのでHAT培地では成長し得ないか
らである。他方の親ハイブリドーマはウアバイン
耐性を欠くので死ぬ。ウアバイン耐性であると共
にすでに機能性TKもしくはHPRT遺伝子を保持
するクアドローマはいずれもHAT−ウアバイン
培地で選択的に成長する。共通融合体は次の理由
のために特に有益である。その理由は、RMAを
このような目的で用いる場合に抗体分子の二つの
結合親和性のうちの一つに対する単一の共通な結
合特異性が用いられるからである。例えば、種々
の異なる抗原についてのenzyme−linked
immunosorbent essay（ELISA）での組換えモノ
クローナル抗体に使用には指示薬酵素に対する共
通の結合特異性が要求される。同様に、目標とす
る薬供給系も治療用活性物質を結合するための共
通の特異性部位および組織特異もしくは細胞特異
抗原を結合する種々の特異性を使うことができ
る。 【0025】 前記の選択技術は変異ハイブリドーマ
株の構成を必要としかつクアドローマ融合生成物
にある遺伝子を保有することに依存するけれど
も、第三の技術は不可逆性の生化学的阻害物質に
もとづき変異を必要としない。不可逆性の生化学
的阻害物質は、化学的に結合するものであり、か
つそれがすでに処理された細胞において特定の阻
害活性を示すものである。二つの別々の阻害物質
で処理された親細胞同志を結合してできる融合生
成物は、相補性の故に阻害されない。例えば、一
方の親ハイブリドーマはジエチルピルコカーボネ
ートで処理され、他方のヨードアセトアミドで処
理される。両方の親株は最終的に死ぬ。しかし、
両者の間の結合生成物は生き残る（Wringt，W.
E.，Exptl.Cell Res.112，395（1978）を参照）。 【0026】 従来のハイブリドーマに適用され得る
トリオーマおよびクアドローマを選択しクローニ
ングする技術は、また、本発明のクアドローマお
よびトリオーマにも適用できる。好ましくは、蛍
光標識された抗原は検出系とクローニング系にお
いて用いられる。蛍光抗原を結合する個々の細胞
は、蛍光活性細胞の選別器により分離され得る。
そのような設備により単一細胞は個々のマイクロ
タイマーウエルに沈降し、それにより、従来の選
択やクローニングに要した労力が大幅に軽減され
る。 【0027】 二つの異なる抗原に結合特異性をもつ
た抗体を製造するトリオーマおよびクアドローマ
クローンの検出は、RMAを製造したという強力
な推定証拠である。多くの場合に、他の抗体を有
しないRMAを単離する工程がさらに必要であ
る。これら他の抗体は、例えば単一特異性を有す
る抗体分子、不活性抗体分子および骨髄腫蛋白を
含む同じ細胞により製造され得る。真のRMA分
子は、二元性結合特異性を有する免疫グロブリン
である。RMAは連続した二段階の親和性クロマ
トグラフイーにより特別に精製される。第一段階
は、不動の第一抗原を有する親和性カラムに特定
の結合を行う。第一段階で結合しない抗体分子
は、カラムを通り捨てられる。第一カラムに結合
する抗体は、次いで、カオトロピツクイオン
（chaotropic ion）緩衝液と共に溶離し、そして
第二段階において第二抗原を有する第二親和性カ
ラムにかけられる。いずれのカラムにも結合でき
る組換えモノクローナル抗体のみが第二の抗原に
結合する。適当な溶離工程の後、組換えモノクロ
ーナル抗体が本質的に純粋な形で得られる。 【0028】 RMAの存在は、二段階親和性クロマ
トグラフイーに頼ることなく、固相定量法により
検出されそして定量され得る。例えば、第１抗原
は固相担体に結合することにより固定される。
種々のそのような固相担体および結合技術は当該
技術分野で周知である。抗体試料は次いで固相担
体とインキユベートされ、その固定抗原に親和性
を有する抗体を結合させる。その担体は次いで洗
浄され非結合抗体を除去し、そして第二抗原とイ
ンキユベートされる。この第二抗原は、ラジオア
イソトープ、蛍光リカンドもしくは結合酵素のよ
うな適当なマーカーで標識される。二元性特異性
のRMAおよび第一抗原に対する従来の抗体の両
者は、固定化された第一抗原を結合できるが、
RMAだけが標識された第二抗原を結合できる。
第二抗原を結合できるが第一抗原を結合できない
すべての抗体は洗浄段階で除去され、そしてそれ
ゆえその定量法をそこねない。それゆえある他の
特異性の抗体の存在のもとでの組換えモノクロー
ナル抗体の定性と定量の両方が達成される。 RMAについて考えられる用途のうちのいくつか
を以下に述べる。 【0029】 モノクローナル抗体を腫瘍特異性抗原
に供給するハイブリドーマは、Ricinus
communisからの60000m.w.毒素の毒性サブユニ
ツトに対しモノクローナル抗体を作るハイブリド
