JPH03127992A - 脂肪酸エステルの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、油化学工業、食品工業、医薬品工業の基礎素
材である脂肪酸エステルを製造するに際して、未反応の
脂肪酸をできるだけ減少させるための固定化リパーゼを
用いた脂肪酸エステルの製造方法に関する。

〔従来技術及びその問題点〕

高酸側部、グリセリン及び陰イオン交換体に固定化した
リパーゼを含む反応液を用いて水分含量３＄以下にて反
応を行ない、モノグリセライド高含有物を生産する方法
（特公昭６２−５１５９３号）があるが。

親水性の陰イオン交換基を有する固定化リパーゼによる
と反応系の水分調節が難しく１反応後の酸価が高いもの
であった。

シクロヘキサン中で０．２Ｍの（Ｒ，５）−１−フェニ
ルエタノールと０．３Ｍあるいはヘプタノイック酸との
エステル合成を、オクタデシルトリクロロシランを導入
した漂白土に固定化したリパーゼを用いる方法（Ｍ、Ｎ
ｏｒｉｎ　ｅｔ　ａｌ、Ａｐｐｌ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ
、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ。

２８．５２７（１９８８））があるが、３Ｍのヘプタノ
イック酸を基質としたエステル合成においては基質濃度
が高いにもかかわらず、０．３Ｍのヘプタノイック酸を
基質としたエステル合成速度程の合成速度が得られなか
った。

〔発明が解決しようとする問題点〕

担体表面に陰イオン交換基が存在する固定化リパーゼを
用いて脂肪酸エステルを合成すると、固定化リパーゼが
親木基を有するため加水分解も起こり易く、エステル中
に脂肪酸が大量に残存し、利用価値のあるエステルを得
ることが困難であった。また、高酸価部等を基質とする
ためには、１５〜５０％の高濃度の脂肪酸を用いて反応
を行う必要があるが、高濃度の脂肪酸は遊離リパーゼ、
及び担体表面に陰イオン交換基が存在しない疎水性担体
に結合したリパーゼを阻害した。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明者らは、反応後のエステル中の遊離脂肪酸含量を
減少させるための固定化リパーゼによるエステルの製造
方法について、鋭意研究を重ねた結果、本発明を完成し
たものである。すなわち、本発明は、脂肪酸及びアルコ
ールを含む基質を反応させてエステルを製造するに際し
て、担体表面に陰イオン交換基が存在する固定化リパー
ゼの存在下で反応を行った後、担体表面に陰イオン交換
基が存在しない疎水性担体に固定化したリパーゼの存在
下で反応を行うことを特徴とする脂肪酸エステルの製造
方法である。

本発明に用いる反応液は、通常、脂肪酸が１５％以上含
まれる反応液で、脂肪酸成分としては、脂肪酸又は遊離
脂肪酸を含む油脂が用いられる。脂肪酸のエステル化を
完全にするためのアルコールは、モル濃度において脂肪
酸量の４倍量以上と反応させるのがよい、アルコール成
分としては、１価アルコールの他、グリセロール等の多
価アルコールも含まれる。脂肪酸は、Ｒ−ＣＯＯＨ（Ｒ
：脂肪族基）で表現される、リパーゼによるエステル合
成あるいはエステル交換の基質となるものを言う。

本発明に用いるリパーゼとは、脂肪酸（Ｒ−ＣＯＯＩ＋
）ト８　素（Ｎｏ−Ｅ）　又１ｔ、（）Ｉｓ−Ｅ）　力
結合ジチア　シ／Ｌ’　９　Ｍ（Ｒ−Ｃｏｏ−Ｅ）又は
、（Ｒ−ＣＯ５−Ｅ）をつくる酵素であって、このよう
な機能を有する酵素であればホスホリパーゼ、リポプロ
ティンリパーゼ、プロテアーゼ等いずれのものを用いて
も差し支えない。耐熱性のシュウトモナス属のリパーゼ
又は水分含量を著しく少なくしても活性を有するＭｕｃ
ｏｒ属のリパーゼ（特公昭６２−５１５９３号公報の第
１図参照）などはより好ましいものである。

