JPH031310B2 - - Google Patents

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【発明の詳細な説明】 本発明は次式の化合物に関するものである。 但しR₁は炭素数４−８のアルキル基である。
これらの化合物は生体内免疫調節剤であり、抗ウ
イルス活性、抗腫瘍活性を有し、また酵素阻害剤
でもある。 免疫調節活性はR¹の鎖長が増すと共に（少な
くともメチルからヘキシルまで）増すようであ
る。R¹は直鎖（ｎ）アルキル、すなわちｎ−ブ
チル、ｎ−アミル、ｎ−ヘキシル、ｎ−ヘプチル
またはｎ−オクチルであるのが好ましい。 免疫調節剤は免疫応答を調節する化合物であ
る。かくして、それは、免疫刺激（免疫増強）お
よび免疫抑制の両者を包含する。免疫刺激が免疫
の増強に有用なことはもちろんである。免疫阻害
も多くの領域で有用である。たとえば、それは臓
器移植、たとえば腎臓または心臓の移植において
臓器拒絶を阻止するのに有用である。 化合物類の免疫増強性を示す表において、プラ
ス（＋）は免疫増強性を、マイナス（−）は免疫
抑制性を示す。数字０はその化合物が免疫増強活
性も免疫抑制活性もなかつたことを示す。 特許請求の範囲外の化合物ならびに特許請求の
範囲内の化合物を免疫調節剤、抗ウイルス剤、抗
腫瘍剤として使用することは「免疫調節剤および
抗ウイルス剤」なる同日付出願中に示されてい
る。 幼若化促進物質は免疫処置の間に起るごとき細
胞増殖を誘発する物質である。 本発明の組成物は、ヒト、ブタ、イヌ、ネコ、
ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、マウス、ウサギ、ラ
ツト、モルモツト、ハムスター、サルなどを含め
て哺乳動物（および哺乳動物の細胞）を醜置する
のに有用である。 特に断わりのない限り、部および％はそれぞれ
重量部および重量％である。 特に断わりのない限り、温度はすべて摂氏の度
数である。 それら組成物は、記載された材料から本質的に
なるかまたはそれからなり、プロセスは、かかる
材料を用いての記載された工程を包含し、または
それから本質的になり、あるいはそれらからなつ
ていてよい。 それら組成物は、従来技術によつて、たとえば
口、鼻、直腸、腟を経て、または非経口的（注
射）に哺乳動物に投与できる。それらは注射後、
たとえば水溶液として、または錠剤、ピル、カプ
セルなどの形態として使用できる。 第１表 エリスロ−９−〔１−（１−ヒドロキシエチル）
ヘプチル〕ヒポキサンチンの化学的性質 【表】 好ましい態様および本発明化合物の製造、使用
の方法についての説明 エリスロ−９−〔１−（１−ヒドロキシエチル）
ヘプチル〕−ヒポキサンチン（NPT15392） エリスロ−９−〔１−（１−ヒドロキシエチル）
ヘプチル〕−ヒポキサンチン（ノニルヒポキサン
チン、）の合成経路の概要は、フローチヤート
１および２に示した。シエーフアー・シユベンダ
ー（H.J.SchaefferおよびC.F.Schwender）のジ
ヤーナル・オブ・メデイシナル・ケミストリー、
17巻、６頁（1974年）に記載の方法｛エリスロ−
９−〔１−（１−ヒドロキシエチル）ヘプチル〕−
６−クロロプリン()に至る反応過程における｝
の改良方法が示されている。 ノニルヒポキサンチン()を得るための最終工
程、即ち６−クロロプリン誘導体()の加水分解
はハロゲノプリンの加水分解についてのギナー、
ソロラ、グリテ、ベンデイヒ、ブラウン（A.
Ciner−Sorolla、C.Gryte、A.BendichおよびG.
