JPH03120224A - 新規ペプチドおよびこれを含有する降圧剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 皮！上夏■里分立 本発明は、新規ペプチドおよびこれを含有する降圧剤に
関する。

ｌ米坐及歪 近年、牛乳カゼイン等の食品蛋白質の酵素分解物中にオ
ピオイドペプチド（１）、Ｃａ吸収促進ペプチド、アン
ジオテンシン変換酵素阻害ペプチド（２）等、種々の薬
理活性ペプチドが存在することが報告されてきた。これ
は、食品が単に栄養面での重要性を持つだけでなく、外
在性の因子として生体の制御に関与している可能性を示
していると考えられる、しかしこのようなペプチドの生
理的意義は今のところほとんど明らかにされていない。

参考文献 （１）　：　１　）　　Ｖ、　Ｂｒａｎｔｌ、　Ｈ，Ｔ
ｅ５ｃｈｅｓ＋ａｃｈｅｒ＋　Ａ。

Ｈｅｎ５ｈｅｎ、　ａｎｄ　Ｆ、　Ｌｏｔｔｓｐｅｉｃ
ｈ　＋　ｎｏ　　ｅ−Ｓｓ　１ｅｒｓＺ、　　Ｐｈ　　
５ｉｏｌ、　　Ｃｈｅｗ、　　３６０．　１２１１（１
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Ｉ−１〜、ノ１ ２）　Ｓ、　Ｌｏｕｋａｓ、　ｎ、　Ｖａｒｏｕｃｈａ
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（２）：　　Ｓ、　　？ｌａｒｕｙａｍａ　　、　　Ｋ
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ｋａ＋ａｎｄ　Ｈ，５ｕｚｕｋｉ、　　　ｒｆｃ、Ｂｉ
ｏｌ、Ｃｈｅｓ＋、＋　　４９　　（５Ｌ１４０５（１
９８５） 一方、従来の医薬品は、多くの場合副作用等を有し安全
性の問題を抱えてきたため、副作用が少なく、安全性の
高い機能性食品や薬剤の開発が重要な課題となっている
。上記のような食品蛋白質由来のペプチドを、機能性食
品、医薬品等として利用する場合、これらの起源が日常
我々が摂取する食品であることから、極めて安全性の高
いものが得られると考えられる。特に、大量に生産され
ている乳牛、水牛、羊などの乳に含まれるカゼインを用
い、この中から薬理活性ペプチドを見い出すことにより
、安価にかつより安全性の高いものを得ることが可能で
ある。

゛る 鎖が短かいペプチドで前記薬理活性が高く機能性食品、
医薬に適したものの開発が期待されている。

−゛　るた　の 前記問題点を解決すべく鋭意検討を重ねた結果本発明者
らは構造既知の牛、水牛、羊のβ−カゼイン中のペプチ
ドフラグメントを種々検討し、下記ペプチドを新規に合
成することに成功し、かつ、降下剤として優れているこ
とを見出し、本発明を完成するに到った。即ち、本発明
は、下記構造式のいずれかで示される新規ペプチドおよ
びその塩、及びこれらの少なくとも一種を有効成分とし
て含有する降圧剤である。

Ｌｙｓ−１１ｅ−Ｈｉａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｇ
ｌｎ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｔｙ
ｒ−Ｐｒ。

１１ｅ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−＾１ａ−Ｇｌｎ−Ｔ
ｈｒ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｐｒ
。

旧５−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−Ｇｌ
ｎ−３ｅｒ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ　−Ｔｙｒ−Ｐｒ。

Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−５
ｅｒ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−↑ｙｒ−Ｐｒ。

Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｌ
ｅｕ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｐｒ。

Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−Ｇｉｎ−５ｅｒ−Ｌｅｕ−Ｖ
ａｌ−Ｔｙｒ−Ｐｒ。

Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−５ｅｒ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｔ
ｙｒ−Ｐｒ。

Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−５ｅｒ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｐ
ｒ。

Ｇｌｎ−５ｅｒ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｐｒ。

５ｅｔ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｐｒ。

Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｐｒ。

Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｐｒ。

塩の形態の場合、その塩類としては、塩酸塩、臭化水素
酸塩、ヨウ化水素酸塩、硫酸塩、リン酸塩等の無機酸塩
および酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩、クエン酸塩、マレ
イン酸塩、フマル酸塩、酒石酸塩、乳酸塩、メタンスル
ホン酸塩、Ｐ−）ルエンスルホン酸塩等の有機酸塩が挙
げられる。なお、降圧剤に含有する場合は、機能性食品
、医薬として許容される塩の形態をとる。