本発明の担体表面に陰イオン交換基が存在する固定化リ
パーゼとは、リパーゼを結合させた担体表面に、リパー
ゼの結合していない陰イオン交換基が存在する固定化リ
パーゼである。この固定化リパーゼは（特公昭６３−１
８４７６号公報）のような合成法で製造することができ
る。すなわち、イオン強度を０．１以下にしたリパーゼ
溶液を陰イオン交換体と接触させると、一般に酸性蛋白
質であるリパーゼは陰イオン交換体にイオン結合する他
、疎水基に親和性のあるリパーゼ蛋白は疎水性担体と強
固に疎水結合する。その後、未固定のリパーゼを水で洗
浄することにより、容易に目的の固定化リパーゼを得る
ことができる。なお、より強固に固定化する場合には、
ゲルタールアルデヒド等の多価性反応試薬で処理する。

しかし多価性反応試薬は食品等に混入すると好ましくな
いので、反応終了後、未反応の多価性反応試薬を還元剤
等で完全に除去した後、充分に洗浄する。また、担体表
面に陰イオン交換基が存在する固定化リパーゼを得るた
めには、できるだけ多くのイオン交換基を導入した担体
にリパーゼを吸着させる。リパーゼの吸着量を増してい
くと、未吸着のリパーゼも徐々に増加するが、ある量以
上になると急に増大する。

その量以下にリバー以吸着量を押えれば、目的の固定化
リパーゼを得ることができる。

本発明の担体表面に陰イオン交換基が存在しない疎水性
担体に固定化したリパーゼとは、疎水性の担体にリパー
ゼを吸着させたものを言う。疎水性担体とはマクロポー
ラスなポリスチレンの吸着樹脂アンバーライトＸＡＤ−
８（ローム、アンド、ハース社製）、ダイアイオンＨＰ
−２０，セパビーズＳＰ−２０５（三菱化或社１ｍ）等
やマクロポーラスなフェノール樹、脂デュオライトＳ−
７６１．デュオライトＳ−５８７（ダイヤモンド、シャ
ームロツク社製）あるいはセラミック粉末、ガラス粉末
、金属粉末等にシランカップリング剤を用いて疎水基を
導入したもの等があげられる。リパーゼ溶液を疎水性担
体に接触させると、疎水基に親和性のあるリパーゼ蛋白
は疎水性担体と強固に疎水結合する。リパーゼと疎水性
担体の接触をよくするために超音波処理、脱気処理。

極性溶媒処理等をすれば、活性量の高い固定化すパーゼ
が得られる。その後、未固定のリパーゼを水あるいは塩
溶液で洗浄することにより、容易に目的の固定化リパー
ゼを得ることができる。なお、より強固に固定するには
ゲルタールアルデヒド等の多価性反応試薬で処理し、吸
着したりリパーゼどうしの結合をつくる。多価性反応試
薬の後処理については、陰イオン交換体に固定化した場
合と同様である。

本発明で脂肪酸エステルを製造するには、まず最初に、
担体表面に陰イオン交換基が存在する固定化リパーゼを
用いて反応を行むう。この場合、反応液の水分含量は２
ｚ以下という広い水分範囲に設定することができる。次
に、担体表面に陰イオン交換基が存在しない疎水性担体
に固定化したリパーゼを用いて反応を行なう。これによ
り、反応生成物中の未反応の脂肪酸を減少させる。第２
段の反応を行う場合、水分はできるだけ少ない方が好ま
しく、通常、水分含ｊ１１．１％以下で行う。反応液中
からの水分の除去は、減圧留去の他、モルキュラーシー
ブ等の脱水剤を用いることにより、あるいは窒素ガス等
の不活性ドライガス等を用いることによって行うことが
できる。反応は流動床式、固定床式リアクターのいずれ
でも良い。第１図に向流式流動床式リアクターの説明断
面図を示す。

