JPH03139277A - 高アルカリ性プロテアーゼ、該プロテアーゼをコードするｄｎａ配列、微生物の形質転換ベクター及びプラスミド、微生物、洗剤、合成オリゴヌクレオチド、二本鎖ｄｎａリンカー、及び至適高アルカリ性プロテアーゼの製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、高アルカリ性プロテアーゼをコードするＤＮ
Ａ配列の突然変異により、最適化された高アルカリ性プ
ロテアーゼ、該プロテアーゼをコードするＤＮＡ配列（
遺伝子）、このＤＮＡ配列を含有するベクター及びこの
ベクターにより形質転換した微生物、至適高アルカリ性
プロテアーゼの製法並びにこの至適プロテアーゼを含有
する洗剤に関する。

従来の技術 高アルカリ性プロテアーゼは有利な用途を持つ工業生産
物、特に洗剤工業のそれである。それというのも蛋白質
を含む汚れを除去するからである。有効であるようにす
るためには、これらのプロテアーゼが洗濯条件（ｐＨ値
、温度）下に蛋白質分解活性を有するばかりでなく、更
に他の洗剤成分と、即ち他の酵素、界面活性剤、骨格物
質（ビルダー）、漂白剤、漂白剤活性剤並びに他の添加
剤及び助剤との組合せにおいて認容性、即ちこれらの物
質に対して十分な安定性及びこれらの物質の存在におい
て十分な有効作用を有すべきである。

高アルカリ性プロテアーゼは、微生物の培養により、特
に所望の高アルカリ性プロテアーゼを産生じかつ培地中
に分泌する例えばバチルス・アルカロフィルス（Ｂａｃ
ｉｌｌｕｓ　ａｌｃａｌｏｐｈｉｌｕｓ）のようなバチ
ルス種の培養により得られる特別な酵素であり、前記の
培地からプロテアーゼを単離することができる。該高ア
ルカリ性プロテアーゼは、バチルス種、例えば特に／く
チルス・スブチリス（Ｂ、　ｓ　ｕｂｔｉｌｉｓ）　、
バチルス・アミ口すケ７アシエンス（Ｂ、　ａｍｙｌｏ
ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）及びバチルス・リケ二７オ
ルミス（Ｂ、Ｉｉｃｈｅ−ｎｉｆｏｒｍｉｓ）の培養に
より得られるような通常のアルカリ性プロテアーゼとは
異なっている。

技術水準では、望ましい性質を有する新規高アルカリ性
プロテアーゼを得るために既に多くの試みがなされ、か
つ一連の天然の並びに合成（遺伝子工学）で変換したア
ルカリ性及び高アルカリ性プロテアーゼが公知であるが
、今日でもなお新規な至適高アルカリ性プロテアーゼが
、特に洗浄特性に関して最適な高アルカリ性プロテアー
ゼが強く求められている。

発明が解決しようとする課題 それ故、最適な性質を有する有効な新規高アルカリ性プ
ロテアーゼを製造し、それに必要なＤＮＡ配列（遺伝子
）を突然変異により生成し、かつ必要なベクター及び転
質転換した微生物を提供するという課題が生じた。

課題を解決するための手段 この課題は、本発明による高アルカリ性プロテアーゼ、
それに関連するＤＮＡ配列（遺伝子）、ベクター及び形
質転換した微生物並びに本発明方法により解決される。

本発明は、第１図に図示されているアミノ酸配列に対し
て少なくとも８０％の相同性を有しかつ該アミノ酸配列
とは第１図の位置１８，２７．４２，４９．５７．９６
，１０７．１１４１１５．１３５，１３８，１６６．１
７６゜１７９．１８８，１８９，１９８，２３８，２５
５．２５９，２６６、殊に１８．２７，４２５７．９６
，１０７，１１４，１１５，１３５．１３８，１６６．
２３８，２５５．２５９２６６のうちの少なくとも１つ
で又はそれらに相同の位置の１つで、該当位置に存在す
るアミノ酸が強塩基性アミノ酸により代えられている点
で異なっているアミノ酸配列を有することをコードする
高アルカリ性プロテアーゼに関する。この高アルカリ性
プロテアーゼは、５ＤＳ−ポリアクリルアミド−ゲル電
気泳動法により公知分子量の対照蛋白質に対して測定し
て分子量２６０００〜２８０００ｇ／モルを有する。

更に、範囲１０−１２．５の至適ＰＨを有し、その際至
適ｐＨとは、プロテアーゼが最大蛋白質分解活性を有す
るｐＨ範囲である。本発明によるプロテアーゼは出発プ
ロテアーゼに比べて基本的に不変の、即ち同じように良
好なｐＨ安定性を有する。本発明の優れた実施形では、
アミノ酸配列が第１図のアミノ酸配列に対して９０％以
上、特に９５％以上の相同性を有しかつ前記の位置の少
なくとも１つのアミノ酸が強塩基性アミノ酸により代え
られているプロテアーゼが存在する。

第１図に記載のアミノ酸配列に対する相同性とは、この
アミノ酸配列に対する該当するアミノ酸配列の構造的に
非常に緊密な類縁性を表わす。相同性を測定するに当っ
ては、第１図のアミノ酸配列及びそれと比較すべきアミ
ノ酸配列の構造的に相応する断片を、アミノ酸配列間の
最大の構造上の一致が生じるように相互に重ね合わせ、
その際に各アミノ酸の欠失又は挿入により生じる差違を
考慮しかつ配列断片を相応して移動させることにより調
節する。第１図の配列中に含まれるアミノ酸の総数に対
する配列中で相互に一致するアミノ酸の数が相同性（％
）を表わす。配列中での差異はアミノ酸の変異、挿入並
びに欠失によりもたらされる。

それ故、第１図に対して少なくとも８０％相同性である
プロテアーゼから得られた本発明による高アルカリ性プ
ロテアーゼでは、第１図に関して挙げたアミノ酸の位置
がそれに相同の本発明によるプロテアーゼの位置に関す
ることは明らかである。第１図に対して相同のプロテア
ーゼ中の欠失又は挿入はアミノ酸位置の相対的な移動を
可能にし、それ故相互に相同性であるアミノ酸配列の相
同性である断片において相応するアミノ酸位置の番号が
同じである必要はない。

プロテアーゼ中に導入される突然変異の数は制限されて
いない。本発明により最適化されたプロテアーゼ中では
特に前記の位置の１つ又は数個で、例えば１〜３ｆｌ！
、殊に１又は２個で強塩基性アミノ酸に代えられていて
よい。前記の位置のうちたった１つよりも多くの位置で
アミノ酸が強塩基性アミノ酸に代えられている本発明に
よる高アルカリ性プロテアーゼの例は、例えば前記の位
置の２９において、例えば位置２７及び１１５．２７及
び１３５．９６及び２６６もしくは１０７及び２３８で
該当するアミノ酸が強塩基性アミノ酸により代えられて
いる、第１図に記載したアミノ酸に対して少なくとも８
０％の相同性を有するようなプロテアーゼである。

交換位置に元来存在するアミノ酸に代わって導入される
強塩基性アミノ酸としてはアルギニン及びリジンが好適
である。特にアルギニンが有利であることが明らかにな
つＩ；。本発明により最適化された高アルカリ性プロテ
アーゼの特に有利な例としては、位置１８又は２５９の
アミノ酸がリジンにより代えられているプロテアーゼ及
び位置２７．４２，５７．９６，１０７１１４、　１１
５．　１３５．　１３８．　１６６゜２３８．２５５又
は２６６のアミノ酸がアルギニンに代えられているプロ
テアーゼが挙げられる。

本発明によるプロテアーゼを取得するには、該当するプ
ロテアーゼをコードする構造遺伝子を含有する発現ベク
ターで形質転換された微生物を培養する。発現ベクター
は後でお載の方法により得られた。この方法の開示には
第１図のプロテアーゼの配列決定も包含される。

それ故、本発明はそのような形質転換した微生物、発現
ベクター及び他のベクター、並びに第１図のプロテアー
ゼを配列決定する方法にあるいは本発明による高アルカ
リ性プロテアーゼの形成及び取得に特に重要であるプロ
テアーゼが構造遺伝子（即ちプロテアーゼをコードする
ＤＮＡ配列）をも包含する。

本発明によるＤＮＡ配列は、第１図に記載のアミノ酸配
列に対して少な（とも８０％の相同性を有しかつ該アミ
ノ酸配列とは第１図の位置１８，２７，４２．４９，５
７．９６．１０７１１４．１１５，１３５．１３８，１
６６゜１７６．１７９．１８８，１８９，１９８，２３
８．２５５．２５９．２６６の少なくとも１つで又はそ
れらに相同の位置の１つで、該当位置に存在するアミノ
酸が強塩基性アミノ酸により代えられている点で異なっ
ているアミノ酸配列を有する高アルカリ性プロテアーゼ
をコードすることをコードする。アミノ酸配列が第１図
のアミノ酸配列に対して９０％以上、特に９５％以上の
相同性を有しかつ前記の位置の少なくとも１つでアミノ
酸が強塩基性アミノ酸により代えられている高アルカリ
性プロテアーゼをコードするような本発明によるＤＮＡ
配列が優れている。特に、本発明によるＤＮＡ配列は、
前記の位置の１〜３個、殊に１又は２個におけるアミノ
酸が強塩基性アミノ酸に代えられている前記のアミノ酸
配列をコードすることができる１個以上、例えば２個の
アミノ酸が代えられている、本発明によるＤＮＡ配列に
よりコードされているプロテアーゼの例は、相応する本
発明による高アルカリ性プロテアーゼに関して既に記載
した。

本発明によるＤＮＡ配列の特別な実施形では、該ＤＮＡ
配列が、該当するアミノ酸が強塩基性アミノ酸のリジン
又はアルギニン、特にアルギニンにより代えられている
高アルカリ性プロテアーゼをコードすることをコードす
る。本発明によるＤＮＡ配列の特に有利な例としては、
位置１８又は２５９のアミノ酸がリジンにより代えられ
ている高アルカリ性プロテアーゼをコードするＤＮＡ配
列、及び位置２７，４２，５７．９６．１０７．１１４
．１１５，１３５゜１３８．１６６．２３８，２５５又
は２６６のアミノ酸がアルギニンにより代えられている
高アルカリ性プロテアーゼをコードするＤＮＡ配列が挙
げられる。

前記のＤＮＡ配列は、例えば微生物の形質転換に好適で
ある本発明によるベクター中に含まれている。これらの
ベクターは、高アルカリ性プロテアーゼの製造及び取得
に使用することのできるような微生物の形質転換に好適
である本発明によるベクター中に含有されている。有利
に、本発明によるプロテアーゼの工業生産には、前記の
本発明によるＤＮＡ配列を生産に有用な微生物のゲノム
中に組み込むこともできる。

優れているベクターはプラスミドである。ここで使用さ
れるプラスミドの一群は、β−ラクタマーゼ（マーカー
：例えばアンピシリン耐性）及びＥ、コリ（ｃｏｌｉ）
　　″複製開始点（Ｅ、コリ中でのプラスミドの増殖に
必要な遺伝情報を含有する）をコードするＥ、フリかも
のＤＮＡ配列、抗生物質耐性（マーカー：例えばカナマ
イシン−又はネオマイシン耐性）及びバチルス“複製開
始点”　（プラスミドがバチルス種中で増殖するのに必
要な遺伝情報を含有する）をバチルス・スブチリス中で
コードするＤＮＡ配列、本発明の″プロテアーゼのプロ
モータ配列及びＰｒｅｐｒ。

配列並びに本発明によるＤＮＡ配列の１つを含有する。

後で記載する方法により得られるこのようなプラスミド
は発現ベクターとして著しく好適である。記号ｐＡＬＩ
Ｎｃを有するこのような発現ベクターの例は第１４図に
図示されている。

更に、本発明によるベクターＴこは、前記の本発明によ
る発現ベクターの前駆体であるベクターが挙げられる。

変異体においては、前記の発現ベクター中に含有されて
いるすべてのＤＮＡ配列を、本発明によるプロテアーゼ
をコードする本発明による変異したＤＮＡ配列を除いて
含有する。その際、プロテアーゼＤＮＡ配列のその位置
は合成リンカ−により占められており、このリンカ−は
好適な制限エンドヌクレアーゼで切断されて全部又は一
部が除去され、かつ弓続いて残りのベクタ一部分とプロ
テアーゼＤＮＡ配列とを組換える際にこのプロテアーゼ
ＤＮＡ配列によって代えられ得る。記号ｐＡＬＩＰを有
するこのような発現ベクターの前駆体の例は第１１図の
制限地図に図示されている。合成リンカ−はこの例では
制限位ＩＮｃｏｌ　（１２０７）から制限位置ＸｂａＩ
　（１２１３）及びＡｓｐ７１８（１２１９）を介して
制限位置）ｉｉｎｄｎｌ（１２２５）まで達している。

他の変異体では、発現ベクター前駆体は付加的に、突然
変異が行なわれるべきではないようなプロテアーゼＤＮ
Ａ配列の部分も既に含有している。例えば、このような
ベクターは、プロテアーゼＤＮＡの突然変異がプロテア
ーゼ構造遺伝子のＣ末端側半分か又はＮ末端側半分のア
ミノ酸の交換により行なわれるかどうかに応じて、プロ
テアーゼＤＮＡのＮ−又はＣ末端側半分を含有する。こ
のような発現ベクター前駆体は前記のｐＡＬＩＰの前記
の発現ベクター前駆体から、合成リンカ−の一部を突然
変異していないプロテアーゼ構造遺伝子のＮ−又はＣ末
端側半分により代えることにより得られる。記号ｐＡＬ
ＩＮ（ベクターｐＡＬＩＰ中の合成リンカ−のＮｃｏＩ
／ＸｂａＩ−フラグメントの代りに挿入されている、突
然変異していないプロテアーゼ構造遺伝子のＮ末端側半
分を含有する）もしくは記号ｐＡＬｌｃ（ベクターｐＡ
ＬＩＰ中の合成リンカ−のＸｂａＩ／Ａｓｐ７１８−フ
ラグメントの代りに挿入されている、突然変異していな
いプロテアーゼ構造遺伝子のＣ末端側半分を含有する）
を有する完全発現ベクターのこれらの前駆体の例は第１
２図ないしは第１３図に図示されている。