ーマと融合される。そのクアドローマはRMAを
製造する。このRMAは毒素を有することが可能
であり、そして腫瘍細胞に結合するべく用いられ
得る。この腫瘍細胞は、これら腫瘍細胞を殺す毒
素を内蔵する。 【0030】 腫瘍特異抗原の対するモノクローナル
抗体を作るハイブリドーマは、トリニトロフエノ
ール（TNP）に対しモノクローナル抗体を作る
ハイブリドーマと融合される。TNPはリポソー
ムの外表面のアミノグループに共有結合し得る。
これらリポソームは、特に、腫瘍細胞への薬の供
給に用いられ得る。その理由は、リポソームが化
学治療薬をカプセル化するために作られ得るから
である。リポソームはTNPに結合するRMAで被
覆され、そしてそのRMAもまたその腫瘍に結合
し、その結果、これらリポソームが腫瘍細胞と融
合しそしてその薬を腫瘍細胞へ供給する。あるい
は、薬やホルモンのような細胞特異抗原およびハ
プテンに対するRMAが、そのハプテンを所望細
胞に特別かつ直接供給するのに用いられ得る。 【0031】 ホルモン（例えば、ヒト絨毛性ゴナド
トロピンのＢサブユニツト）、薬もしくは腫瘍特
異抗原に対するモノクローナル抗体を作るハイブ
リドーマは、放射性同位元素で高比活性に標識し
たラジオアイソトープハプテンに対するモノクロ
ーナル抗体を製造するハイブリドーマに融合され
る。そのクアドローマは、放射能をおび得る
RMAを製造する。そのようなRMAは定量、腫
瘍位置確認もしくは治療用に用いられ得る。同位
元素を用いるかどうかの選択は意図する最終の用
途の性質による。γ線放射同位元素は、薬、体液
中のホルモンおよび他のハプテン、組織試料、ウ
リンなどの免疫学的検定に用いられ得る。腫瘍特
異抗原、ホルモンもしくは薬が固相に結合する場
合には、そのRMAは一段階の競合放射性免疫学
的検定において用いられ得る。γ線放射同位元素
はまた腫瘍位置確認にも有用である。高熱量のα
線放射同位元素はα線放射が組織内で高熱量でか
つ短絡するため治療目的に特に有用である。β線
放射同位元素も同様に検定に用いられ得るが、臨
床実験室には通常見られないカウント設備を要す
る。 【0032】 前項の診断に役立つ抗原に対するモノ
クローナル抗体を製造するハイブリドーマは、酵
素西洋ワサビペルオキシダーゼに対するモノクロ
ーナル抗体を製造するハイブリドーマと融合され
る。そのクアドローマはRMAを製造する。この
RMAは一工程のenzyme−linked
immunosorbent assay（ELISA）に用いられ得
る。 【0033】 腫瘍特異抗原に対するモノクローナル
抗体を製造するハイブリドーマは、蛍光プローブ
に対するモノクローナル抗体を製造するハイブリ
ドーマと融合される。そのクアドローマはRMA
を製造する。そのRMAは、組織細片の腫瘍細胞
の蛍光顕微鏡検出に、もしくはフロー・ミクロフ
ルオリメトリー（FMF）を用いる細胞懸濁液の
腫瘍細胞の計数に用いられ得る。 【0034】 ここで用いる「腫瘍特異抗原」という
用語は、特別の腫瘍に特有な、もしくはそのよう
な腫瘍と互いに強く関連する抗原を意味すると解
釈される。しかし、腫瘍特異抗原に関する当該技
術分野における最近の理解によれば、これら抗原
は腫瘍組織に必ずしも独特ではないということ、
もしくはこれら抗原に対する抗体が正常組織の抗
原と交差反応し得るということである。腫瘍特異
抗原が腫瘍細胞に独特でない場合でさえも、実際
上のこととして、腫瘍特異抗原に結合する抗体は
交差反応のゆえのとんでもない危険もしくは干渉
なしに所望の操作を行うのに腫瘍細胞に十分に特
異的であるということがしばしば起こる。この実
際上の特異性には多くの要因が関係している。例
えば、腫瘍細胞上のある量の抗原は正常細胞上に
みられる量を大きく超過し、あるいは交差反応抗
原を有する正常細胞はその腫瘍とは無関係な位置
にあることが確認され得る。正常反応の抗原は腫
瘍特異抗原と部分的に交差反応し得るにすぎな
い。腫瘍を構成する細胞型に特異な生成物は、
時々、実際上の腫瘍特異抗原として働く。例え
ば、リンパ球白血病細胞により作られる抗体はそ
れ自体抗原として用いられ得る。この抗原に対
し、「抗イデイオ型」抗体がそのような細胞に特
別に結合するよう選択され得る。それゆえ、「腫
瘍特異抗原」という用語は実際的な利用の特異性
にここでは関係するのであつて、絶対的特異性を
意味したりあるいは腫瘍に独特な抗原を意味する
ものではない。 【0035】 さらに、腫瘍細胞以外の細胞は所定型
の細胞に特有かもしくはこれと互いに強く関連す
る細胞特異抗原を有することが理解される。所定
組織は組織特異抗原を有し得、これら抗原はある
所定組織に特有かもしくはこれと主として関連す
る。細胞特異で組織特異な抗原はまた、所望細胞
と組織に対し、もし独占的に結合しなければ、優