このリアクターは特願昭６２−２５５０５８７号明細書
に記載されている。このリアクターにおいては、上段の
撹拌槽に、担体表面に陰イオン交換基が存在しない疎水
性担体に固定化したリパーゼを存在させ、下段の撹拌槽
に、担体表面に陰イオン交換基の存在する固定化リパー
ゼを存在させる。中下段より脂肪酸含む基質を、中上段
よりアルコールを供給して下端より未反応のアルコール
を採取し上端よりエステルが連続的に流出する。未反応
のアルコールには反応により生成した水が含まれている
ので、減圧蒸留、乾燥窒素等により脱水を行い再び中上
段よりアルコールとして供給する。

〔作用〕

脂肪酸が１５〜３０％含まれている高酸細部等の基質は
、これを担体表面に陰イオン交換基が存在する固定化リ
パーゼの存在下でアルコールと反応させることにより、
脂肪酸濃度を１５％以下に減少させることができる。上
記固定化リパーゼは、担体と多く結合して安定化すると
同時に、陰イオン交換基の微細環境効果により、リパー
ゼ周辺のプロトンを排除して、ｐＨを至適ｐＨ付近に維
持し、これにより、脂肪酸の高濃度での反応を可能にす
る（特公昭６２−５１５９３号参照）。また本願実施例
１に示すように、水分含量が２ｚ以下であれば、グリセ
ライド合成反応が進行する。したがって、高濃度脂肪酸
含有基質の縮合反応によって、多少の水分が生成されて
も反応は妨げられない。本発明者らは、以前に水分含量
０．５〜３．０％の範囲で反応すると良いという笑事を
開示したが、未反応の脂肪酸を除く目的の本発明におい
ては、前反応において水分含量を２％以下に保持し、後
反応において水分含量を１．１％以下に保持すると良い
結果が得られることが判明した。

リパーゼを用いるのエステルの合成反応は、アシル酵素
（Ｒ−ＣＯＯ＝Ｅ）が可溶媒介解し、再び活性酵素（Ｈ
Ｏ−Ｅ）になる反応の繰り返しである。この時、アシル
酵素の分解に際して、水に親和性を持つ環境をつくるか
、アルコール、グリセリンあるいは、ジグリセライド等
の部分エステルに親和性のある環境をつくるかで、加水
分解が起こるか、エステル合成又はエステル交換反応が
起こるかが決定される０本発明においては、エステル合
成反応の後間において、担体表面に陰イオン交換基が存
在しない疎水性担体に固定化したリパーゼを用いること
により、未反応の脂肪酸や部分エステルを減少させるこ
とができる。

担体表面に陰イオン交換基が存在しない疎水性担体に固
定化したリパーゼは、水に対して親和性が少なく、アル
コールや、ジグリセライド等の部分エステルに対して親
和性を持つ。このものは、水分含量低い条件で有効にそ
の機能を発揮する。

また、上記担体に、膵臓リパーゼ、ムコール属のリパー
ゼ等の水が著しく少ない系においても活性を発現するリ
パーゼを固定化したものを用いることにより、本発明の
効果はより向上する。

〔実施例〕

次に本発明を実施例によりさらに詳細に説明する。

実施例１ マクロポーラスな陰イオン交換樹脂（ダウエックスＮＷ
Ａ−１．ダウケミカル社製）１ｇ、シュウトモナス・メ
フィティ力・バリアント・リポリテイ力（微工研菌寄５
０２号）のリバー１１８５単位を脱塩濃縮したものを２
−吸着させた。この吸着物をガラスフィルター上で吸引
濾過しながら乾燥させた。比活性２２００単位／ｍｇ蛋
白に精製した本リパーゼの蛋白の分子量を１７５００と
すると、１１８５単位の分子数は次のように計算される
。

リパーゼ数＝（１１８５／２２００）　Ｘ　ｔｏ−３／
１２５００畔４．３　Ｘ　１０−８このモル数を、ダウ
エックスＮＷＡ−１の交換容量と比較すると、 ４．２Ｘ　１０−’／（４，３Ｘ　１０−”）＝９．８
Ｘ　１０４すなわち、リパーゼ１分子あたり９，８Ｘ１
０’個の陰イオン交換基が疎水性のポリスチレン担体上
に存在している。一方、１７５００の蛋白上のイオン結
合に関与する酸性アミノ酸数は１０以下と推定される。