更に、本発明によるベクターには、ファージミド（Ｐｈ
ａｇｅｍ、ｉｄ）群が挙げられ、これはプロテアーゼ構
造遺伝子の突然変異Ｎ−もしくはＣ末端側半分の取得に
使用すると有利である。例えば、好適な制限エンドヌク
レアーゼによる切断及び統〈高アルカリ性出発プロテア
ーゼのプロテアーゼ構造遺伝子の相応する半分との組換
えにより、プロテアーゼ遺伝子に含まれるプロモータ及
びＰｒｅｐｒｏ　Ｄ　Ｎ　Ａ配列を含めてＮ末端側半分
か又はプロテアーゼ構造遺伝子のＣ末端側半分が導入さ
れたファージミドが該当する。記号ｐｃＬＭＵＴＮ　ｌ
　（Ｐｒｅｐｒｏ−及びプロモータ配列を含めて、高ア
ルカリ性出発プロテアーゼの構造遺伝子の変異していな
いＮ末端側半分を含有する）ないしは記号ｐｃＬＭＵＴ
ｅ　ｌ　（高アルカリ性出発プロテアーゼの構造遺伝子
の変異していないＣ末端側半分を含有する）を有する該
ベクターの例は第５図、及び第６ｒＩ！Ｊに図示されて
いる。

更に、本発明によるベクターには、一方では高アルカリ
性出発プロテアーゼの構造遺伝子の単離、複製及び配列
決定に重要でありかつ他方では前記のベクターの形成に
必要とされる全プロテアーゼ構造遺伝子又はその一部の
供給源として有用であるクローン化−及び発現ベクター
を包含するプラスミド群が挙げられる。このベクターは
、抗生物質耐性及びバチルス中の“複製の開始点”をコ
ードするＤＮＡ配列並びに高アルカリ性出発プラスミド
のプロモーター、Ｐ「−ｅｐｒｏ−及びＤＮＡ配列を含
有する。記号ｐ　ＣＬＥＡＮＯもしくはｐＣＬＥＡＮ４
を有するそのようなプラスミドの例は第２図及び第３図
の制限地図で図示されている。

本発明による微生物は、前記の本発明にょるベクターで
形質転換されていることをコードする。本発明によるベ
クターの情報を発現することのできるすべての微生物が
好適である。本発明による微生物には、本発明によるプ
ロテアーゼの生産に好適な形、質転換された微生物並び
に後記の配列決定及びＤＮＡ配列突然変異の方法の範囲
において初めて生成された形質転換微生物も含まれる。

プロテアーゼ産生用形質転換微生物を取得するには、本
発明による発現ベクターで形質転換しかつ高アルカリ性
プロテアーゼの産生に好適である微生物を使用すること
ができる。これにはプロテアーゼ産生細菌、殊にバチル
ス種が挙げられるが、例えば本発明による発現ベクター
で形質転換するのに好適であって、ただしそれ自体でプ
ロテアーゼを産生じないで形質転換によって初めて産生
能を獲得する細菌のような微生物も挙げられる。アルカ
リ性又は高アルカリ性プロテアーゼを産生ずる細菌もし
くは本発明による発現ベクターで形質転換したプロテア
ーゼ欠損変異株が特に優れている。

このような細菌は特にバチルス種であり、例えばバチル
ス・スブチリス、バチルス・リケニフオ／レミス、バチ
ルス・アミ口すケ７アンエンスである。他の本発明によ
る微生物は例えば本発明によるベクターで形質転換しｆ
：　Ｅ　、コリ種の細菌である。特に、この微生物は、
本発明によるベクターの構成法で使用するのに好適であ
りその際に該微生物はこのベクターの選択及び複製に常
用であり、並びに配列決定及び目的の突然変異誘発法で
使用するのに好適であり、その際に該微生物は一本鎖Ｄ
ＮＡ配列の取得に有用である。

更に、本発明は、本発明による高アルカリ性プロテアー
ゼ少なくとも１種を含有する洗剤を包含する。この用途
のために、本発明は公知のプロテアーゼに比べて改良さ
れた個々の性質を有する新規高アルカリ性プロテアーゼ
群を開示しており、この群から特に必要とされる性質（
洗浄効率、温度安定性、他の成分との認容性）に応じて
、それぞれの洗剤Ｒ製に特に好適な本発明によるプロテ
アーゼを選択することができる。本発明によるプロテア
ーゼは、洗剤の調製、特に粉末洗剤の調製において単独
に使用するかもしくは所望の場合には相互に組合せて、
場合により技術水準の洗剤プロテアーゼ又は他の常用の
洗剤酵素、例えばアミラーゼ、リパーゼ、ベクチターゼ
、ヌクレアーゼ、オキシドレダクターゼ等と組合せて使
用することもできる。

本発明によるプロテアーゼは洗剤の調製の際に洗剤酵素
に常用の量、特に３重量％までのｉ（全組成物の乾物に
対して）、殊に０，２〜１．５Ｍ量％の量で使用する。

前記の洗剤酵素以外に、本発明による洗剤は技術水準で
常用のすべての洗剤成分、例えば界面活性剤、漂白剤又
は骨格物質（ビルダー）並びに洗剤の調製に常用の他の
助剤を常用量で含有してもよい。助剤としては、例えば
補強剤、酵素安定剤、汚れキャリア及び／又は相溶性化
ギｆ、錯体−及びキレートビルダー、泡調製剤及び添加
物、例えば光学的増白剤、不透明化剤、防腐剤、帯電防
止剤、色素、殺菌剤、漂白剤活性剤、過酸漂白剤前駆物
質が挙げられる。

本発明による洗剤調剤は代表的な組成例において乾物に
体して次の通りである： ａ）界面活性剤又はその混合物少なくとも５重量％、例
えば１０〜５０重量％、 ｂ）ビルダー又はビルダー混合物４０重量％Ｃ）漂白剤
又は漂白剤混合物、殊に過硼素酸ナトリウム四水和物又
は過硼素酸ナトリウムー水和物のような過硼素酸＠４０
重量％まで、 ｄ）本発明によるグロテアーゼ少なくとも１１１３重量
％まで、及び ｅ）助剤のような他の成分全ｔｌｏｏ重量％洗剤調剤は
常法で調製することができる。例えば本発明によるプロ
テアーゼはそのために顆粒、プリル状物（Ｐｒ１ｌｌ）
又はペレット状物の形で、場合により表面皮膜を施して
、洗剤調剤の他の成分と公知の方法で混合することがで
きる。

更に、本発明は、第１図にお載されている出発プロテア
ーゼのアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の相同性
を有しかつ該アミノ酸配列とは第１図の位置１８，２７
．４２．４９，５７．９６，１０７，１１４，１１５，
１３５゜１３８．１６６．１７６．１７９，１８８，１
８９．１９８，２３８，２５５，２５９，２８６　殊に
１８．２７，４２．５７，９６，１０７．１１４，１１
５，１３５，１３８．１６６２３８．２５５，２５９，
２６６のうちの少なくとも１つで又はそれらに相同の位
置の１つで、該当位置に存在するアミノ酸が強塩基性ア
ミノ酸により代えられている点で異なっているアミノ酸
配列をコードするＤＮＡ配列を有するベクターを含有す
る、本発明により形質転換した微生物を用いて本発明に
より最適化した高アルカリ性プロテアーゼの製法を包含
する。本発明により形質転換しｔ：微生物を培養しかつ
該培地から、Ｍ１５！：Ｉの出発プロテアーゼのアミノ
酸配列とは前記の位置の少なくとも１つにおいてアミノ
酸が強塩基性アミノ酸により代えられて異なっているア
ミノ酸配列を有する至適高アルカリ性プロテアーゼを単
離する。この方法では、高アルカリ性プロテアーゼのア
ミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を有するベクターを
含有する微生物を使用すると有利であり、その際にこの
プロテアーゼのアミノ酸配列は第１図のアミノ酸配列に
対して９０％以上、特に９５％以上の相同性を有しかつ
アミノ酸配列中で記載の位置の少なくとも１つのアミノ
酸が強塩基性アミノ酸により代えられている。

前記の方法で使用する微生物の生成は次のようにして行
なうことができる： ａ）初めに、第１図のアミノ酸配列に対して少なくとも
８０％、殊に９０％以上、特に９５％以上の相同性を有
するアミノ酸配列を含有する高アルカリ性プロテアーゼ
を産生ずる好適な細菌から、該プロテアーゼをコードす
るＤＮＡ配列（即ちプロテアーゼの構造遺伝子）を単離
する、 ｂ）このＤＮＡ配列のヌクレオチド順序を測定する、 Ｃ）公知になったＤＮＡ配列において、変異したＤＮＡ
配列が、元のプロテアーゼのアミノ酸において前記の位
置で強塩基性アミノ酸に代えられている高アルカリ性プ
ロテアーゼをコードするように変異（点変異）を誘発さ
せる、 ｄ）次に、変異させたＤＮＡ配列を用いて発現ベクター
を生成する、かつ ｅ）得られた発現ベクターを、最終的に変異高アルカリ
性プロテアーゼの製造に使用することのできる好適な微
生物中に形質転換する。

本発明による高いアルカリ性プロテアーゼの構成及び取
得の方法工程並びにその際に得られる、一部本発明の目
的でもある、ＤＮＡ配列、ベクター、特に発現ベクター
及び形質転換した微生物・という形の中間産生物につい
て次に詳説する。

第１図に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％
の相同性を有する高アルカリ性プロテアーゼのアミノ酸
配列をコードする構造遺伝子は公知の一般的方法により
得られる。このために、例えば細菌（“供与体細菌”）
、特に高アルカリ性プロテアーゼを産生するバチルス種
から染色体ＤＮＡを公知方法により単離しかつ好適な制
限エンドヌクレアーゼで部分的に加水分解する。制限エ
ンドヌクレアーゼは、基質特異的に２本鎖のＤＮＡの個
々のヌクレオチド骨格の間のホスフェート−ジエステル
結合を分解することにより７ラグメントに切断する酵素
である。すべての制限エンドヌクレアーゼは、該当する
制限エンドヌクレアーゼの活性にとって特異的作用位置
（切断位置）を標識するＤＮＡの一定の塩基対を認識す
ることができる。二本ｍＤＮＡを切断（制限）する際に
、いくつかの制限エンドヌクレアーゼでは特異的な所謂
“突出している末端″が生じ、これは一定の変性条件下
に再び相互に又は他の方法で得られたＤＮＡ７ラグメン
トの相応する（相補性の）突出している末端と結合（連
結）し得る（組換え）。

他の制限エンドヌクレアーゼで切断する際に、平らな末
端を有するＤＮＡ二本鎖が生成する。

平らな末端を有するこのＤＮＡ二本鎖は、同様に平らな
末端を有する任意のＤＮＡ二本鎖と組換えることができ
る。

得られｔ；供与体ＤＮＡの制限フラグメントは、例えば
ゲル電気泳動により大きさで分離することができ、その
後所望の大きさのフラグメントを好適な二本鎖ベクター
ＤＮＡと組換えることができる。

ベクターは、外来ＤＮＡを宿主細胞中に導入（形質転換
）するための運搬分子（ビヒクル）として好適であり、
そこで場合により自動的に複製可能でありかつ場合にに
より所謂マーカーを有するＤＮＡ分子である。マーカー
は、一定の観察可能な性質（例えば抗生物質耐性）をコ
−ドしかつ次に形質転換された微生物（形質転換体）の
選択に有用であるＤＮＡ７ラグメントである。しばしば
使われるベクターは所謂プラスミドであり、即ち染色体
外の環状二本鎖細菌ＤＮＡであり、これは適当な方法で
他の微生物中に導入することができかつそこで増殖させ
ることができる。

試験管内で組換えたＤＮＡ　（ベクター十供与体ＤＮＡ
の制限フラグメント）を用いて細菌、殊にバチルス種を
形質転換しかつ形質転換体を公知のマーカー特性（例え
ばネオマイシン耐性）により選択することができる。こ
のようにしてクローン、即ち遺伝学的に同一の形質転換
体が得られる。これらの形質転換体中で、プロテアーゼ
を多く分離するものを蛋白質含有プレート上でさがしか
つ単離することができる。最後に、プロテアーゼ活性を
有するクローンから、これらの形質転換体中に導入した
プラスミドＤＮＡを単離し、かつ細菌を改だに形質転換
することにより、プロテアーゼ活性がプラスミド結合し
ているか、即ちプロテアーゼ活性がマーカー特性と結合
しているかを調べる。

このように単離したプラスミドは、公知の制限位置を有
するベクターＤＮＡ七共に、最適化すべき高アルカリ性
出発プロテアーゼの所望の構造遺伝子及びこの場合には
必要とされない他の供与体細菌からのＤＮＡ配列を含有
する。記号ｐＣＬＥＡＮ　Ｏを有するこのベクターの例
は第２図に図示されている。