ペプチドを構成するアミノ酸は、天然に存在するという
点でＬ一体が望ましい。

本発明のペプチドはペプチド合成に通常用いられる固相
法で、ペプチド結合の任意の位置で二分される２種のフ
ラグメントの一方に相当する反応性カルボキシル基を有
する原料と、他方のフラグメントに相当する反応性アミ
ノ基を有する原料をジシクロへキシルカルボジイミド法
を用いて縮合させ、生成する縮合物が保護基を有する場
合、その保護基を除去させることにより製造し得る。

この反応工程において反応に関与すべきでない官能基は
、保護基により保護される。アミノ基の保護基としては
、例えばベンジルオキシカルボニル、ｔ−ブチルオキシ
カルボニル、Ｐ−ビフェニルイソプロピルオキシカルボ
ニル、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル等が挙
げられる。Ｃ端のカルボキシル基はクロルメチル樹脂、
オキシメチルｍ脂、Ｐ−アルコキシベンジルアルコール
樹脂等の担体に結合している。

縮合反応は、ジシクロへキシルカルボジイミド等の縮合
剤の存在下にて実施する。

縮合反応終了後、保護基は除去され、さらにペプチドの
Ｃ端と樹脂との結合を切断する。

さらに、本発明の新規ペプチドは通常の方法に従い精製
される。例えばイオン交換クロマトグラフィー、逆相液
体クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフ
ィー等が挙げられる。

本発明の降圧剤の有効成分として使用するペプチドまた
はその塩の摂取方法、投与経路としては、経口投与、非
経口投与、直腸内投与のいずれでもよいが、機能性食品
として用いるときは特に経口投与が好ましい。本発明の
ペプチドまたはその塩の摂取量、投与量は、化合物の種
類、摂取方法、投与方法、健常人あるいは患者の症状・
年令等により異なるが、通常１回０．００１〜１ｏｏｏ
■、好ましくは０．０１〜１０ｆｆＩｒを１日当り１〜
３回である。本発明のペプチドまたはその塩は通常、食
品用担体、製剤用担体と混合して調製した食品、製剤の
形で投与される。食品及び製剤用担体としては、食品分
野、製剤分野において常用され、かつ本発明のペプチド
またはその塩と反応しない食品及び物質が用いられる。

具体的には、例えば乳糖、ブドウ糖、マンニット、デキ
ストリン、シクロデキストリン、デンプン、蔗糖、メタ
ケイ酸アルミン酸マグネシウム、合成ケイ酸アルミニウ
ム、結晶セルロース、カルボキシメチルセルロースナト
リウム、ヒドロキシプロピルデンプン、カルボキシメチ
ルセルロースカルシウム、イオン交換樹脂、メチルセル
ロース、ゼラチン、アラビアゴム、ヒドロキシプロピル
セルロース、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、
ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロ
リドン、ポリビニルアルコール、軽質無水ケイ酸、ステ
アリン酸マグネシウム、タルク、トラガント、ベントナ
イト、ビーガム、カルボキシビニルポリマー、Ｍ化チタ
ン、ソルビタン脂肪酸エステル、ラウリル硫酸ナトリウ
ム、グリセリン、脂肪酸グリセリンエステル、精製ラノ
リン、グリセロゼラチン、ポリソルベート、マクロゴー
ル、植物油、ロウ、流動パラフィン、白色ワセリン、フ
ルオロカーボン、非イオン界面活性剤、プロピレングリ
コール、水等が挙げられる。剤型としては、錠剤、カプ
セル剤、顆粒剤、散開、シロップ剤、懸濁剤、坐剤、軟
膏、クリーム剤、ゲル剤、貼付剤、吸入剤、注射剤等が
挙げられる。これらの製剤は常法に従って調製される。

なお液体食品、飲料、液体製剤にあっては、用時、水又
は他の適当な媒体に溶解又は懸濁する形であってもよい
。また錠剤、顆粒剤は周知の方法でコーティングしても
よい。注射剤の場合には、本発明のペプチドまたはその
塩を水に溶解させて調製されるが、必要に応じて生理食
塩水あるいはブドウ糖溶液に溶解させてもよく、また緩
衝剤や保存剤を添加してもよい。

