JPH0314426B2 - - Google Patents
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- JPH0314426B2 JPH0314426B2 JP60080885A JP8088585A JPH0314426B2 JP H0314426 B2 JPH0314426 B2 JP H0314426B2 JP 60080885 A JP60080885 A JP 60080885A JP 8088585 A JP8088585 A JP 8088585A JP H0314426 B2 JPH0314426 B2 JP H0314426B2
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Description
〔産業上の利用分野〕
本発明はピラノース・オキシダーゼおよびその
製造法に関する。さらに詳しくはβ−Ｄ−グルコ
ースのみならずα−Ｄ−グルコースにも作用する
ピラノース・オキシダーゼおよびポリポラス属に
属する担子菌によるその製造法に関する。 本発明のピラノース・オキシダーゼは、酸素の
存在下、α−Ｄ−グルコースおよびβ−Ｄ−グル
コースに作用した場合、Ｄ−グルコゾンと過酸化
水素を生成する。それ故、過酸化水素の生成量あ
るいは酸素の減少量を公知の方法で測定すること
によつて、生体試料中または食品中のグルコース
量を迅速に測定することが可能である。 〔従来技術〕 従来、Ｄ−グルコースを酸化して、Ｄ−グルコ
ゾンと過酸化水素を生成するピラノース・オキシ
ダーゼが担子菌ポリポラス・オブツサスに見出さ
れている（バイオキミカ・エ・バイオフイジカ・
アクタ）〔Biochimica et Biophysica Acta〕
Vol167、p493、p501（1968）〕。しかし、この酵素
はβ−Ｄ−グルコースに作用するが、α−Ｄ−グ
ルコースは基質となり得ない。また最近、特開昭
58−43785号公報にコリオラス属、ダエダレオプ
シス属、プロイロタス属またはグロエオフイルム
属に属する微生物がＤ−グルコースに特異性が高
いピラノース・オキシダーゼを生産するという報
告もある。 〔発明が解決しようとする問題点〕 生体試料中あるいは食品中のＤ−グルコースを
特異的に定量する方法としては従来よりグルコー
ス・オキシダーゼが繁用されている。しかし、グ
ルコース・オキシダーゼはβ−Ｄ−グルコースに
しか作用しない。生体試料中あるいは食品中のＤ
−グルコースの存在形態はα−Ｄ−グルコースと
して36.5％、β−Ｄ−グルコースとして63.5％で
ある。このため、グルコース・オキシダーゼを用
いてＤ−グルコースを定量する場合、ムタロター
ゼを添加しなければ迅速な定量ができない。 本発明者らは、上記現状に鑑み、担子菌の生産
するピラノース・オキシダーゼについて鋭意検討
を重ねた結果、ピラノース・オキシダーゼ生産菌
として公知であるポリポラス・オブツサスが培養
物中にα−Ｄ−グルコースにも作用する従来知ら
れていなかつたピラノース・オキシダーゼを著量
生産することを見出し、本発明を完成した。従つ
て本発明の目的はＤ−グルコースを迅速に定量で
きるピラノース・オキシダーゼおよびポリポラ
ス・オブツサスを培養して上記酵素を工業的に安
価に製造する方法を提供することにある。 〔問題点を解決するための手段〕 本発明を概説すれば、本発明はピラノース・オ
キシダーゼおよびその製造法に関するものであ
り、本発明の第１の発明は下記の理化学的性質を
有することを特徴とするピラノース・オキシダー
ゼに関する。 (1) 作用：酸素の存在下、Ｄ−グルコースの第２
炭素を酸化し、Ｄ−グルコゾンと過酸化水素を
生成する。 (2) 基質特異性：Ｄ−グルコースに対する作用が
最も高いが、Ｌ−ソルボース、Ｄ−キシロー
ス、Ｄ−マルトース、Ｄ−ガラクトース、２−
デオキシ−Ｄ−グルコース、グルコン酸δ−ラ
クトンなどにも作用する。またＤ−グルコース
に作用する場合、β−Ｄ−グルコースのみらら
ず、α−Ｄ−グルコースをも酸化する。 (3) 至適PHおよびPH安定性：至適PHが5.0付近で
あり、37℃、60分処理ではPH5.0〜9.0の間で安
定である。 (4) 至適温度および熱安定性：至適温度が55℃付
近であり、PH6.0、10分間処理では60℃まで安
定である。 (5) 電子受容体：分子状酸素を最適の電子受容体
とするが、フエナジンメトサルフエイトおよび
２，６−ジクロロフエノールインドフエノール
をも電子受容体とする。 (6) 分子量：ゲル過法で測定した分子量が約
195000で、ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）−
ポリアクリルアミドゲル電気泳動法で測定する
と約40000のサブユニツト３個、約30000のサブ
ユニツト１個および約28000のサブユニツト１
個から構成されている。 (7) 補酵素：補酵素であるフラビンアデニン・ジ
ヌクレオチド（FAD）が約40000のサブユニツ
ト１個当り１分子、酵素１分子当り３分子共有
結合している。 (8) 等電点：6.95 (9) 阻害剤：Hg2+、Fe2+、Ag+、フエニルメチ
ルスルホニルフルオリド、硫化ナトリウム、ｐ
