JPH03133381A - 血小板ファクター４の発現ベクター、血小板ファクター４融合蛋白、形質転換微生物及び血小板ファクター４の製造法 - Google Patents
血小板ファクター４の発現ベクター、血小板ファクター４融合蛋白、形質転換微生物及び血小板ファクター４の製造法Info
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- JPH03133381A JPH03133381A JP1271249A JP27124989A JPH03133381A JP H03133381 A JPH03133381 A JP H03133381A JP 1271249 A JP1271249 A JP 1271249A JP 27124989 A JP27124989 A JP 27124989A JP H03133381 A JPH03133381 A JP H03133381A
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- Japan
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- platelet factor
- blood platelet
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- acid sequence
- plasmid
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
り粟上殴■且分国
本発明は、血小板ファクター４発現のためのベクター、
血小板ファクター４融合蛋白、前記ベクターを大腸菌に
組み込んだ形質転換微生物及びこの形質転換微生物を用
いて血小板ファクター４を大量に生産する方法に関する
。
血小板ファクター４融合蛋白、前記ベクターを大腸菌に
組み込んだ形質転換微生物及びこの形質転換微生物を用
いて血小板ファクター４を大量に生産する方法に関する
。
従米勿肢血
血小板ファクター４は、ヒトの血小板から見出されたポ
リペプチドであって、正常な細胞の増殖を阻害すること
なく腫瘍細胞の増殖を阻害する性質を有する。
リペプチドであって、正常な細胞の増殖を阻害すること
なく腫瘍細胞の増殖を阻害する性質を有する。
この血小板ファクター４は、別名オンコスタチン−Ａと
称され、約６０以上のアミノ酸よりなり、分子量は約７
，０００程度である。このアミノ酸配列等についてはす
でに知られており、またその類似体も知られている （
特開昭６１−５０１７０８号公報参照）。
称され、約６０以上のアミノ酸よりなり、分子量は約７
，０００程度である。このアミノ酸配列等についてはす
でに知られており、またその類似体も知られている （
特開昭６１−５０１７０８号公報参照）。
そして、これらの化合物は、その正常な細胞の増殖を阻
害することなく腫瘍細胞の増殖を阻害する性質があるの
でこの性質を利用してヒトに投与し、癌及び肉腫の増殖
を阻害し、これらの疾病の予防、診断及び治療等に利用
することができる。
害することなく腫瘍細胞の増殖を阻害する性質があるの
でこの性質を利用してヒトに投与し、癌及び肉腫の増殖
を阻害し、これらの疾病の予防、診断及び治療等に利用
することができる。
しかし、これらの治療等に用いるためには、生物活性を
もった、充分な量の血小板ファクター４を得る必要があ
るが、ヒト血小板から得ることは到底困難であり、また
、遺伝子工学的手法で産生じようとする試みも提案され
ているが（例えば、上記公報参照）、この方法もまだ充
分満足できる方法ということはできない。
もった、充分な量の血小板ファクター４を得る必要があ
るが、ヒト血小板から得ることは到底困難であり、また
、遺伝子工学的手法で産生じようとする試みも提案され
ているが（例えば、上記公報参照）、この方法もまだ充
分満足できる方法ということはできない。
” しよ゛と る
本発明は、従来のこのような問題点を解決するためにな
されたものであって、血小板ファクタ４をヒト−アンジ
オジェニンと融合蛋白の形で発現させ、その発現が高く
、これを効率よく生産できる発現ベクターを提供するも
のである。さらに、本発明は、大量にしかも安価に血小
板ファクター４融合蛋白を生産し、それから血小板ファ
クター４を取得する方法を提供するものである。
されたものであって、血小板ファクタ４をヒト−アンジ
オジェニンと融合蛋白の形で発現させ、その発現が高く
