JPH03131753A - 液体クロマトグラフィーによる試料の分析装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、液体クロマトグラフィーによる試料の分析方
法および分析装置に係り、特に試料を前処理し液体クロ
マトグラフィーを利用して成分分離する分析操作を自動
的に行うのに適した分析方法および分析装置に関する。

〔従来の技術〕

液体クロマトグラフは、溶液状態で成分を分離した後、
特定成分を選択的に分析できるのが特徴で、臨床検査の
分野においても重要な分析項目が多い。しかし、一方に
おいて分析手段が複雑で分析に時間がかかるものが多く
、それが臨床検査など多数の検体を限られた時間内で処
理しなければならないルチーンワークの業務における分
析検体数の増加をはばんでおり、この種の自動機の普及
が遅れている原因になっている。

このようなルチーンワークへの適用が遅れている分析項
目としてカテコールアミン類の分析やプロスタグランジ
ンの分析が挙げられる。カテコールアミン類は、細胞腫
、循環器、脳神経系、内分泌代謝などの異常やストレス
などの診断に有効性が認められ、成人病集団検診の場合
の重要項目として注目されている。また、プロスタグラ
ンジンは、多彩な生理活性を示すものであり、多くの種
類があるところから各成分を分離して定量することが必
要とされる。

これらの分析項目を液体クロマトグラフィーで分離分析
する場合には、試料と蛍光ラベル剤を反応させ、蛍光光
度計によって測定するのが一般的である。ラベル化の方
法としては、分離カラムによる成分分離の前にラベル剤
と反応させるプレラベル法と分離カラムによって成分分
離した後にラベル剤と反応させるポストラベル法が知ら
れているが、ポストラベル法では分離カラム溶出後の成
分の拡散が大となるので高感度検出が困難であり、生体
試料中の微量成分を測定する場合にはプレラベル法が有
利である。

カテコールアミン類をプレラベル法によってラベル化（
誘導体化）し、クロマトグラフィー分析する先行技術と
して、特開昭６１−８８１４８号および特開昭６０−１
４３７６６号に記載された方法が知られている。

この内、特開昭６１−８８１４８号では、試料にアルミ
ナを添加してアルミナにカテコールアミンを吸着させ、
吸着中にダンシル・クロリドを反応させてカテコールア
ミンを誘導体化している６次いでアルミナから誘導体化
された試料を脱着させ液を蒸発濃縮する。このようにし
て準備された試料を液体クロマトグラフの流路内へ注入
して成分分離し蛍光を検出する。

また、特開昭６０−１４３７６６号では、血漿や尿など
の生成試料を流路内に注入したあと、その流路内に３種
の反応試薬を次々と導入し反応コイル内を流通させなか
らカテコールアミンをラベル化（誘導体化）している。

このように処理した試料を濃縮カラムで捕捉濃縮した後
１分離カラムへ移送し成分分離して蛍光を検出する。

プロスタグランジンをプレラベル法によってラベル化し
、クロマトグラフィー分析する先行技術として、特開昭
６１−９２５９９号および特開昭５８−１０８４５７号
に記載された方法が知られている。

この内、特開昭６１−９２５９９号は、高速液体クロマ
トグラフィーを用いてプロスタグランジンを分析する場
合に、試料を蛍光ラベル化しておき、その後分離カラム
で成分分離し蛍光検出器で測定する方法があることを示
唆している。特開昭６１−９２５９９号にはこれ以上の
詳細な記載はない。

また、特開昭５８−１０８４５７号では、生体試料を逆
相分配クロマトグラフィーに付して得たプロスタグラン
ジン含有液を乾固した後、溶解してカルボキシル基用蛍
光プレラベル剤と反応させ、プロスタグランジンをエス
テル体にしている。このようにして準備された試料を液
体クロマトグラフの流路内へ注入して成分分離し、蛍光
検出器で測定する。

〔発明が解決しようとする課題〕

上述した先行技術の内、特開昭６１−９２５９９号はプ
レラベルの可能性を示唆しているだけにすぎず、特開昭
６１−８８１４８号および特開昭５８−１０８４５７号
による方法では、液体クロマトグラフの流路内に注入す
べき試料を準備するための操作に時間がかかり、且つ自
動化が困難なために臨床検査などのルチーンワークには
不向きである。

また、特開昭６０−１４３７６６号による方法では、ラ
ベル化反応を反応コイル内に試料を流通しながら行って
いるばかりでなく、試料の処理をすべて流路内で行って
おり、検体分析数は１時間に２検体程度である。このよ
うに単位時間当りの検体分析数が少ないのは、試料注入
から分離検出までの分析操作の全工程を終了した後に１
次の試料を注入する方式を採用していることに起因する
。

本発明の目的は、試料のラベル化反応を行っても多数の
試料を効率的に分析処理できる液体クロマトグラフィー
利用の分析方法および分析装置を提供することにある。

本発明の他の目的は、臨床検査などのルチーンワークに
も十分離使用できる処理能力が得られる分析方法および
分析装置を提供することにある。

〔課題を解決するための手段〕

上記目的を達成するために、本発明では、不要物除去カ
ラムもしくは濃縮用カラムが誘導体化された特定の試料
の処理を行っている間に、分離カラムにおいて上記特定
の試料より先行した試料の成分分離を行い、反応処理部
において上記特定の試料に後続する試料の誘導体化反応
を行うようにしたものである。