次に、最適化すべき高アルカリ性プロテアーゼの構造遺
伝子を配列決定するための経費をできる限り低くするた
めには、本来の配列決定の前に、供与体ＤＮＡ配列から
不必要なＤＮＡ配列を除去しかつ供与体ＤＮＡ配列を基
本的にプロテアーゼの構造遺伝子に減することが推奨さ
れる。このためには、例えば構造遺伝子及び付加的なＤ
ＮＡ配列を包含するプラスミドを一連の異なる制限エン
ドヌクレアーゼで切断（制限）シ、得られたＤＮＡフラ
グメントをゲル電気泳動により大きさで分離しかつ見出
されたバンドパターンに基いて制限地図を作成する。こ
のようにして、供与体ＤＮＡ配列の範囲机固定している
制限位置が確定される。プラスミドの制限地図の作成に
より、プラスミドから選択した制限エンドヌクレアーゼ
で切断することにより、基本的に高アルカリ性プロテア
ーゼの構造遺伝子、それに関連するＰｒｅ−及びＰｒｏ
単位並びに遺伝子発現に必要なプロモータ単位を包含す
る、供与体ＤＮＡ配列からのＤＮＡフラグメントを切断
することができる。

大きさが減じた供与体ＤＮＡ配列を好適なベクター中に
再導入することにより新規な複製可能なベクターが得ら
れ、このベクターの高アルカリ性出発プロテアーゼ発現
能は、細菌、特にバチルス種をこのベクターで形質転換
し、得られｔ；形質転換体を培養しかつプロテアーゼ活
性についてチエツクすることにより検査することができ
る。記号ｐＣＬＥＡＮ　４を有するこのようなベクター
の例は第３図に図示されている。

プロテアーゼ構造遺伝子のヌクレオチド配列の測定（配
列決定）に当っては、初めに前記のベクターを好適な微
生物中で複製し、かつプロテアーゼ遺伝子を単離する。

その後で、プロテアーゼ遺伝子をファージミド中にサブ
クローン化し、かつ引続いて得られた７アージミドを好
適な微生物、例えばＥ、コリ中に形質転換し、かつ形質
転換体を培養することによりプロテアーゼ遺伝子を含有
する一本鎖ＤＮＡを産生する。形成された一本鎖ＤＮＡ
を単離しかつ配列決定を行なう。配列決定は公知方法で
行ない、つまり例えばプロテアーゼ遺伝子を含有する一
本鎖ＤＮＡをマクサム・ギルバー）　（Ｍａｘａｍ、　
Ｇ１−１ｂｅｒｔ　）法により塩基特異的部分的化学分
解にもたらす［Ｌ、ｌＣｒｏｓｓｍａｎｎ、　Ｋ、Ｍｏ
１ｄａｖｅ、“Ｍｅ　ｔｈｏｄｓｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌ
ｏｇｙ　”　　６５巻、４９９頁（１９８０年）　、　
Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ　Ｉｎｃ、　　にューヨ
ーク及びロンドン在）出版］かもしくは例えばプロテア
ーゼ遺伝子を含有する一本鎖ＤＮＡを、サンガー及びブ
ラウンリー（Ｓａｎｇｅｒ　−Ｂｒｏｗｎｌｅｅ）によ
るジデオキシ・チェーンターミネイター法［“　Ｐｒｏ
ｃ、　Ｎａｔｌ、　　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　　Ｕ　Ｓ
　ＡＭ　　７４巻、５４７３頁（１９７７年）１により
相補性ＤＮＡ鎖の断片の部分合成用マトリックスとして
使用する。

決定したヌクレオチド配列を、遺伝コード（３文字−コ
ドンは一定のアミノ酸を表わす）によりプロテアーゼの
アミノ酸配列に翻訳することができる。成熟プロテアー
ゼ酵素（即ちＰｒｅ−及びＰｒｏ単位を含まない酵素）
のアミノ酸配列の開始点を測定するには、成熟プロテア
ーゼのＮ末端でアミノ酸配列の短い部分片を公知のペプ
チド中のアミノ酸配列測定法により測定する。明らかに
なったＮ末端アミノ酸配列を遺伝コードに基いて前記の
ヌクレオチド配列の相応する部分片に関連させかつこの
ようにして成熟プロテアーゼをコードするＤＮＡ配列の
開始点を決定する。プロテアーゼの他のアミノ酸の順序
は必然的にＤＮＡ配列から遺伝コードを用いて引続くア
ミノ酸を関連させることにより判明する。

本発明により、プロテアーゼをコードするＤＮＡ配列を
相応するコドンの交換により、第１図のアミノ酸配列の
位置１８，２７．４２．４９．５７．９６，１０７，１
１４，１１５，１３５．１３８，１６６．１７６．１７
９，１８８．１８９，１９８，２３８，２５５．２５９
２６６、殊に１８．２７．４２，５７，９６１０７．１
１４，１１５，１３５，１３８゜１６６．２３８，２５
５，２５９．２６６の少なくとも１つか又はそれに相同
の位置の１つで該尚するアミノ酸が強塩基性アミノ酸に
より代えられている変異したＤＮＡ配列が至適高アルカ
リ性プロテアーゼをコードするように変異する。

本発明により交換可能なアミノ酸はプロテアーゼ分子の
表面領域で、プロテアーゼ分子の２次−及び３次構造の
維持に重要であるプロテアーゼの触媒中心が交換によっ
て実質的に作用されないような位置に存在する。

本発明により、例えば出発プロテアーゼに対して変らな
いｐＨ安定性を有するが、特異的な条件（洗剤の塁、温
度等）下では改良された洗濯性を有する、至適ｐＨ１ｏ
〜１２，５を有する最適化された高アルカリ性プロテア
ーゼが開示される。

高アルカリ性プロテアーゼをコードするＤＮＡ中への点
変異の導入は公知の突然変異法により実施する。このた
めに、好適なベクター（ファージミド）、例えば第５図
のｐＣＬＭＵＴＮ　ｌ又は第６図のｐＣＬＭＵＴＣＩか
ら、場合によりヘルパーファージを一緒に使用して、全
構造遺伝子かあるいは有利に元のプロテアーゼの構造遺
伝子の、突然変異を行なおうとする部分（例えばＮ末端
部分もしくはＣ末端部分）だけを含有する環状−水銀Ｄ
ＮＡを生成する。この環状−水銀ＤＮＡを用いて、所望
の点変異位置において、そこのコドンが元のこの位置の
アミノ酸に比べて強塩基性のアミノ酸、例えばアルギニ
ン又はリジンをコードするように選択されているヌクレ
オチド骨格を宵する合成交雑性オリゴヌクレオチドを交
雑する。付加的に、このオリゴヌクレオチドは交雑すべ
き元のヌクレオチド配列とは１個又は数個の他のヌクレ
オチド骨格により、元のアミノ酸配列のコード付けが遺
伝コードの変性範囲では保持されるが元のプロテアーゼ
ヌクレオチド配列中では場合により存在する制限位置が
合成オリゴヌクレオチドでは除去されもしくは他の制限
位置が合成オリゴヌクレオチド中に導入されるように変
換されている。除去もしくは導入された制限位置は後に
、出発ＤＮＡ配列に対して変異体ＤＮＡ配列を好適な制
限エンドヌクレアーゼにより固定するのに有用である。

別法においては、目的の突然変異法においてウラシル化
−末鎖ＤＮＡをマトリックスとして生成しかつ合成オリ
ゴヌクレオチドとの交雑に使用する。目的の突然変異法
の反応の終結後に、変異ＤＮＡ鎖（ベクター）を生成す
るためのマトリックスとして有用なウラシル含有ＤＮＡ
−末鎖をウラシル−Ｎ−グルコシラーゼで処理すること
により除去することができ、その際に変異体の表現型選
択の必要はない。グルコシラーゼ処理は単離した酵素で
も、また変異したベクターＤＮＡで形質転換した、ウラ
シル−Ｎ−グルコシラーゼ活性を有するｔＦＦ適な微生
物を用いても実施することができる。

交雑により得られた部分的に二本鎖のＤＮＡ配列を完全
な二本鎖に補完するためには、必要なヌクレオチドの添
加により及びＤＮＡポリメラーゼ及びＤＮＡリガーゼの
作用下に実施する。次に、生成した環状の二本Ｉ　Ｄ　
Ｎ　Ａ配列をベクターとして好適な微生物中に形質転換
しかつ十分に複製した後で変異ＤＮＡ配列を単一（ｕｎ
−ｉｔａｅｒ　）のＭ＠エンドヌクレアーゼ認識位置に
ついて同定し、かつ引続いて単離する。ウラシル化−水
銀ＤＮＡを使用する場合は、複製を例えばＥ、コリ菌株
中で行ない、殊にこの菌株は突然変異法で生成した二本
鎖ベクターの、変異させた非つラシル化ＤＮＡ鎖を増殖
する。これにより、変異ＤＮＡベクターの選択が更に簡
単化される。

目的の突然変異に必要な合成オリゴヌクレオチドは公知
方法により製造する。例えば、サイクロン・シンセタイ
ザ（Ｂｉｏｒｅｓｅａｒｃｈ）中でβ−シアノエチル−
ホスホラミジットを用いてオリゴヌクレオチドを製造す
ることができる［Ｓ、ＬＢｅａｎｃａｇｅ及びＩＪ、Ｈ
，Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ共著、　　Ｔｅｔｒ−ａｈｅｄｒ
ｏｎ　Ｌｅｔｔａｒｓ　”　　２２巻、１８９５〜１８
６２頁（１９８１年）］。得られたオリゴヌクレオチド
は例えばポリアクリルアミドゲルからの溶離及び場合に
より引続いて行なうセファデックスカラムによる脱塩に
より精製しかつ更に使用する。合成オリゴヌクレオチド
は前記の突然変異法におけるＤＮＡポリノラーゼ用のプ
ライマーとして直接使用することができる。合成オリゴ
ヌクレオチド配列は、例えばアミノ酸約７〜１０個をコ
ードするヌクレオチド骨格２０〜３０個を包含する。勿
論、前記の交雑に長いヌクレオチド配列を使用すること
もできるが、短鎖の合成オリゴヌクレオチドの十分な交
雑性が保障されている場合は他の利点をもたらさない。

しかし２個又はそれ以上の突然変異を隣接位置で行なお
うとする場合は特に長し）ヌクレオチド配列が該当する
。このオリゴヌクレオチドはモノヌクレオチドからその
ものとして合成するか又は好適な短いオリゴヌクレオチ
ド配列力）らの合成により製造することができる。しか
しながらこれは強制的なものではない。それと＋、１う
のも２個又はそれ以上の突然変異は例え１ｆフロテアー
ゼＤＮＡのＮ末端部分又はＣ末端部分で２個又はそれ以
上の好適なオリゴヌクレオチド配列を用いて連続して突
然変異することによっても実施することができる。更に
、二重変異（Ｄｏｐｐｅｌｍｕｔａｔｉｏｎ　）は、本
発明番こよる高アルカリ性プロテアーゼのＣ末端もしく
（まＮ末端をコードする、変異したＣ末端ＤＮＡフラグ
メントとＮ末端ＤＮＡフラグメントとの組合せ↓こよっ
ても行なうことができる。

前記の突然変異法により得られた、突然変異を有する環
状二本鎖Ｄ　Ｎ　Ａ配列は、好適な制限エンドヌクレア
ーゼで処理すること（こよりそれぞれに応じて変異プロ
テアーゼ構造遺伝子全部又はプロテアーゼ構造遺伝子の
変異部分を切断しかつ好適な発現ベクター中に導入（サ
ブクローン化）することのできる変異ベクターであるこ
の発現ベクターを用いて好適な微生物、例えばバチルス
種を形質転換し、次に発現させかつ変異高アルカリ性プ
ロテアーゼを取得するために好適な条件下に培養する。

本発明の優れた実施形では、全構造遺伝子を目的の突然
変異に使用するのではなく、突然変異させるべき部分だ
けを使用する。構造遺伝子の複製に有用であるベクター
から、例えば構造遺伝子のＮ末端側又はＣ末端側半分を
好適な制限エンドヌクレアーゼで切断しかつ好適なファ
ージミド中にサブクローン化する。こうしてベクターが
得られ、このベクターはプロテアーゼの構造遺伝子のＮ
末端側半分か又はＣ末端側半分を含有しかつ好適な微生
物、例えばＥ、コリ中で初めて十分に複製され、次に前
記の突然変異にもたらされる。構造遺伝子の部分片の突
然変異は、短い一本鎖ＤＮＡ配列を使用することができ
、それ故合成オリゴヌクレオチドとの交雑工程により部
分的ＤＮＡ二本鎖において全ＤＮＡ配列を使用する場合
よりも著しく少ないヌクレオチドが補完されるという利
点を有する。

これにより、合成上の経費が付加的に不所望な偶然の変
異の危険が軽減する。更に、後にプロテアーゼＤＮＡ配
列の変異したＮ末端側及びＣ末端側の半分を組合せるこ
とによりプロテアーゼＤＮＡ配列中で簡単に二重変異を
誘発することができる。

変異したＤＮＡ・配列は、変異の誘発に使われるクロー
ン化用ベクターから好適な制限エンドヌクレアーゼによ
り切断し、かつ相応する制限位置を有し、高アルカリ性
プロテアーゼの発現に必要な発現ベクターの前駆体であ
るベクター中に導入することができる。このベクターは
、好適な制限位置く例えば合成リンカ−から）以外に、
宿主微生物中でプロテアーゼ発現に必要である調節配列
、シグナル配列、プロモータ配列及びプロテアーゼのＰ
ｒｅ−及びＰｒｏ単位をコードするＤＮＡ配列を含有す
るように構成されている。