先的に結合することのできるRMAを製造するの
に有用である。 【0036】 次の実施例は、RMAを製造するクア
ドローマの製造に適用される技術を説明するクア
ドローマを調製しかつあらゆる所望のペアの抗原
を結合し得る組換えモノクローナル抗体を製造す
るために本質的には記述される所望の技術が適用
され得る。 【0037】 たいていのRMAは二つの異なる抗原
に結合親和性を有するが、同一の抗原上の二つの
異なるエピトープに結合するRMAは、適当に選
択されたクアドローマもしくはトリオーマクロー
ンから調製され得ることが理解される。他の
RMAを調製するための操作における重大な変更
は、免疫性を与えるために用いる抗原の性質、適
切なハイブリドーマとトリオーマとクアドローマ
による抗体生成を検出するのに用いる検索テス
ト、および用いる精製法にある。検索定量法は特
に重大である。その理由は、結合親和性の他に所
望の抗体特性、例えば抗体が抗原を沈降させるか
どうか、補体を結合するかどうか、他の抗原と交
差反応するかどうかなど、の選択がこの段階で行
われるからである。ここに開示された技術と機能
的に均等であると当該分野で知られかつ当業者に
理解されるタイプの技術上の変更を行つて便宜の
ためあるいは収率の最適化のため、あるいは単純
化のためあるいは全体の操作を改善して効果的な
コストにするために努め得る。 【0038】 【実施例】（実施例１） 次の抗原は、フルオレセインおよびローダミンと
いう二つの蛍光ハプテンに二元性の結合親和性を
有する組換えモノクローナル抗体を製造するため
に調製される。その抗原とは、フルオレセイン・
イソチオシアネートが結合された牛の血清アルブ
ミン（Ｆ−BSA）、フルオレセイン・イソチオシ
アネート標識した卵アルブミン（Ｆ−OVA）、ロ
ーダミン・イソチオシアネートが結合された牛の
血清アルブミン（Ｒ−BSA）、そしてローダミ
ン・イソチオシアネートが結合された卵アルブミ
ン（Ｒ−OVA）である。フルオレセインおよび
ローダミンはこれが蛍光によりただちに定量され
るのでハプテンとして選択され、そしてこれらは
その励起および放射極大が実質的に互いに異なる
ため相互の存在下で定量され得る。二つの異なる
蛋白に連結する同一ハプテンを用いることによ
り、そのハプテンに向く抗体とそのハプテンが結
合する該蛋白に向く抗体とを識別することが可能
になる。例えば、Ｆ−BSAが免疫処置に用いら
れる場合、検索はＦ−OVAで行われる。フルオ
レセインの一部に結合親和性をもつ抗体のみが検
索の定量において検出される。フルオレセインと
ローダミンのイソシアネート誘導体は、例えば、
ミズリー州セントルイスにあるSigma Chemical
Co.から、市販されている。 【0039】 カプリング反応を行うために、PH９の
0.1モルNaHCO310mlに溶かした50mgの蛋白を所
望のイソチオシアネート誘導体５mgと混合し、そ
してゆるやかに攪拌を行いつつ室温にて30分間イ
ンキユベートした。その生成物は、グラス・ウー
ルで濾過し沈殿蛋白と不溶性の未反応イソチオシ
アネートを除去して後、リン酸緩衝化生理食塩水
（PH7.4の10mM Na−Phosphate 0.15M NaCl）
のセフアデツクスＧ−25（スエーデン、ウプサラ
のPharmacia，Inc.の商標）クロマトにかけて、
標識蛋白を未反応生成物から分離しそしてバツフ
アー系を変えた。誘導蛋白のピークは視覚で同定
され、そしてそのカラムのポイド容積に等量のバ
ツフアー量で溶離する。この誘導蛋白は、それ以
上の精製を行うことなく、免疫処置とテスト用に
用いられる。 【0040】（実施例２） 免疫処置 生体内での免疫処置は、Vaitukaitis，
J.等のJ.Clin.Endocrin.33，998（1971）の免疫処
置に基づく方法を用いて行われる。完全フロイン
トアジユバントと生理食塩水の懸濁液の抗原100
mgが20部位に等量に皮内注射される。一週間後、
最初の注射により生ずる肉芽種に同じ抗原試料を
第二の注射として注射する。二週間後、100mgの
抗原が実際的に１：１の不完全フロイントアジユ
バントと生理食塩水を用いて肩と腰上の４箇所に
注射される。一週間後、尾から血液の試料が採ら
れそして抗体が測定される。この動物は、現在４
日間連続的に１回の注射当り1μｇの抗原が静脈
注射されている。この処理により、ひ臓にあるリ
ンパ芽球細胞の数が最大となる。そのため、融合
段階後に抗原特異ハイプリドーマの生成する頻度
が増大する。 【0041】 インビトロでの免疫処置の操作は、
Luben，R.A.等のProc.Second Int.Lymphokine
Workshop，Academic Press，New York，N.