本発明を別の観点で述べれば、試料の前処理から分離検
出までの分析操作全体を三つの工程区分離分け、第１の
工程区分では試料と試薬とを混合して試料を前処理し、
第２の工程区分では前処理された試料を不要物除去カラ
ム内に捕捉し、第３の工程区分では上記不要物除去カラ
ムから送られた試料を分離カラムで成分分離し分離され
た成分を検出器で検出し、上記第１．第２および第３の
工程区分を並行して進めると共に、各試料につき上記第
１の工程区分から上記第３の工程区分までを順次行うよ
うに操作を進めるようにしたものである。

〔作用〕

物理的性質の似た複数成分が共存するカテコールアミン
類やプロスタグランジンのような物質を含む生体試料で
は、個々の成分をクロマトグラフィーで分離して測定す
ることが有効である。例えばカテコールアミン類では、
エピネフリン、ノルエピネフリン、ドーパミンなどが共
存しており、プロスタグランジンでは、トロンボキサン
チンＢ２プロスタグランジンＥ２，６−ケドプロスタグ
ランジンＰｓｉ、プロスタグランジンＥ１などが共存し
ているので、これらをクロマトグラフィー分離すれば個
々の成分濃度を求めることが可能となる。

しかし、カテコールアミン類やプロスタグランジンは、
そのままの状態では検出することが困難であるので、本
発明ではクロマトグラフィー分離カラムで成分分離する
前に、試料にラベル剤を反応させて誘導体化し、その後
検出精度を低下させないように夾雑物や過剰の反応試薬
などの不要物をプリカラムで除去し、次いで、誘導体化
されている試料を分離カラムを導入して成分分離し１分
離カラムからの流出物を検出器で検出する。例えば誘導
体化のために蛍光ラベル剤を用いる場合には、検出器と
して蛍光検出器を用い、被検成分が誘導体化によって得
た性質を検出に利用する６検出器はラベル化の態様によ
って吸光光度計や電導度検出器など種々のものから選択
される。

この方法では、各試料は誘導体化試薬との混合、誘導体
化反応の進行、プリカラムへの移送、成分分離、検出な
どの一連の処理を受ける。この一連の処理は、現状では
種々の工夫を施しても１０分以内の時間に短縮すること
が回置である。従って、先の試料に関する全体の分析操
作が終了したあとに次の試料に対する分析操作を開始し
たのでは、１時間に６検体を越える測定を行うことがで
きない。

そこで本発明では、試料の前処理から分離検出までの分
析操作全体を三つの工程区分離分け、それぞれの工程区
分離おいて試料を処理するようにして、効率化をはかっ
た。すなわち、中間の工程区分である第２の工程区分で
は、すでに誘導体化されている特定の試料をプリカラム
内で捕捉する処理がなされ、第３の工程区分では、上記
特定の試料より先行した試料に対して成分分離処理およ
び検出がなされ、第１の工程区分では、上記特定の試料
に後続する試料に対して誘導体化反応処理がなされるよ
うにした。

これにより、１時間に１０検体以上の分析処理が可能と
なり、臨床検査などのルチーンワークへの適用が可能と
なった。

これらの工程区分の境界は必ずしも画一的なものではな
く、誘導体化の反応条件や成分分離条件によって多少の
変更があり得る。

本発明の望ましい実施例では、試料の誘導体化反応の開
始は流路系外に配設された前処理装置で行われる。ここ
では、試料処理が容器内で実行される。すなわち、試料
と誘導体化試薬の混合は容器内でなされる。だから、試
料の誘導体化反応は液の流れのない状態もしくは試料が
拡散されない状態のもとで進められる。容器内での反応
が不十分である場合、あるいは時間的な制約の関係上、
試料と試薬を容器内へ混合した後その混合液試料を計量
管内へ導いてそこで反応を継続させることもできるが、
この場合も誘導体化反応は試料が拡散されない状態に保
たれた部屋の中で進められる。

試料と試薬の混合は、必ずしも撹拌動作を伴うものでは
なく、容器内に試料と試薬が添加されて共存していれば
よい。前処理装置における試料収容容器から反応容器も
しくは混合容器への分注作業および試薬収容容器から上
記反応容器もしくは混合容器への分注作業は、移動可能
なピペッティングノズルの動作によって達成することが
できる。

機構の単純化のためには、ピペッティングノズルは１本
であることが好ましい。

本発明の望ましい実施例では、プリカラムは分離カラム
よりも上流側に配置されている。このプリカラムには試
料の移送およびプリカラムの洗浄に供するための液が流
路切換弁を介して供給される。プリカラムは、不要物除
去カラムあるいは濃縮カラムと称されることがある。プ
リカラムに導入された試料は、移送洗浄液の供給によっ
て、測定精度を低下させる要因となる夾雑物や過剰試薬
などの不要物がプリカラムから排出され、被検物質が捕
捉される。この機能に着目した場合、プリカラムは不要
物除去カラムと称される。

プリカラムには１通常その試料収容容積よりも多い容積
の試料が供給される。供給試料量は、所定容積を有する
試料計量管によって定まる。反応処理された試料が移送
・洗浄液によりプリカラムに導入されると、被検物質が
プリカラム内に捕捉され、試料が流入する間蓄積される
。その後プリカラムへ溶離液が供給されると、プリカラ
ム内に捕捉された被検物質は脱離され分離カラムの方へ
移送される。プリカラムへ導入される試料容量よりもプ
リカラムから脱離されるときの試料液容量の方が少ない
ので、分離カラムへ導かれる試料は濃縮されたことにな
る。この機能に着目した場合、プリカラムは濃縮カラム
と称される。