以上の計算例からも示されるように、本固定化法により
、担体表面に陰イオン交換基が存在する固定化リパーゼ
が得られた。なおリパーゼ活性測定法は、Ｎｏｒｄらの
変法（白層化３６巻８６０ページ（１９６０））で行い
、ｐＨ７，０，６０℃で反応し、１分間に１マイクロ当
量の酸を遊離する酵素量を１単位とした。

マクロポーラスな吸着樹脂（アンバーライトＸＡＤ−８
）Ｉｇに、シュウトモナス・メフィチ力・バリアント・
リポリティ力（微工研菌寄５２０号）のリパーゼを超音
波をかけて分散溶解したもの２成を吸着させた。この吸
着物をガラスフィルター上で吸引濾過しながら乾燥させ
、担体表面に陰イオン交換基が存在しない疎水性担体に
固定化したリパーゼを得た。

高酸価の米糠油（高酸原油）を脱蝋して高酸価ｄｔＩを
得た。高酸価油の酸価は７５．０であったので、未糠油
の脂肪酸平均分子量から計算すると、遊離脂肪酸含量は
３６％であった。精製米糠油に１０％のオレイン酸を添
加して低酸細部を調製した。低酸細部の酸価は２１．９
であった。

固定化リパーゼ調製時の酵素量を４００単位となるよう
な固定化リパーゼの乾燥重量である、ダウエックスＮＷ
Ａ−１固定化リパーゼを０．３１４ｇ、アンバーライト
ＸＡＤ−８を０．４０７ｇを以下の反応に用いた。

先ず、１ｇの高酸価油、０．３１４ｇのダウエックスＮ
ＷＡ−１固定化リパーゼ、各種の量のグリセリンを６０
℃で、１２０時間反応扱の結果は、第１表のとおりであ
る。

第１表 なお反応に用いたグリセリン量は高酸価油中の脂肪酸モ
ル数に対するグリセリンモル数の割合を示した。酸価は
反応終了後、ベンゼン・エタノール（１：１）で反応を
止め、固定化リパーゼを濾過除去してから測定した。表
中の水分含量は、カールフィッシャー法及び乾燥法を用
いて求めた反応液中のものである。水分含量が２％以下
、望ましくは、１．８４％以下、及びグリセリンが脂肪
酸の４倍以上ある時、酸価の減少能が高いことがわかっ
た。

次に、Ｉｇの低酸細部、ダウエックスＮＷＡ−１固定化
リパーゼ、グリセリンを６０℃で１２時間反応後の結果
は第２表のとおりである。

第２表 なお、グリセリン量は低酸価油中のモル数に対するグリ
セリンモル数の割合で示した。ダウエックスＭＩＩＡ−
１固定化リパーゼを用いると、低酸細部の酸価の減少は
わずかであった。

次に、１ｇの高酸価油、アンバーライトＸＡＤ−８固定
化リパーゼ、グリセリンを６０℃で１２０時間反応後の
結果は第３表のとおりである。

第３表 酸価の減少能を示す水分域が０．９０％〜１．０３％と
狭く、水分含量が０．８４％以下になると、酸価の減少
能が低下した。これは、リパーゼ反応に必要な水分量が
不足するため、反応がうまく進まなかったためと考えら
れる。

次に、１ｇの低酸価油、アンバーライトＸＡＤ−８固定
化リパーゼ、グリセリンを６０℃で１２０時間反応後の
結果は第４表のとおりである。

第４表 アンバーライトＸＡＤ−８を用いて、水分を１．１ｚ以
下、望ましくは１．０８％以下にすれば、低酸価油の酸
価が更に減少したことを示す。

実施例２ 実施例１と同様に調製したダウエックスＮＷＡ−１固定
化リパーゼＩｇ、あるいはアンバーライトＸＡＤ−８固
定化リパーゼ１ｇ及びグリセリン１ｇ、高酸価油１ｇを
６０℃で１３３回振ヒラしながら１２０時間反応後１反
応液を濾過除去して、濾液の酸価を測定したところ、ダ
ウエックスＮＷＡ−１固定化リパーゼを用いた方は２８
．６．アンバーライトＸＡＤ−８を用いた方は５６．１
で、高酸価油と最初に反応させるのには、前者の方が良
いことが分った。