B.Brown）のジヤーナル・オブ・オーガニツ
ク・ケミストリー（J.Org.Chem）34巻、2157頁
（1969年）に記載の方法を採用した。別法のルー
ト、即ちノニルヒポキサンチン()を得るための
エリスロ−９−〔１−（１−ヒドロキシエチル）ヘ
プチル〕−アデニン（EHNA）()のニトロソ化
（フローチヤート２）は、まずクロル誘導体()
をアンモノリシスによつてアミノプリン（、
EHNA）に変換しその後ニトロソ化してノニル
ヒポキサンチン()を得る。 フローチヤート １ エリスロ−９−〔１−（１−ヒドロキシエチル）
ヘプチル〕−ヒポキサンチン()の合成の概要 〔第１工程〕アセトアミドノナン−２−オン() ２−アミノオクタン酸のアシル化 〔第２工程〕アセトアミドノナン−２−オン−ヒ
ドロクロリド アセトアミドノナン−２−オンヒドロクロリド
の生成 〔第３工程〕エリスロ−３−アミノ−２−ノナー
ル() アセトアミドノナン−２−オン−ヒドロクロリ
ドの還元 （矢印の下の数字は収量％をしめす。） 〔第４工程〕エリスロ−５−アミノ−４−クロロ
−６−〔１−（１−ヒドロキシエチ
ル）ヘプチルアミノ〕ピリミジン
（） エリスロ−３−アミノ−２−ノナノールと５−
アミノ−４，６−ジクロロピリミジンとの縮合 〔第５工程〕エリスロ−９−〔１−（１−ヒドロキ
シエチル）ヘプチル〕−６−クロロ
プリン() エリスロ−５−アミノ−４−クロロ−６−〔１
−（１−ヒドロキシエチル）ヘプチルアミノ）ピ
リミジン()の閉環 〔第６工程〕エリスロ−９−〔１−（１−ヒドロキ
シエチルヘプチル〕−ヒポキサンチ
ン() （６−クロロプリン誘導体の加水分解） フロー・チヤート ２ エリスロ−９−〔１−（１−ヒドロキシエチル）
ヘプチル〕−ヒポキサンチン()の製造について
の別法 〔工程1a〕エリスロ−９−〔１−（１−ヒドロ
キシエチル）ヘプチル〕−アデニ
ン() エリスロ−９−〔１−（１−ヒドロキシエチル）
ヘプチル〕−６−クロロプリン()のアンモノリ
シス 〔工程2b〕エリスロ−９−〔１−（１−ヒドロ
キシエチル）ヘプチル〕−ヒポキ
サンチン() エリスロ−９−〔１−（１−ヒドロキシエチル）
ヘプチル〕−アデニン()のニトロ化 ３−アセトアミドノナン−２−オン() ２−アミノ−１−オクタン酸（Ｉ、200ｇ、
1.26mol〕の無水酢酸（960ml）溶液をピリジン
（640ml）との混合物を沸とう水浴上で４時間加熱
した。反応混合物を真空中で蒸発し、残渣を５％
水性NaHCO₃（400ml）及びエーテル（400ml）の
間で６〜８回分液した。エーテル抽出分を合し、
無水硫酸マグネシウムで乾燥し、蒸発乾固して粗
３−アセトアミドノナン−２−オン、154ｇ（70
％）を得た。 ３−アミノ−２−ノナノンヒドロクロリド() 先の工程で得た粗生成物()（154ｇ）を濃塩
酸（1540ml）中に溶解し、２時間加熱還流し真空
中で蒸発乾固した。得られた固形物をエタノール
（200ml）の温溶液から再結晶して25゜に冷却した。
この溶液にエーテル（600ml）を加えた。白色結
晶状沈澱物が析出し、この懸濁液を5゜で一夜放置
した。この沈澱を集め、エーテル（１回100ml）
で洗浄して125ｇ（67％）の白色結晶が得られた。
融点112゜（分解）。 もし、この結晶物質が白色でなかつたり、融点
が低い場合には、テトラヒドロフランから、活性
炭をもつて再結晶すべきである。この処理１回あ
たり、粗塩酸塩()100ｇに対して150mlのテトラ
ヒドロフランが使用される。 エリスロ−３−アミノ−２−ノナノール() ３−アミノ−２−ノナノール塩酸塩（43.8ｇ、
0.226モル）を無水メタノール（150ml）中に溶解
し、氷−食塩浴中で−10゜に冷却した。(1)水素化
ホウ素カリウム（24.4ｇ、0.45mol）(2)を少量づ
つ２−３時間で加える。この混合物を３時間−
10゜〜−15゜に保ち、（３，４）ゆつくり室温（22゜）
にもどす。そして一夜（20時間室温で撹拌する。
混合物を真空蒸発乾燥（シロツプ状）し、H₂O
（150ml）およびクロロホルム（150ml）の間で分
液した。水層をさらに３回クロロホルム（100ml
づつ）で再抽出した。クロロホルム層を硫酸マグ
ネシウムで乾燥し、真空蒸発すると淡黄色油状物
が得られる。この液体を真空下に95゜−100゜（0.15
mmＨｇ）で蒸留して純粋エリスロ−３−アミノ−
２−ノナノール、26.4ｇ（75％収量）を得た。融
点81゜−86゜ (1) の溶液を冷却すると沈殿が生ずるが、これ
は本反応の成果には何の影響も与えない。 (2) 次の点において、本方法はシエーフアー等
（Schaeffer et al）の方法と異なる。即ちシエ