本発明の望ましい実施例では、第２の工程区分の処理時
間の長さを基準として一定時間間隔で第２工程区分への
試料の受け入れ動作を繰り返す。

第１工程区分および第３工程区分の作業は、第２工程区
分と並行して試料処理（試料受入準備も含む）を進める
ように関係づけられる。

このように複数試料の並行処理を実現した結果、１検体
当りの平均分析時間を６分以内にすることが可能となり
、単位時間当りの検体分析数が増大される。

〔実施例〕

本発明の望ましい実施例では、第１工程区分が主として
オートサンプラ上で作業される。ここでは、試料の誘導
体化に必要な処理が施される。第２工程区分では、流路
内に配置されたプリカラムを中心として不要物除去およ
び試料の濃縮に伴う作業が行われる。第３工程区分では
、分離カラムによる試料の成分分離および検出が行われ
る。

この内、第２工程区分では、試料導入弁の計量管に注入
した試料を、弁を切換えて移送・洗浄液によりプリカラ
ムに輸送し濃縮と不純物除去を行った後、カラム切換弁
を切換えて溶離液により解離して分離カラムに移送し、
再びカラム切換弁を切り換えて前処理液をプリカラムに
流し次の試料を受け入れられる状態に復元させるまでで
一巡する。

分析操作は、第２工程区分の１サイクルの時間間隔で、
オートサンプラ上の試料の第１工程区分の作業を開始せ
しめ、連続して分析する複数の試料について前記第１．
第２．第３の工程区分の処理を並行して行なうことによ
り実行される。すなわち、第１の試料が第１工程区分の
作業を終了し第２工程の作業に移動すると、つぎの第２
の試料の第１の工程区分の作業が開始され、さらに第１
の試料が第２の工程区分の作業を終了し第３の工程区分
の作業に移行した時点で、つづく第２の試料が第２工程
区分の作業に移動し、さらに第３の試料の第１工程区分
の作業が開始されるというような手順で進行される。

以上の分析手順による本装置の分析処理時間は、最初の
一検体については前記第１〜第３の工程の合計の時間が
必要であるが、第２検体以後はプログラムの一サイクル
すなわち第２工程区分の所要時間の間隔で分析結果を得
ることが出来、連続分析における検体処理時間は著しく
短縮することが出来る。各工程区分の作業内容の細部は
必ずしも特定する必要はないが１分析プログラムが第２
工程区分の所要時間を１サイクルとした繰り返しプログ
ラムにより実行されるため、このプログラムの実行に適
するよう、各工程の時間配分を考慮して区分を決め、プ
ログラムを作成することが望ましい、且各工程区分の所
要時間は前記１サイクルの時間内であることが望ましく
、この場合は各工程区分毎に一検体ずつ並行処理を行な
うことにより分析を進行させることが出来る。しかし、
誘導体化反応は分析対象により時間がかかるなどのため
、前記１サイクルの時間より長い時間がかかる場合も生
じる可能性があり、この場合は複数の反応場所を設ける
などの方法により対処する０例えば、二倍近くの時間が
かかる場合は反応容器を２個設は交互に使用することに
より、１サイクル毎に一検体ずつの処理を行なうことが
できる。

第三サイクルは分離した成分の検知器を通過し測定が終
了するまでの時間が、前記１サイクルの時間内であるこ
とが要件であり、データの演算表示などの電気的処理は
必ずしも１サイクルに含まれる必要はない。

カテコールアミン類の誘導体化試薬としての蛍光ラベル
剤には、例えば１，２−ジフェニルエチレンジアミン（
ＤＰＥ）を用いることができ、準備される蛍光ラベル剤
溶液には、６０ｍＭのＤＰＥ　。

２ｍＭのフェリシアン化カリウム、４０％のアセトニト
リルなどが含まれる。またカテコールアミン類を分離す
るために分離カラムに供給される溶離液は、例えばアセ
トニトリルとメタノールと水溶液を５：２：４の割合で
含む液が使用される。

この場合水溶液には、５０ｍＭの硝酸リチウムと１０ｍ
Ｍのドデシル硫酸ナトリウムが含有されている。

プロスタグランジンの誘導体化試薬としての蛍光ラベル
剤には、モノダンジルカダベリン（ＭＤＣ）を用いるこ
とができる。準備される蛍光ラベル剤溶液には、６ｍＭ
のＭＤＣ１８６ｍＭのジエチルホスホロシアニテート（
ＤＥＰＣ）などが含まれる。またプロスタグランジンを
分離するための溶離液には、水とテトラヒドロフランと
アセニトリルからなる系の液を使用することができる。

蛍光検出器の励起波長は３４０ｎｍ、蛍光波長は５２０
ｎｍが好ましい。

本発明は、単一の分離カラムを用いる場合に適用できる
。この場合、分離カラムを複数本用いる場合に比べて機
構が簡素で済む。本発明が好適に適用される生体試料は
、血漿、血清、尿などである。

本発明を適用したカテコールアミン自動分析装置の例を
図面を参照して以下に説明する。

第１図は、カテコールアミン自動分析装置の全体構成を
示す概略図である。この装置は、各種容器や分注機構を
備えた前処理部２６と、流路系内で試料の濃縮動作や分
離動作を行う濃縮・分離部４４を有する。以下では、前
処理部２６を便宜上オートサンプラと称し、濃縮・分離
部４４を分析部と称する。

オートサンプラ２６のサンプラステージ２８には、サン
プルラック２７が装填される。サンプルラック２７は、
血漿試料を収容した複数の試料容器を保持している。ま
たサンプルラック２７には、蛍光ラベリング用の反応試
薬容器３０．内部標準液容器３１．標準サンプル容器３
２が配置されている。このオートサンプラ２６では、サ
ンプルステージ２８に近接した固定位置に、反応容器３
３゜ノズル洗浄槽３４．ドレインポート３５．注入ポー
ト３６が設けられている。

