JPH03252555A - 生体試料の分析方法および分析装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、生体試料の分析方法および分析装置に係り、
特に被検成分を誘導体化した後に成分分離する分析方法
および分析装置に関する。

〔従来の技術〕

液体クロマトグラフは、溶液状態で成分を分離した後、
特定成分を選択的に分析できるのが特徴で、臨床検査の
分野においても重要な分析項目が多い。しかし、一方に
おいて分析手段が複雑で分析に時間がかかるものが多く
、それが臨床検査など多数の検体を限られた時間内で処
理しなければならないルチーンヮークの業務における分
析検体数の増加をはばんでおり、この種の自動機の普及
が遅れている原因になっている。

このようなルチーンワークへの適用が遅れている分析項
目としてカテコールアミン類の分析やグリコヘモグロビ
ンの分析が挙げられる。これらの分析項目を液体クロマ
トグラフィーで分離分析する場合には、試料と誘導体化
用蛍光ラベル剤を反応させ、蛍光光度計によって測定す
るのが一般的である。ラベル化の方法としては、分離カ
ラムによる成分分離の前にラベル剤と反応させるプレラ
ベル法と分離カラムによって成分分離した後にラベル剤
と反応させるポストラベル法が知られているが、ポスト
ラベル法では分離カラム溶出後の成分の拡散が大となる
ので高感度検出が困難であり、生体試料中の微量成分を
測定する場合にはプレラベル法が有利である。

カテコールアミン類をプレラベル法によってラベル化（
誘導体化）し、クロマトグラフィー分析する先行技術と
して、特開昭６１−８８１４８号、特開昭６０−１４３
７６６号および特開平１−１２６５４４号に記載された
方法が知られている。

この内、特開昭６１−８８１４８号では、試料にアルミ
ナを添加してアルミナにカテコールアミンを吸着させ、
吸着中にダンシル・クロリドを反応させてカテコールア
ミンを誘導体化している。次いでアルミナから誘導体化
された試料を脱離させ液を蒸発濃縮する。このようにし
て準備された試料を液体クロマトグラフの流路内へ注入
して成分分離し蛍光を検出する。

特開昭６０−１４３７６６号では、生体試料を流路内に
注入したあと、第１反応部においてフェリシアン化カリ
ウム溶液と反応させ、次に第２反応部においてアスコル
ビン酸溶液と反応させ、続いて第３反応部において水酸
化ナトリウム溶液と反応させてカテコールアミンをトリ
ヒドロキシインドールに変換している。その後生成され
たトリヒドロキシインドールを含む液を酸性の緩衝液で
濃縮用逆相カラムへ導いて濃縮した後、分離カラムで成
分分離して蛍光分析する構成が示されている。

さらに、特開平１−１２６５４４号では、生体試料をイ
オン交換樹脂からなる吸着剤を充填した吸着カラムへ導
き、酸性状態でカテコールアミンを吸着させ、次に吸着
カラムに誘導体化試薬を供給してカテコールアミンを吸
着させた状態のまま誘導体化している。続いて吸着カラ
ムを弱酸性の調整液で洗浄して分解成分等を排出し、そ
の後中性の脱着液を吸着カラムに導入してカテコールア
ミンの吸着状態を解除して分離カラムに導き、成分分離
して蛍光測定することが示されている。

一方、カテコールアミンをプレラベル化せずに濃縮だけ
を行って分離分析することが特開昭５５−５１３５４号
に示されている。この先行技術では、試料を濃縮カラム
に注入してカテコールアミンを吸着させ濃縮したあと、
吸着されているカテコールアミンを酸性緩衝液を用いて
濃縮カラムから脱離し、分離カラムで成分分離してカテ
コールアミンの自己蛍光を検出している。この特開昭５
５−５１３５４号では、濃縮カラムをカテコールアミン
の濃縮だけのために用いており、吸着用充填剤として硼
酸を含有するグリコールゲルが好ましいと指摘している
。

〔発明が解決しようとする課題〕

上述した先行技術の内、特開昭６１−８８１４８号によ
る方法では、液体クロマトグラフの流路内に注入すべき
試料を準備するための操作に時間がかかり、且つ自動化
が困難なために臨床検査などのルチーンワークには不向
きである。