ーフアー等（Schaeffer）の方法では、KBH₄
と同時に酢酸を加えてPH５−６に保つている。
中和すればHBH₄の損失をともなうし、また５
を超えるPHというのは大目にみてもよい。さら
に重要なことは、酢酸とKBH₄との同時添加シ
エーフアー〔（Schaeffer）の提案のように〕す
ると反応の調整が極めて困難となる。温度が非
常に上昇し、収量の低下および／または生成物
の純度の低下がおこる。 (3) うまく反応がすすむよう、はげしく撹拌する
ことをすすめる。すなわち、水素化ホウ素カリ
ウムの小さなかたまりがない方が反応がよく進
行するのである。 (4) シエーフアー（Schaeffer）らが述べている
ように0゜に冷却すること（方法Ｄ）では不十分
である。反応を0゜未満で行う点が改良点であ
る。常に−10゜に保つことが最も好ましい。も
し−10゜を超えるようになれば著るしく収量が
低下する。 エリスロ−５−アミノ−４−クロロ−６−〔１
−（１−ヒドロキシエチル）ヘプチルアミノ〕ピ
リジン() ４，６−ジクロロ−５−アミノピリジン（Ｖ、
24.6、0.15mol）と、エリスロ−３−アミノ−２
−ノナノール（、26.2ｇ、0.164mol）とを１−
ペンタノール（1.080ml）及びトリブチルアミン
（350ml）中に懸濁させた液を、25゜で撹拌するこ
とによつて調製した。この懸濁液を28時間窒素気
流中で加熱還流した（約1/2時間で溶液状態とな
る）。その時点における反応生成物のUVλ_nax267
および297nm（水、PH5.5）。 得られた溶液を温浴中、10mm圧で濃縮してシロ
ツプ状となし、さらに0.1mm圧、100゜の油浴中で
蒸発して、粘着性液を得、これにｎ−ヘキサン
（450ml）を加えた。この混合物を１時間加熱還流
し、この液から、黄色のヘキサン上澄液を円型底
フラスコに取つた。 かかるヘキサン溶液を真空蒸発させて得られた
淡褐色油状物質をクロロホルム（150ml）中に溶
解した。このクロロホルム溶液を炭酸水素ナトリ
ウムの飽和溶液（各回250ml）で８回抽出した。
クロロホルム層を分離し、硫酸ナトリウムまたは
硫酸マグネシウムで乾燥後、40゜（水浴）で真空
（0.1mm）蒸発することによつて淡褐色油を得、こ
れを冷却することにより固形物を得た。この物質
は、直接次の反応工程に使用できるが、次の方法
で精製してもよい。即ち、得られた油状物を75〜
100mlのクロロホルムに溶解し、ｎ−ヘキサン
（約300ml）を加えて白色結晶を沈殿させる。液を
冷却み該沈殿物を濾取した（抽出は、炭酸ガスが
出なくなるまで、４−８回行つた）。この操作を
さらに２回くり返した。収量：23.3ｇ（54％）
UVλ_nax267、297（水、PH5.5）融点113−116゜エリスロ −９−〔１−（１−ヒドロキシエチル）
ヘプチル〕−６−ヒドロキシプリン() 先の工程で得たエリスロ−５−アミノ−４−ク
ロロ−６−〔１−（１−ヒドロキシエチル）ヘプチ
ルアミノ〕ピリミジン（11.48ｇ、40mmol）より
成る粗シロツプをオルトギ酸トリエチル（106ml）
およびクロロホルム（34ml）に溶かし、エタンス
ルホン酸（10滴）を加えた。25゜で一夜放置した
後、真空下に蒸発させ、シロツプを得た。収量
11.7ｇ（定量的）。この粗エリスロ−９−〔１−
（１−ヒドロキシエチル）ヘプチル〕−６−ヒドロ
キシプリン()は次の工程に使用する。λ_nax
264nm。エリスロ −９−〔１−（１−ヒドロキシエチル）
ヘプチル〕−ヒポキサンチン() （６−クロロプリン誘導体の加水分解による） 0.5Nカセイソーダ（40ml）中のエリスロ−６
−クロロ−９−〔１−（１−ヒドロキシエチル）ヘ
プチル〕−プリン（、4.0ｇ、13.4mmol）の懸
濁液を２時間加熱還流し、冷却した。氷酢酸で中
和し、冷却するとエリスロ−９−〔１−（１−ヒド
ロキシエチル）ヘプチル〕−ヒポキサンチン()
の結晶状沈殿が得られ、これを濾取し乾燥した。
収量：3.8ｇ（定量的）、融点196゜UVλ_nax（PH5.5）
251nm。 かくして得られた粗生成物()を、ペーパーク
ロマトグラフイ（３溶媒）では単一物質であり、
Cl−についてのテスト（銅線による炎色反応ナト
リウム溶融、酸性化、硝酸銀反応）は陰性となつ
た。 粗生成物を水性エタノールから３回再結晶して
（精製参照）、無色結晶を得た。融点202゜：計算値
C₁₄H₂₂N₄O₂()としてＣ、60.41：Ｈ、7.97：Ｎ、
20.13、実測値：Ｃ、60.47、Ｈ、7.86、：Ｎ、
20.08エリスロ −９−〔１−（１−ヒドロキシエチル）
ヘプチル〕−ヒポキサンチン()の精製 粗ノニルヒポキサンチン()を再結晶によつて
