JPH03147784A - 修飾スーパーオキサイドディスムターゼの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、虚血性疾患の治療剤、放射線傷害治療剤、抗
炎症治療剤などの医薬品に、また皮膚でおこる酸素傷害
の防止の為の化粧品等に利用することのできる修飾スー
パーオキサイドディスムターゼに関するものである。

〔従来の技術〕

スーパーオキサイドディスムターゼ（ＳＯＤ）は、広く
生物界に存在し、酸素の代謝産物であるスーパーオキサ
イドアニオンラジカル（以下ラジカルと略す）を消去す
る酵素として知られる。動物、植物、微生物等、酸素を
必要として生きているもの全てにおいて見出されている
。

ヒトでは銅と亜鉛を持つ型、マンガンを持つ型及び最近
、細胞の外にある細胞外ＳＯＤの３種が存在することが
確認されている。広く一般に知られるのは銅と亜鉛を持
つ型である。これらＳＯＤがリュウマチや変形性関節症
に対して抗炎効果があるとの報告がなされ、また虚血−
再潅流傷害防止などを期待し、臨床訃究がなされている
。しかし、その殆どが未修飾状態の８０Ｄの投与により
なされている。これら８０Ｄが血中に投与された時の半
減期は数分と短い為、ＳＯＤの効果を最大限引き出して
いるとは言えず、限定された範囲でのみ効力試験が実施
されているに過ぎない。

本発明は、血中での半減期を極めて長くし、広い範囲で
臨床応用が可能な薬剤としての修飾スーパーオキサイド
ディスムターゼの簡単で、しかも高純度な薬剤を得る高
回収率な工業的規模での製造を可能とした製造法に関す
る。従来、ＳＯＤの血中半減期を延長させる為、ＳＯＤ
の種々の化学修飾が行われている。

例えば、高分子デキストラン（Ｗ、　Ｆ、　Ｐｅｔｒｏ
ｎｅｅｔ　ａｌ、　、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃ
ａｄ、　８ｃｉ、　Ｕ　８　Ａ　７７　。

１１５９（１９８０））、ポリエチレングリコール（特
開昭・６１−２４９３８８、特開昭６２−１１５２８０
、特開昭６３−２４５６７１、Ｃｈａｒｌｅｓ　Ｏ，Ｂ
ｅａｕｃｈａｍｐらの報告（ＡｎａｌｙｔｉｃａｌＢｉ
ｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　１３１．　２５−３３（１９
８３））、またはイヌリン（特開昭５８−３２８２６）
などによるＳＯＤの修飾が行われている。しかし、これ
らの修飾ＳＯＤ及び修飾ＳＯＤの製造法は、下記に示す
ように種々の欠点を有しており、問題点を充分に解決す
るに至っていない。

〔発明が解決しようとする課題〕

上記のＳＯＤ誘導体は全て、静脈内投与及び筋肉的投与
等により、生体での酸化的組織障害を防止することを目
的に開発されたものである。上記チャールズ・オ・ビュ
ーチャンプ（Ｃｈａｒｌｅｓ　Ｏ。

Ｂｅａｕｃｈａｍｐ　）らの報告を除いて、いずれの誘
導体も活性化された修飾化剤は２つの官能基を有してお
り、修飾剤を介し、ＳＯＤが２分子導入され、分子量の
大きい修飾体が製造される為、血中半減期が非常に延長
されてしまい、未修飾ＳＯＤよりは血中半減期が長くな
るとの利点に加え、生体に長く滞留し過ぎてしまう等の
欠点をも示している。

前記のようにビューチャンプらはこの点に改良を加え、
Ｎ、Ｎ’−カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）による
活性化によりポリエチレングリコール（ＰＥＧ）に１つ
の官能基を持たせることに成功し、報告している。しか
し、この方法は製造、特に、医薬用途に大量製造するに
は処理量が少なすぎまた処理に長時間を有する等の欠点
があった。

本発明はこのような事情に鑑みなされたもので、短時間
で、大量にポリオキシエチレングリコール修飾５ＯＤ（
ＰＥＧ−８ＯＤと略す）または、ポリオキシエチレング
リコール・ポリオキシプロピレングリコール・ポリオキ
シエチレングリコール修飾５ＯＤ（ＰＥＧ−ＰＰＧ−８
ＯＤと略す）を製造し、医薬用途に供することを目的に
鋭意検討した結果見出されたものである。

〔課題を解決する為の手段〕

本発明者らは、蛋白質を医薬品に供与する研究を検討し
ていく過程で、蛋白質の血中における半減期を延長させ
ることによって蛋白質の医薬利用の範囲を最大限引き出
すことが可能となることを見出し、既に特開昭５９−５
９０２９に効力持続型組成物を出願している。本発明で
用いられる未修飾なスーパーオキサイドディスムターゼ
（８０Ｄ）は、近年医薬用途として脚光をあびてきてお
り、臨床研究も精力的に進められてきている。

しかし、発明者らは未修飾ＳＯＤの血中の半減期がラッ
トで数分と極めて短いこと、薬効を示す量が、通常考え
られる医薬用酵素蛋白質の量よりはるかに多いことに着
目し、これらの欠点をカバーできる方法として、大量に
処理することが可能な簡易な、高収率な、高純度な修飾
スーパーオキサイドディスムターゼの研究を鋭意重ねて
きた。