また、特開昭６０−１４３７６６号による方法では、ラ
ベル化反応を３種類の反応コイル内に試料を流通しなが
ら行うので構造が複雑であり、また分析結果の再現性も
良好ではない。特開平１−１２６５４４号による方法で
は、生体試料中の蛋白質等の妨害成分による影響を排除
する点に難点があり、誘導体化反応を再現性良く行わせ
ることが困難である。

また、特開昭５５−５１３５４号はカテコールアミンの
自己蛍光を測定するものであるため高感度測定が困難で
ある。

また、プレラベルは高感度化の方法として近年多用され
ているが、目的とする反応以外に副反応が発生したり、
共存する成分による反応の妨害といった問題がある。

本発明の目的は、被検生化学成分をクロマトグラフィー
分離する前に誘導体化する場合であっても、被検生化学
成分の分解を低減して高い再現性を有する測定結果を得
ることができ、被検生化学成分含有量が微量であっても
高感度測定できる生体試料の分析方法および分析装置を
提供することにある。

〔課題を解決するための手段〕

本発明に基づく生体試料の分析方法では、前処理カラム
としてフェニル硼酸を導入した親水性ゲルを充填したも
のを用い、この前処理カラムを成分吸着と誘導体化反応
に利用する。この分析方法の操作では、前処理カラムへ
生体試料を供給し、被検生化学成分を吸着せしめること
、上記前処理カラム内に上記被検生化学成分が吸着され
ている状態で上記前処理カラム内を誘導体化試薬液で満
たすこと、上記前処理カラム内における液の流れを停止
させた状態で上記前処理カラム内の被検生化学成分と誘
導体化試薬を反応させ、誘導体化反応に伴って上記被検
生化学成分を上記充填剤から吸着解除せしめること、誘
導体化された生化学成分を含む液を上記前処理カラムか
ら分離カラムへ移送すること、および上記分離カラムに
よって上記誘導体化された生化学成分を分離すること、
を特徴とする。

本発明に基づく生体試料の分析装置は、生体試料を分析
し得るように構成された液体クロマトグラフから成り、
上述の分析方法を実行し得るように構成されている。

〔作用〕

本発明は、生化学成分特にカテコールアミンを特定の前
処理カラムに吸着させておいて特定の誘導体化試薬を作
用させると、その生化学成分の分解がそれほど促進され
ずに誘導体することができることを発明者らが見い出し
たことに基づいている。

本発明において用いられる前処理カラムは、フェニル硼
酸を導入した親水性ゲルが固定相充填剤として充填され
ている。この前処理カラムにおける生化学成分の吸着お
よび誘導体化反応について第３図の模式図を参照して説
明する。第３図（ａ）は吸着現象を示しており、第３図
（ｂ）は誘導体化反応を示している。

第３図（ａ）において、親水性ゲル母材２０１にはフェ
ニル硼酸２０２が導入されている。このような充填剤を
充填した前処理カラム内の液性を弱アルカリ性（ｐＨ８
〜９）に保ち、カテコールアミンの如き生化学成分を含
む生体試料を導入すると、カテコールアミン２０４は充
填剤に吸着される。すなわち、フェニル硼酸２０２の水
酸基とカテコール核のシス−ジオール（Ｃｉｓ　−Ｄｉ
ａｌ　）がキレートを形成することによって、カテコー
ルアミンが充填剤に固定化される。

しかしながら、生体試料（例えば血清、尿）中の蛋白質
、アミノ酸およびペプチドの大部分はシス−ジオールを
有していないので、充填剤への吸着が行われない、だか
ら、前処理カラムに弱アルカリ性の前処理液を生体試料
の導入に続いて所定時間流すことにより吸着されなかっ
た成分を前処理カラムから排出することができる。つま
り、シス−ジオールを有する生化学成分が選択的に前処
理カラムにトラップされ、被検成分の誘導体化反応を阻
害する成分が前処理カラムから除去される。

一般にカテコールアミンのような生化学成分は時間経過
に伴って分解が進むが、分解されやすい官能基が吸着の
際に充填剤と結合されるので、結果として官能基を分解
から保護することができる。

前処理カラムから反応妨害成分を排出した後、生化学成
分を吸着している前処理カラムに誘導体化試薬液を供給
する。第３図（ｂ）では誘導体化試薬として蛍光試薬で
ある１、２−ジフェニルエチレンジアミン（ＤＰＥ）２
０５を例示しである。