精製する。粗生成物は、加熱によつて、その重量
の６−10倍がエチルアルコールに溶解し同量の水
を加える。この溶液をエーレンマイヤーフラスコ
中で活性炭処理し、温かいうちにはセライトによ
つて濾過する。この溶液を撹拌をつづけながら熱
板上で蒸発させる。これに、水を少量づつ加え蒸
発した量を回復させると多量の沈殿物が出てく
る。溶媒の蒸発をつづけ、全エタノールを除去し
他方くり返しH₂Oを生成物の８−12倍（重）に
なるまで加える。それぞれの再結晶に当つて減少
する生成物は約10％である。２回の再結晶で融点
は202゜まで上昇し、無色結晶状態のものが得られ
る。一方粗生成物はいくぶん黄色またはピンク気
味であり、融点は192゜であつた。エリスロ −９−〔１−（１−ヒドロキシエチル）
ヘプチル〕−アデニン・HCl() 先の工程で得られた粗油状エリスロ−９−〔１
−（１−ヒドロキシエチル）ヘプチル〕−６−クロ
ロプリン()（6.15ｇ）を飽和メタノール性アン
モニア（300ml）および塩化アンモニウム（１ｇ）
に80−100゜、１時間で、ステンレススチール製ガ
スボンベ（Parr Instrument）中で、溶解させ
る。冷却後、溶液を真空下蒸発乾固した。メタノ
ールを加え、再度蒸発を行い（３回）過剰のアン
モニアを除去した。 シロツプ状の残渣を無水メチルアルコール中に
溶解し、温度を20゜以下に保ちながら（氷浴で）
乾燥塩酸ガスを通した。1/2時間塩化水素を通じ
た後、混合物を5゜に冷やし、沈殿物をガラスフイ
ルターロートで集めた。これを冷メチルアルコー
ルで洗浄し空気中で乾燥した。収量6.0ｇ（92
％）、融点173−175゜（分解）、UVλ_nax260nm（水、
PH5.5）エリスロ −９−〔１−（１−ヒドロキシエチル）
ヘプチル〕−ヒポキサンチン()を製造するた
めの別法 亜硝酸ナトリウム（5.6ｇ、71mmol）をエリス
ロ−９−〔１−（１−ヒドロキシエチル）ヘプチ
ル〕−アデニン（、4.0ｇ、14mmol）の50％酢
酸（20ml）及び１規定塩酸（3.2ml）溶液中に、
25゜で撹拌しながら、ゆつくり加えた。この混合
物を25゜で２時間撹拌をつづけた。その後、UVス
ペクトラムを監視し、UVmaxが250nmに達した
時、溶液を２規定カセイソーダーで中和した。得
られた沈殿を濾取し、H₂Oで洗浄した。収量3.03
ｇ（75％）融点195゜ 分析用サンプルを３回水から再結晶して、融点
202゜の生成物を得た。 元素分析値 C₁₄H₂₂N₄O₂として、計算値、Ｃ、
60.40；Ｈ、7.96；Ｎ、20.13、実測値；Ｃ、
60.40；Ｈ、7.90；Ｎ、20.12 【表】 生物学的活性 方 法 抗インフルエンザ活性−（血球吸着試験） インフルエンザウイルスが、組織培養細胞の単
層に感染すると、モルモツトの赤血球は、その細
胞表面に吸着されるという細胞表面の変化がおこ
る。吸着細胞の病巣数（血球吸着病巣形成単位
HAFFU）は、感染性を定量するものである。そ
の方法は次の通りである。 単一層は次の方法で二次培養した：培地を流し
出し、PH7.2のカルシウム、マグネシウムを含ま
ないリン酸緩衝食塩水（PBS）、（GIBCO＃419）
を洗浄液として約50mlで単一層を２回洗浄した。
修飾したPuckの生理食塩水A1あたりトリプシ
ン（１：250）0.5ｇとEDTA2.0ｇを含有するト
リプシン−EDTA溶液（GIBCO＃530L）１mlを
37゜で名フラスコに添加し、静かに撹拌しながら、
単一層を分散させた。それから細胞を取り出すの
に必要な時間に従い、約３〜５分の間37゜の培養
器にいれておいた。時々撹拌する必要がある。移
植培地10mlを各フラスコに添加し、ヒペツトで浮
遊液を吸いこんだり、放出したりして細胞を分散
した。一連のフラスコの内容物はプールし、浮遊
液中の細胞を、移植培地で７〜8.5×10⁴細胞／ml
に希釈した。移植培地は、次の組成から成り立つ
ている：アール（Earle）塩とヘルペス
（HEPES）緩衝剤（GIBO＃236）を含有するイ
ーグル（Eagle）の最小必須培地（MEM）に次
の物質を添加して87mlのMEMにした。 ●仔牛胎児血清 10ml（FCS−GIBCO
＃614HI） ●Ｌ−グルタミン １ml（200Molar−GIBCO
＃503） ●クロルテトラサイクリン １ml（5000μｇ／
mlGIBCO＃528） ●ペニシリン 10000単位、ストレプトマイシ
ン10000μｇおよびネオマイ
シン10000μｇの混合物１ml
（PSN−GIBCO＃564」 細胞は、リンブロ（Linbro）組織培養トレイ
の中で二次培養した。そのトレイは各々３mlの容