変異ＤＮＡ配列をそのようなベクター中にサブクローン
化することにより、至適高アルカリ性プロテアーゼの固
有の発現ベクターが得られる。変異ＤＮＡ配列を発現ベ
クターのこの前駆体中に導入する仕方は、好適な解読わ
くを有する発現ベクターが生成するように行なう。この
際に、プロテアーゼをコードするＤＮＡ配列の変異部分
片、例えばＣ末端部分片又はＮ末端部分片をその都度の
残りの変異されていないか又は場合によっては変異され
ている（多重変異の誘発）部分片を含有するベクター中
に導入することができ、あるいはプロテアーゼをコード
する変異ＤＮＡ配列全部を、このプロテアーゼＤＮＡ配
列の部分片を含有していないベクター中に導入する。変
異されていないか又は場合によっては変異されているＤ
ＮＡ配列の部分片を含有する、そのような発現ベクター
の前駆体ベクターの例は、記号ｐＡＬＩＮ及び　ｐＡＬ
　Ｉ　Ｃを宵するベクターであり、それらの制限地図は
第１２図及び第１３図に図示されている。プロテアーゼ
ＤＮＡ配列の部分片を含有していないベクターは第１１
図に図示した制限地図を有するベクター　ｐ　ＡＬＩＰ
である。

本発明の優れた別法（Ｎ末端側半分又はＣ末端側半分で
の突然変異）のための発現ベクター前駆体は例えば次の
ようにして得られる。初めて、バチルス・プラスミド中
にポリクローン化位置を導入する。このようにして得ら
れたプラスミドを制限し、かつマーカー及び複製に重要
な配列部分を含有するＥ、コリプラスミドフラグメント
と組換える。引続いて、場合により、後からの方法工程
を妨害するかもしれない制限位置を例えば突然変異によ
り除去する。このようにして得られたプラスミドから新
規のベクターを構成し、このベクターはバチルスプラス
ミド及びＥ、コリプラスミドから複製に有用なＤＮＡ配
列、プロモータのＤＮＡ配列、プロテアーゼのＰｒｅ　
−Ｐｒｏ配列をコードするＤＮＡ配列（例えば第３図の
ｐＣＬＥＡＮ　４から得られる）及び合成リンカ−を含
有する。記号ｐＡＬＩＰを有するそのようなプラスミド
の例は第１１図に図示されている。その際に、合成リン
カ−は、好適な制限エンドヌ久しアーゼで切断した後で
、元の構造遺伝子全部もしくは変異構造遺伝子全部もし
くは構造遺伝子の変異した又は変異していない部分片と
組合せることができるように選択する。例えば構造遺伝
子の変異したＮ末端側半分と組換える発現ベクター前駆
体を製造するに当って、前記のバチルス配列、Ｅ、コリ
配列、プロテアーゼのプロモータ配列及びＰｒｅ　−及
びＰｒｏ配列並びに合成リンカ−を含有する前記のよう
に構成したベクター中に、合成リンカ−の切断により例
えば初めに突然変異していない又は場合によって既に突
然変異した（例えばプロテアーゼＤＮＡ配列のＣ−及び
Ｎ末端部分で突然変異を有するプロテアーゼの誘発のた
めに）プロテアーゼの構造遺伝子のＣ末端側半分を導入
する。このようにして前記の第１３図のｐＡＬｌｃ型の
ベクターが得られる。引続いて、合成リンカ−を再度切
断することにより、プロテアーゼ構造遺伝子の、なお欠
損している変異したＮ末端側半分を導入する。このよう
にして、第１４図のｐＡＬ　ＩＮｃ型のベクターが得ら
れる。逆の場合も同様のことが該当する。初めに、変異
していないか又は場合により既に変異したＮ末端側半分
を第１３図のｐＡＬ　Ｉ　Ｐ型のベクター中に導入しか
っこのようにして得られた第１２図のｐＡＬＩＮ型のベ
クター中に後から変異させたＣ末端側半分を導入して、
同様に第１４図のｐＡＬＩＮｃ型のベクターが得られる
。

前記の発現ベクターで好適な細菌、殊にバチルス種、特
にバチルス・スブチリス、Ｂ、リヶニフォルミス及びＢ
、アルカロフイルスを形質転換する。引続いて、形質転
換体を公知方法で培養しかつ形成した高アルカリ性プロ
テアーゼを培地から単離する。このために、発現ベクタ
ーを固有プロテアーゼ形成能を有する細菌中にかつまた
プロテアーゼ欠損細菌（固有プロテアーゼを形成しない
）中に形質転換させることができる。固有のプロテアー
ゼを形成する宿主微生物の場合、本発明による高アルカ
リ性プロテアーゼは所望の場合引続いて精製処理、例え
ば高性能液体クロマトグラフィ（ＨＰ　Ｌ　Ｃ）により
、形成した固有プロテアーゼから分離することができる
。これに対して、このような精製工程はプロテアーゼ欠
損宿主微生物で省略することができる。それというのも
この微生物は本発明によるプロテアーゼだけ（又は主に
それだけ）を形成することができるからである。

次に、本発明を代表的な実施例により詳説するが、本発
明はこれによって限定されるものではない。

実施例を簡明にするために、しばしばくり返される方法
及び摂念を次に詳説しかつそれぞれの実施例では略語で
表わす。特に記載のない限り、一般１こマニアチス及び
その他により記載されているような方法で操作した［Ｔ
、　ＩＪａｎｉａｔｉｓ。

Ｅ、　Ｆ、　Ｆｒ１ｔｓｃｈ、　Ｊ、　Ｓａｍｂｒｏｏ
ｋ共著、Ｍｏ　１ｅｃｕ　ｊａｒＣｌｏｎｉｎｇ、　Ａ
　　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　１ｊａｎｕａｌ、　Ｃｏ１
ｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
　（１９８２年）］使用した出発ベクターは市販されか
つ制限なしに入手し得るか、又は入手可能なベクターか
ら公知方法で製造することができる。

使用した種々の制限エンドヌクレアーゼは技術水準から
のものでありかつ市販されている。

これらの公知の制限エンドヌクレアーゼを使用する際に
それぞれ必要な反応−１補助因千−及び他の条件も同様
に公知である。例えばベクター又はＤＮＡフラグメント
約１μｇの量に対しては緩衝溶液約２０ｐＱ中の制限エ
ンドヌクレアーゼで１単位（＝ＩＵΔｕｎｉｔ）を使用
することができる。３７°Ｃで約１時間の十分な恒温保
持時間を一般に保持したが、恒温保持条件は記載の要件
に適応させることができる。制限エンドヌクレアーゼと
共に恒温保持しｔ；後で、蛋白質を抽出（例えばフェノ
ール及びクロロホルムを用いて）することにより除去し
かつ切断ＤＮＡを（例えば水性フラクションからエタノ
ールで沈殿させることにより）単離しかつ更にそれを使
用した。

制限エンドヌクレアーゼによるベクターの切断に続いて
、場合により５′−ホスフェート末端基をアルカリ性ホ
スファターゼにより加水分解（脱りン厳）することがで
きる。これにより、切断の際に生成した制限ＤＮＡ又は
制限ベクターの末端がそれ自体と連結して、外来ＤＮＡ
フラグメントの制限位置への望ましい挿入が妨害される
ことを回避することができる。実施例において５′末端
の脱リン酸を行なう場合、これは公知方法で行なった。

脱リン酸を実施するためのこれ以上の記載及びそれに必
要とされる反応成分については前記のマニアチス等によ
る文献（１３３〜１３４頁）から明らかである。

部分加水分解は制限エンドヌクレアーゼによるＤＮＡの
不完全な消化を表わす。その際に、反応条件は、ＤＮＡ
基質中で使用した制限工ンドヌクレアーゼに関してすべ
てではなく、いくつかの認識位置で切断されるように選
択する。

例えばＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼ処理した後で、
一定のＤＮＡフラグメントを取得しかつ単離するために
、生成ＤＮＡフラグメントを公知方法でゲル電気泳動（
例えばアガロースゲル上で）により分離し、次に分子量
（公知の分子量の参照ＤＮＡフラグメントとの比較によ
り測定）を介して固定しかつ所望のＤＮＡ７ラグメント
を相応するゲルゾーンから分離する。

Ｅ、コリからのＤＮＡポリメラーゼＩのフレノウ−フラ
グメントによる処理とは、ＤＮＡ二本鎖の突出している
５′末端のヌクレオチドに相補性であるヌクレオチドに
より、二本鎖ＤＮＡの内側３′末端を充填する方法であ
る。この方法は、例えば二本鎖ＤＮＡを制限エンドヌク
レアーゼで切断することにより生成する内側ＤＮＡ鎖末
端をヌクレオチドで充填して、例えば連結するのに必要
な平らなＤＮＡ二本鎖末端を生成する場合に使用する。

フレノウ−フラグメントによる処理は、好適な相補性ヌ
クレオチドを充填すべきＤＮＡと、Ｅ、コリＤＮＡポリ
メラーゼ１の十分な触媒活性を有するフレノウフラグメ
ントの存在において反応させる（例えば１５℃で１５分
間）ことにより行なう。フレノウ−フラグメント並びに
フレノウ処理に必要な他の反応成分は技術水準において
知られておりかつ市販されている。フレノウ処理に関す
る詳細は例えばマニアチス等には文献（１０７〜１０８
頁）から明らかである。

連結とは、ＤＮＡフラグメント間のホスホジエステル結
合の形成法である（例えばマニアチス等には文献１４６
頁参照）。連結は、例えば緩衝液中でほぼ等モル量の連
結すべきＤＮＡフラグメント０．５μｇ当りＴ４−ＤＮ
Ａ−リガーゼ約ｌθ単位を用いて公知条件下に実施する
ことができる。

形質転換とは微生物中へのＤＮＡの挿入であり、ＤＮＡ
を微生物中で複製もしくは発現させることができる。Ｅ
、コリの転質転換には、マンデル（Ｍａｎｄｅｌ）及び
その他Ｅ″Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ。

５３巻、１５４頁（１９７０年）］又はマニアチス等（
２５０〜２５１頁）による塩化カルシウム法が好適であ
る。バチルス種には例えばアナグツストポラス（Ａｎａ
ｇｎｏｓｔｏｐｏｌｏｕｓ）及びその他〔“Ｊ、　Ｂａ
ｃｔ、”　　８１巻、７ｇ／〜７４６頁（１９６１年）
］による方法が好適である。

リンカ−は、制限エンドヌクレアーゼのいくつかの認識
位置を有しかつＤＮＡフラグメントの結合に好適である
短鎖二本鎖ＤＮＡフラグメントである。リンカ−は、例
えばＤＮＡフラグメントをベクターに組換える際に使用
しかつ一定の制限エンドヌクレアーゼの認識位置をこの
ベクター中に導入するのに使用することができる。

ポリクローン化位置くポリリンカー）は、多数の制限エ
ンドヌクレアーゼの認識位置を緊密に隣接して有する短
いものから中程度までの二本１ＤＮＡフラグメントであ
る。実施例で使用する、ベクターＭ１３ｔｇ１３１に由
来するポリクローン化位置は例えば大きさ約０．０７Ｋ
Ｂ（キロ塩基対）を有しかつ１４個の異なる制限エンド
ヌクレアーゼのための認識位置を有する。

例１で使用しかつバチルス・アルカロフィルスＩＡＩと
命名されたバチルス・アルカロフィルス菌株はドイツ微
生物保存機関（ＤｅｎＬｓｏｈｅＳａｍｍｌｕｎｙ　ｖ
ｏｎ　Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ　：　Ｄ　Ｓ　
Ｍ　）に０５Ｍ５４６６として１９８９年７月２４日に
寄託されている。

例　　ｌ Ｂ、アルカロフィルスからのゲノムのＤＮＡライブラリ
ーの製造及び高アルカリ性出発プロテアーゼの遺伝子の
単離 天然分離物バチルス・アルカロフィルスＨＡｌ（ドイツ
微生物保存機関に０５Ｍ５４６６で寄託）からサイトウ
及びその他による方法〔“Ｂｉｏｃｈｉ＋ｎ　、　Ｂｉ
ｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ”　７２巻、６１９〜６２９頁
（１９６３年）］により染色体ＤＮＡを単離しかつ制限
エンドヌクレアーゼ５ａｕ３Ａで部分的に加水分解した
。制限フラグメントをアガロースゲル上で電気泳動する
ことにより分離しかつ大きさ３〜８ＫＢの７ラグメント
を単離した。

バチルス・アルカロフィルスＩＡＩからの大きさで選択
単離したＤＮＡフラグメントをプラスミドｐＵＢ１１０
（例９に記載したように製造）のベクターＤＮＡと試験
管内で組換えた。

このために初めにプラスミドｐＵＢｌｌｏを制限エンド
ヌクレアーゼＢａｍＨＴで制限し、９続いて子牛の腸か
らのアルカリ性ホスファターゼで脱リン酸した。制限し
かつ脱りン酸したベクターＤＮＡ２μｇをＢ、アルシロ
フィルスＤＮＡフラグメント８μｇと全容量１００μＱ
でＴ４−ＤＮＡリガーゼと共に１６℃で２４時間恒温保
持した。