前処理カラム内が誘導体化試薬液で満たされると、直ち
に送液ポンプを停止したり流路を弁で閉塞することによ
って前処理カラム内の液の流れを停止させる。これによ
り誘導体化反応が開始されるが、このときの前処理カラ
ム内の液性は中性（ｐＨ６，５〜７．５）である。

吸着されていたカテコールアミンは、ＤＰＥと縮合閉環
反応をし、誘導体化生成物２０６となる。

この反応に伴い、カテコールアミンは充填剤から拘束を
解かれ離脱される。それ故、誘導体化反応の間、前処理
カラム内の液を流出させないように維持する。誘導体化
生成物２０６がフリーとなるのは、ＤＰＥとカテコール
アミンとの結合の安定度定数が、充填剤へのカテコール
アミンの吸着の安定度定数よりも高いからと考えられる
が明らかではない、前処理カラムを３０〜６０℃の温度
に維持すれば、所定時間後（１０分以内）に誘導体化反
応を完了させることができる。

次に、前処理カラムと分離カラムを連通し、溶離液又は
前処理液を送液して誘導体化された生化学成分を分離カ
ラムへ導入する。分離カラムには、好ましくは逆相型充
填剤を充填したものが用いられる。溶離液の供給に伴い
分離カラムによってクロマトグラフィー分離された成分
は、検出器（例えば蛍光検出器）によって検出される・
〔実施例〕 カテコールアミン類の誘導体化試薬としての蛍光ラベル
剤には、例えば１，２−ジフェニルエチレンジアミン（
ＤＰＥ）を用いることができ、準備される蛍光ラベル剤
溶液には、６０ｍＭのＤＰＥ。

２ｍＭのフェリシアン化カリウム、４０％のアセトニト
リルなどが含まれる。この誘導体化試薬液の液性は中性
（ｐＨ６，５〜７．５）である。またカテコールアミン
類を分離するために分離カラムに供給される溶離液は、
例えばアセトニトリルとメタノールと水溶液を５：２：
４の割合で含む液が使用される。この場合水溶液には、
０．１Ｍのリン酸水素ナトリウムと１０ｍＭのドデシル
硫酸ナトリウムが含有されている。この溶離液の液性は
酸性（例えばｐＨ３，０）である。

本発明を適用した分析装置に採用される前処理カラムに
は、フェニル硼酸を導入した親水性ゲルからなる充填剤
が充填される。この固定相充填剤は好ましくはポリマー
ゲルがよいが、これに限定されるものではなく、シリカ
ゲルでもよい。また分離カラムには逆相型充填剤（例え
ばシリカ−０ＤＳなど）が充填される。カテコールアミ
ンのような被検生化学成分を前処理カラムに吸着させ、
かつアルブミン、グロブリン、アミノ酸等を排出させる
ために前処理カラムに流す前処理液としては、弱塩基性
（ｐＨ８〜９）の緩衝液が用いられる。

本発明を適用したカテコールアミン自動分析装置の例を
図面を参照して以下に説明する。

第１図は、カテコールアミン自動分析装置の全体構成を
示す概略図である。この装置は、各種容器や分注機構を
備えたオートサンプラ２６と、流路系内で試料の濃縮動
作や分離動作を行う濃縮・分離部４４を有する。以下で
は、濃縮・分離部４４を便宜上分析部と称する。

オートサンプラ２６のサンプルステージ２８には、サン
プルラック２７が装填される。サンプルラック２７は、
血漿試料を収容した複数の試料容器を保持している。ま
たサンプルラック２７には、蛍光ラベリング用の誘導体
化試薬容器３０．内部標準液容器３１．標準サンプル容
器３２が配置されている。このオートサンプラ２６では
、サンプルステージ２８に近接した固定位置に、混合容
器３３、ノズル洗浄槽３４．ドレインポート３５゜注入
ポート３６が設けられている。

分注ノズル３８は、試料や試薬を注入ポート３６へ移す
働きをする。駆動機構３７はｘ、ｙ。

Ｚ方向の駆動機能を有し、分注ノズル３８を縦横上下自
在に駆動して、前記サンプラ上の容器やポートの位置に
移動させることが出来る。分注ノズル３８を保持してい
るスライダ５は横移動をもたらす。分注ノズル３８の上
端はプラスチックチューブなどの細管３９により三方弁
４０を介して。