−クロロメルクリ安息香酸、ｏ−フエナントロ
リンなどによつて阻害される。 (10) Km値：1.23×10-3M（Ｄ−グルコース） また、本発明の第２の発明はポリポラス属に属
するピラノース・オキシダーゼ生産能を有する菌
株を培地に培養し、該培養物から本発明の第１の
発明のピラノース・オキシダーゼを採取すること
を特徴とする。 本発明に使用される担子菌には、ポリポラス
（Polyporus）属に属する菌株、例えばポリポラ
ス・オブツサス（Polyporus obtusus）
ATCC26733がある。 本発明方法を更に詳しく説明すれば、培地に加
える栄養源は使用する菌株が利用し、ピラノー
ス・オキシダーゼを生産するものであればよく、
炭素源としては例えばグルコース、デンプン、シ
ユクロース、マルトース、ラクトース、グリセロ
ール、デキストリン、油脂類などが利用でき、窒
素源としては酵母エキス、ペプトン、脱脂大豆、
コーンスチープリカー、肉エキスなどが適当であ
る。その他にリン酸塩、カリウム塩、マグネシウ
ム塩などの無機質および金属塩類を加えてもよ
く、更にはビタミン類、生長促進因子を加えても
よい。 担子菌を培養するにあたり、ピラノース・オキ
シダーゼの生産量は培養条件により大きく変動す
るが、一般に培養温度は20〜35℃、培地のPH４〜
８が良く、２〜10日間の通気撹拌培養でピラノー
ス・オキシダーゼの生産は最高に達する。培養条
件は使用する菌株、培地組成などに応じ、ピラノ
ース・オキシダーゼの生産量が最大になるように
設定するのは当然である。本発明の菌株によつて
生成されたピラノース・オキシダーゼは主に菌体
内にある。菌体からのピラノース・オキシダーゼ
の精製は次のように行なう。 培養液を過して得た菌体をPH４〜10の緩衝液
に懸濁して、10〜40℃で２〜48時間撹拌するとピ
ラノース・オキシダーゼが菌体内より抽出され
る。 例えば、菌体10ｇを0.1M、0.5M、1Mおよび
2Mの各リン酸緩衝液（PH7.0）100mlに懸濁し、
20℃あるいは30℃で20時間撹拌して抽出した後、
遠心分離して得た上澄中のピラノース・オキシダ
ーゼ活性を第１表に示す。なお、コントロールと
して菌体10ｇと0.1Mリン酸緩衝液（PH7.0）100
mlをエマレーシヨン〔テラオカ(株)製〕を用いてホ
モゲナイズして得た上澄中の活性をも示す。
製造法に関する。さらに詳しくはβ−Ｄ−グルコ
ースのみならずα−Ｄ−グルコースにも作用する
ピラノース・オキシダーゼおよびポリポラス属に
属する担子菌によるその製造法に関する。 本発明のピラノース・オキシダーゼは、酸素の
存在下、α−Ｄ−グルコースおよびβ−Ｄ−グル
コースに作用した場合、Ｄ−グルコゾンと過酸化
水素を生成する。それ故、過酸化水素の生成量あ
るいは酸素の減少量を公知の方法で測定すること
によつて、生体試料中または食品中のグルコース
量を迅速に測定することが可能である。 〔従来技術〕 従来、Ｄ−グルコースを酸化して、Ｄ−グルコ
ゾンと過酸化水素を生成するピラノース・オキシ
ダーゼが担子菌ポリポラス・オブツサスに見出さ
れている（バイオキミカ・エ・バイオフイジカ・
アクタ）〔Biochimica et Biophysica Acta〕
Vol167、p493、p501（1968）〕。しかし、この酵素
はβ−Ｄ−グルコースに作用するが、α−Ｄ−グ
ルコースは基質となり得ない。また最近、特開昭
58−43785号公報にコリオラス属、ダエダレオプ
シス属、プロイロタス属またはグロエオフイルム
属に属する微生物がＤ−グルコースに特異性が高
いピラノース・オキシダーゼを生産するという報
告もある。 〔発明が解決しようとする問題点〕 生体試料中あるいは食品中のＤ−グルコースを
特異的に定量する方法としては従来よりグルコー
ス・オキシダーゼが繁用されている。しかし、グ
ルコース・オキシダーゼはβ−Ｄ−グルコースに
しか作用しない。生体試料中あるいは食品中のＤ
−グルコースの存在形態はα−Ｄ−グルコースと
して36.5％、β−Ｄ−グルコースとして63.5％で
ある。このため、グルコース・オキシダーゼを用
いてＤ−グルコースを定量する場合、ムタロター
ゼを添加しなければ迅速な定量ができない。 本発明者らは、上記現状に鑑み、担子菌の生産
するピラノース・オキシダーゼについて鋭意検討
を重ねた結果、ピラノース・オキシダーゼ生産菌
として公知であるポリポラス・オブツサスが培養
物中にα−Ｄ−グルコースにも作用する従来知ら
れていなかつたピラノース・オキシダーゼを著量
生産することを見出し、本発明を完成した。従つ
て本発明の目的はＤ−グルコースを迅速に定量で
きるピラノース・オキシダーゼおよびポリポラ
ス・オブツサスを培養して上記酵素を工業的に安
価に製造する方法を提供することにある。 〔問題点を解決するための手段〕 本発明を概説すれば、本発明はピラノース・オ
キシダーゼおよびその製造法に関するものであ
り、本発明の第１の発明は下記の理化学的性質を
有することを特徴とするピラノース・オキシダー
ゼに関する。 (1) 作用：酸素の存在下、Ｄ−グルコースの第２
炭素を酸化し、Ｄ−グルコゾンと過酸化水素を
生成する。 (2) 基質特異性：Ｄ−グルコースに対する作用が
最も高いが、Ｌ−ソルボース、Ｄ−キシロー
ス、Ｄ−マルトース、Ｄ−ガラクトース、２−