得られた試験管内組換えＤＮＡを用いて菌株バチルス・
スブチリスＢ　Ｄ　２２４　（ＢａｃｉｌｌｕｓＧｅｎ
ｅｔｉｃ　５ｔｏｏｋ　Ｃｅｎｔｅｒ　Ｉ　Ａ　４６　
）のプロトプラストをＳ、チャン（Ｃｈｏｎｇ）及びＮ
、コーエン（Ｃｏｈｅｎ）により記載された方法［Ｍｏ
１．Ｇａｎ、　Ｇｅｎｅｔ、、１６８巻、１１１−１１
５頁（１９７９年）］により形質転換した。形質転換体
をネオマイシンを含むプレート上で選択し、引続いて脱
脂乳寒天上に移した。試験した１３８００個の形質転換
体のうち、脱脂乳寒天の蛋白質分解により明らかに大き
な量を形成する部分が認められた。このクローンからプ
ラスミドＤＮＡをマニアチス等による方法により単離し
た。このプラスミド中に含まれるクローン化された、Ｂ
２アルカロフィルスＤＮＡからの７ラグメントは大きく
４．１ＫＢを有しかつ（例２で立証されているように）
Ｂ、アルカロフィルスＩＡＩからの高アルカリ性プロテ
アーゼの正しい完全ＤＮＡ配列を含有していた。このプ
ラスミドに記号ｐｃＬＥＡＮｏを与えた。このプラスミ
ドｐ　ＣＬＥＡＮＯを種々の制限エンドヌクレアーゼで
切断し、この制限したＤＮＡを電気泳動によりアガロー
スゲル上で分離し、バンドパターンにより制限地図を作
成し、これをあとで例４により配列決定に基いて検査し
た。このプラスミドの制限地図は第２図に図示されてい
る。

例　　２ 構造遺伝子の発現及び発現した出発プロテアーゼの蛋白
質分解活性の測定 プラスミドｐｃＬＥＡＮｏを再度菌株のＢ９スブチリス
ＢＤ２２４中に導入し、かつ得られた形質転換体を培養
した。対照菌株として、プラスミドｐＵＢ　１１０で形
質転換したＢ、スブチリスＢＤ２２４を培養しかつプロ
テアーゼ遺伝子を単離するための出発菌株、Ｂ、アルカ
ロフイルスＨＡＩも同じように培養した。菌株Ｂ、スブ
チリスＢ　Ｄ　２２４　（ｐｃＬＥＡＮＯ）及び対照菌
株Ｂ６スブチリスＢＤ２２４　（ｐＵＢｌ　１０）及び
Ｂ、アルカロフィルスＨＡＩをこのために、１１２当り
栄養素ブイヨン８ｇ、ＭｇＳＯ４４０雇９ＣａＣ１２０
，２９、ＭｎＣ１２１ｒｎ９及びＦｅＳＯ４１１１１９
を含有する培地中で３７℃、２５　Ｏｒｐｍで恒温保持
した。プラスミド含有Ｂ、スブチリス菌株の培地は付加
的にネオマイシン１０　μｇ／ｉを含有していた。アル
カロフイルス出発菌株の培地は培地１１２当り付加的に
炭酸ナトリウム緩衝液（１モル、ｐＨ９，７５）　１Ｏ
ｒｘＱを含有し　ｔこ　。

２８時間後に試料を培養物から採取し、遠心分離しかつ
上澄み中蛋白質分解活性を測定した更に、蛋白質分解活
性をセリンプロテアーゼ阻害剤ＰＭＳＦ　（フェニルメ
チルスルホニルフルオリド）もしくはメタロプロテアー
ゼ阻害剤ＥＤＴＡ　（エチレンジアミンテトラ酢酸）の
存在においても測定した。

表１は阻害剤の不存在並びに阻害剤ＰＭＳ　Ｆもしくは
ＥＤＴＡの存在における結果を示す。

表　　１ 活　　　性 ＰＭＳＦ　　　　ＥＤＴＡ 上澄み　　　　　　　　　の存在　の存在Ｂ、アルカロ
ア（ルス　　　　　　１００　％　　　　　　１．５　
　％　　　９５　％ＡＩ Ｂ、スブチリス　ＢＤ２２４　　　１００　　％　　　
　　４４　％　　　　　５１　％（ｐＵＢｌｌｏ） Ｂ、スブチリス　ＢＤ２２４　　　１００　　％　　　
　　　６　％　　　　　７８　％（ｐｃＬＥＡＮｏ） 前記の試料の遠心分離により得られた上澄みに関しては
蛋白質分解活性に加えて、この上澄み中に含まれている
蛋白質を等電点電気泳動により分離した。これにより、
Ｂ、スブチリスＢＤ　２２４　（ｐｃＬＥＡＮ　Ｏ）が
対照菌株（専らプラスミドｐＵＢ１１０のベクターＤＮ
Ａを含有するＢ、スブチリスＢＤ２２４）とは逆に、Ｂ
。

アルカロフィルスＨＡＩから産生ずる高アルカリ性プロ
テアーゼと同じ等電点を有する蛋白質を分離することが
明らかである。

ｐｃＬＥＡＮＯで形質転換されｆ−Ｂ　、スブチリスＢ
Ｄ２２４によるプロテアーゼの形成は、プロテアーゼ構
造遺伝子を選択するために例１で使った表現特性、例え
ばネオマイシン耐性及びプロテアーゼ活性（即ち強まり
だ脱脂乳寒天上での量形成）が同プラスミドｐＣＬＥＡ
Ｎ　Ｏに随伴していることを立証する。更に、結果から
、プラスミドｐＣＬＥＡＮ　ｔｌ中に含有されている、
Ｂ、アルカロフイルスＨＡＩからのＤＮＡ７ラグメント
が高アルカリ性Ｂ、アルカロフィルスプロテアーゼを合
成するための完全な情報を含んでいることが明らかでる
。それというのもＢ、スブチリスＢＤ２２４　（ｐｃＬ
ＥＡＮ　Ｏ’）により形成１こより形成されたプロテア
ーゼが元のＢ、アルカロフィルスＨＡＩグロテアーゼと
同じ等電点を有しかつ更にＢ、アルカロフィルスーグロ
テアーゼと同様にＰＭＳＦ又はＥＤＴＡのような阻害剤
に対して挙動するからである。

例　　３ プラスミドｐＯＬＥＡＮ４の構成 プラスミドｐＣＬＥＡＮ　Ｏを制限エンドヌクレアーゼ
Ａ　ｖａ　Ｔ及びＨｉｎｄｌｌｒにより制限した。大き
さ２．３ＫＢのＤＮＡフラグメントを単離し、かつこれ
も同様に予めＡ　ｖａ　Ｉ及びＨｉｎｄＩＩＩで切断し
たベクターｐＵＢ１３１（例１Ｏに記載したように製造
）と連結した。

ｐＣＬＥＡＮ　４という記号で表わされる得られたプラ
スミドを菌株のＢ、スブチリスＢＤ２２４中に導入した
。この形質転換体は高アルカリ性プロテアーゼを分離す
ることができ、このことはＡｖａｌ　／　Ｈｉｎｄ　ｍ
フラグメントがＢ、アルカロフィルスＨＡＩからの高ア
ルカリ性プロテアーゼの完全な構造遺伝子を含有するこ
とを表わす。プラスミドｐＣＬＥＡＮ４の制限地図は第
３図に図示されている。

例　　４ 高アルカリ性プロテアーゼの構造遺伝子の配列決定 プロテアーゼ構造遺伝子の一本鎖ＤＮＡを製造するに当
り、プラスミドｐＣＬＥＡＮ４を制限エンドヌクレアー
ゼＡｖａｌ及びＨｉｎｄＩ［で切断しかつ大きさ約２．
３ＫＢのＡ　ｖａＩ　／　Ｈ１ｎｄｌｌｒ　−ＤＮＡ７
ラグメント（プロテアーゼ構造遺伝子）を７アージミド
ｐＢＳ（＋）又はｐＢＳ（−）中に導入した。ファージ
ミドｐＢＳ（＋／−）はストラタジン（Ｓｔｒａｔａｇ
ｅｎｅ　；カリフォルニア州、ＬａＪｏｌｌａ在）から
入手した。単離した一本鎖ファージミド中に含まれてい
るプロテアーゼ遺伝子のヌクレオチド配列はサンガー等
によるジデオキシーチェーンターミネイション法（Ｐｒ
ｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ　Ｓ　
Ａ”　　７４巻５４７３頁（１９７７年）］及びマキサ
ム（Ｍａｘａｍ）等によるＤＮＡ−水銀の塩基特異的化
学的分解［Ｌ、　Ｇｒｏｓｓｍａｎｎ、　Ｋ、　Ｍｏｌ
ｄａｖｅ編、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏ
ｇｙ”　、６５巻、４９９頁、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒ
ｅｓｓ　Ｉｎｃ、出版、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ及びＬｏｎｄ
ｏｎ在（１９８０年）】により測定した。プロテアーゼ
の確定したヌクレオチド配列及びそれに対応するアミノ
鎌配列は第１図に図示されているヌクレオチド配列の位
置１１９０に存在する成熟高アルカリ性プロテアーゼの
アミノ酸配列の開始点は高アルカリ性プロテアーゼのＮ
末端のアミノ酸配列により測定した。

例　　５ 目的とする突然変異により変異させたＤＮＡ配列の製造 目的とする突然変異はプロテアーゼ構造遺伝子のＤＮＡ
部分配列においてＴ、Ａ　　、７ｔン・クンケル［ｖｏ
ｎ　　Ｋｎｕｋｅｌ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃ
ａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ　Ｓ　Ａ、８２巻、４８８〜４９
２頁（１９８５年）］により記載された方法により実施
した。このためにプラスミドｐｃＬＭＵＴＮ１　　（例
６に記載したように製造）及びｐ　ＣＬＭＵＴＣｌ　Ｃ
例７に記載したように製造）を使用し、これらを初めに
次に記載するようにウラシル化−末鎖類縁体に変換した
。出発ベクター　ｐ　ＣＬＭＵＴＮ　ｌ及びｐ　ＣＬＭ
ＵＴＣｌは、Ｂ、アルカロフイルスＨＡＩからのプロテ
アーゼ構造遺伝子の全ＤＮＡ配列を含有するのではなく
、このＮ末端側半分（ｐ　ＣＬＭＵＴＮＩ）又はＣ末端
側半分（ｐ　ＣＬＭＵＴＣｌ　）だけを含有する。

これらのベクターは、ファージミドの誘導体として、こ
こに記載の条件下で複製に有用な宿主微生物から分離し
かつ単離することのできた一水銀ベクターＤＮＡの形成
に対しである程度は能力を有する。

これらのベクターをそれぞれマニアチス等により（２５
０−２５１頁）ＣａＣ１２法により宿主微生物としての
Ｅ、コリＣＪ２３６中に導入し　Ｉこ　。

細菌Ｅ、コリＣＪ２３６　（ウラシル−Ｎ−グリコシラ
ーゼ欠損変異株）はベクターの複製の際にチミンの代り
にヌクレオチドのウラシルをベクターのＤＮＡ配列中に
導入するので、前記の形質転換体の培養によりベクター
ｐ　ＣＬｔＪＵＴＮ　１又はｐ　ＣＬＭＵＴＣ１のウラ
シル含有類縁体が得られた。これらのウラシル含有ベク
ターは通常チミン含有ベクターとは試験管内反応は区別
することはできない。ベクターＤＮＡ中のウラシル含量
は試験管内り、ＮＡ合成を妨害しない。それというのも
ウラシルは試験管内でも又は生体内でも突然変異性では
なくかつウラシルはチミンと同じようにコードするから
である。ウラシル化されたベクターは次に目的とする突
然変異の試験管内反応に使用すると有利である。反応の
終結後に、変異ＤＮＡ鎖（ベクター）を生成するための
鋳型として有用であるウラシル含有ＤＮＡ−水銀をウラ
シル−Ｎ−グリコシラーゼで処理することにより除去す
ることができ、その際に変異株の表現型選択を必要とし
ない。グリコシラーゼ処理は、単離した酵素でも、また
ベクターＤＮＡ形質転換した、ウラシル−Ｎ−グリコシ
ラーゼ活性を有するＥ、コリ菌株でも実施することがで
きる。

所望の突然変異の鋳型として必要な、ｐ　ＣＬＭＵＴＮ
Ｉ及びｐ　Ｃ１，ＭＵＴＣｌのウラシル化−水銀ＤＮＡ
は、両方のベクターで形質転換され、付加的にヘルパー
ファージＭ　１３　Ｋ　Ｏ７（Ｂｉｏ　−Ｒａｄ　Ｌａ
−ｂｏｒａｔｏｒ　ｉｅｓから入手、カリフォルニア、
リッチモンド在）で感染させたＥ、コリＣＪ２３６細菌
を培養することにより製造した。

ヘルパーファージは殆んど増殖能を有しておらずかつベ
クターｐ　ＣＬＩＪＵＴＮ　ｌ又はｐ　ＣＬＭＵＴＣｌ
のベクターＤＮＡとの妨害的な相互作用を示さない。そ
の役割は形成されたウラシル化−末鎖ベクターＤＮＡの
鞘蛋白質の合成である。包まれた一水銀ベクターＤＮＡ
を宿主微生物Ｅ、コリＣＪ２３６から分離し、かつ培地
から単離することができる。ヘルパーファージを一緒に
使用することにより一水銀ベクターＤＮＡ　（ここでは
ウラシル化されている）の定性的及び定量的収率は著し
く上昇する。

単離したウラシル化ＤＮＡ−零ＭベクターｐＣＬＭＬＩ
ＴＮ　１又はｐ　ＣＬＭＵＴＣｌを、変異位置を有しか
つ同時に、次に変異により完全なＤＮＡ二本鎖に補完す
るためのプライマーとして有用である例８で製造した合
成オリボタクレオチドと交雑した。

第２のＤＮＡ鎖の合成はヌクレオチドの添加下に７４−
ＤＮＡ−ポリメラーゼにより行ない、かつ新しく形成さ
れた鎖の連結はＴ４−ＤＮＡ−リガーゼにより行なった
［　Ｋｕｎｋｅｌ及びその他共著、　　Ｍｅｔｈｏｄｓ
　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、″　１５４巻、３６７〜３８
２頁（１９８７年）］。形成された二本鎖ベクターＤＮ
ＡをＥ、コリＭＣｌ０６１中に形質転換しかつ変異した
ベクターを、合成オリゴヌクレオチドで導入もしくは除
去した相応するユニタリー（ｕｎｉｔａｅｒ）　制限エ
ンドヌクレアーゼ認識位置を検査することにより同定し
た。