量の底の平らな管24本から成つている：細胞培養
浮遊液（１ml）を各管に添加した。 翌日その培地を除去し、新鮮な移職培地ととり
かえた。単一層がほぼ合流するような条件に到達
したとき（約３〜４日）、実験に用いた。 リンブロ（Linbro）トレイのヘラ（Hela）細
胞培養液が（細胞を見て）、実験できる段階に至
つたら、培地を静かに注ぎだし、与えられた濃度
のテスト化合物を含有する保存培地（３％に減少
したFCSを含有するMEM）１mlを１トレイ中の
４管の培養液に添加した。 2.3〜150ｇ／mlの範囲の種々の薬物濃度のもの
を使用した。対照培養液としては保存培地のみの
ものを用いた。薬物および対照培地を投与して
後、実験群と感染した対照培養液に希釈したウイ
ルス浮遊液0.1mlを添加した。非感染対照培養液
には生理食塩水のみを添加した。リンブロ
（Linbro）トレイを37℃で18時間培養し、後に全
群における培地を吸引した。各培養液をPBSで
１回洗浄した。生理食塩水を吸引し、PBS中の
0.4％Ｖ／Ｖモルモツト赤血球浮遊液（0.5ml）を
各培養管に添加した。培養液は30分間室温に維持
し、その後培地を静かにそそぎ、特異的に結合し
ている赤血球を除き、他のすべての赤血球を取り
去るために、培養液をPBSで２回洗浄した。３
回目の洗浄の後、保存培地を全培養液に添加し
た。 ハワード（Howard）ミクロメーター接眼レン
ズ（C8385）をニコン（Nikon）倒立位相差顕微
鏡の接眼レンズにさしこんだ。各培養液を４倍と
いう低倍率の対物レンズで入念に調べ、視野目標
（field marker）として接眼レンズのグツドを使
つて、赤血球吸着細胞の数を直接数えた。感染さ
せた対照培養液で生じた血球吸着細胞の数と密度
に応じて、実験群について部分的な視野あるいは
視野すべてについて数えた。血球吸着細胞を数え
るのに最も好ましい状態を得るためには、60倍か
150倍の拡大であつた。60倍と150倍での血球吸着
を測定するため視夜係数を計算した。60倍では、
55.5という乗数で、全視野数をかぞえた。150倍
では、乗数は273であつた。乗数55.5と273は、
各々60倍を150倍での全視野数を表わす。数えた
視野数は、一管あたり３〜５の範囲で使用した一
処理群あたり、３−４管用いた（試験した視野数
に関する結果の部分の生のデータ表を見ょ）。平
均と標準誤差を計算し、スチユーデントｔ検定法
を使つてデーターを評価した。 NPT15392を用いたマウスの生体内処理：コ
ンカナバリンＡによる脾細胞増殖の試験管内刺
激に及ぼす効果 本実験の目的は、化合物NPT−15392をマウス
に投与し、これら動物から取りだした脾臓細胞の
幼若化促進物質コンカナバリンＡによつて誘導さ
れる増殖に対する効果を試験管内で評価すること
によつてこれら化合物の生体内投与の影響を測定
することにある。 方 法 生体内処理 ８〜９週令、体重18〜20ｇの９匹のBalb／Ｃ
系雄性マウスを２群に分けた。第１群には、日に
２回（１日間）、午前と午后とにNPT15392 10
mg／Kgを経口投与した。第２群には、対照群には
傷薬として生理食塩水を投与した。 試験管内脾細胞試験：細胞標本 翌日、各群を殺して脾臓を取り出しプールし
た。その脾臓を細かく切りきざみ、細胞を２mmの
グルタミンおよび抗生物質を補足したRPMI−
1640培地グランド アイランド ビオロジカルス
（Grand Island Biologicals）で洗浄した。各標
本の細胞濃度は、クールター（Coulter）計数管
で測定し、RPMI培地で５×10⁴細胞／mlに調整
した。 ミクロタイタープレート試験 ミクロタイター試験は、５×10⁵個の細胞と所
定濃度のCon Ａとを含有、あるいはCon Ａと化
合物とを含有する培養液（0.2ml）中で行われた。
すべての試験は１群につき６重複行われ、細胞の
みを含むブランク試験と比較した。試験プレート
を37゜、５％CO₂中で４日間培養した。培養の最
後の18〜20時間の間、HTdR（10μCi／ml、6Ci／
mmol）0.5mlを各培養液に添加した。培養液を複
式自動細胞ろ集装置〔multiple autmatic
sample harvester（MASH）〕により細胞をろ集
し、取りこまれた3HTdRをベツクマン
（Beckman）LS8000液体シンチレーシヨン計数
管で測定して、細胞の増殖を検定した。その結果
を、Con ＡあるいはCon Ａと化合物とで処理し
た培養液の測定値をブランク培養液の測定値にに
対する比として表にした。 化合物15392で生体内投与すると、試験管内で
の、最適以下の幼若化促進物質濃度（5μｇ／ml）