デオキシ−Ｄ−グルコース、グルコン酸δ−ラ
クトンなどにも作用する。またＤ−グルコース
に作用する場合、β−Ｄ−グルコースのみらら
ず、α−Ｄ−グルコースをも酸化する。 (3) 至適PHおよびPH安定性：至適PHが5.0付近で
あり、37℃、60分処理ではPH5.0〜9.0の間で安
定である。 (4) 至適温度および熱安定性：至適温度が55℃付
近であり、PH6.0、10分間処理では60℃まで安
定である。 (5) 電子受容体：分子状酸素を最適の電子受容体
とするが、フエナジンメトサルフエイトおよび
２，６−ジクロロフエノールインドフエノール
をも電子受容体とする。 (6) 分子量：ゲル過法で測定した分子量が約
195000で、ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）−
ポリアクリルアミドゲル電気泳動法で測定する
と約40000のサブユニツト３個、約30000のサブ
ユニツト１個および約28000のサブユニツト１
個から構成されている。 (7) 補酵素：補酵素であるフラビンアデニン・ジ
ヌクレオチド（FAD）が約40000のサブユニツ
ト１個当り１分子、酵素１分子当り３分子共有
結合している。 (8) 等電点：6.95 (9) 阻害剤：Hg2+、Fe2+、Ag+、フエニルメチ
ルスルホニルフルオリド、硫化ナトリウム、ｐ
−クロロメルクリ安息香酸、ｏ−フエナントロ
リンなどによつて阻害される。 (10) Km値：1.23×10-3M（Ｄ−グルコース） また、本発明の第２の発明はポリポラス属に属
するピラノース・オキシダーゼ生産能を有する菌
株を培地に培養し、該培養物から本発明の第１の
発明のピラノース・オキシダーゼを採取すること
を特徴とする。 本発明に使用される担子菌には、ポリポラス
（Polyporus）属に属する菌株、例えばポリポラ
ス・オブツサス（Polyporus obtusus）
ATCC26733がある。 本発明方法を更に詳しく説明すれば、培地に加
える栄養源は使用する菌株が利用し、ピラノー
ス・オキシダーゼを生産するものであればよく、
炭素源としては例えばグルコース、デンプン、シ
ユクロース、マルトース、ラクトース、グリセロ
ール、デキストリン、油脂類などが利用でき、窒
素源としては酵母エキス、ペプトン、脱脂大豆、
コーンスチープリカー、肉エキスなどが適当であ
る。その他にリン酸塩、カリウム塩、マグネシウ
ム塩などの無機質および金属塩類を加えてもよ
く、更にはビタミン類、生長促進因子を加えても
よい。 担子菌を培養するにあたり、ピラノース・オキ
シダーゼの生産量は培養条件により大きく変動す
るが、一般に培養温度は20〜35℃、培地のPH４〜
８が良く、２〜10日間の通気撹拌培養でピラノー
ス・オキシダーゼの生産は最高に達する。培養条
件は使用する菌株、培地組成などに応じ、ピラノ
ース・オキシダーゼの生産量が最大になるように
設定するのは当然である。本発明の菌株によつて
生成されたピラノース・オキシダーゼは主に菌体
内にある。菌体からのピラノース・オキシダーゼ
の精製は次のように行なう。 培養液を過して得た菌体をPH４〜10の緩衝液
に懸濁して、10〜40℃で２〜48時間撹拌するとピ
ラノース・オキシダーゼが菌体内より抽出され
る。 例えば、菌体10ｇを0.1M、0.5M、1Mおよび
2Mの各リン酸緩衝液（PH7.0）100mlに懸濁し、
20℃あるいは30℃で20時間撹拌して抽出した後、
遠心分離して得た上澄中のピラノース・オキシダ
ーゼ活性を第１表に示す。なお、コントロールと
して菌体10ｇと0.1Mリン酸緩衝液（PH7.0）100
mlをエマレーシヨン〔テラオカ(株)製〕を用いてホ
モゲナイズして得た上澄中の活性をも示す。
【表】
得られた抽出液に沈殿剤、例えば硫安を20〜
80w／ｖ％加えることにより、あるいは有機溶
媒、例えばアルコール、アセトンなどを50〜
80v／ｖ％加えることにより沈殿として分離され
る。得られた沈殿物を限外過、透析あるいはセ
フアデツクス処理などによつて脱塩し、粗酵素液
を得る。得られた粗酵素液を精製するには、あら
かじめ0.01Mホウ酸緩衝液（PH9.0）で緩衝化し
たDEAE−セフアロース（CL−6B）のカラムに
粗酵素液を吸着させ、吸着物を0.03Mホウ酸緩衝
液（PH9.0）で洗浄後、0.1Mホウ酸緩衝液（PH
9.0）で溶出して活性区分を集める。次にこの活
性区分を限外過で濃縮、脱塩後、0.01Mリン酸
緩衝液（PH6.0）で緩衝化したCM−セフアロース
（CL−6B）のカラムに吸着させ、吸着物を0.03M
リン酸緩衝液（PH6.0）で洗浄後、0.1Mリン酸緩
衝液（PH6.0）で溶出して活性区分を集める。こ
の活性区分を蒸留水で透折後、凍結乾燥し、精製
酵素粉末を得る。この酵素粉末はポリアクリルア
ミドゲルデイスク電気泳動的に単一である。 本発明のピラノース・オキシダーゼの酵素化学
的および理化学的性質は次のとおりである。 (1) 作用： 本酵素は酸素の存在下、Ｄ−グルコースに作
用した場合、Ｄ−グルコースの第２炭素を酸化
し、Ｄ−グルコゾンと過酸化水素を生成する。
その反応式は下記のごとくである。 Ｄ−グルコース＋O2→Ｄ−グルコゾン＋H2O2 (2) 基質特異性： 本酵素の基質として各種の糖溶液（反応液中