前記のようにビューチャンプらはＣＤＩで活性化したＰ
ＥＧによる修飾ＳＯＤの報告をしているが、彼らの製造
法は大量に製造する上では設備等・において難点があっ
た。

本発明はこれらの欠点を克服するもので、式（式中Ｒは
平均分子量的２，０００〜１０，０００の水溶性重合物
残基を表わす） にて示される重合物のカルボニルジイミダゾール誘導体
とスーパーオキサイドディスムターゼとをｐＨ９，０−
１１，０、濃度０．１Ｍ−０，５Ｍ、好ましくは０．２
−０．４Ｍ、の緩衝液の存在下に、３０−７０’Ｃ，好
ましくは４５−６０°Ｃにおいて反応させることを特徴
とする式 ％式％（１） （式中、孔は前記と同義、ＳＯＤはスーパーオキサイド
ディスムターゼの残基を表わす）にて示される修飾スー
パーオキサイドディスムターゼの製造法である。

式（Ｉ）の重合物のカルボニルジイミダゾール誘導体は
分子量約２，０００ないし１０．Ｇｏｏの水溶性重合物
をジオキサンのような無関係溶媒中でカルボニルジイミ
ダゾール（ＣＤＩ）と反応させることによって得ること
ができる。

水溶性重合物としては、たとえば、分子量約２．０００
ないし１０，０００のポリオキシアルキレングリコール
、たとえば、ポリオキシエチレングリコール、モノ低級
アルコキシポリオキシエチレングリコール、モノ低級ア
ルコキシポリオキシエチレン・ポリオキシプロピレン・
ポリオキシエチレングリコールなどが挙げられる。上記
の低級アルコキシは通常０１〜Ｃ４アルコキシ基である
。水溶性重合物の好ましい例は、平均分子量３，５００
のモノメトキシポリオキシエチレングリコールおよび同
分子量のモノメトキシポリオキシエチレン・ポリオキシ
プロピレン・ポリオキシエチレングリコールである。

水溶性重合物のＣＤＩによる活性化率を高めかつ一定化
するには、水溶性重合物をその初発濃度が０．１５〜０
．３５Ｍ１好ましくは０．２５〜０．３Ｍになるように
反応溶媒に加えるのがよく、また重合物とＣＤＩの初発
濃度比は前者１に対して後者１〜３、好ましくは後者１
．５〜２．５とするのがよい。

上記の濃度を選べば反応液量を減少させることができる
。

また、ｐＨ６〜６．５程度の微酸性緩衝剤を反応混合物
に加えてｐＨを上昇させることなく反応を停止させるこ
とにより重合物の活性化率を一定に保つこともできる。

反応後、透析、凍結乾燥などの手段により反応混合物か
ら式（１）の誘導体を分離することができる。

表１は本発明の１例とビューチャンプらの方法を比較し
たものである。本発明者らとビューチャンプらの方法と
の決定的な相違は表１（４）における活性化修飾剤の製
造において、修飾剤の濃度、反応後の緩衝液の添加によ
るｐＨの上昇を起こさない反応の停止にある。この二つ
の条件の改良は安定な活性化修飾剤を大量に調製するに
際して、必須であることが、鋭意条件の改良を加えてい
く過程で判明した。即ち、修飾剤の濃度は大量に活性化
を行うことを容易にした。その濃度範囲は０．１５〜０
．３５Ｍでも可能であるが、好ましくは０．２５〜０．
３Ｍが良い。ビューチャンプらは修飾剤と活性化剤ＣＤ
Ｉの濃度比を１：１０で検討しているが、本発明者らは
１：１〜１：３、好ましくは１：１゜５〜１：２．５の
割合が最も修飾化が一定できることを見出した。また修
飾剤濃度を高く保つので、反応液量を少なくすることを
可能とした。その為、反応後の反応液をさらに濃縮処理
する装置の利用が可能となり、以後の処理を簡易にする
ことに到達した。次に表１ａ３）においては、活性化Ｐ
ＥＧまたはＰＥＧ−ＰＰＧによるＳＯＤの修飾化におい
ては、本発明の特徴をさらに明瞭にすることが可能であ
る。本発明では緩衝液の濃度を高く保つことで、大量製
造した時の、蛋白質の量によるｐＨの変化を最小限に抑
えることを可能とするばかりでなく、ｐＨをあげること
によって、反応速度を短縮することが可能となることが
判明した。

緩衝液のｐＨは９〜１０が、濃度は０．１〜０．５　Ｍ
１好ましくは０．２−０．４Ｍが良い。緩衝液の組成は
本発明のｐｕ範囲で緩衝化能があり、容易に調製が可能
なものであれば限定されるものではない。

炭酸水素ナトリウム緩衝液は、医薬品添加物に良く用い
られ、安全性が高いことから、好ましい緩衝液である。

本発明者らは、活性化ＰＥＧまたはＰＥＧ−ＰＰＧのＳ
ＯＤの修飾化反応を早く進行させ、大量製造法を種々検
討した結果、反応温度は、３０〜７０°Ｃ１好ましくは
４５〜６０℃で行うことにより、極めて短時間に修飾化
を完了することを可能とした。従来、他の蛋白質では、
蛋白質の熱に対する安定性が必ずしも良いとは言えず、
上記のような反応温度で修飾反応を進行させることは望
ましくはなかったが、意外にも優れた結果が得られた。