におけるCon Ａ刺激による脾細胞の反応は増大
する。Con Ａを最適な濃度（10μｇ／ml）にし
て、細胞を刺激しても、化合物15392処理のいず
れにおいても有意差はみられなかつた。 1μｇ／mlのNPT15392を用いて、Con Ａ刺激
細胞に及ぼす影響を試験管内で試験した。両化合
物は、顕著なCon Ａ使激を増大させる能力を有
し、特に最適以下の幼若促進物質濃度（5μｇ／
ml）のときそれが著るしく、10μｇ／mlではこれ
より小さかつた。Con A5μｇ／mlでは、
NPT15392による刺激は、Con Ａのみの場合の
2.8倍である。 以上の結果は、これら化合物が脾細胞増殖に対
し免疫調節作用をもつことを示している。動物を
これら化合物のいづれかで前処理することによ
り、これらの細胞が以後のミトーゲン刺激に対し
て感作されるが、他方ミトーゲン刺激後に生体内
で細胞をこれら化合物に曝露すると増殖反応が増
強される。 【表】 【表】 いくつかの化合物を幼若化促進物質惹起による
ネズミリンパ球の増殖に対して試験した。その結
果を次に示す。 【表】 生物学的活性 免疫調節試験 被験物質が免疫系のいくつかの細胞種の活性を
調節する能力を評価するのに次の３つの試験方法
を使用した。これらの方法では、（試験されたパ
ラメーターの抑制によつて証明される）免疫抑制
活性のみならず（試験されたパラメーターの促進
によつて証明される）免疫促進活性をも確認する
ことができる。 １ 幼若化促進物質誘導によるマウス脾細胞試験 Ｂ−及びＴ−リンパ球を含むマウス脾細胞は多
くの異物（例えばCon Ａのような植物性幼若化
促進物質）によつて刺激され、増殖することが可
能である。 この増殖を促進することは、細胞性免疫を促進
することを示唆するものである。 以下の方法は被験物質の免疫促進作用を評価す
るために用いられるものである。 物 質 コンカナバリンＡ（Calbiochem， La Jolla、
California）、Lot＃210073、食塩を含む凍結乾燥
品、をまず最初に１％溶液として調整し、２倍に
希釈してそれぞれの希釈液（0.5、10、2.5μｇ／
ml）を作製した。 動 物 ６〜８週令のバルブ／シー（Balb／Ｃ）およ
びC₃H系雄性マウスを次の所から入手した：フロ
ー・レサーチ・アニマルス・インコーポレーテツ
ド・ダブリン・バージニア；チヤールスリバープ
リーデイング・ラボラトリーズ・ウイルミント
ン・マサチユーセツト；ラボラトリー・サプラ
イ・カンパニー・インデイアナポリス・インデイ
アナ及びライオネル、ストロング・フアンデーシ
ヨン・サンデイエゴ、カリフオルニヤ（Flow
research Animals、Inc.、Dublin、Virginia；
Charles River Breeding Laboratories、
Wilmington、Massachusetts；Laboratory
Supply Company、Indianapolis、Indiana；お
よびLionel Strong Foundation、San Diego、
California）。 細 胞 ３〜５匹のマウスを頚部脱白によつて殺し、脾
臓を無菌的に取り出した。プールした脾臓を細か
く切りきざみ殺菌したピンセツトで引き裂いた；
それから、二重のナイロンメツシユでこした。細
胞懸濁液を５％仔牛胎児血清と抗生物質を補足し
たRPMI 1640の15mlで１回洗浄した。細胞は、
マイクロプレート10⁶細胞／0.1ml／管の濃度で培
養した。培養液は５％CO₂を含有する湿つた空気
中で幼若化促進物質の存在下、あるいは不存在下
において48時間培養した。被験化合物は、幼若化
促進物質といつしよに種々の濃度で培養液に添加
した。 増 殖 18時間の培養期間中における〔 2³H〕チミジ
ン1.0Ciの取りこみによつて増殖の試験を行つた。
培養液をマツシユ（MASH）装置〔オツトー、
ヒラーカンパニー、マジソン、ウイスコンシン
（Ctto Hiller、Co.、Madison、Wisconsin）〕に
より細胞をろ集し、チミジン取りこみ量を液体シ
ンチレーシヨン計数計で分析をした。試験は一群
につき３重複でおこない、データを平均値士実験
平均値の標準誤差を表わした。対照値に対する薬
物の促進率も計算しグラフに表わした。 ２ 幼若化促進物質によるヒト末梢血液リンパ球 ウイルス性疾患や癌にみられるような免疫状態
が不足あるいは弱められた状態にある患者におい
て、免疫反応を増強するような治療剤が臨床的に
必要である。異物に応じてヒト末梢血液リンパ球
の増殖を高めるような薬物の能力を研究すること
によつてヒトにおいて免疫促進活性をもつ薬剤を