これらの食品、製剤は、本発明のペプチドまたはその塩
を０．２％以上、好ましくは０．５〜７０％の割合で含
有することができる。これらの食品。

製剤はまた、機能性食品としであるいは、治療上価値あ
る他の成分を含有していてもよい。

１隻■ 以下、実施例により本発明を具体的に説明する。

なお、本明細書中で用いた略号は、次の意味を有する。

Ａｌａアラニン（以下アミノ酸は全てＬ体）。

＾ｒｇアルギニン Ａｓｎアスパラギン Ａｓｐアスパラギン酸 Ｇｌｎグルタミン Ｇｌｕグルタミン酸 ｃｔｙグリシン 旧Ｓヒスチジン ＩＩｓイソロイシン Ｌｅｕロイシン Ｌｙｓリジン Ｎｅｔメチオニン Ｐｈｅフェニルアラニン Ｐｒｏプロリン Ｓｅｒセリン Ｔｈｒスレオニン Ｔｒｐ　　）リプトファン Ｔｙｒチロシン Ｖａｌバリン Ｂｏｃ　ｔ−ブチルオキシカルボニル基Ｆｍｏｃ　　９
−フルオレニルメチルオキシカルボニル基 ＨＯＢｔ　　１−ヒドロキシベンゾトリアゾールＤＭＦ
ジメチルホルムアミド Ｂｕ’　ｔ−ブチル基 ＨＤＴＡ　　エチレンジアミン四酢酸 ＴＬＣ１層クロマトグラフィー 実施例１ Ｓｅｔ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｔｙｌ−Ｐｒ。

Ｆ＋ｗｏｃ−Ｐｒｏ樹脂（Ｆｓｏｃ−Ｐｒｏ　ＯＨが０
．５３ミリモル／ｇ樹脂の割合で導入されているＰ−ア
ルコキシベンジルアルコール樹脂）　１５０■を振とう
できるように装置したＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄの固相法用
反応装置にとり、開Ｆ（１０ａ＋１）に懸濁し１５５分
間振うし、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ樹脂を膨潤させた。

これを、以下のＦａ＋ｏｃ基除去サイクルに付した。

ａ）ＤＭＦ１０ｓｊｔ中、１分間振とう（１回）。

ｂ）５０％ピペリジン−ＤＭＦ溶液１０ｔａｌｌ中、３
分間振とう。

Ｃ）５０％ピペリジン−ＤＭＦ溶液１０ａｌ中でｌＯ０
分間振うし、Ｆｍｏｃ基を脱離する。

ｄ）ＤＭＦ１０ｍｊ！で４回洗浄。

ｅ）イソプロパツール１０ｔａｌｌで１回洗浄。

ここで、Ｋａｉｓｅｒ法（Ｅ、　Ｋａｉｓｅｒ　ｅｔ　
ａｌ、　１Ａｎａｌ。

Ｂｉｏｃｈｅｓ、　　、１１．５９５（１９７０）　）
により、Ｆｍｏｃ基が完全に除去したことを確認し、も
し、不完全ならば上記の除去サイクルを繰り返した。ま
た、完全に除去されているならば、以下に示す縮合サイ
クルに供した。

ｆ　）　Ｆｍｏｃ基除去サイクルで得られたＨ−Ｐｒｏ
樹脂をＤＭＦ１０ｍ＃で２回振とうすることによって膨
潤させた。

ｇ　）　Ｆｍｏｃ−Ｔｙｌ（Ｂｕ’）−０Ｈ（７３ｗ、
０．１５９ミリモル）　、ＨＯＢｔ　（２６■、０．１
９１ミリモル）のＤＭＦ溶液（７ａｔ’）を加え、１分
間振とうする。