Y.（1979）に記述されている技術にもとづく。 【0042】 免疫処置のなされていない成体の
BALB／ｃマウスのひ臓は無菌的に取り出され、
そしてひ臓細胞の単一細胞懸濁液が調製される。
この細胞は、完全ダルベツコの修正イーグル培地
（以下DMEMという、ニユーヨーク州ダランドア
イランドのGrand Island Biological Company
から市販）で20mlに稀釈される。この培地は抗原
を30μｇ〜1000μｇ含有する。そして、10mlの胸
線細胞調整培地が加えられる。 【0043】 胸線細胞調整培地は生後10日の３匹の
マウスの胸線細胞からもしくは成体マウスから得
られる混合胸線細胞培養物から調製される。
BALB／ｃマウスからの胸線細胞と、主要組織
適合性部位（例えば、C57ブラツク）での異なる
株からのものとが完全DMEMにて２〜４×106胸
線細胞／mlで共培養される。37℃で48時間の培養
の後その細胞およびその破片は遠心分離され、そ
して培地はアスピレータで吸引され10mlづつの試
料の形で−70℃で凍結し保存される。 【0044】 免疫処置のなされていないひ臓細胞、
抗原および胸線細胞調製培地の混合物は、75cm2の
フラスコに入れ、そして組織培養器内に37℃にて
５日間触れないておく。５日後、大きなリンパ芽
球が位相差顕微鏡により観察され得、免疫処置が
うまく行つたことがわかる。これら細胞はついで
融合に供される。 【0045】（実施例３） リンパ球・骨髄腫融合およびハイブリドーマの単
離 Shulman，M.等のNature276，269（1978）に記
述されているSP2と称する骨髄腫株が融合に選ば
れる。このSP2細胞系は非製造型骨髄腫蛋白であ
る点に特徴があり、そしてHPRT活性を欠くた
めに８−アザグアニン耐性である。SP2細胞系は
すでに広く行きわたつており、例えば、カリフオ
ルニア州ラジオラのScripps Clinic and
Research FoundastionのKlinman教授から得ら
れうる。 【0046】 融合培地は、血清を含まない培地にポ
リエチレングリコール1540M.W.を47容量％でそ
してジメチルスルフオキシドを7.5容量％で含む。
ポリエチレングリコールはPontecorvo，G.の
Somatic Cell Genet.VOL.1397（1975）に記載さ
れているように細胞融合を誘発する。ジメチルス
ルフオキシドはNorwood，T.H.等のSomatic
Cell Genet.Vol.2263（1976）に記載されているよ
うに融合頻度を高める。これは膜相遷移温度を下
げることにより可能となる。 【0047】 生体内で免疫処置されるひ臓細胞し
て、単一細胞懸濁液が培養での免疫処置のために
記述のように過剰免疫性ひ臓から作られる。対数
増殖期でのSP2骨髄腫細胞（30ml、５〜８×105
細胞／ml）は50mlの円錐形ポリプロピレン遠心分
離管へ移され、ひ臓細胞懸濁液（５ml）が加えら
れる。粘着性リンパ芽球細胞を除去し、遠心分離
しそして培地を除いて後細胞がインビトロで免疫
処理されたひ臓細胞用に得られる。SP2細胞（30
ml）が上記のように加えられる。いずれかの試料
と共に、これら細胞は血清を含まない50mlの
DMEMを用い遠心分離により３回洗浄される。
３回目の洗浄物からのペレツトは、37℃水浴から
取り出されたばかりの融合培地１mlに再懸濁され
る。この培地は１分間にわたつて添加されそして
細胞はピペツト先端で連続的に攪拌される。攪拌
はさらに１分間続けられる。37℃の無血清
DMEMの２mlが攪拌しつつ次の３分間にわたつ
て添加される。10％のウサギ血清を含有する37℃
DMEMの数mlが攪拌しつつ次の３分間にわたつ
て添加される。細胞は遠心分離され、そして
HAT選択化学薬品と供給細胞を含有する10mlの
完全培地に再懸濁される。そして、マイクロタイ
マー板の96のウエルに分配される。 【0048】 フイーダー細胞は、0.5mlプリスタン
（２，６，10，14−テトラメチルペンタデカン）
の腹膜内注射後に得られる腹膜の浸出物細胞であ
る。４日後、細胞は処理マウスの腹膜腔をすすぐ
ことにより収集される。収量はマウス当り終始一
貫２〜４×107である。 【0049】 抗体生成細胞は、蛍光活性化細胞選別
器を用いて直接クローン処理される。陽性の細胞
はその装置の蛍光プローブに結合し陰性細胞から
分離される。プローブは、免疫処置において用い
る蛋白とは異なる蛋白に連結する蛍光ハプテンか
ら得られる。例えばＦ−BSAもしくはＲ−BSA
が免疫処置に用いられるとき、その蛋白に対する
抗体を製造するハイブリドーマの選択をさけるた