、これを効率よく生産できる発現ベクターを提供するも
のである。さらに、本発明は、大量にしかも安価に血小
板ファクター４融合蛋白を生産し、それから血小板ファ
クター４を取得する方法を提供するものである。
ｉ ° るための
本発明は、
（］） ｔａｃプロモーターのフラグメント、プラス
ミ１’ｐＵｃ１８の複製開始点（Ｏｒｉ）のフラグメン
ト、ヒト−アンジオジェニンのアミノ酸配列の一部もし
くは全部をコードする塩基配列からなるＤＮＡ及び血小
板ファクター４のアミノ酸配列をコードする塩基配列か
らなるＤＮＡを含み、かつ前記側ＤＮＡが結合されてい
て、ヒトアンジオジェニンのアミノ酸配列の一部もしく
は全部と血小板ファクター４との融合蛍白を発現するよ
うにされている血小板ファクター４発現ベクタ （２） ヒト−アンジオジェニンのアミノ酸配列の一
部もしくは全部と血小板ファクター４とが結合してなる
血小板ファクター４融合蛋白。
ミ１’ｐＵｃ１８の複製開始点（Ｏｒｉ）のフラグメン
ト、ヒト−アンジオジェニンのアミノ酸配列の一部もし
くは全部をコードする塩基配列からなるＤＮＡ及び血小
板ファクター４のアミノ酸配列をコードする塩基配列か
らなるＤＮＡを含み、かつ前記側ＤＮＡが結合されてい
て、ヒトアンジオジェニンのアミノ酸配列の一部もしく
は全部と血小板ファクター４との融合蛍白を発現するよ
うにされている血小板ファクター４発現ベクタ （２） ヒト−アンジオジェニンのアミノ酸配列の一
部もしくは全部と血小板ファクター４とが結合してなる
血小板ファクター４融合蛋白。
（３）萌記項（１）の発現ベクターを大腸菌に形質導入
したことからなる形質転換微生物。
したことからなる形質転換微生物。
（４）前記項（３）の形質転換微生物を培養し、血小板
ファクター４融合蛋白を発現させ、これを採取した後、
切断して、血小板ファクター４又はその類縁体を回収す
ることからなる血小板ファクター４の製造法。
ファクター４融合蛋白を発現させ、これを採取した後、
切断して、血小板ファクター４又はその類縁体を回収す
ることからなる血小板ファクター４の製造法。
に関する。
本発明にいう ｔａｃプロモーターのフラグメントは、
第３図に示した塩基配列を有するもので、ＤＮＡ合成機
等により容易に合成することができる。
第３図に示した塩基配列を有するもので、ＤＮＡ合成機
等により容易に合成することができる。
したがって、これらのプロモーターを合成し、これをプ
ラスミドρＵＣ１Ｂの複製開始点（Ｏｒｉ）のフラグメ
ント等と組合せても良いが、市販のプラスミドの切り出
しや接合等を組合せることにより比較的容易に調製でき
る。例えば、市販のプラスミ）’ｐ ＫＫ ２２３−３
（例えば、ファルマシア社製（Ｐｈａｒｍａｃｉａ
ＡＢ）カタログ２７−４９３５−０１ ）を制限酵素Ｐ
ｖｕｌ及びＮｒｕｌで切断したｔａｃプロモーターフラ
グメントを含むサイト部と市販ののプラスミドｐＵｃ１
８（例えば、ファルマシア社製（ＰｈａｒｍａｃｉａＡ
Ｂ）カタログ２７−４９．１９−０１ ）を制限酵素Ｐ
ｖｕｌ及びＮｒｕｌで切断した複製開始点（Ｏｒｉ）の
フラグメントを含むサイト部とをＴ４ＤＮＡリガーゼで
接合してプラスミドｐＭＫ２を得、これにヒトアンジオ
ジェニンの一部もしくは全部の遺伝子を組み込んで構築
すると、ｔａｃプロモーターのフラグメント、プラスミ
ドｐＵｃ１８の複製開始点（Ｏｒｉ）のフラグメント、
ヒト−アンジオジェニンのアミノ酸配列の一部もしくは
全部の遺伝子を組み込んで構築すると、ｔａｃプロモー
ターのフラグメント、プラスミドρＵＣｌ３の複製開始
点（Ｏｒｉ）のフラグメント、ヒト−アンジオジェニン
のアミノ酸配列の一部もしくは全部をコードする塩基配
列からなるＤＮＡを含むベクターが得られる。このベク
ターのうち、ヒト−アンジオジェニンの全部の遺伝子を
組み込んだものは、本発明者等によりヒトアンジオジヱ
ニン発現ベクターｐＭＡＧＮ１として、既に提案してい
る（特願平１−２１２４４２号公報参照）。この発現ベ
クターを利用すると比較的簡便に、本発明の血小板ファ
クター４の発現ベクタを構築することができる。
ラスミドρＵＣ１Ｂの複製開始点（Ｏｒｉ）のフラグメ
ント等と組合せても良いが、市販のプラスミドの切り出
しや接合等を組合せることにより比較的容易に調製でき
る。例えば、市販のプラスミ）’ｐ ＫＫ ２２３−３
（例えば、ファルマシア社製（Ｐｈａｒｍａｃｉａ
ＡＢ）カタログ２７−４９３５−０１ ）を制限酵素Ｐ
ｖｕｌ及びＮｒｕｌで切断したｔａｃプロモーターフラ