さらに、本発明者らは活性化ＰＥＧまたはＰＥＧ−ＰＰ
ＧとＳＯＤの濃度を高くして反応することができ、工業
的な大量製造を行うことを充分可能とした。本発明は、
ＰＥＧまたはＰＥＧ−ＰＰＧ修飾８０Ｄの製造を意図す
るものであるから、製造した修飾ＳＯＤに未修飾なＳＯ
Ｄや活性化剤が混入するのは望ましくない。そこで、発
明者らは、前者の対策として、修飾化を２回行うことで
完全に未修飾ＳＯＤが消失することを見出したが、１回
の修飾化反応においても、修飾ＳＯＤ中の未修飾ＳＯＤ
含量は８％以下であり、充分医薬用途に供せられるもの
であることを知った。

また、未反応の活性化剤の混入を完全に除去する為、陰
イオン交換体によるカラムクロマトが有効な手段である
ことを見出した。未修飾活性化剤と修飾ＳＯＤの分子量
はそれぞれ３２，０００と１３０．０００と異なってお
り、通常は分子篩クロマトが用いられるのが一般的であ
ったが、本発明者らはより効果的な陰イオン交換体によ
るカラムクロマトが最適であることを見出した。この目
的の為の陰イオン交換体としてはＤＥＡＥ基を有するも
のであれば、いずれのものも使用できるが、好ましくは
ＤＥＡＥ−セファロース０Ｌ−６Ｂが良い。このように
して活性化ＰＥＧまたはＰＥＧ−ＰＰＧで修飾化したＳ
ＯＤの修飾率は１７〜２０％と一定した値が得られ、し
かもビューチャンプらより効率的に修飾ＳＯＤが製造で
きることが見出された。医薬品として用いる場合には一
定の品質が確保できる製造法が最適とされるが、本発明
は充分にこの要望に応えうるものである。

表１　　本発明とビューチャンプらの方法の比較（Ａ）
　　ＣＤＩによるＰＥＧの活性化本発明　　　ビューチ
ャンプら 溶媒　　　　　ジオキサン　　　ジオキサン修飾剤　　
　　ＰＥＧ−ＰＰＧ　　ＰＥＧ修飾剤濃度　　３００　
ｍＭ　　　　５０　ｍＭ湿温度　　　　３０℃　　　　
　３７°Ｃ反応時間　　　２時間　　　　　２時間濃縮
処理　　　有り　　　　　　なし くエバポレーター） 反応停止　　　緩衝液添加 透析処理（外液）氷　　　　　　　水 凍結乾燥　　　有り　　　　　　有り 活性化率　　　〉９　　　　　６〜８ ＣＢ） 活性化修飾剤によるＳＯＤの修飾化 本発明　　　　ビューチャンブら 緩衝液 活性化修飾剤 濃度 ＳＯＤ濃度 反応温度 反応時間 修飾回数 精製処理 修飾率 血中半減期 ＳＯＤの活性 残存率 １００〜５００ｍＭ　　１０　ｍＭホウ酸ホウ酸ソーダ
（ｐＨソーダ（ｐＨ８，５）９．５）又は炭酸ソ ーダ（ｐＨ９，５） ５（］〜１００ｍＭ ０ｍＭ １〜２ｍＭ ４０〜６０℃ ０．５〜１時間 １〜２回 ０、０　５　　ｍＭ ４°Ｃ ４８〜９８時間 １′１回 ＤＥＡＥクロマト　不明 グラフィー １７〜２０％　　　５〜１０％ １４時間　　　　９時間 ９２〜９８％　　９５％ 本発明で用いられるＳＯＤは、特に起源が限定されるも
のではないが、好ましくは銅と亜鉛を含有したＳＯＤが
良い。

以下に実験例および実施料を示すが、それらに用いた測
定または分析法が先ず示される。

キサンチン−キサンチンオキシダーゼによるスーパーオ
キサイド発生系にチトクロームＣと未修飾ＳＯＤまたは
修飾ＳＯＤを共存させ、チトクロームＣの還元速度を低
下させる量を指標として酵素の活性を測定するＭＯＣｏ
ｒｄとＦｒ１ｄｏｖｉｃｈの方法（ジェー・ビー・シー
、２４４巻、６０４９−６０５５．１９６９）を用いた
。修飾ＳＯＤの活性残存率（％）は、キサンチン−キサ
ンチンオキシダーゼ系で発生したスーパーオキサイドに
対し未修飾８０Ｄを用いた場合の測定値を１００％とし
てこれに対する割合で示した。

修飾率の測定 ０．６Ｍホウ酸・水酸化ナトリウム緩衝液、ｐＨ９，５
に未修飾Ｓ　ＯＤ　０．１肩ｔ、０．２Ｎ水酸化ナトリ
ウム試液０．１　ｍｌおよび２．４．６−　）リニトロ
ベンゼンスルホン酸ナトリウム（７，２ｑ／ｌｘｌの水
、ＴＮＢＳ）溶液０．１　ｙｓｔを加え、２５°Ｃ，３
時間水浴上で１反応させる。３６７　ｎｍにおける反応
液の吸光度を測定する。横軸に蛋白質量を、縦軸に吸光
度をとり、未修飾ＳＯＤのＴＮＢＳ発色検量線を（傾き
二Ａ）作成する。同様の操作を修飾ＳＯＤについても行
い、修飾ＳＯＤ発色検量線（傾き二Ｂ）を作成する。修
飾率（％）は（Ａ−Ｂ／Ａ）Ｘ１００で算出した。