分注ノズル３８は、試料や試薬を反応容器３３へピペッ
ティングにより分注したり、反応した試料を反応容器３
３から注入ポート３６へ移す働きをする。駆動機構３７
はｘｙｚの駆動機能を有し、分注ノズル３８を縦横上下
自在に駆動して、前記サンプラ上の容器やポートの位置
に移動させることが出来る。分注ノズル３８の上端はプ
ラスチックチューブなどの細管３９により三方弁４０を
介して、分注ポンプ４１．および洗浄液槽４２に連結さ
れている。分注ポンプ４１はパルスモータ−で駆動され
るシリンジポンプを使用している。恒温ブロック８０は
反応容器３３の温度を所定の条件に保つために設けられ
ている。またサンプルステージ２８にはサンプルラック
２７上のサンプルや試薬を、分析中低温に保つよう冷却
装置が組込まれている。

分析部４４はサンプルの濃縮と不要物除去を行なうプリ
カラム流路系、サンプル成分の分離を行なう分離カラム
流路系、および測定演算部からなる。プリカラム流路系
では、液槽４５の移送・洗浄液がポンプ４６により一定
流速で送液され、試料導入弁４７を経由してプリカラム
４８に流れている。試料導入弁４７にはオートサンプラ
の注入ボート３６から注入されたサンプル液を所定量計
量して分析部に導入するための計量管４９が設けられて
いる。

分離カラム流路系では溶離液槽５０の溶離液がポンプ５
１により一定流速で装液され、カラム切換弁５２、を経
由して単一の分離カラム５３に流れている。カラム切換
弁５２を切換えることにより溶離液はプリカラム４８を
経由して流れ、プリカラム４８で処理されたサンプルを
分離カラム５３に移送する。測定演算部は分離カラム５
３から溶出するサンプル成分の蛍光強度を測定する蛍光
４廣計５４および測定結果の演算処理および表示を行な
うためのＡ／Ｄ変換部５５．制御部５６゜プリンター５
７．ＣＲＴ５８などからなり、蛍光光度計５４にはフロ
ーセル５９を有する。切換弁６０．６１はポンプ４６．
５１内の液を必要時にパージ出来るよう設けられている
。

本実施例による分析は、 （１）オーサンプラ上でのサンプルの蛍光ラベリング作
業。

（２）プリカラムによる濃縮および不純物除去作業、（
３）分離カラムによるサンプル成分の分離および測定、 の順序で行われる。第２図のフローチャートを参照して
次に一連の分析操作を説明する。

反閃産ｌ叉車 ステップ１０１の分析動作開示のあと、ステップ１０２
で反応容器３３が洗浄される。この際。

ノズル３８を反応容器３３の位置に移動し、ポンプ４１
を動作させ洗浄液槽４２からの洗浄液を反応容器へ注入
する。注入量は反応容器３３の容量より多量に注入し、
余剰の洗浄液はオーバーフローさせドレインポート３５
から排出管４３の方へ廃出させる。次いで、ノズル３８
を反応容器３３の底に降下させ容器内の洗浄液を吸いあ
げ、ノズル３８をドレインポート３５に移動させて吸い
上げた液を廃出する。この動作に先たち吸いあげた汚れ
た洗浄液がノズル内の新鮮な洗浄液に拡散しないよう予
めノズル３８の先端に若干量の空気を吸っておく必要が
ある。（吸引に先だち気泡を吸って境界を作っておく作
業は、後のサンプルや試薬を吸いあげる場にも必要であ
るが、説明が繁雑になるので以後の説明では省略する。

）以上の動作を複数回（例えば３回）繰り返すことによ
り反応容器３３の洗浄が終る。

丈λプ歩分圧 ステップ１０３では反応容器３３への試料（サンプル）
の分注が行われる。ノズル３８を内部標準液容器３１の
位置に移動し、降下させて所定量吸引し、ついで分析す
る試料容器２９の位置に移動し、所定量のサンプルを吸
引した後、ノズル３８を反応容器３３の位置に移動させ
、吸引保持されているサンプルと内部標準液を反応容器
３３に吐出分注する。内部標準液は、カラムの回収率の
変動などを補正するために使用される標準液で、本実施
例の場合はイソプロテレノールを標準物質として用いて
いる。

ノズル洗浄 ステップ１０４では、ノズル３８を洗浄する。

この場合、ノズル３８をドレインポート３５に移動し、
洗浄液を吐出して、内部標準液およびサンプルによるノ
ズルの内壁の汚れを洗い出した後、ノズルを洗浄槽３４
に移動して槽内に降下させ、洗浄液を吐出してノズル３
８の尖端外側を洗浄する。

ヌ１」はＵ【倉 ステップ１０５では反応容器３３へ試薬を加える。ノズ
ル３８を反応試薬の容器３ｏの位置に移動し、ノズル内
に誘導体化試薬を所定量吸引し、反応容器３３に注入し
先に注入されているサンプルおよび内部標準液と混合さ
せる。混合はこの他に、ノズル内に予め空気を吸引して
おき、容器内に挿入して空気を吐出する方法や、外部か
ら機械的または電気的に容器を振動させる方法などによ
り行うこともできるが、混合しやすい液体で且つ吐出量
が比較的多量であれば、高速度で吐出するだけで可能な
場合もある。