グメントを含むサイト部と市販ののプラスミドｐＵｃ１
８（例えば、ファルマシア社製（ＰｈａｒｍａｃｉａＡ
Ｂ）カタログ２７−４９．１９−０１ ）を制限酵素Ｐ
ｖｕｌ及びＮｒｕｌで切断した複製開始点（Ｏｒｉ）の
フラグメントを含むサイト部とをＴ４ＤＮＡリガーゼで
接合してプラスミドｐＭＫ２を得、これにヒトアンジオ
ジェニンの一部もしくは全部の遺伝子を組み込んで構築
すると、ｔａｃプロモーターのフラグメント、プラスミ
ドｐＵｃ１８の複製開始点（Ｏｒｉ）のフラグメント、
ヒト−アンジオジェニンのアミノ酸配列の一部もしくは
全部の遺伝子を組み込んで構築すると、ｔａｃプロモー
ターのフラグメント、プラスミドρＵＣｌ３の複製開始
点（Ｏｒｉ）のフラグメント、ヒト−アンジオジェニン
のアミノ酸配列の一部もしくは全部をコードする塩基配
列からなるＤＮＡを含むベクターが得られる。このベク
ターのうち、ヒト−アンジオジェニンの全部の遺伝子を
組み込んだものは、本発明者等によりヒトアンジオジヱ
ニン発現ベクターｐＭＡＧＮ１として、既に提案してい
る（特願平１−２１２４４２号公報参照）。この発現ベ
クターを利用すると比較的簡便に、本発明の血小板ファ
クター４の発現ベクタを構築することができる。
本発明では、上述のようなｔａｃプロモーターのフラグ
メント、プラスミドｐＵｃ１８の複製開始点（Ｏｒｉ）
のフラグメント、ヒト−アンジオジェニンのアミノ酸配
列の一部もしくは全部をコードする塩基配列からなるＤ
ＮＡを含むベクターを利用すると良いが、これら以外に
、用いたプラスミド由来の他の遺伝子を含んでいても何
ら支障はないが、例えば、ｒｒｎ Ｂターミネータ−、
アンピシリン耐性遺伝子等のフラグメント等を含んでい
ると、高発現を行うことができ、また、スクリーニング
が簡便となり、特に好ましい。
メント、プラスミドｐＵｃ１８の複製開始点（Ｏｒｉ）
のフラグメント、ヒト−アンジオジェニンのアミノ酸配
列の一部もしくは全部をコードする塩基配列からなるＤ
ＮＡを含むベクターを利用すると良いが、これら以外に
、用いたプラスミド由来の他の遺伝子を含んでいても何
ら支障はないが、例えば、ｒｒｎ Ｂターミネータ−、
アンピシリン耐性遺伝子等のフラグメント等を含んでい
ると、高発現を行うことができ、また、スクリーニング
が簡便となり、特に好ましい。
一方、血小板ファクター４の遺伝子は、第１図に血小板
ファクター４を構成するアミノ酸配列を示したが、その
アミノ酸数が７０と小さいため、ヒトアンジオジェニン
遺伝子と同様にＤＮＡ合成機を用い、比較的簡便に調製
できる。勿論、ｃＤＮＡライブラリーからｃＤＮＡをス
クリーニングすることによって得ても良いことは言うま
でもない。この遺伝子は、大腸菌での使用頻度の高いコ
ドンを用いることが好ましく、特に第２圀に示した塩基
配列の遺伝子を用いることが好ましい。
ファクター４を構成するアミノ酸配列を示したが、その
アミノ酸数が７０と小さいため、ヒトアンジオジェニン
遺伝子と同様にＤＮＡ合成機を用い、比較的簡便に調製
できる。勿論、ｃＤＮＡライブラリーからｃＤＮＡをス
クリーニングすることによって得ても良いことは言うま
でもない。この遺伝子は、大腸菌での使用頻度の高いコ
ドンを用いることが好ましく、特に第２圀に示した塩基
配列の遺伝子を用いることが好ましい。
次に、前述のｔａｃプロモーターのフラグメント、プラ
スミドρＵＣｌ３の複製開始点（Ｏｒｉ）のフラグメン
ト、ヒトアンジオジエニンのアミノ酸配列の一部もしく
は全部をコードする塩基配列からなるＤＮＡを含むベク
ターに上記の血小板ファクター４の遺伝子を組み込む。
スミドρＵＣｌ３の複製開始点（Ｏｒｉ）のフラグメン
ト、ヒトアンジオジエニンのアミノ酸配列の一部もしく
は全部をコードする塩基配列からなるＤＮＡを含むベク
ターに上記の血小板ファクター４の遺伝子を組み込む。
この組込においては、種々の制限酵素を用いて開裂する
ことにより行うことができるが、前記ベクターとして前
述のプラスミドｐＭＡＧＮ １を用いる場合は、制限酵
素Ｎｒｕｌを用いて開裂し、血小板ファクター４の遺伝
子と結合すると良い。この場合、接合方法としては、公
知の種々の方法を用いることができるが、特に、プラス
ミドＰＭＡＧＮ１の制限酵素Ｎｒｕｌ切断サイトをアル
カリホスファターゼ処理によって５′−リン酸基を除去
し、血小板ファクター４遺伝子の末端サイトをクレノー
酵素で処理してプラントエンドにし、両者を接合すると
よい。この方法ではアンジオジェニン遺伝子をコードす