分注ポンプ４１、および洗浄液槽４２に連結されている
６分注ポンプ４１はパルスモータ−で駆動されるシリン
ジポンプを使用している。またサンプルステージ２８に
はサンプルラック２７上のサンプルや試薬を、分析中低
温に保つよう冷却装置が組込まれている。

分析部４４はサンプルの濃縮と蛋白質などの不要物除去
を行なう前処理カラム流路系、サンプル成分の分離を行
なう分離カラム流路系、および測定演算部からなる。前
処理カラム流路系では、前処理液槽４５の前処理液がポ
ンプ４６により一定流速で送液され、試料導入弁４７を
経由して前処理カラム４８に流れている。試料導入弁４
７にはオートサンプラの注入ポート３６から注入された
サンプル液を所定量計量して分析部に導入するための計
量管４９が設けられている。

分離カラム流路系では溶離液槽５０の溶離液がポンプ５
１により一定流速で送液され、流路切換弁５２を経由し
て単一の分離カラム５３に流れている。流路切換弁５２
を切換えることにより溶離液は前処理カラム４８を経由
して流れ、前処理カラム４８で誘導体化された生化学成
分を含む液を分離カラム５３に移送する。測定演算部は
分離カラム５３から溶出するサンプル成分の蛍光強度を
測定する蛍光光度計５４および測定結果の演算処理およ
び表示を行なうためのＡ／Ｄ変換部５５゜制御部５６．
プリンター５７．ＣＲＴ５８などからなり、蛍光光度計
５４はフローセル５９を有する。切換弁６０．６１はポ
ンプ４６．５１内の液を必要時にパージ出来るよう設け
られている。前処理カラム４８は恒温装置４３により３
０〜６０℃の内の所定温度に維持され、安定した誘導体
化反応を行い得るように構成される。

第４図に、第１図の分析装置における制御系統図を示す
。分析制御は、操作パネル７７からの入力により制御部
５６を中心に行われる。先ずパワースイッチをＯＮする
と温度制御装置７８が動作すると共に、蛍光光度計５４
の光源が点灯する。

つぎに分析準備のスイッチをＯＮするとポンプ４６、ポ
ンプ５１が送液を開始する。オートサンプラ２６にサン
プルラック２７を装着した後、分析開始スイッチをＯＮ
にすると、オートサンプラ２６、試料導入弁４７．流路
切換弁５２が動作開始し、所定の分析手順に従って分析
操作が行われる。測定結果は蛍光光度計５４からの信号
をＡ／Ｄ変換器５５を経由して制御部内でデータ処理さ
れ、プリンタ５７に打出すと共にＣＲＴ５８に表示され
る。

第１図の分析装置による分析操作は、（１）オートサン
プラ上で生体試料を分注ノズル内に採取し。

その採取した試料を計量管内に注入する工程、（２）前
処理カラムに計量管内の試料を緩衝液で移送し、被検生
化学成分を前処理カラムに吸着させると共に、前処理カ
ラムに緩衝液を流して蛋白質等を排出し、その後前処理
カラムに誘導体化試薬液を供給して生化学成分の誘導体
化を行う工程、（３）誘導体化された生化学成分を分離
カラムで分離し、各成分を測定する工程、の順序で行わ
れる。

これらの三つの工程は並行して行われ、各工程において
異なったタイミングで流路内に導入される試料に対して
順次実行される。

第１図の分析装置による分析操作を第２図のフローチャ
ートを参照して説明する。

土２ｊ五肛１ 分析動作が開始されると、ステップ１０１において分注
ノズル３８による試料分注動作が行われる。分注ノズル
３８を次に分析すべき試料容器２９の位置に移動し、分
注ノズル内に所定量のサンプルを吸入保持した後、ノズ
ル３８を注入ポート３６の位置へ移動する。試料導入弁
４７を第１図に図示の状態にしておきノズル３８からサ
ンプル液を押し出して試料計量管４９内へ注入する。サ
ンプルに内部標準液を混合させたい場合には、混合容器
をサンプルステージ２８上に設けておき、所定量のサン
プルと内部標準液を分注ノズル３８で一旦混合容器内に
移し混合させておき、その混合容器から注入ポート３６
へ分注ノズル３８によって混合液を注入するように動作
させる。標準物質としてはイソプロテノールを用いるこ
とができる。