分子量測定 ＴＳＫ　　Ｇ　　３０００ＳＷ（トーソー■製）カラム
を使用した高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）に
より行った。溶媒は０．３Ｍ食塩を含有した０、１Ｍリ
ン酸ソーダ緩衝液、ｐＨ７，０、流速、１．０ｇ／／分
でクロマトを行った。

電気泳動による分析 ファーストシステム（ファルマシア社製）を用い、８〜
２５％のポリアクリルアミド濃度勾配ゲルにより泳動し
、蛋白質の染色はクマーシーブリリアントブルー１−２
５０により行った。

蛋白質の定量 Ａ、　Ｃ，Ｇｏｒｎａｌｌらのビウレット法（ジエー・
ビー・シー、１７７巻、７５１．１９４９）により蛋白
質をアルカリ条件下で２価の銅と反応させて生じる赤紫
色の吸収を波長５４０　ｎｍで吸光度測定し、牛血清ア
ルブミンを標準品として用いた時の検量線より算出した
。

実験例　１　血中半減期 家兎を用い、家兎体重２．５　ｋｑに対し、ＰＥＧ−Ｐ
ＰＧ（分子量３，５００）修飾ＳＯＤおよび未修飾ＳＯ
Ｄをそれぞれ３８，０００単位を生理食塩水に置換また
は溶解した後、静脈内投与し、経時的に血漿中のＳＯＤ
濃度を測定した。その結果（家兎２匹の平均）を第１図
に示す。修飾ＳＯＤは血中では未修飾８０Ｄより消失速
度が低下し、血中でのＳＯＤ活性の発現している時間を
延長させていることを示している。しかし、修飾ＳＯＤ
は永遠に血中に留まるわけでなく、２４時間後にはほぼ
投与前の血中濃度レベルに達し、血中から消失し、つい
で排泄されていると思われる。このことは非常に重要な
ことで、ＳＯＤの作用を未修飾ＳＯＤより適度に延長さ
せ、過剰な延長のない修飾５−ＯＤが製造できたことを
示している。

実験例　２　抗原性 修飾化したＳＯＤに新たな抗原性が出現するかについて
の試験は、ジャーナル・オブ・イムノロジカル・メソッ
ズ　１４．３８１（１９７７）に記載の方法に従って行
った。未修飾ＳＯＤまたは修飾ＳＯＤ’、約３０μノ）
をフロイント完全アジュバント（ＦＣＡ）で乳化したの
ちＡ／Ｊマウスの腹腔内へ投与した。その後、１４日目
、２８日目に追加投与し免疫した。投与開始日より経時
的に一週間毎にマウス眼静脈より採血し、その血清につ
いて、ラットをもちい、予め希釈しておいた血清を皮肉
注射（０，１ｍｌ　）をしておき、その４時間後に未修
飾５ｏＤ（０，５ｑ）とエバンスブルー２０りの混合液
２　ｘｉを静脈注射し、色素の血管透過性により判定す
る受身皮膚アナフィラキシ−反応ＣＰＯＡ反応）による
抗体産生の評価試験を行った。結果を表２に示した。表
中、各数値はＰｃＡ反応が陽性であった血清の最大希釈
倍数を示しており、数値の高いことは抗原性の強いこと
を表している。

表２　　抗原性試験 動　　　　　　　Ｐ　ＣＡ　−ｔｉｔｅｒ物　　　　　
　（白目） 数　　７　１４　　２１　　２８　　５５未修飾ＳＯＤ
　　１０匹　８　５２　１２８　２５Ｇ　　２５６修飾
ＳＯＤ　　１０匹　ｏｏ　　　ｏ　　　ｏ　　　。

表２の結果は未修飾ＳＯＤがヒト由来である為に、抗原
性が出現していることを示しているが、本発明で製造さ
れた修飾ＳＯＤでは金側とも抗原性を示す結果は得られ
ず、ヒト由来のＳＯＤを異種動物に用いたこの実験では
、ＳＯＤ本来の抗原性をも低下させていることを示すも
のである。

実験例　３ 実施例で製造した各修飾ＳＯＤの比活性の比較を未修飾
ＳＯＤと行った結果を表３に記載した。

表３　　比活性の比較 試料 Ｕ／Ｍｇ蛋白 未修飾８０Ｄ ５．８０ 実施例　１　　　　３．８００ ２　　　　　　３．８００ ３　　　　　　４．１００ ４　　　　　　４、　ＯＯ０ ５３，８００ いずれの修飾ＳＯＤも未修飾ＳＯＤと比較し、比活性の
低下が見られなかった。このことは、本発明の製造法が
ＳＯＤのもつスーパーオキサイドアニオンラジカル消去
効果を、自然状態のまま保持したことを意味し、実験例
１の結果と考え合わせて見た時、生体での半減期のみを
延長させた修飾ＳＯＤが製造できたことを明確にした。