る第６６番目アミノ酸の後に血小板ファクター４遺伝子
フラグメントが結合され、血小板ファクター４融合蛋白
を大量に発現できるようになる。
ことにより行うことができるが、前記ベクターとして前
述のプラスミドｐＭＡＧＮ １を用いる場合は、制限酵
素Ｎｒｕｌを用いて開裂し、血小板ファクター４の遺伝
子と結合すると良い。この場合、接合方法としては、公
知の種々の方法を用いることができるが、特に、プラス
ミドＰＭＡＧＮ１の制限酵素Ｎｒｕｌ切断サイトをアル
カリホスファターゼ処理によって５′−リン酸基を除去
し、血小板ファクター４遺伝子の末端サイトをクレノー
酵素で処理してプラントエンドにし、両者を接合すると
よい。この方法ではアンジオジェニン遺伝子をコードす
る第６６番目アミノ酸の後に血小板ファクター４遺伝子
フラグメントが結合され、血小板ファクター４融合蛋白
を大量に発現できるようになる。
このようにして本発明の血小板ファクター４融合蛋白発
現ベクターｐＭＡＰＦ４を得ることができる。
現ベクターｐＭＡＰＦ４を得ることができる。
そしてこの血小板ファクター４融合蛋白発現ベクターｐ
ＭＡＰＦ４を大腸菌に導入し、スクリニングすることに
より形質転換菌を得ることができる。
ＭＡＰＦ４を大腸菌に導入し、スクリニングすることに
より形質転換菌を得ることができる。
この形質転換菌を所定の培地で培養することにより、血
小板ファクター４融合蛋白を生産させ、次いで、菌体を
破壊した後、遠心分離、カラムクロマトグラフィー等の
手段により、単離、精製することができる。
小板ファクター４融合蛋白を生産させ、次いで、菌体を
破壊した後、遠心分離、カラムクロマトグラフィー等の
手段により、単離、精製することができる。
得られた血小板ファクター４融合蛋白は、ブロムシアナ
ミド等で処理して血小板ファクター４を得る。
ミド等で処理して血小板ファクター４を得る。
、本発明は血小板ファクター４ばかりではなく、その類
縁体の発現をも含むものである。
縁体の発現をも含むものである。
次に、本発明の実施例を示す。
実施例
（１）プラスミドｐＭＡＧＮ１の構築
（ｉ） ヒト−アンジオジェニン遺伝子の調製第４図に
示した塩基配列を１４分割して、オリゴヌクレオチドを
ＤＮＡ合成機〔アプライドバイオシステムズ（ＡＰＰＬ
ＩＥＤ ＢｆＯ３ＹＳＴＥＭＳ）モデル３８〇八］で合
成した。これを逆相Ｃ１Ｂカラムを用いた高速液体クロ
マトグラフィーにより精製した。得られた各々のオリゴ
ヌクレオチド５００ｐｍｏｌをＴ４ポリヌクレオチドキ
ナーゼで処理して５′−末端をリン酸化した。次にこの
オリゴヌクレオチドを第４図のＨｉｎｄ ｍ開裂部位の
点で第５図に示すように、前半部（Ａバート）と後半部
（Ｂパート）とに分けてＴ４ＤＮＡリガーゼ結合させ、
この各々を、市販の発現ベクターｐｕｃ１ｓを制限酵素
ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄｌ［Ｉで切断した部位に組み込
み、大腸菌Ｅ、ｃｏｌｉ Ｊ Ｍ １０９株に導入し
て、増殖させた。この両者を上記の制限酵素で切り出し
て、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで結合し、ヒトアンジオジエニ
ンの完全な遺伝子を得た。
示した塩基配列を１４分割して、オリゴヌクレオチドを
ＤＮＡ合成機〔アプライドバイオシステムズ（ＡＰＰＬ
ＩＥＤ ＢｆＯ３ＹＳＴＥＭＳ）モデル３８〇八］で合
成した。これを逆相Ｃ１Ｂカラムを用いた高速液体クロ
マトグラフィーにより精製した。得られた各々のオリゴ
ヌクレオチド５００ｐｍｏｌをＴ４ポリヌクレオチドキ
ナーゼで処理して５′−末端をリン酸化した。次にこの
オリゴヌクレオチドを第４図のＨｉｎｄ ｍ開裂部位の
点で第５図に示すように、前半部（Ａバート）と後半部
（Ｂパート）とに分けてＴ４ＤＮＡリガーゼ結合させ、
この各々を、市販の発現ベクターｐｕｃ１ｓを制限酵素
ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄｌ［Ｉで切断した部位に組み込
み、大腸菌Ｅ、ｃｏｌｉ Ｊ Ｍ １０９株に導入し
て、増殖させた。この両者を上記の制限酵素で切り出し
て、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで結合し、ヒトアンジオジエニ
ンの完全な遺伝子を得た。
（ｉｉ）プラスミドｐＭＡＧＮ１の調製第６図に示すよ