例えばプロテアーゼ構造遺伝子のＮ末端部分か又はＣ末
端部分で２９の変異を製造するためには、本例による方
法を第１変異の導入（例８の第１合成オリゴヌクレオチ
ドの使用）後に、同じようにして、プロテアーゼ構造遺
伝子のこの部分に第２の変異を導入するために例８の他
の合成オリゴヌクレオチドの使用下に繰り返した。この
ようにして、プロテアーゼ構造遺伝子のＮ末端部分又は
Ｃ末端部分に例えば２９の変異を有するｐ　ＣＬＭＵＴ
Ｎ　１−又はｐ　ＣＬＭＵＴＣｌをの変異ベクターが得
られた。

例　　６ ベクーターｐ　ＣＬＭＵＴＮ　１の構成例３で製造した
プラスミドｐ　ＣＬＭＵＴＮ　４をＡｖａ■で切断した
。突出している末端（′付着末端″）を必要なヌクレオ
チドの添加下にＥ、コリポリメラーゼＩのフレノウフラ
グメント（マニアチス等、１１４頁）を用いて充填して
ＤＮＡ二本鎖にした。引続いてこのＤＮＡをＸｂａｌで
制限した後で、Ｎ末端の１６１８塩基対（ＢＰ）を包含
するプロテアーゼ遺伝子の７ラグメントを単離しかつｐ
ＢＳの５ｅａｌ／ＸｂａＩ−位置中にクローン化した。

この生成ベクターがｐＣＬＭＵＴＮ　ｌである。このベ
クターの制限地図は第５図に図示した。

例　　７ ベクターｐ　ＣＬＭＵＴＣ１の構成 例３で製造したプラスミドｐ　ＣＬＭＵＴＮ　４を制限
エンドヌクレアーゼＸ　ｂａ　Ｉ及びＡｓｐ７１８で切
断した。プロテアーゼ構造遺伝子のＣ末端側半分を包含
する６５８ＢＰ含有Ｘｂａｌ　／　Ａｓｐ７１８−二本
鎖ＤＮＡ７ラグメントをｐＢＳのＸｂａＩ／Ａｓｐ７１
８位置にクローン化した。この生成ベクターがｐ　ＣＬ
ＭＵＴｅ　ｌである。このベクターの制限地図は第６図
に図示した。

例　　８ 所望の突然変異用の人工オリゴヌクレオチドの合成 合成オリゴヌクレオチドはサイクロン・シンセタイザ−
（Ｃｙｃｌｏｎ　５ｙｎｔｈｅｔｉｓｅｒ　：　Ｂｉｏ
ｒｅｓｅａ−ｒｃｈ社）中β−シアノエチルーホスホラ
ミジットを用いて製造した［Ｓ、　Ｌ、　Ｂｅａｎｃａ
ｇｅ及びＭ。

Ｈ，Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ共著、”Ｔｅｔｒａ　−ｈｅｄ
ｒｏｎ　Ｌｅｔｔｅｒｓ２２巻、１８５９〜１８６２頁
（１９８１年）により］。得られたオ′リゴヌクレオチ
ドをポリアクリルアミドゲルから溶離しかつ引続いてセ
ファデックスＧ２５カラムを用いて脱塩することにより
精製した。合成ヌクレオチド配列及びそれらの性質に関
する例は第４図に図示した。第４図は合成オリゴヌクレ
オチドｌ−Ｘ１ｉ’のＤＮＡ配列を表わしかつ各制限エ
ンドヌクレアーゼの脱離もしくは生成された認識位置が
記載されている。出発プロテアーゼの元のＤＮＡ配列に
対して誘発されたヌクレオチドの変換は変換されたヌク
レオチドを小文字で記載することにより表わした。プロ
テアーゼ遺伝子中に変異を導入するための例５による方
法で使用した合成オリゴヌクレオチドの配列Ｉ〜ＸＶは
、次の条件を満足するものを選択したニ ー合成オリゴヌクレオチドのＤＮＡ配列はプロテアーゼ
遺伝子の相応する配列に対して、その十分な交雑能を保
障するように相補性である一交雑すべきアミノ酸をコー
ドするコドンの１個又は数個のヌクレオチドを他のヌク
レオチドにより交換して、この変異コドンがリジン又は
アルギニンの群類からの強塩基性アミノ酸をコードする
（変異）。新しい強塩基性アミノ酸に対しては、プロテ
アーゼ遺伝子中で相応する強塩基性アミノ酸に関して最
も頻繁に出現するコドンを使用した＠ −ａのコドン内で別のヌクレオチドに交換すると、アミ
ノ酸の元のコード付けは保持されるが、それによりプロ
テアーゼ遺伝子中に出現する制限エンドヌクレアーゼの
認識配列は除去されるかあるいは新規に生成された。こ
れは、例５による方法において、新規の高アルカリ性プ
ロテアーゼの変異ＤＮＡ配列を有するベクターに対する
スクリーニングを簡単化にするのに有用であった。

例　　９ プラスミドｐＵＢの単離及び精製 菌株バチルス・スブチリスＢＤ３６６　（Ｂａｃ−４１
１ｕｓ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　５ｔｏｃｋ　Ｃａｎｔｅｒ　
　ｌ　Ｅ　６　）から　Ｔ。

Ｊ、グリジャン（ｃｒｙｃｚａｎ　）及びその他による
方法［’Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　　　３４巻、３
１８〜３２９頁（１９７８年）］によりプラスミドｐＬ
ＪＢＩＩＯを単離し、引続いてマニアチス等による方法
（９３参照）により塩化セシウム密度勾配遠心分離を介
して精製した。ベクターｐｕＢ　ｌ　ｌ　Ｏハ制限エン
ドヌクレアーゼＢａｍＨＩ（７）１回だけ出現する制限
位置及びマーカーとしてネオマイシンに対する抗生物質
耐性をコードするＤＮＡ配列並びにバチルス種での複製
に必要なＤＮＡ配列（゛複製の開始点″）を含有する例
１Ｏ ベクターｐＵＢ１３１の構成 例９により得られたプラスミドｐＵＢ１１０をＥｃｏＲ
Ｉ及びＢａｍＨＩで制限した。小さいＤＮＡフラグメン
ト（７９０Ｂ　Ｐ）を、予めベクターＭ　ｌ　３　ｔｇ
ｌ　３１　（Ａｍｅｒｓｈａｍから入手、英国　Ｂ　ｕ
ｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ在）からＥｃｏＲＩ／Ｂｇ
ｌ■−フラグメントとして単離した６７塩基対から成る
ポリリンカーにより代えた。これが新規ベクターｐＵＢ
　ｌ　３１であった。それ故、このベクターｐＵＢ１３
１は、約０．８ＫＢのＥｃｏＲ１／ＢａｍＨＩ−フラグ
メントが欠失しておりかつそのためにポリリンカー位置
が導入されたｐＵＢＩＩＯの誘導体である。このベクタ
ーの制限地図は第７図に図示されている。

例１１ ベクターｐＵＢＣｌ　３１の構成 プラスミドｐ　Ｕ　０１８　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｌ
　Ｋ　Ｂから入手、スウェーデン、Ｕｐｐｓａ　ｌａ在
）をＡａｔＩＩ及びＰｖｕｆｆで切断した。β−ラクタ
マーゼ遺伝子及びＥ、コリの゛″複製開始点”を有する
１つ９０塩基対の７ラグメントを単離した。突出してい
る末端（゛付着末端″）を必要なヌクレオチドの添加下
にＥ、コリＤＮＡポリメラーゼ１のフレノウフラグメン
ト（マニアチス等による文献、１１４頁）を用いてＤＮ
Ａ二本鎖に充填した。引続いてこのフラグメントを例１
０により得られたベクターｐＵＢ１３１の５ｎａＢＩ位
置に導入した。この新規ベクターをｐＵＢｃ１３１と名
付けた。このベクターの制限地図を第８図に図示した。

例１２ ベクターｐｕＢｃ　１３２の構成 例１１で得られたベクターｐＵＢｃ１３１の２１８７Ｂ
ＰのＥｃｏＲＩ　／　ＢｇｌｌＩ　−フラグメントをｐ
ＢＳ（＋）のＥｃｏＲＩ　／　ＢａｍＨＩ−位置にサブ
クローン化した。制限地図を第９ａ図に図示した得られ
たベクターな　ｐ　ＢＳＲＥＰＵと名付けた。引続いて
、ベクター　ｐ　ＢＳＲＥＰＵ中のｒｅｐＵ−ポリペプ
チドのＤＮＡ配列中に存在する［１、　Ｍａｃｉａｇ及
びその他共著、”Ｍｏ１．　Ｇｅｎ、　Ｇｅｎｅｔ２１
２巻、２３２〜２４０頁（１９８８年）］ＮｃｏＩ−も
しくはＳＬｙ■認識位置を所望の突然変異により、ヌク
レオチド配列ＣＣＡ　　ＴＧ　Ｇ、をヌクレオチド配列
ＣＣＧ　　ＴＧＧ　（両方のヌクレオチド配列はアミノ
酸配列よりトリプト７アンーブロリンをコードする）に
より代えて除去した。例５の方法と同様にして行なった
このために、ベクター　ｐ　ＢＳＲＥＰＵのウラシル化
−末鎖ＤＮＡをＮ　ｃｏ　Ｉ−もしくは５ｔｙＩ認識位
置を除去するための所望の突然変異のための鋳型として
製造した。引続いて、この鋳型を例５に記載したパブラ
イマー伸長”法と同様に第９ｂ図の合成オリゴヌクレオ
チド（例８の合成オリゴヌクレオチドの製法と同様にし
て製造しかつ精製した）の使用下にＤＮＡ二本鎖ベクタ
ーに補完しかっＥ、コリＭＣ１０６１の形質転換及び培
養によりＮｃｏＩ−もしくは５ｔｙＩ認識位置を含まな
いベクターと単離した。単離したベクターの１７２６Ｂ
ＰのＥｃｏＲＩ　／　ＡｐａＩ　−フラグメントをｐＵ
ＢＣ１３１のＥｃｏＲＩ／ＡｐａＩ−位置に導入した。

制限地図を第１Ｏ図に図示したこの新しいベクターをｐ
ＵＢＣ１３２と名付けた。

例１３ プラスミドｐＡＬ　Ｉ　Ｐの構成 プラスミドｐＡＬＩＰは次の３つの要素を連結すること
により製造したニ ー　ｐ　ＣＬＥＡＮ　４の２２１８塩基対の大きさのＡ
ｖａＩ　／　Ｎｃｏｌ　−フラグメント；このフラグメ
ントは高アルカリ性出発プロテアーゼのプロモータ及び
Ｐｒｅｐｒｏ領域を含有する、 −例１７により製造した合成リンカ−；これは制限エン
ドヌクレアーゼＮｃｏＩ、ＸｂａＩ及びＡｓｐ７１８に
対するそれぞれの認識位置を含有し、これらによって変
異ベクターｐｃＬＭＵＴ　ｌもしくはｐ　ＣＬＭＵＴＣ
ｌからのプロテアーゼ遺伝子の変、４Ｎ末端側半分もし
くはＣ末端側半分の導入又はプラスミドｐＣＬＥＡＮ４
からの出発プロテアーゼの全遺伝子の導入が可能である
。

−例１２で極造したベクターｐＵＢＣ１３２からの５７
７６塩基対の大きさＡ　ｖａ　Ｉ　／Ｈ１ｎｄＩ［Ｉ−
フラグメント；このフラグメントはＥ、コリ中の複製及
び選択可能なマーカーのＤＮＡＮ列並びにＢ、スプチリ
ス、Ｂ、リケニフオルミス及びＢ、アルカロフイルス中
の複製及び選択可能なマーカーのＤＮＡ配列を含有する
。

ベクターｐＡＬＩＰの構成はＥ、コリＭＣｌ０６１中で
実施しかつベクターをアンピシリン耐性Ｅ、コリ形質転
換体から単離した。得られたベクターの制限地図は第１
１図に図示した。

例１４ プラスミドｐＡＬＩＮの構成 プラスミドｐＡＬ　Ｉ　Ｎは、初めに例１で得られｔ；
ベクターｐＣＬＥＡＮ４を制限エンドヌクレアー−ｔ’
ＮｃｏＩ及びＸｂａＩで切断し、かつ引続いて得られた
大きさ４１４塩基対のＮｃｏＩ／ＸｂａＩ−フラグメン
トをベクターｐＡＬＩＰ（例１３により製造した）のＮ
ｃｏＩ　／　ＸｂａＩ　−位を中にクローン化すること
により構成した。ベクターｐＡＬＩＮの構成はＥ、コリ
ＭＣ１０６１中で行ないかつアンピシリン耐性Ｅ、コリ
形質転換体からのベクターを単離した。製造したベクタ
ーは、成熟酵素をコードするＤＮＡ配列のＮ末端部分及
び高アルカリ性プロテアーゼを転写及び翻訳するための
調節要素並びにシグナル配列及びプロセッシング配列を
含有する。このベクターの制限地図は第１２図に図示し
た。