濃度1.67ｍＭ）を用いて検討したところ、本酵
素はＤ−グルコースに対する特異性が高く、他
にＬ−ソルボース、Ｄ−キシロースなどにも作
用した（第２表）。
80w／ｖ％加えることにより、あるいは有機溶
媒、例えばアルコール、アセトンなどを50〜
80v／ｖ％加えることにより沈殿として分離され
る。得られた沈殿物を限外過、透析あるいはセ
フアデツクス処理などによつて脱塩し、粗酵素液
を得る。得られた粗酵素液を精製するには、あら
かじめ0.01Mホウ酸緩衝液（PH9.0）で緩衝化し
たDEAE−セフアロース（CL−6B）のカラムに
粗酵素液を吸着させ、吸着物を0.03Mホウ酸緩衝
液（PH9.0）で洗浄後、0.1Mホウ酸緩衝液（PH
9.0）で溶出して活性区分を集める。次にこの活
性区分を限外過で濃縮、脱塩後、0.01Mリン酸
緩衝液（PH6.0）で緩衝化したCM−セフアロース
（CL−6B）のカラムに吸着させ、吸着物を0.03M
リン酸緩衝液（PH6.0）で洗浄後、0.1Mリン酸緩
衝液（PH6.0）で溶出して活性区分を集める。こ
の活性区分を蒸留水で透折後、凍結乾燥し、精製
酵素粉末を得る。この酵素粉末はポリアクリルア
ミドゲルデイスク電気泳動的に単一である。 本発明のピラノース・オキシダーゼの酵素化学
的および理化学的性質は次のとおりである。 (1) 作用： 本酵素は酸素の存在下、Ｄ−グルコースに作
用した場合、Ｄ−グルコースの第２炭素を酸化
し、Ｄ−グルコゾンと過酸化水素を生成する。
その反応式は下記のごとくである。 Ｄ−グルコース＋O2→Ｄ−グルコゾン＋H2O2 (2) 基質特異性： 本酵素の基質として各種の糖溶液（反応液中
濃度1.67ｍＭ）を用いて検討したところ、本酵
素はＤ−グルコースに対する特異性が高く、他
にＬ−ソルボース、Ｄ−キシロースなどにも作
用した（第２表）。
【表】
また、本酵素がα−Ｄ−グルコースとβ−Ｄ
−グルコースに作用した場合の反応速度を比較
した。反応系は100ｍMα−Ｄ−グルコースあ
るいはβ−Ｄ−グルコース溶液0.1ml、マツキ
ルベイン緩衝液（PH6.0）1.5ml、24.6ｍM4−ア
ミノアンチピリン溶液0.1ml、0.42Mフエノー
ル溶液0.1ml、西洋ワサビ由来のペルオキシダ
ーゼ溶液（240単位／ml）0.1ml、水1.0mlおよ
び本酵素液（30単位／ml）0.1ml、反応液量3.0
mlで37℃、キユベツト中で反応を行ない生成し
たキノネイミン色素による500nｍの吸収変化
を経時的に測定した。その結果を第１図に示
す。 第１図中、実線はβ−Ｄ−グルコース、点線
はα−Ｄ−グルコースの場合であり、横軸は反
応時間（秒）、縦軸は吸光度をそれぞれ示す。 第１図より明らかなように本酵素はβ−Ｄ−
グルコースに対する活性よりも若干低いが、α
−Ｄ−グルコースにも充分作用することが認め
られた。 ところで、α−Ｄ−グルコースには作用しな
いことが公知であるグルコース・オキシダーゼ
を用いて同様な実験を行なつた。その結果を第
２図に示す。第２図中実線はβ−Ｄ−グルコー
ス、点線はα−Ｄ−グルコースの場合であり、
横軸は反応時間（秒）、縦軸は吸光度をそれぞ
れ示す。グルコース・オキシダーゼ溶液（東洋
紡製300単位／ml）0.1mlを用いて、500nｍの吸
収変化を追跡したところ、見かけ上α−Ｄ−グ
ルコースにも若干作用しているが、これはα−
Ｄ−グルコースからβ−Ｄ−グルコースへの非
酵素的変換に起因するものである。 (3) 至適PHおよびPH安定性： 本酵素の至適PHは第３図の曲線で表わされる
ごとく、PH5.0付近に高い活性を有している。
本酵素を37℃においてそれぞれのPHで60分間処
理したときのPH安定性を第４図に示した。第４
図より明らかなように本酵素はPH5.0〜9.0の間
で安定である。 (4) 至適温度および熱安定性： 本酵素の至適温度は第５図の曲線で表わされ
るごとく、55℃付近に至適温度を有している。
本酵素をPH6.0においてそれぞれの温度で10分
間処理したときの熱安定性を第６図に示した。
本酵素は60℃まで安定であつた。 (5) 電子受容体： 本酵素の電子受容体の検討を行なつたところ
本酵素は分子状の酸素を最適の電子受容体とす
るが、他にフエナジンメトサルフエイトおよび
２，６−ジクロロフエノールインドフエノール
をも電子受容体とした（第３表）。
−グルコースに作用した場合の反応速度を比較
した。反応系は100ｍMα−Ｄ−グルコースあ
るいはβ−Ｄ−グルコース溶液0.1ml、マツキ
ルベイン緩衝液（PH6.0）1.5ml、24.6ｍM4−ア
ミノアンチピリン溶液0.1ml、0.42Mフエノー
ル溶液0.1ml、西洋ワサビ由来のペルオキシダ
ーゼ溶液（240単位／ml）0.1ml、水1.0mlおよ
び本酵素液（30単位／ml）0.1ml、反応液量3.0
mlで37℃、キユベツト中で反応を行ない生成し
たキノネイミン色素による500nｍの吸収変化
を経時的に測定した。その結果を第１図に示
す。 第１図中、実線はβ−Ｄ−グルコース、点線
はα−Ｄ−グルコースの場合であり、横軸は反
応時間（秒）、縦軸は吸光度をそれぞれ示す。 第１図より明らかなように本酵素はβ−Ｄ−
グルコースに対する活性よりも若干低いが、α
−Ｄ−グルコースにも充分作用することが認め