うに市販のプラスミドｐＫＫ２２３−３ （ファルマシ
ア社製）を制限酵素ＰｖｕＩ及びＮｒｕｌで切断したＰ
ｔａｃサイト部と市販のｐＵｃ１８を制限酵素Ｐνｕｌ
及びＰｖｕ■で切断した複製開始点（Ｏｒｔ）及びアン
ピシリン耐性遺伝子を含むサイト部とをＴ４ＤＮＡリガ
ーゼで接合した。これを大腸菌Ｅ、ｃｏｌｉ Ｊ Ｍ
１０９株に導入して培養し、アンピシリン耐性により
スクリーニングしてｐＫＫ２２３−３のｔａｃプロモー
ターとｐＵＣ１８の複製開始点（Ｏｒｔ）とを有するベ
クターを調製した。この調製したプラスミドの塩基配列
は、サンガー法で確認した。このプラスミドをｐＭＫ２
とした。
うに市販のプラスミドｐＫＫ２２３−３ （ファルマシ
ア社製）を制限酵素ＰｖｕＩ及びＮｒｕｌで切断したＰ
ｔａｃサイト部と市販のｐＵｃ１８を制限酵素Ｐνｕｌ
及びＰｖｕ■で切断した複製開始点（Ｏｒｔ）及びアン
ピシリン耐性遺伝子を含むサイト部とをＴ４ＤＮＡリガ
ーゼで接合した。これを大腸菌Ｅ、ｃｏｌｉ Ｊ Ｍ
１０９株に導入して培養し、アンピシリン耐性により
スクリーニングしてｐＫＫ２２３−３のｔａｃプロモー
ターとｐＵＣ１８の複製開始点（Ｏｒｔ）とを有するベ
クターを調製した。この調製したプラスミドの塩基配列
は、サンガー法で確認した。このプラスミドをｐＭＫ２
とした。
次に、上記プラスミドｐＭＫ２を取り出し、第７図に示
すように、制限酵素ＥｃｏＲＩで切断した後、アルカリ
ホスファターゼ処理によって、５′−リン酸基を除去し
た。この直鎖状プラスミドと上記で得たヒト−アンジオ
ジェニン遺伝子をＴ−４リガーゼで結合した。これを大
腸菌Ｅ、ｃｏｌｉ ＪＭ１０９株に導入し、アンピシ
リン耐性及びコピー数の増加を調べることによりスクリ
ーニングした。
すように、制限酵素ＥｃｏＲＩで切断した後、アルカリ
ホスファターゼ処理によって、５′−リン酸基を除去し
た。この直鎖状プラスミドと上記で得たヒト−アンジオ
ジェニン遺伝子をＴ−４リガーゼで結合した。これを大
腸菌Ｅ、ｃｏｌｉ ＪＭ１０９株に導入し、アンピシ
リン耐性及びコピー数の増加を調べることによりスクリ
ーニングした。
この正しい方向にクローン化されたプラスミドをｐＭＡ
ＧＮｌとした。
ＧＮｌとした。
（２）プラスミドｐＭＡＰＦ４の調製
（ｉ）血小板ファクター４遺伝子の調製第２図に示した
塩基配列をもつ血小板ファクター４遺伝子のアミノ酸配
列を含むオリゴヌクレオチドをＤＮＡ合成機〔アプライ
ドバイオシステムズ（ＡＰＰ！、ＦＥＤ ＢＩＯ５ＹＳ
ＴＥＭＳ） モテル３８０Ａ） Ｔ：合成し、両末端の
ＥｃｏＲ１部位をクレノー酵素で処理して次に示すよう
にプラントエンドにした。
塩基配列をもつ血小板ファクター４遺伝子のアミノ酸配
列を含むオリゴヌクレオチドをＤＮＡ合成機〔アプライ
ドバイオシステムズ（ＡＰＰ！、ＦＥＤ ＢＩＯ５ＹＳ
ＴＥＭＳ） モテル３８０Ａ） Ｔ：合成し、両末端の
ＥｃｏＲ１部位をクレノー酵素で処理して次に示すよう
にプラントエンドにした。
血小板ファクター４遺伝子 クレノクレノー
開始コドン （ｉｉ ）プラスミドｐＭＡＰＦ４の８周製第７図に示
すように上記（１）（ｉｉ）で得たプラスミドｐＭＡＧ
Ｎｌのヒト−アンジオジェニン遺伝子のアミノ酸配列を
コードするＤＮＡの部位を制限酵素Ｎｒｕｌで開裂した
後、アガロースゲル電気泳動により、直鎖状ＤＮＡを精
製した。これのＮｒｕｌ切断サイトをアルカリホスホク
ーゼ処理して５′−リン酸基を除去し、次に示すように
ブラントエンドにした。
開始コドン （ｉｉ ）プラスミドｐＭＡＰＦ４の８周製第７図に示
すように上記（１）（ｉｉ）で得たプラスミドｐＭＡＧ
Ｎｌのヒト−アンジオジェニン遺伝子のアミノ酸配列を
コードするＤＮＡの部位を制限酵素Ｎｒｕｌで開裂した
後、アガロースゲル電気泳動により、直鎖状ＤＮＡを精
製した。これのＮｒｕｌ切断サイトをアルカリホスホク
ーゼ処理して５′−リン酸基を除去し、次に示すように
ブラントエンドにした。
このようにして新しく ＥｃｏＲＩ切断サイトを作り、
両者を接合した。これを大腸菌ＥｃｏｌｉＪＭ１０９株
に導入し、アンピシリン耐性及びコピー数の増加を調べ
ることによりスクリーニングした。
両者を接合した。これを大腸菌ＥｃｏｌｉＪＭ１０９株
に導入し、アンピシリン耐性及びコピー数の増加を調べ
ることによりスクリーニングした。
この正しい方向にクローン化されたプラスミドをｐＭＡ
ＰＦ４とした。
ＰＦ４とした。
（３）血小板ファクター４融合蛋白の発現上記のプラス
ミドｐＭＡＰＦ４により形質転換しされた大腸菌Ｅｃｏ