めに、Ｆ−OVAもしくはＲ−OVAがプローブと
して用いられる。 【0050】 非蛍光性抗原に適した別の検索操作
は、enzyme−linked immunosorbent assay
（Saunders，Ｇ，C.Immunoassays in the
Clinical Laboratory，99−118（1979）に基づく。 【0051】 可溶性抗原に対する抗体を検出するた
めに、水に溶かした抗原10〜100μｇ／mlがウエ
ル当り50μの割でポリスチレンの96ウエルの板
に加えられ、37℃培養器内での乾燥に供される。
使用直前に、これらの板は150mMNaCl中の
10mM Na2HPO4（PBS−９）で３回洗浄される。
細胞表面成分との反応性について抗体を検索する
ために、細胞を不動化レクチンを用いて固定化す
る。コンカナバリンＡは可溶なカーボジミドを用
いポリスチレンウエルに共有結合される
（Reading，C.L.等のJ.Natl，Cancer Inst.64，
1241（1980））。これら板はPBS−９で３回洗浄さ
れ、細胞は、100μの完全DMEMの各ウエル
（１×105〜２×105）に加えられる。板は細胞が
付着する１〜２時間37℃に保持される。その後、
板はPBS−９で６回洗浄されそしてPBS−９の
新鮮な１％ホルムアルデヒド50μが各ウエルへ
加えられる。板は室温に15分保持され、次いで
PBS−９で６回洗浄されそしてただちに使われ
る。 【0052】 各ハイブリドーマ培養物から50μの
培地が抗原を含有するウエルへ移される。これら
試料は室温で30分間培養され、板は0.05％トリト
ン−Ｘ−100水溶液（商標、ニユージヤージー州
ヌトレイのRohm ＆ Haas Company）で10
回洗浄される。酵素標識した抗マウス免疫グロブ
リン（ペンシルバニア州コークランビルの
Cappel Laboratories）は10mM Na2HPO4
0.05M NaCl、牛の血清アルブミン50μｇ／mlを
含有する0.5容量％トリトン−Ｘ−100に希釈され
る。 【0053】 接合体は各ウエルに加えられそして室
温で15分間培養される。板は0.5容量％トリト−
Ｘ−100で10回洗浄され100μの基質が加えられ
る。色素基質２，2′−アジノージー（３−エチ
ル）−ベンズチアゾリンスルフオン酸（ABTS）
が前記Saundersにより述べられているように用
いられる。着色した酵素生成物は、414mμでの吸
光度を測定することにより定量される。 【0054】 所望抗体を製造する培養物からの細胞
は、計数されそして希釈されて完全HT培地
（10-3Ｍ ヒポキサンチンと３×10-4Ｍチミジン
含有DMEMの１ml当り30〜50の生育し得るハイ
ブリドーマを得る。 【0055】 懸濁液の0.1mlずつが96ウエルのマイ
クロタイター板の各ウエルヘピペツトで注入され
る。この板には1.2×105の腹膜浸出物供給細胞が
含まれる。各ウエルは、ウエル当り平均３〜５の
ハイブリドーマ細胞を含有する。 【0056】 培養物は37℃で７日間組織培養培養器
にて培養され、次いで0.1mlの完全HT培地に各ウ
エルに加えられる。さらに14〜21日の培養の後
に、クローンは密に存在し、すぐにも検索に供さ
れ得る。この検索はELISA法かもしくは添加さ
れた蛍光性ハプテンを結合する抗体のゆえに蛍光
消光の測定かのいずれかによりなされる。特異性
制御のゆえに、フルオレセインと反応する抗体は
ローダミンを結合するはずがなく、その逆もまた
同じである。６つの最も強力な陽性培養物がより
広いウエルへ移され、そしてその培養物が再度密
になるまで培養した後再定量される。最も強力な
２つの培養物からの細胞に一部を限界稀釈法によ
り、すなわち（フイーダー層を用い）ウエル当り
約0.3細胞とすることにより再クローン化される。
この２つの最強の陽性培養物中の残留細胞は追加
培地にて培養され数が増える。そして凍結保存さ
れる。 【0057】 制限稀釈クローンが適当な細胞濃度に
達すると、存在する単一クローンを有する各ウエ
ルは定量される。６つの陽性クローンはより広い
ウエルへ移され、数を増やすために再び培養さ
れ、そして凍結存在される。２つの最強のウエル
について、限界稀釈クローニングをもう一度行つ
て安定性が検査される。FACSは既述のようなし
方でこれら選択と再クローニング工程において有
用である。これらのプロセスは激しい労働である
ため、該細胞選別器を適用できるどの段階におい
ても用いることは有効である。90％を上まわる陽
性クローンを生むクローンは、安定であると考え
られる。90％を下まわる陽性クローンを生むクロ