反−皮 ステップ１０６では、カテコールアミン類に対する蛍光
性物質への誘導体化が行われるように蛍光ラベリング反
応を開始させる。反応容器３３内におけるサンプルと誘
導体化試薬との混合液（以下サンプル液と称する）を、
一定温度に保温された反応容器３３内で所定時間放置し
て反応を進行させ、蛍光ラベリングを行う。

含量　へのサンプル゛、込 ステップ１０７では、反応容器３３内の反応液を計量管
４９内へ導入する。反応容器３３内で実質的に反応の終
了した誘導体化されたサンプル液をノズル３８内に吸引
し、ノズルを注入ポート３６へ移動してその中に挿入し
、試料導入弁４７を第１図の如き状態にして試料計量管
４９ヘサンプル液を注入する。計量管４９がサンプル液
で満たされた後試料導入弁４７を切換えると、切換弁４
７のポートに接続されている計量管４９は、流路６２と
流路６３の間に接続され、移送・洗浄液の流れにより所
定量のサンプル液がプリカラム４８へ移送される。

１−里 ステップ１０８では、プリカラム４８内への誘導体化さ
れたカテコールアミン類の捕捉と夾雑物や過剰試薬の除
去が行われ、同時にサンプル液の濃縮が行われる。移送
・洗浄液の流れによりプリカラム４８にサンプル液が導
入されると、プリカラム４８内にはサンプルが吸着捕捉
され蓄積される。このとき測定の妨害となる不要物であ
る夾雑物や過剰試薬がプリカラムを通過して排出口６４
を経て排出される。

並ｙ二υｌ創道 ステップ１０９では、不要物を除去されて捕捉されてい
るサンプルをプリカラム４８からａＳし、分離カラム５
３へ導く。第１図に実線図示の状態から破線の状態にカ
ラム切換弁５２を切換えると。

プリカラム４８は流路６５，６６の間に接続され、溶離
液はプリカラム４８を経由して流れ、プリカラム４８に
濃縮されたサンプルを解離して分離カラム５３に送り、
分離が開始される。全サンプルが流路６６に移動した時
点で、カラム切換弁５２を再び切換える（図示の実線状
態となる）と溶離液はプリカラム４８を経由せず直接分
離カラム５３に流れ、プリカラム４８には移送・洗浄液
が流れ始める。

分−且 ステップ１１０では、引きつづき溶離液を分離カラム５
３に流し、カテコールアミン類の成分分離が行われ、ノ
ルエピネフリン（ＮＥ）、エピネフリン（Ｅ）、ドーパ
ミン（ＤＡ）が成分バンドを形成して分離カラムから溶
出される。

プ辺ｉ５１蕗先 ステップ１１０のサンプル成分の分離と並行して、ステ
ップ１１１ではプリカラム４８に移送・洗浄液を流し、
つぎのサンプルを受入れられる状態に復元させる。

夾一定 ステップ１１２では、分離カラム５３からの溶出液が蛍
光光度計５４によって観測される。分離カラム５３によ
り分離され溶出したサンプル成分は順次、蛍光光度計５
４のフローセル５９に流れ、分離された各成分の蛍光強
度を検出し、演算処理して各成分の濃度を求める。

デニノｊＩＫ−沓Ｊ− ステップ１１３では、ステップ１１２で得たデータをプ
リンター５７、ＣＲＴ５８、などにより表示出力する。

ステップ１１４では、オートサンプラ２６上の試料がす
べて処理されたかどうかが判断され、まだ残っていれば
ステップ１０２に戻り、すべて処理されていればステッ
プ１１５に進んで装置の分析動作が終了する。

以上一検体についての分析手順を説明したが、つづいて
本発明に基づく多数検体連続処理の手順について説明す
る。第３図Ａおよび第３図Ｂにその分析プログラムの一
例を示す。

図の縦軸は、先に説明した分析フローチャートの作業内
容を工程１，２．３に区分して示している。第１工程は
主としてサンプルを誘導体化するだめのオートサンプラ
上での作業、第２工程はプリカラムによるサンプルの濃
縮作業、第３工程は分離カラムによるサンプル成分の分
離および測定の作業であり、各工程の境界区分はそれぞ
れの工程の時間配分がプログラム上適当になるように区
分されている。横軸は進行する分析プログラムのサイク
ル数と経過時間を示す。プログラムは１サイクル内で第
１．２．３各工程の作業がそれぞれ一巡するように組ま
れている。

第３図Ａはｎ番目の検体の分析する状態を中心に示した
ものである。実線太線がその状態を示す。

実線細線は（ｎ＋１）番目と（ｎ−１）番目の検体、鎖
線は（ｎ　−２）番目と（ｎ＋２）番目の検体の状態を
示している。第３図Ｂには切換弁の動作を示している。

試料導入弁４７の「計量」状態ａはサンプル液を注入ポ
ート３６から計量管４９に注入出来る状態すなわち、第
１図に図示された状態、「移送」状態すは弁が切換ねり
計量管４９がプリカラム流路に接続された状態を示す。

また。

カラム切換弁５２の「接続」状態Ｃはプリカラム４８が
分離カラム流路に接続された状態、「並行処理」状態ｄ
は切離されて移送・洗浄液が流れている状態すなわち第
１図実線で図示された状態を示す。各切換弁の動作も１
サイクル毎の繰り返し動作を行なう。