ｌｉ ＪＭ１０９株を５０ｇｇ７ｍＲのアンピシリン
を含むＬＢ培地〔バタトトリプトン（Ｂａｃｔｏ−ｔｒ
ｙｐｔｏｎｅ） Ｌｏｇ／ ｌ 、バクトイ−ストエキ
ストラクト（Ｂａｃｔｏ−ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ
）５ｇ／４２ ＸＮａＣ１１０ｇ／ Ｉ！、、ｐＨ７，
５）で培養した。−晩培養後遠心分離して菌体を集めた
後、レムリのサンプル緩衝液に懸濁し、加熱熔解後、５
ＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動に供した。泳動後、
クマシーブリリアントブルーにより染色し、脱色したと
ころ分子量約１４．０００の位置に血小板ファクター４
融合蛍白の発現が６Ｉ Ｌ’２された。この結果、血小
板ファクター４融合蛋白は全菌体蛋白の約３０％の発現
を示し、培地１１当り５０■の生産量であった。
ミドｐＭＡＰＦ４により形質転換しされた大腸菌Ｅｃｏ
ｌｉ ＪＭ１０９株を５０ｇｇ７ｍＲのアンピシリン
を含むＬＢ培地〔バタトトリプトン（Ｂａｃｔｏ−ｔｒ
ｙｐｔｏｎｅ） Ｌｏｇ／ ｌ 、バクトイ−ストエキ
ストラクト（Ｂａｃｔｏ−ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ
）５ｇ／４２ ＸＮａＣ１１０ｇ／ Ｉ！、、ｐＨ７，
５）で培養した。−晩培養後遠心分離して菌体を集めた
後、レムリのサンプル緩衝液に懸濁し、加熱熔解後、５
ＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動に供した。泳動後、
クマシーブリリアントブルーにより染色し、脱色したと
ころ分子量約１４．０００の位置に血小板ファクター４
融合蛍白の発現が６Ｉ Ｌ’２された。この結果、血小
板ファクター４融合蛋白は全菌体蛋白の約３０％の発現
を示し、培地１１当り５０■の生産量であった。
このプラスミドｐＭＡＰＦ４が挿入された菌株は、Ｅｃ
ｏｌｉ Ｊ Ｍ２Ｏ３ｐ ＭＡ Ｐ Ｆ ４ （微工研
条寄第２６１０号（ＦＢＩ？Ｍ ＢＰ−２６１０） ）
として微工研に寄託されている。
ｏｌｉ Ｊ Ｍ２Ｏ３ｐ ＭＡ Ｐ Ｆ ４ （微工研
条寄第２６１０号（ＦＢＩ？Ｍ ＢＰ−２６１０） ）
として微工研に寄託されている。
このようにして得られた血小板ファクター４融合蛋白を
ブロムシアナミドで処理して血小板ファクター４を得た
。
ブロムシアナミドで処理して血小板ファクター４を得た
。
発凱皇訪来
本発明はｔａｃプロモーターのフラグメント、プラスミ
ドｐＵｃ１８の複製開始点（Ｏｒｉ）のフラグメント及
びヒト−アンジオジェニンのアミノ酸配列をコードする
塩基配列からなるＤＮＡと、血小板ファクター４のアミ
ノ酸配列をコードする塩基配列からなるＤＮＡとを含み
、かつ前記両ＤＮＡが結合されていて血小板ファクター
４融合蛋白を発現するようにされたベクターを用いて、
大腸菌により、血小板ファクター４を融合蛋白の形で発
現させるので血小板ファクター４を効率よ（大量に発現
することができる。
ドｐＵｃ１８の複製開始点（Ｏｒｉ）のフラグメント及
びヒト−アンジオジェニンのアミノ酸配列をコードする
塩基配列からなるＤＮＡと、血小板ファクター４のアミ
ノ酸配列をコードする塩基配列からなるＤＮＡとを含み
、かつ前記両ＤＮＡが結合されていて血小板ファクター
４融合蛋白を発現するようにされたベクターを用いて、
大腸菌により、血小板ファクター４を融合蛋白の形で発
現させるので血小板ファクター４を効率よ（大量に発現
することができる。
第１図は、血小板ファクター４のアミノ酸配列を、第２
図は血小板ファクター４遺伝子のアミノ酸配列を含むＥ
ｃｏＲＩ −ＥｃｏＲ１間のフラグメントの好ましいＤ
ＮＡ配列の例を、第３図はｔａｃプロモーターのフラグ
メント、第４図はヒトアンジオジエニンの好ましい塩基
配列の例をそれぞれ示す。第５図は、ヒト−アンジオジ
ェニン遺伝子を調製する過程の概略を示す。第６図は、
プラスミドｐＭＫ２を、第７図はプラスミドｐＭＡＧＮ
１を、第８図はプラスミドｐＭＡＰＦ４をそれぞれ調製
する過程の概略を示した図である。 Ｇｌｕ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ａ
ｓｐ Ｌｅｕ Ｇｉｎ Ｃｙｓ Ｌｅｕ Ｃｙｓ Ｖａ
ｌ ＬｙｓＴｈｒ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｇｉｎ Ｖａｌ