例１５ プラスミドｐＡＬｌＧの構成 プラスミドｐＡＬｌｃは、初めに例３で得られたベクタ
ーｐＣＬＥＡＮ　４を制限エンドヌクレアーゼＸ　ｂａ
　Ｉ及びＡｓｐ７１８で切断しかつ得られた６０６塩基
対の大きさのＸｂａｌ　／　Ａｓｐ７１８−フラグメン
トをベクターｐＡＬＩＰ（例１３により製造）のＸｂａ
ｌ　／　Ａｓｐ７１８−位置中にクローン化した。ベク
ターｐＡＬｌｃの構成はＥ、コリＭＣ１０６１中で行な
いかつベクターをアンピシリン耐性Ｅ、コリ形質転換体
から単離した。この製造したベクターは成熟プロテアー
ゼをコードするＤＮＡ配列のＣ末端部分及び高アルカリ
性プロテアーゼの転写及び翻訳のだめの調節要素並びに
シグナル配列及びプロセッシング配列を含有する。この
ベクターの制限地図は第１３図に図示した。

例１６ 発現ベクターｐＡＬＩＮｃの構成 プロテアーゼＤＮＡ配列のＣ末端部分に変異を有する発
現ベクター　プロテアーゼＤＮＡ配列のＮ末端部分に変
異を有する発現ベクターＤＮＡ配列のＮ−及びＣ末端部
分に変異を有する発現ベクター及び比較のためにプロテ
アーゼＤＮＡ配列に変異を含まない発現ベクターも製造
した。

Ａ、プロテアーゼのＤＮＡ配列のＮ末端部分に変異を有
する発現ベクター 例５により、所望の突然変異により得られた変異ベクタ
ーｐ　ＣＬＭＵＴＮ　１を制限エンドヌクレアーゼＮｃ
ｏｌ及びＸｂａＩで切断した。単離した４１４塩基対の
ＮｃｏＩ　／　ＸｂａＩ　−フラグメント（変異Ｎ１８
に１に２７Ｒ，Ｎ４２Ｒ，Ｑ５７ＲＡ９６Ｒ％Ｑ１０７
Ｒ，Ｎｌ　ｌ　４Ｒ，Ｎｌ　１５Ｒ，Ｑ１３５Ｒ，Ｎ１
３８Ｒを有するプロテアーゼ構造遺伝子の変異Ｎ末端部
分）を例１５により得られたプラスミドｐＡＬ１ｃのＮ
　ｃｏ　１／Ｘｂａｌ−位置中にクローン化した。得ら
れたベクターは変異プロテアーゼを発現するための好適
な解読枠を有する完全な発現ベクターである。ベクター
を次のように表わした： ｐＡＬＮ１８に一変異Ｎ１８Ｋを有するプロテアーゼの
発現ベクター； ｐＡＬＫ２７Ｒ−変異に２７Ｒを有するプロテアーゼの
発現ベクター； ｐＡＬＮ４２Ｒ−変異Ｎ４２Ｒを有するプロテアーゼの
発現ベクター； ｐＡＬＱ５７Ｒ−変異Ｑ５７Ｒを有するプロテアーゼの
発現ベクター； ｐ　ＡＬＡ９６　Ｒ＝変異Ａ９６Ｒを有するプロテアー
ゼの発現ベクター； ｐＡＬＱ１０７Ｒ−変異Ｑ１０７Ｒを有するプロテアー
ゼの発現ベクター； ｐＡＬＮｌ１４Ｒ−変異Ｎ１１４Ｒを有するプロテアー
ゼの発現ベクター； ｐＡＬＮ１１５Ｒ−変異Ｎ１１５Ｒを有するプロテアー
ゼの発現ベクター； １）ＡＬＱ１３５Ｒ−変異Ｑ１３５Ｒを有するプロテア
ーゼの発現ベクター； ｐＡＬＮ２３８Ｒ−変異Ｎ１３８Ｒを有するプロテアー
ゼの発現ベクター： ｐＡＬ２７／　ｌ　１５−変異に２７Ｒ／Ｎ１１５Ｒを
有するプロテアーゼ の発現ベクター； ｐＡＬ２７／１３５−変異に２７Ｒ／Ｒ１３５Ｒを有す
るプロテアーゼ の発現ベクター ８．２０テアーゼのＤＮＡ配列のＣ末端部分に変異を宵
する発現ベクター 例５により、所望の突然変異により得られた変異ベクタ
ーｐ　ＣＬＭＵＴＣｌを制限エンドヌクレアーゼＸｂａ
Ｉ及びＡｓｐ７１８で切断した。単離した６０６塩基対
のＸｂａＩ　／Ａｓｐ７１８−フラグメント（変異Ａ１
６６Ｒ，Ｖ２３８Ｒ，Ｎ２５５ＲＸＳ２５９に、Ａ２６
６Ｒを有するプロテアーゼ構造遺伝子の変異Ｃ末端部分
）を例１４により得られたプラスミドｐＡＬＩＮのＸ　
ｂａ　Ｉ／Ａｓｐ７１８−位置へクローン化しＩ；。得
られたベクターは変異プロテアーゼを発現するのに好適
な解読枠を有する完全な発現ベクターである。ベクター
を次の記号で表わした二 ｐＡＬＡ１６６Ｒ−変異Ａ１６６Ｒを有するプロテアー
ゼの発現ベクター； ｐＡＬＶ２３８Ｒ−変異Ｖ２３８Ｒを有するプロテアー
ゼの発現ベクター； ｐＡＬＮ２５５Ｒ−変異Ｎ２５５Ｒを有するプロテアー
ゼの発現ベクター； ｐＡＬ５２５９に一変異５２５９Ｋを有するプロテアー
ゼの発現ベクター； ｐＡＬＡ２６６Ｒ−変異Ａ２６６Ｒを有するプロテアー
ゼの発現ベクター− 〇、グロテアーゼＤＮＡ配列のＣ末端−及びＮ末端部分
に変異を有する発現ベクター前記のＡで製造した発現ベ
クターｐＡＬＡ９６Ｒ及びＢで製造した発現ベクターの
ｐ　Ａ、　Ｌ　Ａ２６６Ｒをそれぞれ制限エンドヌクレ
アーゼＸｂａｌ及びＡ　ｖａ　Ｉで切断した。プラスミ
ドｐＡＬＡ９６Ｒの１６１２塩基対の７ラグメントをプ
ラスミドｐＡＬＡ２６６Ｈの６３８８塩基対の７ラグメ
ントと連結した。生成プラスミドをｐＡＬ９６／２６６
と名付けた。

同じようにして、前記のＡで製造した発現ベクターｐＡ
ＬＱ１０７Ｒ及びＢで製造した発現ベクターｐＡＬＶ２
３８ＲからｐＡＬ１０７／２３８のプラスミドを製造し
た。

Ｄ、出発プロテアーゼの変異していないＤＮＡ配列を有
する発現ベクター プロテアーゼの変異していない出発構造遺伝子を有する
発現ベクターは、例３により得られたプラスミドｐＣＬ
ＥＡＮ４からの４１４塩基対の変異していないＮｃｏＩ
　／　ＸｂａＩ　−フラグメントを例１５により得られ
たプラスミドｐＡＬ１ｃのＮｃｏｌ／ＸｂａＩ−位置に
クローン化することにより、あるいは例３により得られ
たプラスミドｐＣＬＥＡＮ　４からの６０６塩基対のＸ
ｂａＩ／ＡＳり７１８−フラグメントを例１４により得
られたプラスミドｐＡＬＩＮのＸｂａＩ　／　Ａｓｐ７
１８−位置にクローン化することにより得られた。

このようにして得られたベクターは、変異していない高
アルカリ性出発プロテアーゼの発現に好適な解読枠を有
する完全な発現ベクターである。

前記の４つの発現ベクターの構成はその都度Ｅ、コリＭ
Ｃ１０６１中で行なった。アンピシリン耐性Ｅ、コリ形
質転換体から発現ベクターを単離した。変異したグロテ
アーゼ遺伝子及び変異していないグロテアーゼ遺伝子の
発現に当り、本例で製造しかつ単離した発現ベクターを
Ｂ、スブチリスＢＤ２２４中に導入した。選択はネオマ
イシン−又はフレオマイシン耐性により行なっＩ；。形
質転換体は変異した（Ａ、Ｂ及びＣからのベクターによ
る形質転換体）もしくは変異していない（Ｄからのベク
ターによる形質転換体）高アルカリ性プロテアーゼの産
生能を有していた。

ｐＡＬＩＮｃ型のこのベクターの制限地図は第１４図に
図示した。

例１７ ＤＮＡ二本鎖リンカ−の合成 配列の初めに存在するＮＣｏＩ％次にＸｂａＩ及びＡｓ
ｐ７１８並びに最後に存在するＨｉｎｄＩ［Ｉの制限エ
ンドヌクレアーゼに関して記載の順序で相互に接近して
又は隣接して存在する認識部位をコードするＤＮＡ配列
をコードする、突出している５′末端を有する二本鎖リ
ンカ−を合成するに当り、初めに両方の一本鎖ＤＮＡ配
列を例８の合成オリゴヌクレオチドの合成法と同様にそ
れぞれ製造しかつ精製した。次に、得られたＤＮＡ−末
鎖を相互に交雑して二本鎖にした。次の配列及び次の制
限エンドヌクレアーゼの認識位置を有する、製造された
合成ＤＮＡ二本鎖リンカー： ５　’　−ＣＣＡＴＧＧＴＣＴＡＧＡＧＧＴＡＣＣＡ−
３’３　’−ＣＡＧＡＴＣＴＣＣＡＴＧＧＴＴＣＧＡＡ
−５’八　　　　　　　　八　　　　　　　　八　　　
　　　　　八Ｎｃｏｌ　　　　　Ｘｂａｌ　　　　　Ａ
ｓｐ７１８１ｎｄｌ は例１３によるベクターの構成に使用した。

例１８ 変異高アルカリ性プロテアーゼ及び比較のために出発プ
ロテアーゼの製造 予備培地（ＩＱ当りトリプトン２０ｇ、酵母エキス１０
９、ＮａＣｌ３９、可溶性デンプン７５９トウモロコシ
膨化水１０１）に試験すべき菌株（それぞれ例１６によ
り製造したベクターｐＡＬ　Ｉ　ＮＣの１つで形質転換
したＢ、スプチリスＢＤ２２４）のコロニーを接種した
。培養物を３７℃、２５０ｒｐ＋ｎで恒温保持した。こ
の培養物２．５ｍｌ２ｔ−主要培地（ｌ当り大豆粉３０
ｇジャガイモデンプン９０ｇ、Ｎａカゼイネート１０９
及び膨化水１０ｍＱ＞　５０ｍＱに接種した。

主要培養物を予備培養と同じ条件下に恒温保持した。７
２時間後に、培養物を遠心分離した。

上澄みから高アルカリ性プロテアーゼをＨＰＬＣ（ＬＫ
ＢのＵｌｔｒｏｐａｃ　　Ｃｏｌｕｍｎ　Ｔ　Ｓ　Ｋ　
−ＣＭ−２ＳＷ型：溶離緩衝液０．０５Ｍ酢酸Ｎａ。

ｐＨ６及び０．８Ｍ酢酸Ｎａ、ｐＨ６）を介して精製し
た。

次に至適な（変異させた）プロテアーゼの洗浄特性を変
異させなかった出発プロテアーゼと比較して測定した。

例１９ 洗濯試験はリニ試験（Ｌ　１ｎｉｔｅｓｔ　）において
試験織物としてＥＭＰＡ　１１７　（１１ｃｍＸ　１１
ｃ＋ｉ；ポリエステル／木綿−交織布；ミルク、血液及
び墨で汚れている）を用いて実施した（スイス連邦材料
試験所から入手、スイス［１１５ａｎｋｔＧａｌｌｅｎ
在）。１５ｄＨの水中の過硼素酸塩を含有する６９／Ｑ
−ＩＥＣ試験洗剤、ｌ　Ｗ　（Ｌｅｖ−ｅｒ　５ｕｎｌ
ｉｃｈｔ　　ＧｒｎｂＨ社、Ｍａｎｎｈｅｉｍ在；組成
：漂白活性剤を含まない噴霧乾燥した粉末として線状ア
ルキルスルホネート６．４重量％、エトキシ基１４％を
含有するエトキシル化脂肪アルコール２．３重量％、ナ
トリウム石けん２．８重量％、トリポリリン酸ナトリウ
ム３５重量％、珪酸ナトリウム６重量％、珪酸マグネシ
ウム１．５重量％、カルボキシルメチルセルロース１重
量％、エチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）０．２
重量％、光学的増白剤（スチルベン型）０．２重量％、
硫酸ナトリウム１６．８重量％及び水７．８重量％並び
に過硼素酸ナトリウム・四水和物２０重量％）で洗浄し
た。洗浄液のｐＨ値はｐＨ１０，５であった。洗濯時間
は４５℃で３０分間であり、かつその都度１００ｍｄ当
りプロテアーゼ２０Ｕ（例１８のようにして製造した）
を使用した。洗濯工程の終結後、洗濯物を３回水道水で
すすぎ、乾燥かつアイロンがけをした。試験布片の反射
を両面でそれぞれ４回ずつ測定した。表２は１６回の洗
浄試験の平均値を表わす。

表　　２ 盲試験 （プロテアーゼな　し） 出発　プロテアーゼ Ｋ　　２７　　Ｒ Ｎ　　４２　　Ｒ Ｑ　　５７　１？ Ｑ　　１０７　　Ｒ Ｎ　　１１５　　Ｒ Ｓ　　２５９　　Ｋ Ｋ２７Ｒ／Ｎ１１５Ｒ Ｑ１０７Ｒ／　Ｖ２３８Ｒ ４８，８ ７１，１ ７２，８ ７１，９ ７２，３ ７１，６ ７１，７ ７３，６ ７４，１ ７３％ １００　　％ １０７．６ ０３Ｊ ］、０５．４ １０２．２ １０２．７ １１１．２ １１３．５ １０８．５ 例２゜ 洗濯試験を例１９と同様に実施した。粉末洗剤として、
アニオン〜及びニオ（Ｎ１ｏ）界面活性剤、錯化剤とし
てトリポリリン酸ナトリウム、珪酸ナトリウム、漂白剤
として過硼素酸ナトリウム及び調節剤として硫酸ナトリ
ウムを含有する洗剤をヨーロッパに好適であるように調
製して使用した。洗濯結果を表３に記載した。