認識することができる。その方法は、今述べた方
法あるいは、ヘイドン（Hadden、J.W）、インフ
エクシヨン・アンド・イムニイテイ、２月（1976
年）382−387、特に382−383頁にも記述されてい
る。 ３ マクロフアージは、白血球の亜集団であり、
細胞性および液性免疫の両方をコントロールする
免疫系における重要な細胞である。以下に述べる
試験方法は、マクロフアージの機能の促進作用物
質として研究されている物質を評価するものであ
る。 植物性血球凝集素（PHA）（HA−17）は、バ
ローズ、ウエルカム（Burroughs Wellcome）よ
り入手した。マクロフアージ幼若化因子
（MMF）とマクロフアージ活性化因子（MAF）
は、ヘイドン（Hadden et al）、ネーチヤー、第
257巻、第483〜485頁（1975年）中に記載されて
いるように（モルモツトの）抗原−刺激されたリ
ンパ腺のリンパ球から調製した。この標本を真空
透析とセフアデツクスＧ−100カラムクロマトグ
ラフイーによつて部分的精製を行うと、幼若化促
進作用と活性化の性質の両方もつ活性部分が35〜
70000ダルトンの範囲に得られた。その活性部分
を、増殖と活性化試験の両方に用いた。 方 法 フイコル−ハイパツク（Ficoll−hypaque）に
より精製したヒト末梢血液リンパ球を調整し、
PHA誘導リンパ球の増殖をヘイドン（Hadden
et al）らにより、セルラー、イミノロジー
（Cell.Immunol.）、第20巻、第98〜103頁（1975
年）に述べられている方法により、三重水素化チ
ミジンの取りこみによつて試験した。最適以下、
最適、最適以上の各濃度（各々、0.001、0.01、
0.1単位／ml）のPHAの存在下で、各化合物を試
験した。パラフイン油誘導モルモツト腹膜マクロ
フアージを調製し、単一層培養として培養した
（＞98％の純粋なマクロフアージ）。リンフオカイ
ン（MMF）誘導による増殖は、ヘイドン
（Hadden et al）、ネイーチヤー、第257巻、第
483〜第485頁（1975年）に記載されている方法に
より、培養３日目と５日目に三重水素化したチミ
ジンの取りこみによつて試験した。MAFの存在
する場合、あるいは存在しない場合において、５
日間の培養後、グラム陽性桿菌を殺すリンパ球
（MAF）誘導マクロフアージの活性化、ヘイド
ン・イングランド（HaddenおよびEngland）、イ
ミノフアルマコロジー
（Immunopharmacology）、第87〜100頁
（Plenum Press、1977年）で述べられている方法
により、６時間の間行つた。食作用は、グラム陽
性桿菌に20分間接触させている間、ラブテク
（Labtek）チエンバー内のグラム染色した単一層
におけるバクテリア含有マクロフアージの数と一
食細胞あたりのバクテリアの数を数えることによ
つて定量した。細胞内のバクテリアの殺滅は、最
初の20分間接触し、６時間後の、バクテリアを含
有する細胞の数と１細胞あたりのバクテリアの数
を数えることによつて評価した。マクロフアージ
を溶解し、細胞内バクテリアを培養するという実
験を平行して行つて、この系における方法によつ
て定量したバクテリアの活性の効力を確認した。
薬物は、幼若化促進物質あるいはリンフオカイン
の存在する場合と、存在しない場合において、３
種類の一連の対数濃度範囲で各群につき３重複し
た試験で用いた。どの実験も少なくとも３回は行
つた。先の実験結果によると増殖および活性化試
験における反応は薬理学的調整と類似性がみられ
ることを示している。 生物学的活性 抗白血病活性（Ｌ−1210発育阻害） Ｌ−1210腫瘍担癌マウスから摘出した白血病細
胞を試験管内で培養し、期間中、培養液中の細胞
数を数えることによつて、その発育を測定でき
る。抗白血病剤として有効な被験物質を培地に混
入すると白血病細胞の発育は妨げられるが、Ｌ−
1210の発育を50％阻害する薬物の濃度₅₀を次に
示す： 化合物 濃度（μｇ／ml） 15392 28 15417 47 使用した試験方法を以下に述べる。 白血病細胞（Ｌ−1210）の発育阻害測定法 貯蔵培養液中で細胞が充分発育していることを
詳細に観察する。移植後48〜72時間の細胞を使用
する。 所望の目的濃度の50倍の薬物を秤量し、連続的
に希釈する。 McCoyの5A培地500ml、15％仔牛胎児血清、
ペニシリン−ストレプトマイシン溶液５mlおよび
抗生−抗真菌性溶液５mlを用いて目的培地をつく
り、室温で維持する。 薬物希釈液0.1mlを、無菌的に各管に添加する。
適量の細胞を、調製した培養液に添加して、混合
した後、その液を0.5mlをとつて、生理食塩水9.5