られた。 ところで、α−Ｄ−グルコースには作用しな
いことが公知であるグルコース・オキシダーゼ
を用いて同様な実験を行なつた。その結果を第
２図に示す。第２図中実線はβ−Ｄ−グルコー
ス、点線はα−Ｄ−グルコースの場合であり、
横軸は反応時間（秒）、縦軸は吸光度をそれぞ
れ示す。グルコース・オキシダーゼ溶液（東洋
紡製300単位／ml）0.1mlを用いて、500nｍの吸
収変化を追跡したところ、見かけ上α−Ｄ−グ
ルコースにも若干作用しているが、これはα−
Ｄ−グルコースからβ−Ｄ−グルコースへの非
酵素的変換に起因するものである。 (3) 至適PHおよびPH安定性： 本酵素の至適PHは第３図の曲線で表わされる
ごとく、PH5.0付近に高い活性を有している。
本酵素を37℃においてそれぞれのPHで60分間処
理したときのPH安定性を第４図に示した。第４
図より明らかなように本酵素はPH5.0〜9.0の間
で安定である。 (4) 至適温度および熱安定性： 本酵素の至適温度は第５図の曲線で表わされ
るごとく、55℃付近に至適温度を有している。
本酵素をPH6.0においてそれぞれの温度で10分
間処理したときの熱安定性を第６図に示した。
本酵素は60℃まで安定であつた。 (5) 電子受容体： 本酵素の電子受容体の検討を行なつたところ
本酵素は分子状の酸素を最適の電子受容体とす
るが、他にフエナジンメトサルフエイトおよび
２，６−ジクロロフエノールインドフエノール
をも電子受容体とした（第３表）。
【表】
(6) 分子量：
本酵素の分子量は、セフアクリルＳ−300（フ
アルマシア製）によるゲル過法では約195000
であつた。また、（SDS）−ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動法で測定すると、約40000のサブ
ユニツト３個、約30000のサブユニツト１個お
よび約28000のサブユニツト１個から構成され
ていた。 (7) 補酵素： 精製酵素液0.1％濃度（0.1Mリン酸緩衝液PH
7.0）の吸収スペクトルを測定したところ、第
７図に示すフラビン酵素の吸収スペクトルを示
した。 本酵素を熱処理あるいはトリクロロ酢酸処理
し、遠心分離して得られた上澄の薄層クロマト
グラフイーを行なつたが（展開溶媒ｎ−ブタノ
ール：酢酸：水＝４：１：５）、フラビン系色
素は原点から移動せず酵素蛋白と共有結合して
いることが示唆された。そこで本酵素にプロナ
ーゼを作用させた後、ホスホジエステラーゼ処
理をしたところアデノシン−5′−１リン酸
（AMP）の生成が認められたので、FADが本
酵素の補酵素であることが判明した。FADの
450nｍにおける分子吸光係数から判断すると、
本酵素１分子当り３分子のFADが含まれてい
た。なお、本酵素の（SDS）−ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動を行なつて得られたゲルを５
％酢酸溶液中で365nｍの紫外線照射すること
により、３種のサブユニツトのうち40000のサ
ブユニツトのみにFADが存在することが確認
された。 (8) 等電点： フアルマライト（PH３〜10、フアルマシア
製）を用いた焦点電気泳動法により求めた本酵
素の等電点は6.95であつた。 (9) 阻害剤、金属イオン、金属キレート剤の影
響： 本酵素はHg2+、Fe2+、Ag2+、PMSF（フエ
ニルメチルスルホニルフルオリド）、硫化ナト
リウム、PCMB（ｐ−クロロメルクリ安息香
酸）、ｏ−フエナントロリンなどによつて阻害
される（第４表）。
アルマシア製）によるゲル過法では約195000
であつた。また、（SDS）−ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動法で測定すると、約40000のサブ
ユニツト３個、約30000のサブユニツト１個お
よび約28000のサブユニツト１個から構成され
ていた。 (7) 補酵素： 精製酵素液0.1％濃度（0.1Mリン酸緩衝液PH
7.0）の吸収スペクトルを測定したところ、第
７図に示すフラビン酵素の吸収スペクトルを示
した。 本酵素を熱処理あるいはトリクロロ酢酸処理
し、遠心分離して得られた上澄の薄層クロマト
グラフイーを行なつたが（展開溶媒ｎ−ブタノ
ール：酢酸：水＝４：１：５）、フラビン系色
素は原点から移動せず酵素蛋白と共有結合して
いることが示唆された。そこで本酵素にプロナ
ーゼを作用させた後、ホスホジエステラーゼ処
理をしたところアデノシン−5′−１リン酸
（AMP）の生成が認められたので、FADが本
酵素の補酵素であることが判明した。FADの
450nｍにおける分子吸光係数から判断すると、
本酵素１分子当り３分子のFADが含まれてい
た。なお、本酵素の（SDS）−ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動を行なつて得られたゲルを５
％酢酸溶液中で365nｍの紫外線照射すること
により、３種のサブユニツトのうち40000のサ
ブユニツトのみにFADが存在することが確認
された。 (8) 等電点： フアルマライト（PH３〜10、フアルマシア
製）を用いた焦点電気泳動法により求めた本酵