実施例　１ （１）　　カルボニルジイミダゾール−モノメトキシポ
リマーの製造 ジオキサン１０（］＋１！中にモノメトキシポリオキシ
エチレングリコール・ポリオキシプロピレングリコール
・ポリオキシエチレングリコール（平均分子量３，５０
０、東邦化学工業■製、Ｅ、０．　：　Ｉ’、０゜：Ｅ
、０．＝１５００：５００：１５００１以下ＯＭｅ−Ｐ
ＥＧ−ＰＰＧと略す）１００ｙとカルボニルジイミダゾ
ール（以下、ＣＤＩと略す）１０ｙを加え、３０°Ｃで
２時間撹拌しながら溶解し、同時に反応を行い、ＯＭｅ
−ＰＥＧ−ＰＰＧのＣＤＩ誘導体（以下、ＣＤＩ−ＰＥ
Ｇ−ＰＰＧと略す）の反応液を得た。ついで、反応液か
らジオキサンを除去する為、３０’Ｃ以下の水浴上で減
圧濃縮し粘性の高い濃縮夜釣１１０ｇ／を得た。この溶
液に０．５Ｍのリン酸ソーダ緩衝液（ｐＨ６，５）を加
え、２００ｔｔに希釈した。さらに、この希釈液を透析
処理（外液：水）し、試料液１０００ｇ／を得た。

ついで、凍結乾燥し、ＣＤＩ−ＰＥＧ−ＰＰＧの乾燥粉
末を得、−３０°Ｃに保存した。収量は９８％であった
。

（２）　　Ｐ　Ｅ　Ｇ　−Ｐ　Ｐ　Ｇ修飾ＳＯＤの製造
０．３Ｍ炭酸ソーダー塩酸緩衝液（ｐＩ（９，５）１０
（１＋／の入った反応容器中に最終濃度５０ｑ／Ｍｔに
なるように凍結乾燥されたＳＯＤ５ｇを添加し、この反
応容器を温度５０°Ｃに調節した恒温槽に浸しながら撹
拌する。ついで、（１）で製造したＣＤＩ−ＰＥＧ−Ｐ
ＰＧＩ　７．５　ｆを添加し、３０分後にさらに同量の
ＣＤＩ−ＰＥＧ−ＰＰＧを追加添加した。約３０分反応
を継続した後、反応液を透析処理（外液：水）して粗Ｐ
ＥＧ−ＰＰＧ−８ＯＤ溶液を得た。

（３）粗ＰＥＧ−ＰＰＧ−８ＯＤ溶液の精製充分量の水
で良く洗浄し平衡化したＤＥＡＥ−セファロース０Ｌ−
６Ｂ（ファルマシア社製）を充填したカラムに（２）で
得た粗ＰＥＧ−ＰＰＧ−８ＯＤ溶ｉを吸着し、ついでカ
ラム容量の５倍量の水で洗浄し、未反応なＣＤＩ−ＰＥ
Ｇ−ｐＰＧを除去した。吸着しているＰＥＧ−ＰＰＧ−
８ＯＤは０．３Ｍの炭酸ソーダー塩酸緩衝液（ｐＨ９，
５）で溶出した後、限外濾過膜濃縮した。

（４）再ＰＥＧ−ＰＰＧ修飾ＳＯＤの反応（３）で製造
したＰＥＧ−ＰＰＧ−８ＯＤ中の未反応ＳＯＤが６％含
まれていた為、（３）の限外濾過膜濃縮液の濃度を５０
±５１１９　／　ｗｌに調整した後、（２）の操作を再
度行い、完全にＰＥＧ−ＰＰＧ化したＳＯＤ粗溶液を得
た。この粗ＰＥＧ−ＰＰＧ−８ＯＤ溶液はさらに（３）
と同様にＤＥＡＥ−セファロースカラムクロマトを行っ
た。溶出は０．９％の食塩を含有した２５ｍＭリン酸ソ
ーダ緩衝液（ｐＨ７，０）で行い、さらに、この液を限
外濾過膜濃縮ついで、無菌濾過処理を行い、純粋なＰＥ
Ｇ−ＰＰＧ−８ＯＤ溶液を得た。収量は４．８ｙで収率
は９６％であり、ＴＳＫ　　Ｇ　　３０００ＳＷのゲル
濾過（第２図）および電気泳動的にも単一であった。

実施例　２ （１）　　カルボニルジイミダゾール−モノメトキシポ
リマーの製造 ジオキサン５００ｍｔ中に実施例１で記載したＯＭｅ−
ＰＥＧ−ＰＰＧ５００１とＣＤＩ　５０　ｆを加え、３
０°Ｃで２時間撹拌しながら溶解し、同時に反応を行い
、ＰＥＧ−ＰＰＧのＣＤＩ誘導体Ｃ−ＣＤＩ−ＰＥＧ−
ＰＰＧ）の反応液を得た。ついで、反応液からジオキサ
ンを除去する為、３０°Ｃ以下の水浴上で減圧濃縮し粘
性の高い濃縮液、約Ｂｏｏｍ／を得た。この液に０．５
Ｍのリン酸ソーダ緩衝液（ｐＨ６，６）を加え、１００
０Ｗｔ／に希釈した。さらに、この希釈液を透析処理（
外液：水）し、試料液５０００ｇ／を得た。ついで、凍
結乾燥し、Ｃ！ＤＩ−ＰＥＧ−ＰＰＧの乾燥粉末を得、
３０°Ｃに保存した。収量は９９％であった。