ｈ）１Ｍジシクロへキシルカルボジイミド塩化メチレン
溶液０．１７５ａ＋ｊ！を添加し、７００分間振うする
。

ｉ）ＤＭＰＩＯ麟ｌで１回洗浄。

ｊ）イソプロパツール１０ｍ１ｔで２回洗浄。

ここで、Ｋａｉｓｅｒ法によって縮合が完了しているか
否かを確認し、もし、不完全ならば、上記の縮合サイク
ルを繰り返した。

Ｆ＋５ｏｃ−Ｐｒｏ−樹脂を用いている場合は、ここで
のＦｍｏｃ基除去サイクルとして以下の方法を用いた。

ｋ）　ＤＭＦ　１０ｓｊ！中、１分間振とう（１回）。

１）０．２％ピペリジン−ＤＭＦ溶液１０ｔａｌｌ中、
５分間振とう。

ｍ）０．２％ピペリジン−〇ＭＦ溶液１０ｓＪｌ中で３
５５分間振うし、Ｆｍｏｃ基を脱離する。

ｎ）　ＤＭＦ　１０ｓｊ！で４回洗浄。

０）イソプロパツール１０ｓｊ！で１回洗浄。

ここで、Ｋａｉｓｅｒ法によってＦｔａｏｃ基が除去さ
ブ れていることを確認した。そしてｇ）ス孕ツブをＦｓｏ
ｃ−Ｖａｌ−ＯＲで行なう縮合サイクルに付した。以後
同様に、Ｆｍｏｃ基除去サイクルとＦｍｏｃアミノ酸縮
合サイクルを繰り返してＦｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ−、、
Ｆｍｏｃ−Ｓａｒ（Ｂｕ’）−０Ｈ縮合する。こうして
えられるＦｍｏｃ−５ｅｒ（Ｂｕ’）−Ｌｅｕ−Ｖａｌ
−Ｔｙｌ（Ｂｕ’）−Ｐｒｏ樹脂をＦａ＋ｏｃ基除去サ
イクルに付して、５ｅｒ（Ｂｕｔ）−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−
Ｔｙｌ（ｎｕ’）−Ｐｒｏ樹脂を得、ついで、樹脂から
の脱離工程に供した。

すなわち、塩化メチレン１０１１Ｉｌで２回洗浄し、塩
化メチレン（５ｍ＃）−アニソール（１，００ｏ＋ｆ）
−チオフェノール（０，３５ｍ６）混合溶液に懸濁、続
いて、トリフルオロ酢酸（１０ｍＪ）−塩化メチレン（
１，６５ｍｊりを加え、１時間振とうした。

樹脂をろ過し、得られたろ液を減圧濃縮して、残渣にエ
ーテルを加え、ろ過することによって、得られる白色粉
末を逆相液体クロマトグラフィーに供し、求める５ｅｒ
−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ画分を分取し、得ら
れる溶出画分を濃縮乾固する。ついで、蒸留水を加え数
回−ａ縮乾固を繰り返した後、少量の蒸留水にとかし、
凍結乾燥する。こうして精製された５ｅｒ−Ｌｅｕ−シ
ａｌ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏを得た。精製物の一部をとり、Ｆ
ＡＢ質量分析器による分子量測定を行ってｍ　／　ｚ　
：　５７Ｂ（Ｍ”　＋　Ｈ）となり理論値に一致した。

さらに、６Ｈ−ＨＣｊ？水溶液で加水分解し、アミノ酸
分析に供したところＳｅｔ　Ｏ，８９、Ｐｒ。

Ｏ，９８、Ｖａｌ　Ｏ，９８、Ｌｅｕ　１．００　、　
Ｔｙｒ　Ｏ，９３の比となりこれもまた理論値と一致し
た。従って、求めるペプチドが合成されていることが確
認された。

純度は、薄層クロマトグラフィーと逆相液体クロマトグ
ラフィーで純度よく合成されていることを確認した。

前記同様の反応、処理を行ない下記のペプチドを合成し
た。

実施例１４　活性試験 本発明のペプチドまたはその塩は、アンジオテンシン変
換酵素阻害作用を有する。以下に酵素阻害作用について
説明する。

各ペプチド試料溶液１００μｌに、２２５μｌの１０＋
＋＋Ｍｐ−ヒドロキシベンツ゛イルグリシル−−ヒスチ
ジル−し一ロイシン、２．５ｍＭ４−アミノアンチピリ
ン、３ユニツト／ｙｓ　ｊヒプリカーゼ（０．　７　Ｍ
ＮａＣｊ！含む０．１２Ｍホウ酸緩衝液の溶液）を加え
３７℃で３分間保温後、約７０ミリユニツトのウサギ肺
アンジオテンシン変換酵素を加え反応を開始した．２０
分間３７℃に保温後、７５０μｌの３−Ｍ　ｆ！ＤＴＡ
　、　０．　２％トライトンＸ−　１　０　０。

６、５ｓＭ過ヨウ素酸ナトリウム溶液を加え反応を停止
した後、引き続き３分間保温して発色させ、反応溶液を
精製水を対照として波長５０５ｎ−で比色定置した。

阻害率５０％の時の試料の濃度をＩＣｓｏ値として、本
発明のペプチドの一部についての値を表１に示す。

ｎｄ・１μＨ以上の濃度では溶けないので測定できない
。

】１ＲＢ九展 以上の結果から、本発明の新規ペプチドは降圧剤として
有用であり、本発明は医薬及び食品産業上重要である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、下記構造式のいずれかで示されるペプチドおよびそ
   の塩。 【遺伝子配列があります】 ２、下記構造式のいずれかで示されるペプチド又はその
   医薬上許容される塩を有効成分として含有する降圧剤。 【遺伝子配列があります】 【遺伝子配列があります。】