mlを含むガラスビンに入れ、クールター
（Coulter）計数管で数える。40倍希釈を補正する
ために、その数を40倍する（生理食塩水0.5ml中
に0.5mlおよび接種材料を記録する）。 細胞懸濁液５mlを各管に添加する。細胞のより
均一な分布を確実にするために、４管ごとに渦ま
き状によく混ぜた。 ふたをしつかり閉めて、96時間、36〜38℃で、
CO₂恒温器中に入れておく。 96時間後、恒温器から管を取り出し、クールタ
ー（Coulter）計数管で、各々の細胞数を数える。
すべての値に40をかけ、各々の薬物希釈液に対し
て、４回測定値を平均する。もしその値が、接種
した細胞数より小さければ、100％抑制を示す。
その値が８つの対照値の平均よも大きければ、０
％の抑制を示す。他のすべての値には、次の式を
使用する。 処理培養液中の平均（細胞／ml）−接種細胞数（細
胞／ml）／対照培養液中の平均（細胞／ml）−接種細胞
数（細胞／ml）×100＝生存％ 100％−生存％＝処理による発育抑制 本発明の対照化合物は、標準組織培養法を使つ
て、代表的なRNAおよびDNAウイルスの両方の
複製を阻害することがわかつている。RNAウイ
ルスの場合、Ａ及びＢ特殊型の両方に属するイン
フルエンザウイルスのいくつかの菌株が、血球吸
養法により阻害されることがわかつた。インフル
エンザウイルス（Ａ型−USSR90）の複製を阻害
することがわかつた一連の化合物の中のいくつ
か、例えばNPT15392およびNPT15417は、１〜
150ｇ／mlの濃度範囲でインフルエンザウイルス
の少なくとも４種類の菌株の複製を阻害すること
がわかつた。 更に、その系統の中のいくつか、例えば
NPT15392は、DNAウイルスであり、致命的な
ヘルペス脳炎の他にヒトに重症の粘質皮膚障害を
招くウイルスである単純ヘルペスウイルスの複製
を阻害することが示された。この種のウイルスの
他のものは、ブタや牛の口蹄疫、ネコの伝染性の
鼻気管炎を、また犬のケンネルカフ（Kennel
cough）を招来する。NPT15392は、100μｇ／ml
の濃度以下でも、単純ヘルペスウイルスによつて
生じるプラーク形成を90％以上の程度まで減少さ
せることがわかつた。世の中の全疾患のうち少な
くとも25％はウイルスによるものであることがわ
かつている。さらに、腫瘍を誘発する多くのウイ
ルスが分離されている。この様に、抗ウイルス剤
というのは、それ自体、かなりの抗腫瘍性をもつ
ていることが期待される。 ウイルス〔インフルエンザウイルス、HSV、
フレンド（Friend）白血病ウイルス〕、バクテリ
ア、および真菌類のような、多くの感染源は、感
染に対する宿主の防御を弱めて、宿主に免疫抑制
状態をひきおこすという既定の事実がある。アラ
Ｃ（Ara Ｃ）のような他の抗ウイルス性代謝拮抗
物質のほとんどは、宿主の免疫防御機構を抑制
し、それによつて生物体自身の自然防御機構を減
少させ、二次感染を高める可能性が出てくる。 免疫促進作用物質や免疫調節物質は、抑制され
た免疫機能をもとにもどすか、正常な免疫機能を
高めるかどちらか、あるいはその両方を行う物質
である。免疫機能とは、液性（抗体が媒介してい
る）免疫、細胞性（胸腺細胞が媒介している）免
疫、あるいはマクロフアジーと顆粒球が媒介して
いる抵抗力の展開およびその表現として定義され
る。従つて、そのような薬物としては、必然的
に、免疫反応の表現に必要な細胞に直接作用を有
する物質、及び、細胞あるいは分子機構に作用し
て、その結果として免疫反応の表現に必要な細胞
の機能が、修飾されるような物質などがあげられ
る。免疫機能の増強は、免疫系に対する内因性あ
るいは外因性の負のフイードバツクの影響によつ
て生じる抑制機構をとりのぞくように物質が作用
することによつてももたらされるかもしれない。
このように免疫促進作用物質には、いくつかの作
用機序がある。免疫促進物質が作用する細胞側の
多様性あるいは生化学的機構の多様性という点が
あるにもかかわらず、それらの適用は、本質的に
は同じである：すなわち、宿主の抵抗性を増大す
るということである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 式 但しR₁は炭素数４−８のアルキル基を有する
   化合物。 ２ R₁がノルマルアルキル基である特許請求の
   範囲第１項記載の化合物。 ３ R₁が４ないし７個の炭素原子を有する特許
   請求の範囲第２項記載の化合物。 ４ R₁が４ないし６個の炭素原子を有する特許
   請求の範囲第２項記載の化合物。 ５ R₁がｎ−ヘキシル基である特許請求の範囲
   第４項記載の化合物。