（２）　　Ｐ　Ｅ　Ｇ　−Ｐ　Ｐ　Ｇ修飾スーパーオキ
サイドディスムターゼの製造 ０．３Ｍ炭酸ソーダー塩酸緩衝液（ｐＨ９，５）５００
ｇ／の入った反応容器中に最終濃度６０Ｗ／ｍｌになる
ように凍結乾燥された５ＯＤ３０　ｆを添加し、この反
応容器を温度５５°Ｃに調節した恒温槽に浸しながら撹
拌した。ついで、（１）で製造したＣＤＩ−ＰＥＧ−Ｐ
ＰＧ８７．５　Ｆを添加し、３０分段にさらに同量のＣ
ＤＩ−ＰＥＧ−ＰＰＧを追加添加した。約３０分反応を
継続した後、反応液を透析処理（外液：水）して粗ＰＥ
Ｇ−ＰＰＧ−８ＯＤ溶液を得た。

（３）粗ＰＥＧ−ＰＰＧ−８ＯＤ溶液の精製充分量の水
で良く洗浄し平衡化したＤＥＡＥ−セファ０−ス０Ｌ−
６Ｂ（ファルマシア社製）を充填したカラムに（２）で
得た粗ＰＥＧ−ＰＰＧ−８ＯＤＩＷ液を吸着し、ついで
カラム容量の５倍量の水で洗浄し、未反応なＣＤＩ−Ｐ
ＥＧ−ＰＰＧを除去した。吸着しているＰＥＧ−ＰＰＧ
−８ＯＤは０．３Ｍの炭酸ソーダー塩酸緩衝液（ｐＨ９
，５）で溶出した後、限外濾過膜濃縮した。

（４）再ＰＥＧ−ＰＰＧ修飾ＳＯＤの反応（３）で製造
したＰＥＧ−ＰＰＧ修飾ＳＯＤ中の未反応ＳＯＤが１．
５％含まれていた為、（３）の限外濾過膜濃縮液の濃度
を５０±５　ｑ／　ｙｇｌに調整した後、（２）の操作
を再度行い、完全にＰＥＧ−ＰＰＧ化したＳＯＤ粗溶液
を得た。この粗ＰＥＧ−ＰＰＧ−８ＯＤ溶液はさらに（
３）と同様にＤＥＡＥ−セファ０−スカラムクロマトを
行った。溶出は０．９％の食塩を含有した２５ｍＭリン
酸ソーダ緩衝液（ｐＨ７，０）で行い、さらに、この液
を限外濾過膜濃縮ついで、無菌濾過処理を行い、純粋な
ＰＥＧ−ＰＰＧ−８ＯＤ溶液を得た。収量は２９１で収
率は９７％であり、電気泳動的に単一であった。

実施例　３ （１）　　カルボニルジイミダゾール−モノメトキシポ
リマーの製造 ジオキサミノ１００Ｈｌ中１こモノメトキシポリオキシ
エチレングリコール（平均分子量３，５００、東邦化学
工業■製、以下、ＯＭｅ−ＰＥＧと略す）ＩＱＯｙとＯ
ＤＩ　１０　ｆを加え、３０°Ｃで２時間撹拌しながら
溶解し、同時に反応を行い、ＰＥＧのＣＤＩ誘導体（Ｃ
ＤＩ−ＰＥＧ　）の反応液を得た。ついで、反応液から
ジオキサンを除去する為、３０°Ｃ以下の水浴上で減圧
濃縮し粘性の高い濃縮夜釣１０５ｇ＋／を得た。この液
に０．５Ｍのリン酸ソーダ緩衝液（ｐ、Ｈ８，５）を加
え、１８（ｉｔｔにした。

さらに、この希釈液を透析処理（外液：水）し、試料液
９５０ｇ／を得た。ついで、凍結乾燥し、ＣＤＩ−ＰＥ
Ｇの乾燥粉末を得、−３０°Ｃに保存した。収量は９８
％であった。

（２）ＰＥＧ修飾スーパーオキサイドディスムターゼの
製造 ０．３Ｍホウ酸ソーダー塩酸緩衝液（ｐＨ９，５）１０
０ｇｔの入った反応容器中に最終濃度５０Ｍｙ／ｍｌに
なるように凍結乾燥された５ＯＤ５ｙを添加し、この反
応容器を温度５０°Ｃに調節した恒温槽に浸しながら撹
拌する。ついで、（１）で製造したＣＤｌ−ＰＥＧ１７
．５Ｆを添加し、３０分後にさらに同量のＣＤＩ−ＰＥ
Ｇを追加添加した。約３０分反応を継続した後、反応液
を透析処理（外液：水）して粗ＰＥＧ−８ＯＤ溶液を得
た。

（３）粗ＰＥＧ−８ＯＤ溶液の精製 充分量の水で良く洗浄し平衡化したＤＥＡＥ−トヨパー
ル（トーソーー社製）を充填したカラムに（２）で得た
粗ＰＥＧ−８ＯＤ溶液を吸着し、ついでカラム容量の５
倍量の水で洗浄し、未反応なＣＤＩ−ＰＥＧを除去した
。吸着しているＰＥＧ−８ＯＤは０．３　Ｍの炭酸ソー
ダー塩酸緩衝液（ｐＨ９，５）で溶出した後、限外濾過
膜濃縮した。