素の等電点は6.95であつた。 (9) 阻害剤、金属イオン、金属キレート剤の影
響： 本酵素はHg2+、Fe2+、Ag2+、PMSF（フエ
ニルメチルスルホニルフルオリド）、硫化ナト
リウム、PCMB（ｐ−クロロメルクリ安息香
酸）、ｏ−フエナントロリンなどによつて阻害
される（第４表）。
以下に本発明によるピラノース・オキシダーゼ
の製造方法を実施例をもつて示すが、本発明が以
下の実施例に限定されるものではない。なお、％
は他に特記せぬ限りｗ／ｖ％である。 実施例 １ グルコース２％、エビオス0.5％および寒天1.5
％（エビオス培地）の組成の斜面培地にポリポラ
ス・オブツサスATCC26733を接種し、25℃にて
１週間静置培養して種菌とした。グルコース２
％、酵母エキス0.3％、ペプトン１％、
KH2PO40.3％およびMgSO4・7H2O0.1％の組成
の培地100mlを500ml容の三角フラスコに分注し、
120℃で20分間殺菌後、冷却し、これに上記の種
菌をかきとり接種して、25℃で８日間、毎分100
回転で振盪培養した。培養終了後、培養液を過
して菌体を得た。この菌体を1M酢酸緩衝液（PH
5.0）50mlと共に三角フラスコに入れ、25℃、20
時間撹拌しながらピラノース・オキシダーゼの抽
出を行なつた。この抽出液から遠心分離によつて
上澄液を得た。この上澄液の総活性は220単位で
あつた。 実施例 ２ 実施例１のエビオス培地で培養したポリポラ
ス・オブツサスATCC26733をグルコース２％、
酵母エキス0.3％、ペプトン１％、KH2PO40.3％
およびMgSO4・7H2O0.1％の培地100mlを分注し
て殺菌（120℃、20分間）した500mlの三角フラス
コに接種し、25℃で６日間培養して、種培養液と
した。グルコース２％、酵母エキス0.1％、ペプ
トン２％、KH2PO40.3％、MgSO4・7H2O0.1％
および消泡剤（日本油脂社製CB−442）0.02％
（ｖ／ｖ）の組成の培地20を30容のジヤーフ
アーメンターに入れ、120℃で20分間殺菌した。
冷却後、上記の種培養液100mlを接種し、27℃で
７日間、毎分20の通気量と毎分300回転の撹拌
速度の条件で培養した。培養終了後、過して菌
体を得た。この菌体1.50Kgと1Mリン酸緩衝液
（PH7.0）10を撹拌槽に入れ、30℃で24時間、撹
拌しながらピラノース・オキシダーゼの抽出を行
なつた。抽出液から過により菌体残渣を除き、
上澄液を得た。この上澄液11のピラノース・オ
キシダーゼ活性は5.40単位／mlであつた。この上
澄液11に硫酸アンモニウムを70％飽和になるよう
に加えて、一昼夜放置後、得た硫安沈殿物を約
500mlの0.01Mホウ酸緩衝液（PH9.0）に溶解し
た。この粗酵素液を限外過で濃縮し、脱塩後、
あらかじめ0.01Mホウ酸緩衝液（PH9.0）で緩衝
化したDEAE−セフアロース（CL−6B）のカラ
ム（直径5.0cm×長さ10cm）に吸着させ、吸着物
を0.03Mホウ酸緩衝液（PH9.0）で洗浄後、0.1M
ホウ酸緩衝液（PH9.0）で溶出して活性区分を集
めた。次にこの活性区分を限外過で濃縮し、脱
塩後、0.01Mリン酸緩衝液（PH6.0）で緩衝化し
たCM−セフアロース（CL−6B）のカラム（直
径5.0cm×長さ４cm）に吸着させ、吸着物を
0.03Mリン酸緩衝液（PH6.0）で洗浄後、0.1Mリ
ン酸緩衝液（PH6.0）で溶出して活性区分を集め
た。この活性区分を蒸留水で透析後、凍結乾燥
し、精製酵素粉末2.25ｇを得た。この粉末の比活
性は13.7単位／mgであつた。この酵素粉末はポリ
アクリルアミドゲルデイスク電気泳動的に単一で
あつた。以上の精製工程を第５表に示す。
の製造方法を実施例をもつて示すが、本発明が以
下の実施例に限定されるものではない。なお、％
は他に特記せぬ限りｗ／ｖ％である。 実施例 １ グルコース２％、エビオス0.5％および寒天1.5
％（エビオス培地）の組成の斜面培地にポリポラ
ス・オブツサスATCC26733を接種し、25℃にて
１週間静置培養して種菌とした。グルコース２
％、酵母エキス0.3％、ペプトン１％、
KH2PO40.3％およびMgSO4・7H2O0.1％の組成
の培地100mlを500ml容の三角フラスコに分注し、
120℃で20分間殺菌後、冷却し、これに上記の種
菌をかきとり接種して、25℃で８日間、毎分100
回転で振盪培養した。培養終了後、培養液を過
して菌体を得た。この菌体を1M酢酸緩衝液（PH
5.0）50mlと共に三角フラスコに入れ、25℃、20
時間撹拌しながらピラノース・オキシダーゼの抽
出を行なつた。この抽出液から遠心分離によつて
上澄液を得た。この上澄液の総活性は220単位で
あつた。 実施例 ２ 実施例１のエビオス培地で培養したポリポラ
ス・オブツサスATCC26733をグルコース２％、
酵母エキス0.3％、ペプトン１％、KH2PO40.3％
およびMgSO4・7H2O0.1％の培地100mlを分注し
て殺菌（120℃、20分間）した500mlの三角フラス
コに接種し、25℃で６日間培養して、種培養液と
した。グルコース２％、酵母エキス0.1％、ペプ
トン２％、KH2PO40.3％、MgSO4・7H2O0.1％
および消泡剤（日本油脂社製CB−442）0.02％
（ｖ／ｖ）の組成の培地20を30容のジヤーフ