ーンは安定性を得るまで再クローン処理される。 【0058】（実施例４） クアドローマ生成 クアドローマ生成の第一段階
は、親ハイブリドーマの存在下でクアドローマ融
合生成物を優先的に成長させるのにふさわしい変
異ハイブリドーマ株の選択である。この実施例で
は、フルオレセインに対する抗体を製造するハイ
ブリドーマ株が８−アザグアニンおよびアバイン
耐性になるようさらに修飾される。修飾ハイブリ
ドーマは、既述のように、一つの共通融合体とし
て用いられる。 【0059】 ８−アザグアニン耐性の選択は、阻害
物質の濃度を徐々に増加させることにより順応成
長させる工程を含む。阻害物質濃度は約1μMか
ら始める。数世代を経た細胞は、次いで、さらに
数世代の成長期間にわたつて3μMの８−アザグ
アニンへ移される。この工程は、100μMの８−
アザグアニンの存在下で成長する株が得られるま
で、阻害物質の量を少しずつ増やしながら繰り返
し行われる。この操作により自然にもしくは８−
アザグアニン誘発変異により生ずる変異株が選択
される。これら変異株は機能HPRT活性が欠落
している。８−アザグアニン耐性ハイブリドーマ
株は、次いで、Bakar，T.M.等のCell１，９
（1979）に記述されている方法を本質的に用いて
同様な順応成長工程によりウアバイン阻害に耐性
にされる。 【0060】 対数増殖期の親ハイブリドーマ（30
ml、５×105〜８×105細胞／ml）のそれぞれを、
50mlのポリプロピレンのコニカル遠心管に移し、
50ml無血清DMEMで３回遠心によつて洗浄する。
３回目の洗浄により得られるペレツトを37℃ウオ
ーターバスから取出したばかりの融合培地１mlに
再懸濁する。この培地は１分以上にわたつて加え
られ、細胞をピペツトの先でかきまわし続ける。
さらに１分間かきまわす。さらに37℃で無血清培
地を２ml、３分間にわたつてかきまぜながら加え
る。次に10％ウサギ血清を含む37℃のDMEM7ml
を、かきまぜながら３分間にわたつて加える。 【0061】 両方の抗原に対する抗体を製造するク
アドローマの収量は、従来の融合に比較して高
く、その数は、安定した融合１回につき1000〜
10000である。これは個々の親細胞が望ましい型
であるためである。 【0062】 融合工程を完了し、細胞をマイクロタ
イタープレートのウエルに分配した後、10-3Ｍの
ウアバインを含有するHAT培地（３×10-6Ｍチ
ミジン、４×10-7Ｍアミノプテリンおよび３×
10-5Ｍヒポキサンチンを含有するDMEM）中で、
インキユベートする。前述のように、両方の親ハ
イブリドーマ株は、HAT−ウアバイン培地中の
培養で死滅する。これに対して、機能性HPRT
およびウアバイン耐性変異を保持するクアドロー
マは、生き残つて増殖する。 【0063】 選択の後、両抗原を同時に結合するク
アドローマは、個々のマイクロタイターウエルに
おいてクローン処理される。このとき、蛍光活性
化細胞選別器に単一細胞付着アタツチメンを用い
る。この単一細胞は10〜14日のうちに密な培養物
になる。 【0064】 あるいは、これらクアドローマは軟寒
天培地において平板培養することにより検出され
クローン処理される。10〜14日の成育の後、現れ
るクローンは前記Sharon等により述べられる固
相定量法によりその位置でテストされる。 【0065】 最初は一方の抗原と次いで他方の抗原
との反復テストが必要である。両方の抗原と反応
するクローンは所望のクアドローマを含む。ある
いは、クアドローマを一方の抗原で被覆された表
面に結合され他方の抗原との結合能をテストする
ことにより、検索を行うこともできる。 【0066】 ハイブリドーマについて前述したよう
に、最も活性でかつ安定なクローンは、安定性を
確実なものとするために再クローン処理される。
90％を上まわる陽性クローンを得るクローンは安
定であると考えられるが、他方、90％を下まわる
収量のクローンは安定性が達成されるまで再クロ
ーン処理される。推定RAMを製造するクアドロ
ーマクローンは抗体を製造するクローンであり、
その抗体は免疫を与える抗原すなわちフルオレセ
インおよびローダミンの両方を結合する。 【0067】 上記のようにしてクアドローマ細胞が
得られる。上記２種の親ハイブリドーマの代わり
にハイブリドーマとリンパ球とを用い、同様に操
作を行うことによりトリオーマ細胞が得られる。
このようにして、例えば上記と同様の方法で得た
トリオーマ細胞もまた、フルオレセインおよびロ
ーダミンに対して結合親和性を有する抗体を生成
する。 【0068】（実施例５） 組換えモノクローナル抗体の調製および精製 RMAは、クアドローマ培養物の上澄みからかも