分析操作は、第１検体（１番目に分析する検体）の分析
を第１サイクルで開始し、つづいて１サイクル毎に順次
オートサンプラ上のサンプルの分析を開始させることに
より進行する。第３図Ａは第ｎサイクルから第（ｎ＋２
）サイクルにおける作業状態を示している。すなわち第
ｎサイクルに第ｎ検体（ｎ番目に分析する検体）の分析
が開始し、第１工程の作業が行われる。これと並行して
先に分析を開始している第（ｎ−１）検体の第２工程の
作業、および第（ｎ−２）検体の第３工程の作業が進ん
である。ついで第（ｎ＋１）サイクルにおいては、第ｎ
検体は第２工程の作業に進み、つぎの第（ｎ　＋　１　
）検体の第１工程の作業が開始される。これと並行して
第（ｎ−１）検体の第３工程の作業が行われている。さ
らに第（ｎ＋２）サイクルにおいては第ｎ検体の第３工
程の作業、第（ｎ＋１）検体の第２工程の作業が行われ
、つぎの第（ｎ＋２）検体の第１工程の作業が開始され
る。

以上説明した分析手順により、本装置の分析処理時間は
、一検体のみ分析する場合には第１．第２、第３工程の
合計時間すなわち３サイクルの時間が必要であるが、複
数の検体を連続して分析する場合は１サイクル毎に１検
体ずつ分析が出来る。

本実施例では１サイクルの時間が５分であるため。

−検体当りの処理時間は５分となる。

カテコールアミン類のクロマトグラフィーにおいては、
１時間に１０検体以上の処理能力を持つことが望ましい
ので、１サイクルの時間は、６分以内とされる。

第４図は、第１図の実施例のオー１−サンプラ２６の平
面図である。サンプルステージ２８上に着脱可能なサン
プルラック２７には、試料容器挿入ロア０、が横１０個
、縦５列の計５０個所マトリックス状に設けられており
、これに分析すべきサンプルを収容した試料容器が装填
されて配列される。サンプルラック２７上には、また反
応試薬３０、内部標準液３１．標準サンプル３２の直さ
場があり、さらに分析中緊急割込測定が出来るよう、緊
急検体容器挿入ロア１ａ、７１ｂ、７１ｃが設けられて
いる。またサンプルラック２７の側方には反応容器３３
．ノズル洗浄槽３４．ドレインポート３５．計量管４９
への注入ポート３６がそれぞれ固定の位置に設けられて
いる。分注ノズル３８は移動体３の軸４上を滑動し得る
保持部５に保持されており、駆動機構３７により縦、横
。

上下のＸ、Ｙ、Ｚ方向に自在に駆動され、上記各容器あ
るいはポートの位置に随時位置づけられ、必要な作業を
行なう。

分析操作は、上記分析すべきサンプルや試薬を配置した
サンプルラック２７をオートサンプラ２６のサンプルス
テージ２８に装着し、オペレータが操作パネル７７の分
析スタートスイッチを押すことにより開始される。

第５図Ａ、第５図Ｂは本実施例の装置の構成配置図であ
る。装置は縦形で分析に必要な各ユニットを全部組込ん
だ構成となっている。

装置は二段に仕切られ、上段にはオートサンプラ２６．
蛍光光度計５４．カラムパネル７２が配置されており、
カラムパネル７２にはプリカラム４８、分離カラム５３
．試料導入弁４７およびカラム切換弁５２が配置されて
いる。分離カラム５３は分析中の温度状態を一定に保つ
ため、恒温ブロック７３により温度制御されている。オ
ーサンプラ２６へのサンプルラック２７の装着、取出し
はカバー７４を開閉して行なう。蛍光光度計５４の上部
には、測定データを記憶しておくためのフロッピーディ
スク７５が組込まれている。

装置下段には、洗浄液槽４２．移送・洗浄液槽４５、溶
離液槽５０９分注ポンプ４１．移送・洗浄液送液用のポ
ンプ４６．溶離液送液用のポンプ５１が配置され、ここ
から装置上段の分析ユニットに必要な液体の送液が行わ
れる。なお装置の下段後部には電源や基板類などの電気
系７６が収められている。装置上面にはプリンタ５７．
ＣＲＴ５８および本装置による分析のための入力操作を
行なうための操作パネル７７が配置されている。

第６図に本実施例の制御系統図を示す。前記した本実施
例の装置による分析制御は、操作パネル７７からの入力
により制御部５６を中心に行われる。先ずパワースイッ
チをＯＮすると温度制御装置７８が動作すると共に、蛍
光光度計５４の光源が点燈する。つぎに分析準備のスイ
ッチをＯＮするとポンプ４６．ポンプ５１が送液を開始
する。

オートサンプラ２６にサンプルラック２７を装着した後
、分析開始スイッチをＯＮにすると、オートサンプラ２
６．試料導入弁４７．カラム切換弁５２が動作開始し、
第２図および第３図で説明した分析手順に従って分析操
作が行われる。測定結果は蛍光光度計５４からの信号を
Ａ／Ｄ変換器５５を経由して制御部内でデーター処理さ
れ、プリンタ５７を打出すと共にＣＲＴ５８に表示され
る。

第７図に本実施例の装置によるカテコールアミン類の分
析結果の一例を示す、各ピークに打出されでいる数値は
、リテンションタイムすなわち分離開始してから分離さ
れた各成分が検知器に到達するまでの時間を示す０本装
置においては分離開始はカラム切換弁５２を切換え、プ
リカラム４８内に濃縮されたサンプルの分離カラム５３
への移送を開始した時点からであり、最初の０．４８秒
のピークはプリカラムに満されていた移送液が分離され
溶出されるサンプルに先立って検知器を通過するために
検出されるピークである。つづいて。

ノルエピネフリン（ＮＥ）、エピネフリン（Ｅ）。

ドーパミン（ＤＡ）の順序で分離カラム５３により分離
されたサンプル成分が溶出し、最後に内部標準液として
添加された、内標準物質のイソプロテレ７″−ルが溶出
して検出される。各成分の濃度は、それぞれのピーク面
積から求める。