（４）再ＰＥＧ修飾ＳＯＤの反応 （３）テ製造しりＰ　Ｅ　Ｇ　−Ｓ　ＯＤ中の未反応８
０　Ｄが約７％含まれていた為、（３）の限外濾過膜濃
縮液の濃度を５０±５ＷＪｌ／　ｍｅに調整した後、（
２）の操作を再度行い、完全にＰＥＧ化したＳＯＤ粗溶
液を得た。この粗ＰＥＧ−８ＯＤ溶液はさらに（３）と
同様にＤＥＡＥ−トヨパールカラムクロマトグラフィー
を行った。溶出は０．９％の食塩を含有した２　５　ｍ
Ｍリン酸ソーダ緩衝液（ｐＨ７，０）で行い、さらに、
この液を限外濾過膜濃縮、ついで、無菌濾過処理を行い
、純粋なＰＥＧ−８ＯＤｇ液を得た。収量は４．９１で
収率は９８％であり、ＴｓＫＧ　　３０００８Ｗを用い
たゲル濾過および電気泳動的にも単一であった。

実施例　４ （１）　　カルボニルジイミダゾール−モノメトキシポ
リマーの製造 ジオキサン２００ｇ／中に実施例１で用いたＰＥＧ−Ｐ
ＰＧ（平均分子量７．　ＯＯＯ）　２００　ｆとＣＤＩ
　２０　ｆを加え、３０°Ｃで２時間撹拌しながら溶解
し、同時に反応を行い、ＰＥＧ−ＰＰＧのＣＤＩ誘導体
ＣＣＤＩ−ＰＥＧ−ＰＰＧ　）の反応液を得た。ついで
、反応液からジオキサンを除去する為、３０°Ｃ以下の
水浴上で減圧濃縮し粘性の高い濃縮液綿２３０＋ｔを得
た。この液に０．５Ｍのリン酸ソーダ緩衝液（ｐＨ６，
５）を加え、＋００ｙｔｔｌにした。さらに、この希釈
液を透析処理（外液：水）し、試料液１９００ｔｔを得
た。ついで、凍結乾燥し、ＣＤＩ−ＰＥＧ−ＰＰＧの乾
燥粉末を得、−３０°Ｃに保存した。収量は９４％であ
った。

（２）　　Ｐ　Ｅ　Ｇ　−Ｐ　Ｐ　Ｇ修飾ＳＯＤの製造
０．３Ｍ炭酸ソーダー塩酸緩衝液（ｐＨ９，５）１５０
ｔ／の入った反応容器中に最終濃度１００ｑ／　ｙｌに
なるように凍結乾燥された５ＯＤ１　Ｏｆを添加し、こ
の反応容器を温度５０°Ｃに調節した恒温槽に浸しなが
ら撹拌する。ついで、（１）で製造したＣＤＩ−ＰＥＧ
−ＰＰＧ３５　ｆを添加し、３０分後にさらに同量のＣ
ＤＩ−ＰＥＧ−ＰＰＧを追加添加した。約３０分反応を
継続した後、反応液を透析処理（外液：水）して粗ＰＥ
Ｇ−ＰＰＧ−８ＯＤ溶液を得た。

（３）、粗ＰＥＧ−ＰＰＧ−８ＯＤ溶液の精製充分量の
水で良く洗浄し平衡化したＤＥＡＥ−セファロースＣＬ
−６Ｂ（ファルマシア社製）を充填したカラムに（２）
で得た粗ＰＥＧ−ＰＰＧ−８ＯＤ溶液を吸着し、ついで
カラム容量の５倍量の水で洗浄し、未反応なＣＤＩ−Ｐ
ＥＧ−ＰＰＧを除去した。吸着しているＰＥＧ−ＰＰＧ
−８ＯＤは０．３Ｍの炭酸ソーダー塩酸緩衝液（ｐＨ９
，５）で溶出した後、限外濾過膜濃縮して、濃縮液２２
０ｍ１を得た。ついで、無菌濾過処理を行い修飾化され
たＳＯＤ溶液を９．８５ｙ得た。収率は９８．５％であ
り、ＴＳＫ　　Ｇ　　３０００ＳＷを用いたゲル濾過分
析および電気泳動分析でも全く未修飾ＳＯＤを検出する
ことが出来なかった。

実施例　５ （１）　　カルボニルジイミダゾール−モノメトキシポ
リマーの製造 ジオキサン１００ｇ／中に実施例１で用いたＰＥＧ−Ｐ
ＰＧ（平均分子量１．７５０　＞　１００ダとＣＤ１１
０ｇを加え、３０℃で２時間撹拌しながら溶解し、同時
に反応を行い、ＰＥＧ−ＰＰＧのＣＤＩ誘導体（ＯＤＩ
−ＰＥＧ−ＰＰＧ）の反応液を得た。ついで、反応液か
らジオキサンを除去する為、３０°Ｃ以下の水浴上で減
圧濃縮し、粘性の高い濃縮液１００ｇ／を得た。この液
に０．５Ｍのリン酸ソーダ緩衝液（ｐＨ６，５）を加え
、２００＋＋／にした。さらに、この希釈液を透析処理
（外液：水）し、試料液１０００ｇ／を得た。ついで、
凍結乾燥し、ＣＤＩ−ＰＥＧ−ＰＰＧの乾燥粉末を得、
−３０℃に保存した。