アーメンターに入れ、120℃で20分間殺菌した。
冷却後、上記の種培養液100mlを接種し、27℃で
７日間、毎分20の通気量と毎分300回転の撹拌
速度の条件で培養した。培養終了後、過して菌
体を得た。この菌体1.50Kgと1Mリン酸緩衝液
（PH7.0）10を撹拌槽に入れ、30℃で24時間、撹
拌しながらピラノース・オキシダーゼの抽出を行
なつた。抽出液から過により菌体残渣を除き、
上澄液を得た。この上澄液11のピラノース・オ
キシダーゼ活性は5.40単位／mlであつた。この上
澄液11に硫酸アンモニウムを70％飽和になるよう
に加えて、一昼夜放置後、得た硫安沈殿物を約
500mlの0.01Mホウ酸緩衝液（PH9.0）に溶解し
た。この粗酵素液を限外過で濃縮し、脱塩後、
あらかじめ0.01Mホウ酸緩衝液（PH9.0）で緩衝
化したDEAE−セフアロース（CL−6B）のカラ
ム（直径5.0cm×長さ10cm）に吸着させ、吸着物
を0.03Mホウ酸緩衝液（PH9.0）で洗浄後、0.1M
ホウ酸緩衝液（PH9.0）で溶出して活性区分を集
めた。次にこの活性区分を限外過で濃縮し、脱
塩後、0.01Mリン酸緩衝液（PH6.0）で緩衝化し
たCM−セフアロース（CL−6B）のカラム（直
径5.0cm×長さ４cm）に吸着させ、吸着物を
0.03Mリン酸緩衝液（PH6.0）で洗浄後、0.1Mリ
ン酸緩衝液（PH6.0）で溶出して活性区分を集め
た。この活性区分を蒸留水で透析後、凍結乾燥
し、精製酵素粉末2.25ｇを得た。この粉末の比活
性は13.7単位／mgであつた。この酵素粉末はポリ
アクリルアミドゲルデイスク電気泳動的に単一で
あつた。以上の精製工程を第５表に示す。
本発明により臨床診断試薬として極めて有用な
ピラノース・オキシダーゼおよびその工業的生産
に適した製造法が提供された。
ピラノース・オキシダーゼおよびその工業的生産
に適した製造法が提供された。
第１図は本発明により得られるピラノース・オ
キシダーゼのα−Ｄ−グルコースおよびβ−Ｄ−
グルコースに対する反応の特異性を表わすグラフ
であり、第２図は公知のグルコース・オキシダー
ゼのα−Ｄ−グルコースおよびβ−Ｄ−グルコー
スに対する反応の特異性を表わすグラフであり、
第３図は本発明により得られるピラノース・オキ
シダーゼのPHと活性の関係を表わすグラフであ
り、第４図は本発明による酵素を37℃においてそ
れぞれのPHで60分間処理した後のPHと活性の関係
を表わすグラフであり、第５図は本発明による酵
素の温度と活性の関係を表わすグラフであり、第
６図はPH6.0においてそれぞれの温度で10分間処
理した後の温度と活性の関係を表わすグラフであ
り、第７図は本発明による酵素の吸収スペクトル
（酵素濃度0.1％、PH7.0）を表わすグラフである。
キシダーゼのα−Ｄ−グルコースおよびβ−Ｄ−
グルコースに対する反応の特異性を表わすグラフ
であり、第２図は公知のグルコース・オキシダー
ゼのα−Ｄ−グルコースおよびβ−Ｄ−グルコー
スに対する反応の特異性を表わすグラフであり、
第３図は本発明により得られるピラノース・オキ
シダーゼのPHと活性の関係を表わすグラフであ
り、第４図は本発明による酵素を37℃においてそ
れぞれのPHで60分間処理した後のPHと活性の関係
を表わすグラフであり、第５図は本発明による酵
素の温度と活性の関係を表わすグラフであり、第
６図はPH6.0においてそれぞれの温度で10分間処
理した後の温度と活性の関係を表わすグラフであ
り、第７図は本発明による酵素の吸収スペクトル
（酵素濃度0.1％、PH7.0）を表わすグラフである。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 次の理化学的性質を有するピラノース・オキ
シダーゼ。 (1) 作用：酸素の存在下、Ｄ−グルコースの第２
炭素を酸化し、Ｄ−グルコゾンと過酸化水素を
生成する。 (2) 基質特異性：Ｄ−グルコースに対する作用が
最も高いが、Ｌ−ソルボース、Ｄ−キシロー
ス、Ｄ−マルトース、Ｄ−ガラクトース、２−
デオキシ−Ｄ−グルコース、グルコン酸δ−ラ
クトンなどにも作用する。またＤ−グルコース
に作用する場合、β−Ｄ−グルコースのみなら
ずα−Ｄ−グルコースをも酸化する。 (3) 至適PHおよびPH安定性：至適PHが5.0付近で
あり、37℃、60分処理ではPH5.0〜9.0の間で安
定である。 (4) 至適温度および熱安定性：至適温度が55℃付
近であり、PH6.0、10分間処理では60℃まで安
定である。 (5) 電子受容体：分子状酸素を最適の電子受容体
とするが、フエナジンメトサルフエイトおよび
２，６−ジクロロフエノールインドフエノール
をも電子受容体とする。 (6) 分子量：ゲル過法で測定した分子量が約
195000で、ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）−
ポリアクリルアミドゲル電気泳動法で測定する
と約40000のサブユニツト３個、約30000のサブ
ユニツト１個および約28000のサブユニツト１
個から構成されている。 (7) 補酵素：補酵素であるフラビンアデニン・ジ
ヌクレオチド（FAD）が約40000のサブユニツ
ト１個当り１分子、酵素１分子当り３分子共有