スス五史吏 ステップ１０２では、ノズル３８を洗浄する。

この場合、ノズル３８をドレインポート３５に移動し、
洗浄液（通常は純水）を吐出して、サンプルによるノズ
ルの内壁の汚れを洗い出した後、ノズルを洗浄槽３４に
移動して槽内に降下させ、洗浄液を吐出してノズル３８
の先端外側を洗浄する。

廃液はドレイン８０から排出される。

前　環カラムへのサンプル　人 ステップ１０３では、計量管４９内の生体試料を前処理
カラム４８へ供給する。計量管４９がサンプル液で満た
された後試料導入弁４７を切換えると、切換弁４７のポ
ートに接続されている計量管４９は、流路６２と流路６
３の間に接続され、弱アルカリ性の前処理液（ｐＨ８，
７）の流れにより所定量のサンプル液が前処理カラム４
８へ移送される。前処理カラムの大きさは、内径４０ｍ
。

長さ３０■である。

゛　　・　、蛋　・　製 ステップ１０４では、前処理カラム４８において生体試
料中のカテコールアミンの吸着捕捉が行われ、除蛋白が
行われる。前処理液槽４５からの前処理液は、計量管４
９内のサンプル液をすべて前処理カラム４８へ送り終っ
た後も引き続き前処理カラム４８に送液される。前処理
液を流し続ける時間は約１０分間である。この間に、カ
テコールアミンは吸着捕捉され前処理カラム内に蓄積さ
れて濃縮される。同時に、測定の妨害となる蛋白質成分
や誘導体化反応阻害成分を前処理液の流れによってドレ
イン６４から系外へ排出する。

前処理液は、送液ポンプ４６により１ｍＱ／ｗｉｎの流
量で送液される。前処理液は、０．２Ｍのリン酸水素二
アンモニウムと１０ｍＭのＥＤＴＡを含むｐＨ８，７の
緩衝液からなる。前処理カラム４８内の充填剤母材に結
合されているフェニル硼酸は弱アルカリ性の液性では負
に荷電しており、硼酸の水酸基とカテコール核のシス−
ジオールがキレートを形成して吸着が生じる。一方、ア
ルブミン、グロブリン等は充填剤に吸着されないので、
前処理カラム４８から排出され、吸着されたカテコール
アミンが精製される。このような吸着によりカテコール
アミンの官能基は保護される。

Ｋ東分圧 ステップ１０５では、サンプルラック２７上の誘導体化
試薬液を計量管４９内に採取する。サンプルラック２７
上に設置された試薬容器３０内には、６０ｍＭの１，２
−ジフェニルエチレンジアミンと２ｍＭのフェリシアン
化カリウムと４０％のアセトニトリル（ＣＨｓＣＮ）を
含む誘導体化試薬溶液が収容されており、この試薬溶液
はｐＨ７，０に調製されている。

分注ノズル３８は、制御部５６からの制御信号に基づき
試薬容器３０上に移動され、その試薬容器３０内に降下
されて分注ポンプ４１の吸入動作により分注ノズル３８
内に所定量の誘導体化試薬液を吸入保持する。続いて分
注ノズル３８は注入ポート３６の位置に移動され、分注
ポンプ４１の押出動作により注入ポート３６から流路系
内へ保持していた試薬液を押し出し、容量２００μΩの
計量管４９内を誘導体化試薬液で満たす、このときの試
料導入弁４７の状態は第１図に図示の状態である。

ｌ夷彬似反夏 ステップ１０６では、被検生化学成分の誘導体化反応が
前処理カラム４８内で行われる。前処理カラム４８は、
温度制御された恒温ブロック４３によって常時５０℃に
保たれている。第１図に図示の状態から試料導入弁を角
度６０度回転すると流路の接続状態が切換わり、流路６
２からの前処理液により計量管４９内の誘導体化試薬液
が押し出されて、流路６３および切換弁５２を経て前処
理カラム４８に導入される。誘導体化試薬液の導入開始
時には、前処理カラム４８内の充填剤にカテコールアミ
ンが吸着されたままである。誘導体化試薬液の移送動作
を１ｍＱ／■ｉｎの流量で１５秒間続けると、前処理カ
ラム４８内は誘導体化試薬液で満たされる。