本分析例の場合は分離開始すなわちカラム切換弁５２の
切換後約４分強で目的の分離が終了している。すなわち
、この分祈例によると先に説明した５分１サイクル内で
の分離が可能である。

本装置ではルチーンワークで使用する場合の出力は検体
番号と分析した三成分の記号と濃度をプリンター５７に
打出し、第７図のようなりロマトグラムは必要によりＣ
ＲＴ表示やプリンター出方が出来るようになっている。

また本実施例ではプリカラムは１本となっているが、複
数のカラムを使用する場合もある。たとえば２本直列に
使用し、水溶性不純物の除去と疎水性不純物の除去を分
業させる方法などがある。

第８図および第９図に誘導体化の具体的な反応の変形例
を示す。

第８図に示す第１の変形例は１反応容器を２個設ける方
法である。すなわちオートサンプラ上に２個の反応容器
７９ａ、７９ｂを設け、各容器は恒温ブロック８０によ
り保温され、また洗浄の際にオーバーフローする洗浄液
はドレインポート８１に流れる構造となっている。この
方式は反応に時間がかかるなどの理由により、オートサ
ンプラ上の誘導体化の作業、すなわち前記第一工程が、
ｌサイクルの時間よりも長くかかる場合に用いられる。

すなわち１サイクルの時間間隔で２個の反応容器に交互
にサンプルと試薬を分注し反応を進行させることにより
、１サイクル毎に一検体ずつの処理を終らせることが出
来る。ただし作業時間が１サイクルの２倍以上になれば
さらに反応容器の数を増加させる必要がある。

第９図に第２の変形例は試料導入弁の計量管内で反応を
進める例である。オートサンプラ上の容器８２はサンプ
ルと試薬を混合させる混合容器として使用し、混合によ
って反応開始された反応液を分注ノズル３８を用いて注
入ポート３６から計量管８３に注入し、ここで液が流通
しない状態で一定時間放置し反応させる。この場合、計
量管８３は恒温ブロック８４により所定の温度に保持さ
れ、また反応中、液が移動しないよう、出口流路に停止
弁８５が設けである。この方式は反応時間が試料導入弁
４７の動作間隔により決まるので、長時間の反応には採
用できないが、計量管８３が合成樹脂チューブなどをコ
イル状に巻いて作られているので、温度制御がしやすく
、また場所的にも自由度があり、例えば分離カラムの恒
温ブロックと一体化出来るなどの利点がある。

第１０図Ａおよび第１０図Ｂは、第９図の第２変形例に
おけるプログラム例である。工程１は誘導体化のための
オートサンプラ上での作業、工程２はプリカラムによる
濃縮作業、工程３は分離カラムによる分離、測定の作業
に大別されているのは前記実施例の第３図のプログラム
と同じであるが、各工程の区分の境界は多少異なってい
る。すなわち本プログラムでは、サンプル液を試料導入
弁４７の計量管８３に注入するまでが第１工程となって
おり、計量管内での反応開始から＠２工程となり、また
、プリカラムによるサンプルの濃縮で第２工程が終り、
分離カラムへのサンプルの移送から第３工程が始まるよ
うプログラムが組まれている。このように、第９図、第
１０図の例でも分析作業を、オートサンプラ、プリカラ
ム、分離カラムの作業に大別し、繰り返しプログラムに
より連続して分析する検体についてそれぞれの作業を並
行して行わせることができる。

以上の変形例はいずれも反応場所を固定して設ける例で
あるが、それ以外の例として使い捨ての容器を使用する
方法がある。すなわちオートサンプラ上にサンプルの数
と同数の反応用容器を配列しておき、−検体毎に一個の
反応容器を用いて反応を行なわしめる方法である。この
方法は反応容器をいちいち洗浄する必要がなく、また反
応に長い時間がかかる場所にも、複数の反応容器に時間
差おいて順次サンプルと試薬を分注することにより、前
記１サイクルの時間間隔で、誘導体化したサンプル液を
分析部に送ることが出来るのが利点である。しかしサン
プル数と同数の反応容器が必要なためオートサンプラが
大きくなるという欠点がある。

以上本発明の実施例としてカテコールアミン自動分析装
置の例につき説明したが１本発明の適用範囲は必ずしも
この実施例の範囲内に限られるものでない。すなわち分
析対象は、カテコールアミン以外にも例えばアミン酸、
胆汁酸、グアニジンなど、各種の物質の分析に適用出来
る。また誘導体化の方法と使用する検出器についても必
ずしも蛍光光度法に限らず、酵素活性やＵＶ活性法によ
り紫外あるいは可視の光度計を用いて測定する方法など
も適用できる。さらに誘導体化を行わしめる具体的な方
法すなわち、反応場所や作業手順、およびプログラムの
構成なども各種の変形例が考えられる。

〔発明の効果〕

本発明は、試料の誘導体化やプリカラムによる試料濃縮
処理を含むような従来がら長い分析時間を要していた液
体クロマトグラフィーを適用した自動分析装置の分析処
理時間を著しく短縮でき。