表　　３ プロテアーゼ　　　　反射　　　　△ 盲検査 （プロテアーゼな　し〕 出発　プロテアーゼ Ｎ　　１８　　Ｋ Ｋ　　２７　　Ｒ Ｎ　　１１４　　Ｒ Ｑ　　１３５　　Ｒ Ｎ　　１３８　　Ｒ ４７，４％ ６５．６　％ ６６．２　％ ６６．４　％ ６６．５　％ ６６．３　％ ６７．３　％ １００　％ １０３．３ １０４．４ １０４．９ １０３．８ １０９．３ Ａ　　１６６　　Ｒ６５，９％　　　　１０１．６　　
％Ｖ　　２３８　　Ｒ６６％　　　　　１０２．２　　
％Ｎ　　２５５　　Ｒ６５，９％　　　　１０１．６　
　％に２７Ｒ／Ｑ１３５Ｒ６７，４％　　　　１０９．
９　　％Ａ９６！？／Ａ２６６Ｒ６６，６％　　　　１
０５．５　　％

【図面の簡単な説明】

第１図は、バチルス・アルカロフィルスＨＡ１からの高
アルカリ性出発プロテアーゼの構造遺伝子を有するＡｖ
ａｌ　／　Ｈｉｎｄ　ｌｆｆ−フラグメントのＤＮＡ配
列並びにこの出発プロテアーゼのアミノ酸配列の図、第
２図はプラスミドｐＣＬＥＡＮＯの制限地図、第３図は
プラスミド　ｐＣＬＥＡ）Ｊ４の制限地図、第４図はオ
リゴヌクレオチドＩ〜ＸｖのＤＮＡ配列の図、第５図は
ベクターｐＣＬＭｔｌＴＮ　ｌ　ノ制限地図、第６図は
ベクターｐｃｔ＋、ｔｕＴＣＩの制限地図、第７因はベ
クターｐ　ｔＪ　Ｂ　］、　３１の制限地図、第８図は
ベクターｐＵＢＣｌ　３１の制限地図、第９区（ａ）は
ベクターｐ　ＢＳＲＥＰＵの制限地図、第９図（ｂ）は
ベクター　ｐｕＢＣｌ３１から、ｒａｐ　Ｕ蛋白質をコ
ードするＤＮＡ配列中に含有されているＮ　ｃｏ　Ｉ−
もしくはＳｔｙ！認識位置を除去するための合成ＤＮＡ
配列を示す図、第１０図はベクターｐＵＢＣ１３２の制
限地図、第１１図はプラスミドｐＡＬＩＰの制限地図、
第１２図はプラスミドｐＡＬ　ＩＮの制限地図、第１３
図はプラスミドｐＡＬＩＣの制限地図、第１４図は変異
させた及び変異させなかった高アルカリ性プロテアーゼ
を発現するためのｐＡＬＩＮｃｕの発現ベクターの制限
地図である。 ＠出 ゲー・ベー・エフ・ゲ ゼルシャフト・ツユ ア・ビオテヒノロギツ シエ・フォルシュン グ・ミツト・ベシュレ ンクテル・ハフラング ドイツ連邦共和国ブラウンシュヴアイク・マツシエロー
ダー・ヴエーク　１

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、第１図によるアミノ酸配列に対して少なくとも８０
   ％の相同性を有しかつ該アミノ酸配列とは位置１８、２
   ７、４２、４９、５７、９６、１０７、１１４、１１５
   、１３５、１３８、１６６、１７６、１７９、１８８、
   １８９、１９８、２３８、２５５、２５９、２６６のう
   ちの少なくとも１つで又はそれらに相同の位置の１つで
   、該当位置に存在するアミノ酸が強塩基性アミノ酸に代
   えられている点で異なっているアミノ酸配列を有するこ
   とを特徴とする高アルカリ性プロテアーゼ。 ２、請求項１に挙げられた位置の１〜３個のアミノ酸が
   強塩基性アミノ酸により代えられているアミノ酸配列を
   有することを特徴とする請求項１記載の高アルカリ性プ
   ロテアーゼ。 ３、至適ｐＨ１０〜１２．５及び分子量２６０００〜２
   ８０００ｇ／モルを有することを特徴とする請求項１又
   は２記載の高アルカリ性プロテアーゼ。 ４、第１図に図示したアミノ酸配列に対して少なくとも
   ９０％の相同性を有するアミノ酸配列を有することを特
   徴とする請求項１から３までのいずれか１項記載の高ア
   ルカリ性プロテアーゼ。 ５、強塩基性アミノ酸がリジン又はアルギニンであるこ
   とを特徴とする請求項１から４までのいずれか１項記載
   の高アルカリ性プロテアーゼ。 ６、位置１８又は２５９の少なくとも１つのアミノ酸が
   リジンに代えられていることを特徴とする請求項１から
   ５までのいずれか１項記載の高アルカリ性プロテアーゼ
   。 ７、位置２７、４２、５７、９６、１０７、１１４、１
   １５、１３５、１３８、１６６、２３８、２５５又は２
   ６６の少なくとも１つのアミノ酸がアルギニンに代えら
   れているアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項
   １から５までのいずれか１項記載の高アルカリ性プロテ
   アーゼ。 ８、第１図に図示したアミノ酸配列に対して少なくとも
   ８０％の相同性を有しかつ該アミノ酸配列とは位置１８
   、２７、４２、４９、５７、９６、１０７、１１４、１
   １５、１３５、１３８、１６６、１７６、１７９、１８
   ８、１８９、１９８、２３８、２５５、２５９、２６６
   の少なくとも１つで又はそれらに相同の位置の１つで、
   該当位置に存在するアミノ酸が強塩基性アミノ酸により
   代えられている点で異なっているアミノ酸配列を有する
   高アルカリ性プロテアーゼをコードするＤＮＡ配列。 ９、請求項８に挙げた位置の１〜３個のアミノ酸が強塩
   基性アミノ酸により代えられているアミノ酸配列をコー
   ドすることを特徴とする請求項８記載のＤＮＡ配列。 １０、第１図に図示したアミノ酸配列に対して少なくと
   も９０％の相同性を有するアミノ酸配列をコードするこ
   とを特徴とする請求項８記載のＤＮＡ配列。 １１、請求項８記載の位置のアミノ酸が強塩基性アミノ
   酸リジン又はアルギニンにより代えられているアミノ酸
   配列をコードすることを特徴とする請求項８から１０ま
   でのいずれか１項記載のＤＮＡ配列。 １２、位置１８又は２５９の少なくとも１つのアミノ酸
   がリジンに代えられているアミノ酸配列をコードするこ
   とを特徴とする請求項８から１１までのいずれか１項記
   載のＤＮＡ配列１３、位置２７、４２、５７、９６、１
   ０７、１１４、１１５、１３５、１３８、１６６、２３
   ８、２５５又は２６６の少なくとも１つのアミノ酸がア
   ルギニンに代えられているアミノ酸配列をコードするこ
   とを特徴とする請求項８から１１までのいずれか１項記
   載のＤＮＡ配列。 １４、請求項８によるＤＮＡ配列を含有することを特徴
   とする微生物の形質転換に好適なベクター。 １５、ベクターがプラスミドであることを特徴とする請
   求項１４記載のベクター。 １６、高アルカリ性プロテアーゼをコードする請求項８
   によるＤＮＡ配列、高アルカリ性プロテアーゼのプロモ
   ータ及びＰｒｅｐｒｏ領域のＤＮＡ配列、Ｅ．コリ中の
   複製及び選択可能なマーカーのＤＮＡ配列並びにバチル
   ス種中の複製及び選択可能なマーカーのＤＮＡ配列を高
   アルカリ性プロテアーゼの発現に好適な順序で含有する
   ことを特徴とする請求項１５記載のプラスミド。 １７、第１４図による制限地図を特徴とする請求項１６
   記載のプラスミド。 １８、ａ）請求項１記載のアミノ酸配列に対して少なく
   とも８０％の相同性を有するアミノ酸配列を有する高ア
   ルカリ性プロテアーゼをコードするＤＮＡ配列の一部、 ｂ）前記高アルカリ性プロテアーゼのプロモータ及びＰ
   ｒｅｐｒｏ領域をコードするＤＮＡ配列、 ｃ）完全なＤＮＡ配列に補完するにはまだ欠損している
   、高アルカリ性プロテアーゼをコードするＤＮＡ配列の
   一部を導入するための制限エンドヌクレアーゼ認識配列
   を有する請求項２９によるＤＮＡ二本鎖リンカーの一部
   、 ｄ）Ｅ．コリ中の複製及び選択可能なマーカーのＤＮＡ
   配列、並びに ｅ）バチルス種中の複製及び選択可能なマーカーのＤＮ
   Ａ配列 を、欠損しているＤＮＡ配列部分の導入後に、高アルカ
   リ性プロテアーゼの発現ベクターが生成するような順序
   で含有することを特徴とするプラスミド。 １９、プラスミド中に含有されているａ）に記載の、高
   アルカリ性プロテアーゼをコードするＤＮＡ配列部分が
   このＤＮＡ配列のＮ末端Ｎｃｏ I ／Ｘｂａ I −フラグ
   メントである請求項１８記載のプラスミド。 ２０、プラスミド中に含有されているａ）に記載の、高
   アルカリ性プロテアーゼをコードするＤＮＡ配列の部分
   がこのＤＮＡ配列のＣ末端Ｘｂａ I ／Ａｓｐ７１８−
   フラグメントである請求項１８記載のプラスミド。 ２１、ａ）第１図に図示したアミノ酸配列に対して少な
   くとも８０％の相同性を有するアミノ酸配列を含有する
   高アルカリ性プロテアーゼ又はその一部をコードするＤ
   ＮＡ配列を導入するための制限エンドヌクレアーゼ認識
   配列を有する請求項２９記載のＤＮＡ二本鎖リンカー、 ｂ）高アルカリ性プロテアーゼのプロモータ及びＰｒｅ
   ｐｒｏ領域のＤＮＡ配列、 ｃ）Ｅ．コリ中の複製及び選択可能なマーカーのＤＮＡ
   配列、並びに ｄ）バチルス種中の複製及び選択可能なマーカーのＤＮ
   Ａ配列 を、完全な高アルカリ性プロテアーゼをコードするＤＮ
   Ａ配列をＤＮＡ二本鎖リンカーの位置に導入することに
   よりプロテアーゼを発現するための発現ベクターを生成
   できるような順序で含有することを特徴とするプラスミ
   ド。 ２２、ａ）に記載のＤＮＡ二本鎖リンカーが請求項３０
   記載のＤＮＡ二本鎖リンカーであることを特徴とするプ
   ラスミド。 ２３、請求項１４から２２までのいずれか１項記載のベ
   クター又はプラスミドにより形質転換されていることを
   特徴とする微生物。 ２４、微生物が細菌であることを特徴とする請求項２３
   記載の微生物。 ２５、バチルス・スブチリス、バチルス・アルカロフィ
   ルス、バチルス・リケニフォルミス、バチルス・アミロ
   リケファシエンスの群類から選択されるバチルスである
   ことを特徴とする請求項２４記載の微生物。 ２６、請求項１から７までのいずれか１項記載の高アル
   カリ性プロテアーゼを含有する洗剤。 ２７、常用の洗剤調製成分を含有する請求項２６記載の
   洗剤。 ２８、第４図に記載のＤＮＡ配列 I 〜ＸＶを有するこ
   とを特徴とする合成オリゴヌクレオチド２９、制限エン
   ドヌクレアーゼＮｃｏ I 、Ｘｂａ I 、Ａｓｐ７１８及
   びＨｉｎｄIIIの認識配列を記載の順序で近接して又は
   相互に順番に直接並んで有するＤＮＡ配列を特徴とする
   、突出している５′−末端を有する二本鎖ＤＮＡリンカ
   ー。 ３０、制限エンドヌクレアーゼＮｃｏ I 、Ｘｂａ I 、
   Ａｓｐ７１８及びＨｉｎｄIIIの認識配列を有する二本
   鎖ＤＮＡ配列 【遺伝子配列があります】 を有することを特徴とする請求項２９記載の二本鎖ＤＮ
   Ａリンカー。 ３１、請求項１記載のアミノ酸配列を有する至適高アル
   カリ性プロテアーゼを製造する方法において、第１図に
   図示したアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の相同
   性を有しかつ該アミノ酸配列とは位置１８、２７、４２
   、４９、５７、９６、１０７、１１４、１１５、１３５
   、１３８、１６６、１７６、１７９、１８８、１８９、
   １９８、２３８、２５５、２５９、２６６のうちの少な
   くとも１つで又はそれらに相同の位置の１つで、該当位
   置に存在するアミノ酸が強塩基性アミノ酸により代えら
   れている点で異なっているアミノ酸配列をコードするＤ
   ＮＡ配列を含有する形質転換した微生物を培養し、かつ
   その培地から、第１図に図示したアミノ酸配列に対して
   少なくとも８０％の相同性を有するが、前記の位置の少
   なくとも１つでそこに存在するアミノ酸が強塩基性アミ
   ノ酸により代えられている前記プロテアーゼのアミノ酸
   配列を有する至適高アルカリ性プロテアーゼを単離する
   ことを特徴とする至適高アルカリ性プロテアーゼの製法
   。