Ａｒｇ Ｐｒｏ Ａｒｇ Ｈｉｓ ｌｉｅ Ｔｈｒ Ｓ
ｅｒ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｖａｌ ｌｉｅ Ｌｙｓ Ａｌ
ａＧｌｙ Ｐｒｏ Ｈｉｓ Ｃｙｓ Ｐｒｏ Ｔｈｒ
Ａｌａ Ｇｉｎ Ｌｅｕ ｌｉｅ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｌ
ｅｕ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｌｙｓｌｉｅ
Ｃｙｓ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｇｉｎ Ａｌａ
Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｔｙｒ Ｌｙｓ Ｌｙｓ ｌｉｅ ｌ
ｉｅ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｌｅｕ ＬｅｕＧｌｕ Ｓｅｒ ＧＣＡＡＴＴ ＧＴＡＣＣＴＴＣＧＡ ＣＴＴＣＴＴＣ
ＴＧＣＣＡＣＴＧＧＡＣＧＴ ＴへＣＧＧＡＣＡＣＧ６
０ ７０ ．８０ ９０
１００ＧＴＴＡＡＧＡＣＣＡ ＣＴＴＣ
ＴＣＡＧＧＴ ＡＣＧＴＣＣＧＣＧＴ ＣＡＣＡＴ
ＣＡＣＴＴ ＣＴＣＴＧＧＡＡＧＴＣＡＡＴＴＣＴＧ
ＧＴ ＧＡＡＧＡＧＴＣＣＡ ＴＧＣＡＧＧＣＧＣＡ
ＧＴＧＴＡＧＴＧＡＡ ＧＡＧＡＣＣＴＴＣＡｌｌｏ
１２０ １３０
１４０ ＋５０ＡＡＴＣＡＡＡＧＣＴ Ｇ
ＧＴＣＣＧＣＡＣＴ ＧＴＣＣＧＡＣＴＧＣＴＣＡＧＣ
ＴＧＡＴＣＧＣＴＡＣＴＣＴＧＡＴＴＡＧＴＴＴＣＧＡ
ＣＣＡＧＧＣＧＴＧＡ ＣＡＧＧＣＴＧＡＣＧ ＡＧ
ＴＣＧＡＣＴＡＧ ＣＧＡＴＧＡＧＡＣＴＴＴＣＴＧＣ
ＣＡＧＣＡＴＴＴＴＡＧＡＣＡ ＧＡＴＣＴＧＧＡＣＧ
ＴＴＣＧＡＧＧＴＧＡ ＣへＴＧＴＴＣＴＴＣ第１図 ＴＡＧＴＡＧＴＴＴＴ ＴＴＧＡＣＧＡＣＣＴ Ｔ
ＡＧＡＡＴＴＡＣ丁 ＧＡＣＧＴＣＴＴＣＧ ＡＡＣ
ＴＴ入ＡＣｌｏｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒ 弔 図 第 図 第 図 Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒ ｐＭＡＧＮｌ ＭＡＰＦ４ ＰＦ４融合蛋白発現ベクター
図は血小板ファクター４遺伝子のアミノ酸配列を含むＥ
ｃｏＲＩ −ＥｃｏＲ１間のフラグメントの好ましいＤ
ＮＡ配列の例を、第３図はｔａｃプロモーターのフラグ
メント、第４図はヒトアンジオジエニンの好ましい塩基
配列の例をそれぞれ示す。第５図は、ヒト−アンジオジ
ェニン遺伝子を調製する過程の概略を示す。第６図は、
プラスミドｐＭＫ２を、第７図はプラスミドｐＭＡＧＮ
１を、第８図はプラスミドｐＭＡＰＦ４をそれぞれ調製
する過程の概略を示した図である。 Ｇｌｕ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ａ
ｓｐ Ｌｅｕ Ｇｉｎ Ｃｙｓ Ｌｅｕ Ｃｙｓ Ｖａ
ｌ ＬｙｓＴｈｒ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｇｉｎ Ｖａｌ
Ａｒｇ Ｐｒｏ Ａｒｇ Ｈｉｓ ｌｉｅ Ｔｈｒ Ｓ
ｅｒ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｖａｌ ｌｉｅ Ｌｙｓ Ａｌ
ａＧｌｙ Ｐｒｏ Ｈｉｓ Ｃｙｓ Ｐｒｏ Ｔｈｒ
Ａｌａ Ｇｉｎ Ｌｅｕ ｌｉｅ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｌ
ｅｕ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｌｙｓｌｉｅ
Ｃｙｓ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｇｉｎ Ａｌａ
Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｔｙｒ Ｌｙｓ Ｌｙｓ ｌｉｅ ｌ
ｉｅ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｌｅｕ ＬｅｕＧｌｕ Ｓｅｒ ＧＣＡＡＴＴ ＧＴＡＣＣＴＴＣＧＡ ＣＴＴＣＴＴＣ
ＴＧＣＣＡＣＴＧＧＡＣＧＴ ＴへＣＧＧＡＣＡＣＧ６
０ ７０ ．８０ ９０
１００ＧＴＴＡＡＧＡＣＣＡ ＣＴＴＣ