結合している。 (8) 等電点：6.95 (9) 阻害剤：Hg2+、Fe2+、Ag+、フエニルメチ
ルスルホニルフルオリド、硫化ナトリウム、ｐ
−クロロメルクリ安息香酸、ｏ−フエナントロ
リンなどによつて阻害される。 (10) Km値：1.23×10-3M（Ｄ−グルコース） ２ ポリポラス属に属するピラノース・オキシダ
ーゼ生産能を有する菌株を培地に培養し、該培養
物から下記の理化学的性質を有するピラノース・
オキシダーゼを採取することを特徴とするピラノ
ース・オキシダーゼの製造法。 (1) 作用：酸素の存在下、Ｄ−グルコースの第２
炭素を酸化し、Ｄ−グルコゾンと過酸化水素を
生成する。 (2) 基質特異性：Ｄ−グルコースに対する作用が
最も高いが、Ｌ−ソルボース、Ｄ−キシロー
ス、Ｄ−マルトース、Ｄ−ガラクトース、２−
デオキシ−Ｄ−グルコース、グルコン酸δ−ラ
クトンなどにも作用する。またＤ−グルコース
に作用する場合、β−Ｄ−グルコースのみなら
ずα−Ｄ−グルコースをも酸化する。 (3) 至適PHおよびPH安定性：至適PHが5.0付近で
あり、37℃、60分処理ではPH5.0〜9.0の間で安
定である。 (4) 至適温度および熱安定性：至適温度が55℃付
近であり、PH6.0、10分間処理では60℃まで安
定である。 (5) 電子受容体：分子状酸素を最適の電子受容体
とするが、フエナジンメトサルフエイトおよび
２，６−ジクロロフエノールインドフエノール
をも電子受容体とする。 (6) 分子量：ゲル過法で測定した分子量が約
195000で、ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）−
ポリアクリルアミドゲル電気泳動法で測定する
と約40000のサブユニツト３個、約30000のサブ
ユニツト１個および約28000のサブユニツト１
個から構成されている。 (7) 補酵素：補酵素であるフラビンアデニン・ジ
ヌクレオチド（FAD）が約40000のサブユニツ
ト１個当り１分子、酵素１分子当り３分子共有
結合している。 (8) 等電点：6.95 (9) 阻害剤：Hg2+、Fe2+、Ag+、フエニルメチ
ルスルホニルフルオリド、硫化ナトリウム、ｐ
−クロロメルクリ安息香酸、ｏ−フエナントロ
リンなどによつて阻害される。 (10) Km値：1.23×10-3M（Ｄ−グルコース） ３ 培養物からピラノース・オキシダーゼを採取
するに際し、培養物から得られる培養菌体をPH４
〜10の緩衝液に懸濁してピラノース・オキシダー
ゼを抽出する工程を含むことを特徴とする特許請
求の範囲第２項記載の方法。 ４ ポリポラス属に属する担子菌がポリポラス・
オブツサスであることを特徴とする特許請求の範
囲第２項または第３項記載の方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60080885A JPS61239886A (ja) | 1985-04-16 | 1985-04-16 | ピラノ−ス・オキシダ−ゼおよびその製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60080885A JPS61239886A (ja) | 1985-04-16 | 1985-04-16 | ピラノ−ス・オキシダ−ゼおよびその製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61239886A JPS61239886A (ja) | 1986-10-25 |
| JPH0314426B2 true JPH0314426B2 (ja) | 1991-02-26 |
Family
ID=13730796
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60080885A Granted JPS61239886A (ja) | 1985-04-16 | 1985-04-16 | ピラノ−ス・オキシダ−ゼおよびその製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS61239886A (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH07102154B2 (ja) * | 1992-03-02 | 1995-11-08 | 日東紡績株式会社 | １，５−アンヒドログルシトールの定量法 |
| DE4321807C2 (de) * | 1992-06-30 | 1996-08-14 | Nitto Boseki Co Ltd | Verfahren zur quantitativen Bestimmung von 1,5-Anhydroglucitol und Testpack |
-
1985
- 1985-04-16 JP JP60080885A patent/JPS61239886A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS61239886A (ja) | 1986-10-25 |
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