前処理カラム４８が誘導体化試薬液によって満たされた
タイミング（弁４７の切換から１５秒後）で、制御部５
６からの制御信号により送液ポンプ４６の送液動作を停
止させ、この停止状態を３分間継続する。この間に、充
填剤に吸着されていたカテコールアミンがＤＰＥと第３
図（ｂ）の如キ反応をし、誘導体化がなされる。５０℃
で３分間の条件により吸着されていたカテコールアミン
がほぼ完全に誘導体化され、充填剤との吸着状態が解除
される。前処理カラム４８内には、誘導体化反応を阻害
する蛋白質やＳＨ化合物等が存在していないので、反応
効率は極めて高い。

カラムへのサンプル ステップ１０７では、誘導体化された被検生化学成分を
含む液を前処理カラム４８から分離カラム５３へ移送す
る。送液ポンプ４６を３分間の停止状態から再び送液状
態にすると、前処理液が前処理カラム４８内の誘導体化
されたカテコールアミンを含む液を押し出す。このカテ
コールアミンを含む液が流路切換弁５２に到達する前に
流路切換弁５２の角度を６０度回転し流路接続状態を変
える。これによりカテコールアミンを含む液は溶離液槽
５０からの溶離液によって分離カラム５３へ移送される
。

底光分蓋 ステップ１０８では、分離カラム５３による成分分離が
行われる０分離カラム５３内には、逆相型充填剤である
シリカ−０ＤＳ　（粒径３μｍ）が充填されている。こ
の分離カラム５３は、内径４．６閣で長さ６０ｍである
。溶離液はアセトニトリルとメタノールを含むリン酸緩
衝液（ｐＨ３，０）である。

前処理カラム４８から流出した誘導体化された成分を含
む液が分離カラム５３に到達したときに、制御部５６か
らの制御信号により流路切換弁５２を切り換え第１図に
図示の実線状態にする。この状態で溶離液槽５０からの
溶離液を分離カラム５３に流し続ける。この溶離液の送
液によってカテコールアミンが成分分離され、ノルエピ
ネフリン（ＮＥ）、エピネフリン（Ｅ）、ドーパミン（
ＤＡ）が成分バンドを形成して分離カラム５３から溶出
される。成分分離後、分離カラム５３は再生処理される
。

剪欠ｌ左旦Ａ亙ま ステップ１０８の成分分離の開始に伴って流路切換弁５
２が切り換わることにより、前処理カラム４８に前処理
液が通液される。これがステップ１０９である。この前
処理液の通液により前処理カラム４８は次の生体試料を
受け入れられる状態に復元される。ステップ１０９の時
間は、ステップ１０８の時間に比べて短い。

皇一定 ステップ１１０では、分離カラム５３からの溶出液がフ
ローセル５９に流れ、蛍光光度計５４によって観測され
る。誘導体化されている各成分の蛍光強度が測定され、
各成分ピークの面積から濃度が演算される。蛍光光度計
の励起波長は３４５ｎｍ、蛍光波長は４８５ｎｍである
。

五二久人丞二番左 ステップ１１１では、ステップ１１０で得たデータをプ
リンタ５７．ＣＲＴ５８などに出力する。

プリンタ５７においては、プリント用紙上に各生体試料
毎にクロマトグラムの図形と被検各成分の濃度値の数値
が表示される。ＣＲＴ５８の画面上にも同様の表示を行
うことができる。ステップ１１２では、オートサンプラ
２６上の試料がすべて処理されたかどうかが判断され、
まだ残っていればステップ１０１に戻って２個後の試料
のサンプリングを行う、すべて処理されていれば、装置
の分析動作が終了する。

第２図のフローチャートでは、説明の簡略化のために、
１つの生体試料の分析操作の流れだけを示しているが、
第１図の分析装置では、同時に３つの生体試料が処理さ
れる。これらの試料は操作工程が重ならないようにずれ
て処理される。すなわち、特定の試料が前処理カラム４
８で処理されている間に、この特定の試料より１つ先行
して導入された試料は分離カラム５３によって分離され
。