ＴＣＡＧＧＴ ＡＣＧＴＣＣＧＣＧＴ ＣＡＣＡＴ
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１２０ １３０
１４０ ＋５０ＡＡＴＣＡＡＡＧＣＴ Ｇ
ＧＴＣＣＧＣＡＣＴ ＧＴＣＣＧＡＣＴＧＣＴＣＡＧＣ
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ＴＣＧＡＣＴＡＧ ＣＧＡＴＧＡＧＡＣＴＴＴＣＴＧＣ
ＣＡＧＣＡＴＴＴＴＡＧＡＣＡ ＧＡＴＣＴＧＧＡＣＧ
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ＡＧＡＡＴＴＡＣ丁 ＧＡＣＧＴＣＴＴＣＧ ＡＡＣ
ＴＴ入ＡＣｌｏｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒ 弔 図 第 図 第 図 Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒ ｐＭＡＧＮｌ ＭＡＰＦ４ ＰＦ４融合蛋白発現ベクター
Claims (4)
- （１）ｔａｃプロモーターのフラグメント、プラスミド
ｐＵＣ１８の複製開始点（Ｏｒｉ）のフラグメント、ヒ
ト−アンジオジェニンのアミノ酸配列の一部もしくは全
部をコードする塩基配列からなるＤＮＡ及び血小板ファ
クター４のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなる
ＤＮＡを含み、かつ前記両ＤＮＡが結合されていて、ヒ
ト−アンジオジェニンのアミノ酸配列の一部もしくは全
部と血小板ファクター４との融合蛋白を発現するように
されていることを特徴とする血小板ファクター４の発現
ベクター。 - （２）ヒト−アンジオジェニンのアミノ酸配列の一部も
しくは全部と血小板ファクター４とが結合してなる血小
板ファクター４融合蛋白。 - （３）請求項（１）の発現ベクターを大腸菌に形質導入
したことからなる形質転換微生物。 - （４）請求項（３）の形質転換微生物を培養し、血小板
ファクター４融合蛋白を発現させ、これを採取した後、
切断して、血小板ファクター４又はその類縁体を回収す
ることを特徴とする血小板ファクター４の製造法。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1271249A JPH03133381A (ja) | 1989-10-18 | 1989-10-18 | 血小板ファクター４の発現ベクター、血小板ファクター４融合蛋白、形質転換微生物及び血小板ファクター４の製造法 |
| EP19900119603 EP0423641A3 (en) | 1989-10-18 | 1990-10-12 | Expression vector, transformed microorganism, fusion protein and method for the production of platelet factor 4 or tgfalpha |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1271249A JPH03133381A (ja) | 1989-10-18 | 1989-10-18 | 血小板ファクター４の発現ベクター、血小板ファクター４融合蛋白、形質転換微生物及び血小板ファクター４の製造法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH03133381A true JPH03133381A (ja) | 1991-06-06 |
Family
ID=17497442
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1271249A Pending JPH03133381A (ja) | 1989-10-18 | 1989-10-18 | 血小板ファクター４の発現ベクター、血小板ファクター４融合蛋白、形質転換微生物及び血小板ファクター４の製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH03133381A (ja) |
-
1989
- 1989-10-18 JP JP1271249A patent/JPH03133381A/ja active Pending
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