しくはクアドローマ細胞を腹膜内注射されたマウ
スの腹水から単離される。後者の場合には、
BALB／ｃマウスは0.5mlプリスタンを腹膜内注
射することにより前処理される。一つの安定クロ
ーンについて１×106〜２×106クアドローマ細胞
が腹膜内注射される。腹水腫瘍は10〜21日間まで
に明白となり、そして腹水液は腹膜腔が膨張する
と収集される。細胞は遠心分離により除去され、
抗体は60％の飽和硫酸アンモニウムにより沈殿さ
せられる。抗体は次いで透析されそして凍結され
る。抗体収量は、通常、マウス当り約30〜50mgで
ある。 【0069】 組換えモノクローナル抗体は、二段の
親和性クロマトグラフイーにより、抗体調製物か
らさらに精製される。最初のカラムにおいては、
Ｆ−BSAがCNBr活性セフアロース4B（商標、ス
エーデン、ウプサラのPharmacia Fine
Chemicals Ａ Ｂ）に連結される。このとき、
March，S.C.等のAnal.Biochem.60，149（1974）
により述べられている標準カプリング法を用い
る。第二のカラムは、CNBr活性化セフアロース
4Bに連結するＲ−BSAで充填される。これらの
カラムはPBS−９で平衡化される。そして抗原
試料が第一カラムにかけられ、２〜３カラム量の
PBS−９で溶離される。第一カラムは、次いで、
3Mポタシウムイソチオシアネート含有のPBS−
９で溶離される。溶離蛋白はPBS−９に対し透
析されそして第二カラムにかけられる。これも第
１カラムと同じ方法で溶離される。ポタシウムイ
ソトシアネート溶離後に第二カラムから回収され
る蛋白は、組換えモノクローナル抗体であり、こ
れは分子当り二つの別の結合部位を有する。一つ
はフルオレセインに対するものであり、一つはロ
ーダミンに対するものである。このRMA試料
は、透析され、濃縮されそして凍結保存される。 【0070】 本明細書は、組換えモノクローナル抗
体を製造し得る新規な細胞型、クアドローマおよ
びトリオーマ、の生成を述べている。この抗体の
分子種は今までに知られておらず、この抗体は二
つの異なる抗原に結合親和性を有し、（つまり、
分子内に２種の抗原結合部位を有し）かつ両方の
抗原を同時に結合し得る。そのような新しい物質
を製造するための技術が特に実施例という方法を
含む特定の実施態様を挙げて詳述されている。本
発明の生成物および技術は想像以上に意味深くか
つあらゆる対の抗原特異性を単一抗体に結合する
広範囲のRMA型を包含することが理解できる。
さらに、ここに用いる技術の多くの変更は当業者
が容易になし得ることであり、そしてそのような
変更は本発明の範囲内にあると考えられることが
理解できる。 【0071】 【発明の要約】 本発明は、２つの所望の抗原に
対して結合親和性を有する（分子内に２種の抗原
結合部位を有する）抗体（以下、「組換えモノク
ローナル抗体」と称する）を製造するクアドロー
マ細胞：および該クアドローマ細胞の製造方法を
提供する。クアドローマ細胞とは、第１の抗原決
定基に対して特異的な結合部位を有する抗体を製
造するハイブリドーマ細胞と、第２の抗原決定基
に対して特異的な結合部位を有する抗体を製造す
るハイブリドーマ細胞との融合生成物である。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 【請求項１】 第１の抗原決定基に対して特異的
な結合部位を有する抗体を製造するハイブリドー
マ細胞と、第２の抗原決定基に対して特異的な結
合部位を有する抗体を製造するハイブリドーマ細
胞との融合生成物であるクアドローマ細胞であつ
て、 Fab部分とFc部分とを有する抗体であり、分子内
に２種の抗原結合部位を有し、該抗原結合部位が
それぞれ異なる抗体産生細胞に由来し、かつ異な
る抗原決定基に対して特異的である抗体を製造す
る、 クアドローマ細胞。 【請求項２】 前記２種の抗原結合部位の一方が
腫瘍特異抗原との結合親和性を有する請求項１に
記載のクアドローマ細胞。 【請求項３】 前記２種の抗原結合部位の一方が
細胞特異抗原との結合親和性を有する請求項１に
記載のクアドローマ細胞。 【請求項４】 前記２種の抗原結合部位の一方が
組織特異抗原との結合親和性を有する請求項１に
記載のクアドローマ細胞。 【請求項５】 前記２種の抗原結合部位の一方が
酵素との結合親和性を有する請求項１，２，３あ
るいは４に記載のクアドローマ細胞。 【請求項６】 前記２種の抗原結合部位の一方が
ハプテンとの結合親和性を有する請求項１，２，
３あるいは４に記載のクアドローマ細胞。 【請求項７】 前記２種の抗原結合部位の一方が