次に、ダウエックスＮＷＡ−１固定化リパーゼ１ｇ、あ
るいはアンバーライトＸＡＤ−８固定化リパーゼ１ｇ及
びグリセリンＩｇ、低酸価油１ｇを６０℃で１２０時間
反応した。反応後に酸価はダウエックスＮＷＡ−１固定
化リパーゼを用いた方は１７．Ｏ、アンバーライトＸＡ
Ｄ−８固定化リパーゼを用いた方は１１．０で、ある程
度低酸価になった油脂に対しては、後者の方が酸価の減
少能が高かった。しかしこの場合でも、反応時間が６時
間及び１２時間の反応初期においては、ダウエックスＮ
ＷＡ−１固定化リパーゼを用いた方の酸価の減少の方が
大きかった。

実施例３ 第１図に示すようなりアクタ−に、上段二種の撹拌槽に
実施例１と同様に調製したアンバーライトＸＡＤ−８固
定化リパーゼを各々１４．５ｇ、下段二種の撹拌槽に実
施例１と同様に！ｌ！！製したダウエックス阿ｗＡ−１
固定化リパーゼを存在させた。水溶性生産物回収口（９
）をふさいで、水溶性基質供給口（３）よりグリセリン
を１１ｍＱ／ｈｒ、油状基質供給口（７）より高酸価油
を５．５ｍ１２／ｈｒで流した。高酸価油はオレイン酸
及び米糠油の１対１混液で酸価は１５２．１であった。

リアクター中に基質が満たされた後、撹拌を開始し、反
応温度を６０℃にして、グリセリン流入量１−／　ｈ　
ｒ、高酸価油流入量１ｍＱ／ｈｒ、水溶性生産物回収口
（９）より水溶性生産物を１ｎ＋Ｑ／ｈｒで回収すると
、油状生産物回収口（１）より油状生産物が約１ｍＱ／
ｈｒで連続的に溶出した。油状生産物の酸価及び水溶性
生産物中の水分量の経時変化を第５表に示す。

第５表 上側より、１５２．１の酸価を約１７３に減少させる操
作を連続的に行える事が分った。

また、供給したグリセリン中の水分量は０．４６Ｌ％で
、回収された水溶性生産物中の水分量が２〜３ぶなので
、アンバーライトＸＡＤ−８固定化リパーゼ付近の水分
量が１．１％以下、ダウエックスＮＷＡ−１固定化リパ
ーゼ付近の水分量が２ｚ以下になっていることが予想さ
れた。

〔発明の効果〕

リパーゼによりモノグリセライドやシュガーエステル等
の界面活性剤が合成できることが報告されている。この
場合、未反応の脂肪酸を除去するためにはアルカリ精製
法が使えないため、未反応の脂肪酸の出来るだけ少ない
合成法が必要である。

高酸価油等から低酸価油等がリパーゼにより製造する試
みがあるが、加水分解を受けにくく、結晶化速度の速い
トリグリセライド含量のおおい浦脂の製造が必要である
。本発明は、これらの技術的要求に対する解決策を提供
するものである。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本実施例において用いた反応器の説明断面図
である。 １・・・油状生産物回収口 ２・・・上端の静置槽 ３・・水溶性基質供給口 ４・・・撹拌羽根 ５・・・静置槽 ６・・・撹拌槽 ７・・・油状基質供給口 ８・・・下端の静置槽 ９・・・水溶性生産物回収口 １０・・撹拌軸 １１・・・ふるい板 １２・・・撹拌軸カバー

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）脂肪酸をアルコールと反応させてエステルを製造
   するに際して、担体表面に陰イオン交換基が存在する固
   定化リパーゼの存在下で反応を行った後、担体表面に陰
   イオン交換基が存在しない疎水性担体に固定化したリパ
   ーゼの存在下でさらに反応を行うことを特徴とする脂肪
   酸エステルの製造方法。