例えば病院における臨床検査などのルチーンヮークの業
務を自動化できるなどその効果は大きい。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の一実施例の全体構成を示す概略図、第
２図は第１図の実施例における分析操作のフローを示す
図、第３図Ａおよび第３図Ｂは第１図の実施例における
各部の動作タイミングを示す動作プログラム例の図、第
４図は第１図におけるオートサンプラの平面図、第５図
Ａは第１図の装置の正面外観図、第５図Ｂは第５図Ａの
側方から見た配置概念図、第６図は第１図の装置の制御
系統図、第７図はカテコールアミン類の分析結果を示す
図、第８図は第１変形例の要部を示す概略構成図、第９
図は第２変形例の要部を示す概略構成図、第１０図Ａお
よび第１０図Ｂは第９図を適用した装置における各部の
動作タイミングを示す動作プログラム例の図である。 ２６・・・オートサンプラ、２９・・・試料容器、３０
・・・反応試薬収容容器、３３．７９ａ、７９ｂ・・・
反応容器、３６・・・注入ボート、３８・・・分注ノズ
ル。 ４７・・試料導入弁、４８・・・プリカラム、４９゜８
３・・・計量管、５２・・・カラム切換弁、５３・・・
分離カラム、５４・・・蛍光光度計、５６・・・制御部
、８２第 図 第 図 第３図Ａ 第３図Ｂ 第 ４ 図 第 図 第 図 螢光強度 第 図 第 図

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、濃縮用カラムが誘導体化された特定の試料の処理を
   行つている間に、分離カラムにおいて上記特定の試料よ
   り先行した試料の成分分離を行い、反応処理部において
   上記特定の試料に後続する試料の誘導体化反応を行うこ
   とを特徴とする液体クロマトグラフィーによる分析方法
   。 ２、請求項第１項記載の分析方法において、上記誘導体
   化反応は、分注装置によつて容器内に試料およびラベル
   化試薬を供給して混合せしめることにより上記容器内で
   反応開始されるものであることを特徴とする液体クロマ
   トグラフィーによる分析方法。 ３、請求項第１項記載の分析方法において、上記誘導体
   化反応は、試料および誘導体化試薬を受け入れる容器と
   、この容器内の液が導入される計量管内とにおいて進行
   されることを特徴とする液体クロマトグラフィーによる
   分析方法。 ４、試料の前処理から分離検出までの分析操作全体を三
   つの工程区分に分け、第１の工程区分では試料と試薬と
   を混合して試料を前処理し、第２の工程区分では前処理
   された試料を不要物除去カラム内に捕捉し、第３の工程
   区分では上記不要物除去カラムから送られた試料を分離
   カラムで成分分離し分離された成分を検出器で検出し、
   上記第１、第２および第３の工程区分を並行して進める
   と共に、各試料につき上記第１の工程区分から上記第３
   の工程区分までを順次行うように操作を進めることを特
   徴とする液体クロマトグラフィーによる分析方法。 ５、請求項第４項記載の分析方法において、上記試料は
   カテコールアミン類を含む試料であり、上記試薬はカテ
   コールアミン類を誘導体化する試薬であり、上記検出器
   は蛍光検出器であることを特徴とする液体クロマトグラ
   フィーによる分析方法。 ６、試料の前処理から分離検出までの分析操作全体を三
   つの工程区分に分け、第１の工程区分では試料と試薬を
   混合して試料を前処理し、第２の工程区分では前処理さ
   れた試料をプリカラム内に捕捉し、第３の工程区分では
   上記プリカラムから送られた試料を分離カラムで成分分
   離して検出器で検出し、上記第２の工程区分および上記
   第３の工程区分の動作をそれぞれ６分以内の時間で行う
   ことを特徴とする液体クロマトグラフィーによる分析方
   法。 ７、請求項第６項記載の分析方法において、上記第１、
   第２および第３の工程区分は並行して動作されることを
   特徴とする液体クロマトグラフィーによる分析方法。 ８、誘導体化した試料を不要物除去カラムによつて捕捉
   し、捕捉した試料を分離カラムに移送して成分分離する
   液体クロマトグラフィーによる分析装置において、試料
   および誘導体化試薬を容器内で混合して誘導体化反応を
   開始させる前処理装置と、流路切換弁および不要物除去
   カラムを備えており上記前処理装置から受け入れた試料
   を上記流路切換弁を通つて供給される移送用液によつて
   上記不要物除去カラムに導き不要物を排出し試料を捕捉
   する捕捉手段と、上記捕捉装置から受け入れた試料を分
   離カラムによつて成分分離し検出器によつて検出する分
   離検出手段とを設け、上記前処理装置と上記捕捉手段と
   上記分離検出手段の動作が、並行して試料を処理するよ
   うに関連づけられていることを特徴とする液体クロマト
   グラフィーによる分離装置。 ９、試料および誘導体化試薬を容器内へ移送すると共に
   上記容器内から試料計量管の方へ上記誘導体化試薬が混
   合された試料を引き渡す前処理手段と、混合された試料
   中の不要物を不要物除去カラムによつて除去する不要物
   除去手段と、上記不要物除去カラムから移送された試料
   を成分分離する分離カラムと、上記不要物除去手段が試
   料受入れおよび上記分離カラムへの試料引渡しの動作を
   繰返すように動作制御し、上記不要物除去手段の１サイ
   クルの動作が行われている間に上記前処理手段が上記容
   器への試料および試薬の移送動作を行うように動作制御
   する制御手段と、を設けたことを特徴とする液体クロマ
   トグラフィーによる分析装置。 １０、請求項第９項記載の分析装置において、上記試料
   計量管と上記不要物除去カラムの間に流路切換弁を設け
   、上記試料計量管内に上記混合された試料が引き渡され
   てから所定時間経過後に上記試料計量管内の試料が上記
   不要物除去カラムへ導かれるように上記流路切換弁を動
   作せしめることを特徴とする液体クロマトグラフィーに
   よる分析装置。