Ricinus communis 毒素の毒性サブユニツト
との結合親和性を有する請求項１あるいは２に記
載のクアドローマ細胞。 【請求項８】 前記２種の抗原結合部位の一方が
トリニトロフエノールに対して特異的な抗原との
結合親和性を有する請求項１あるいは２に記載の
クアドローマ細胞。 【請求項９】 前記ハンプテンが放射能標識され
ている請求項６に記載のクアドローマ細胞。 【請求項10】 前記２種の抗原結合部位の一方が
ヒト絨毛性ゴナドトロピンのＢサブユニツトとの
結合親和性を有し、そして、他方の抗原結合部位
がハプテンとの結合親和性を有する請求項１に記
載のクアドローマ細胞。 【請求項11】 前記２種の抗原結合部位の一方が
ヒト絨毛性ゴナドトロピンのＢサブユニツトとの
結合親和性を有し、そして、他方の抗原結合部位
が西洋ワサビペルオキシダーゼとの結合親和性を
有する請求項１に記載のクアドローマ細胞。 【請求項12】 前記２種の抗原結合部位の一方
が、フルオレセインもしくはローダミンとの結合
親和性を有する請求項１あるいは２に記載のクア
ドローマ細胞。 【請求項13】 前記２種の抗原結合部位の一方が
フルオレセインとの結合親和性を有し、そして、
他方の抗原結合部位がローダミンとの結合親和性
を有する請求項１に記載のクアドローマ細胞。 【請求項14】 前記抗体がIgM分子である請求項
１に記載のクアドローマ細胞。 【請求項15】 前記抗体がIgG分子である請求項
１に記載のクアドローマ細胞。 【請求項16】 クアドローマ細胞を製造する方法
であつて、第１の抗原決定基に対して特異的な結
合部位を有する抗体を製造するハイブリドーマ細
胞を、第２の抗原決定基に対して特異的な結合部
位を有する抗体を製造するハイブリドーマ細胞に
融合することを包含し、 該クアドローマ細胞が、Fab部分とFc部分とを有
する抗体であり、分子内に２種の抗原結合部位を
有し、該抗原結合部位がそれぞれ異なる抗体産生
細胞に由来し、かつ異なる抗原決定基に対して特
異的である抗体を製造する、 クアドローマ細胞の製造方法。 【請求項17】 前記２種の抗原結合部位の一方が
腫瘍特異抗原との結合親和性を有する請求項１６
に記載のクアドローマ細胞の製造方法。 【請求項18】 前記２種の抗原結合部位の一方が
細胞特異抗原との結合親和性を有する請求項１６
に記載のクアドローマ細胞の製造方法。 【請求項19】 前記２種の抗原結合部位の一方が
組織特異抗原との結合親和性を有する請求項１６
に記載のクアドローマ細胞の製造方法。 【請求項20】 前記２種の抗原結合部位の一方
が、酵素との結合親和性を有する、請求項１６，
１７，１８あるいは１９に記載のクアドローマ細
胞の製造方法。 【請求項21】 前記２種の抗原結合部位の一方が
ハプテンとの結合親和性を有する請求項１６，１
７，１８あるいは１９に記載のクアドローマ細胞
の製造方法。 【請求項22】 前記２種の抗原結合部位の一方が
Ricinus communis 毒素の毒性サブユニツト
との結合親和性を有する請求項１６あるいは１７
に記載のクアドローマ細胞の製造方法。 【請求項23】 前記２種の抗原結合部位の一方が
トリニトロフエノールに対して特異的な抗原との
結合親和性を有する請求項１６あるいは１７に記
載のクアドローマ細胞の製造方法。 【請求項24】 前記ハプテンが放射能標識されて
いる請求項２１に記載のクアドローマ細胞の製造
方法。 【請求項25】 前記２種の抗原結合部位の一方が
ヒト絨毛性ゴナドトロピンのＢサブユニツトとの
結合親和性を有し、そして、他方の抗原結合部位
がハプテンとの結合親和性を有する請求項１６に
記載のクアドローマ細胞の製造方法。 【請求項26】 前記２種の抗原結合部位の一方が
ヒト絨毛性ゴナドトロピンのＢサブユニツトとの
結合親和性を有し、そして、他方の抗原結合部位
が西洋ワサビペルオキシダーゼとの結合親和性を
有する請求項１６に記載のクアドローマ細胞の製
造方法。 【請求項27】 前記２種の抗原結合部位の一方が
フルオレセインもしくはローダミンとの結合親和
性を有する請求項１６あるいは１７に記載のクア
ドローマ細胞の製造方法。 【請求項28】 前記２種の抗原結合部位の一方が
フルオレセインとの結合親和性を有し、そして、
他方の抗原結合部位がローダミンとの結合親和性
を有する請求項１６に記載のクアドローマ細胞の
製造方法。 【請求項29】 前記抗体がIgM分子である請求項
１６に記載のクアドローマ細胞の製造方法。 【請求項30】 前記抗体がIgG分子である請求項
１６に記載のクアドローマ細胞の製造方法。
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