またその間に、前記特定の試料より１つ遅れて導入され
た試料はオートサンプラ２６内での処理および計量管４
９への導入処理が行われる。

例えば、第１番目の試料に関して、分離カラム５３によ
る成分分離工程と分離カラム５３の再生工程を１５分で
実行する場合、並行して第２番目の試料と第３番目の試
料も処理されている。この場合、前処理カラム４８に関
しては、前処理液による再生、第２番目の試料の受入と
吸着、誘導体化試薬液の受入と反応、誘導体化された成
分の分離カラムへの移送などが行われる。同じ１５分の
期間内に、サンプラ２６および計量管４９に関しては、
第２番目の試料用の試薬液の計量管４９への導入と前処
理カラム４８への試薬液供給、計量管内洗浄、第３番目
の試料の分注ノズル３８による採取、第３番目の試料の
計量管４９内への導入などが行われる。

第５図は、第１図の実施例によって得られた生体試料の
分析例を示すクロマトグラムである。第５図において、
ＮＥはノルエピネフリン、Ｅはエピネフリン、ＤＡはド
ーパミンのカテコールアミン成分を示す、ＩＰは内標準
物質として加えたイソプロテノールである。第５図はこ
れらの各成分が共に５０ピコグラム（ｐ　ｇ）前処理カ
ラム４８に供給されるようにして得た結果である。従来
は高感度測定が困難とされていたドーパミンも定量し得
る十分な感度で検出されている。第５図における数値は
リテンションタイムを示す。

次に、本発明による分析方法と従来技術による分析方法
とで測定した実験例を説明する。

実験例 生体試料として健常者のプール血漿を用いた。

従来技術の分析手順は、特開平１−１２６５４４号に示
されたプレラベル化法を用いる分析方法に準じたが、誘
導体化試薬液は本発明の実施例と同じものを使用した。

上述のプール血漿を本発明の実施例による方法Ｃ本実施
例法）および従来技術に準する方法（従来法）によって
１０回ずつ測定し、測定の再現性を調べた。結果を表１
に示す０表１に示すように。

ノルエピネフリン（ＮＥ）およびドーパミン（ＤＡ）に
関し１本実施例法が著しく優れた標準偏差率（ＣＶ）が
得られた。

表　　１ 表２ 次に、上述のプール血漿に、ノルエピネフリン（ＮＥ）
、エピネフリン（Ｅ）、およびドーパミン（ＤＡ）をそ
れぞれ５０　ｐ　ｇ　／　ｍ　１２含んだ液を添加し、
本実施例法および従来法による回収率を求めた。結果を
表２に示す。表２の如く、本実施例法に基づけば、従来
法に比較し高い回収率が得られた。

〔発明の効果〕

本発明によれば、分析操作中における被検生化学成分の
分解が少なく、被検生化学成分を高い効率で誘導体化で
きるので、高感度測定と正確な測定を行うことができる
。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明を適用した一実施例の分析装置の概略構
成図、第２図は第１図の分析装置による分析動作を説明
するための操作手順を示すフローチャート、第３図は前
処理カラムにおける生化学成分の吸着および誘導体化反
応を説明するための模式図、第４図は第１図の分析装置
における制御系統図、第５図は第１図の分析装置によっ
て得られた分析例を示すクロマトグラムである。 ２６・・・オートサンプラ、２９・・・試料容器、３０
・・・誘導体化試薬液容器、３６・・・注入ボート、３
８・・・分注ノズル、４７・・・試料導入弁、４８・・
・前処理カラム、４９・・・計量管、５２・・・流路切
換弁、５３・・・分離カラム、５４・・・蛍光光度計、
５６・・・制御部、２０１・・・親水性ゲル母材、２０
２・・・フェニル硼酸。 第２図 −３（ （ｂ）Ｉ！ｌｌ導体化 ２０１ 第 図 ０冨Ｃ ０１ 第 図 ７ ５ ４

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、フェニル硼酸を導入した親水性ゲルを充填剤として
   充填した前処理カラムへ生体試料を供給し、被検生化学
   成分を吸着せしめること、上記前処理カラム内に上記被
   検生化学成分が吸着されている状態で上記前処理カラム
   内を誘導体化試薬液で満たすこと、上記前処理カラム内
   における液の流れを停止させた状態で上記前処理カラム
   内の被検生化学成分と誘導体化試薬を反応させ、誘導体
   化反応に伴つて上記被検生化学成分を上記充填剤から吸
   着解除せしめること、誘導体化された生化学成分を含む
   液を上記前処理カラムから分離カラムへ移送すること、
   および上記分離カラムによつて上記誘導体化された生化
   学成分を分離すること、を特徴とする生体試料の分析方
   法。 ２、請求項第１項記載の分析方法において、上記被検生
   化学成分を上記前処理カラムに吸着せしめるときの液性
   は弱アルカリ性であり、上記誘導体化反応時の液性は中
   性であることを特徴とする生体試料の分析方法。 ３、請求項第１項記載の分析方法において、上記誘導体
   化試薬液は、１，２−ジフェニルエチレンジアミンを含
   む液であることを特徴とする生体試料の分析方法。 ４、試料容器内から試料を分注ノズルによつて採取し流
   路切換弁に接続されている計量管内に上記分注ノズル内
   に採取した試料を供給する第１の工程と、フェニル硼酸
   を導入した親水性ゲルを充填剤として充填した前処理カ
   ラムへ上記計量管内の試料を緩衝液によつて移送して上
   記試料中の被検生化学成分を吸着せしめ、続いて上記前
   処理カラムを誘導体化試薬液で満たし上記前処理カラム
   内における液の流れを停止して誘導体化反応を行わせる
   第２の工程と、上記前処理カラムから分離カラム内に受
   け入れた誘導体化された生化学成分を成分分離し検出す
   る第３の工程を有し、特定の試料が上記第２の工程を行
   つている間に、その特定の試料より先行する試料に対し
   上記第３の工程を実行すると共に、上記特定の試料に後
   続する試料に対し上記第１の工程を実行することを特徴
   とする生体試料の分析方法。 ５、生体試料中の生化学成分を吸着し得る前処理カラム
   と、生化学成分を成分分離し得る分離カラムと、この分
   離カラムから流出した成分に基づく蛍光を検出する検出
   器を備えた液体クロマトグラフ分析装置において、上記
   前処理カラムとしてフェニル硼酸を導入した親水性ゲル
   を充填したカラムを設け、上記分離カラムとして逆相型
   充填剤を充填したカラムを設け、上記前処理カラムに誘
   導体化試薬液を供給すると共に上記前処理カラム内が誘
   導体化試薬液で満たされたときに上記前処理カラム内の
   液の流れを停止せしめる手段を設けたことを特徴とする
   液体クロマトグラフ分析装置。 ６、請求項第５項記載の分析装置において、上記前処理
   カラムを３０乃至６０℃に保温する手段を設けたことを
   特徴とする液体クロマトグラフ分析装置。 ７、請求項第５項記載の分析装置において、上記生体試
   料を計量管内に導入する手段を設け、上記計量管内の生
   体試料を緩衝液の流れで上記前処理カラムへ搬送せしめ
   る手段を設けたことを特徴とする液体クロマトグラフ分
   析装置。 ８、フェニル硼酸を導入した親水性ゲルを充填剤として
   充填した前処理カラムへ生体試料を供給し、ジオールを
   有する生化学成分を上記充填剤に吸着せしめること、上
   記前処理カラムに緩衝液を流してジオールを有しない成
   分を上記前処理カラムから排出すること、上記生化学成
   分の吸着に関与している官能基と結合し得る誘導体化試
   薬を含む液を上記前処理カラム内に満たし、上記生化学
   成分を誘導体化すること、および上記前処理カラムにて
   誘導体化された生化学成分を分離カラムに導き成分分離
   すること、を特徴とする生体試料の分析方法。 ９、請求項第８項記載の分析方法において、上記生化学
   成分を誘導体化する反応は上記前処理カラム内の液の流
   れを停止した状態で行うことを特徴とする生体試料の分
   析方法。 １０、請求項第８項又は第９項記載の分析方法において
   、上記ジオールを有する生化学成分はカテコールアミン
   であり、上記誘導体化試薬は１，２−ジフェニルエチレ
   ンジアミンであることを特徴とする生体試料の分析方法
   。 １１、請求項第８項又は第９項記載の分析方法において
   、上記生化学成分を誘導体化する反応は上記生化学成分
   と上記誘導体試薬との閉環反応であることを特徴とする
   生体試料の分析方法。