（２）　　Ｐ　Ｅ　Ｇ　−Ｐ　Ｐ　Ｇ修飾ＳＯＤの製造
０．３Ｍ炭酸ソーダー塩酸緩衝液（ｐＨ９，３）１００
ｇｔの入った反応容器中に最終濃度５０ｗ１ｇ／ｍｌに
なるように凍結乾燥された５ＯＤ５ｆを添加し、この反
応容器を温度５０°Ｃに調節した恒温槽に浸しながら撹
拌する。ついで、（１）で製造したＣＤＩ−ＰＥＧ−Ｐ
ＰＧ１７　ｆを添加し、３０分後にさらに同量のＣＤＩ
−ＰＥＧ−ＰＰＧを追加添加した。約３０分反応を継続
した後、反応液を透析処理（外液：水）して粗ＰＥＧ−
ＰＰＧ−８０Ｄ溶液を得た。。

（３）粗ＰＥＧ−ＰＰＧ−８ＯＤ溶液の精製充分量の水
で良く洗浄し平衡化したＤＥＡＥ−セファロース０Ｌ−
６Ｂ（ファルマシア社製）を充填したカラムに（２）で
得た粗ＰＥＧ−ＰＰＧ−８ＯＤ溶液を吸着し、ついでカ
ラム容量の５倍量の水で洗浄し、未反応なＣＤＩ−ＰＥ
Ｇ−ＰＰＧを除去した。吸着しているＰＥＧ−ＰＰＧ−
８０Ｄは０．３Ｍの炭酸ソーダー塩酸緩衝液（ｐＨ９，
５）で溶出した後、限外濾過膜濃縮して、濃縮液１１５
ｍ１を得た。ついで、無菌濾過処理を行い修飾化された
ＳＯＤ溶液を４．８９９得た。収率は９７．８％であり
、ＴＳＫ　　Ｇ　　３０００ＳＷを用いたゲル濾過分析
および電気泳動分析のいずれにおいても全く未修飾ＳＯ
Ｄが検出されなかった。

〔発明の効果〕

本発明によればポリオキシ７゜ルキレングリコールで修
飾されたスーパーオキサイドディスムターゼを簡易に、
高収率、高純度で、工業的規模において製造できる。

【図面の簡単な説明】

第１図は実験例１の動物実験における修飾および未修飾
スーパーオキサイドディスムターゼの血中濃度の推移を
示すグラフ、第２図は実施例１第（４）項における修飾
スーパーオキサイドディスムターゼのゲル濾過の結果を
示すグラフである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １　式 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中Ｒは平均分子量約２，０００〜１０，０００の水
   溶性重合物残基を表わす） にて示される重合物のカルボニルジイミダゾール誘導体
   とスーパーオキサイドディスムターゼとをｐＨ９．０−
   １１．０、濃度０．１Ｍ−０．５Ｍ、好ましくは０．２
   −０．４Ｍ、の緩衝液の存在下に、３０−７０℃、好ま
   しくは４５−６０℃において反応させることを特徴とす
   る式 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｒは前記と同義、￥ＳＯＤ￥はスーパーオキサ
   イドディスムターゼの残基を表わす）にて示される修飾
   スーパーオキサイドディスムターゼの製造法。 ２　カルボニルジイミダゾール誘導体が平均分子量３，
   ５００のモノメトキシポリオキシエチレングリコールの
   カルボニルジイミダゾール誘導体である請求項１記載の
   製造法。 ３　カルボニルジイミダゾール誘導体が平均分子量３，
   ５００のモノメトキシポリオキシエチレン、ポリオキシ
   プロピレン・ポリオキシエチレングリコールのカルボニ
   ルジイミダゾール誘導体である請求項１記載の製造法。 ４　反応終了後、反応混合物中に含まれる未反応物を陰
   イオン交換体クロマトグラフィーにより除去し、高純度
   の修飾スーパーオキサイドディスムターゼを採取する請
   求項１記載の製造法。 ５　分子量２，０００〜１０，０００の水溶性重合物と
   カルボニルジイミダゾールとを、前者の濃度を０．１５
   〜０．３５Ｍ、好ましくは０．２５〜０．３Ｍ、前者と
   後者の濃度比を前者１に対して後者を１〜３、好ましく
   は１．５〜２．５として、反応させ、得られた重合物の
   カルボニルジイミダゾール誘導体をスーパーオキサイド
   ディスムターゼと反応させる請求項１記載の製造法。 ６　水溶性重合物が平均分子量３，５００のモノメトキ
   シポリオキシエチレングリコールである請求項５記載の
   製造法。 ７　水溶性重合物が平均分子量３，５００のモノメトキ
   シポリオキシエチレングリコール・ポリオキシプロピレ
   ングリコール・ポリオキシエチレングリコールである請
   求項５記載の製造法。 ８　分子量２，０００〜１０，０００の水溶性重合物と
   カルボニルジイミダゾールとを、前者の濃度を０．１５
   〜０．３５Ｍ、好ましくは０．２５〜０．３Ｍ、前者と
   後者の濃度比を前者１に対して後者を１〜３、好ましく
   は１．５〜２．５として、反応させることを特徴とする
   式 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｒは分子量２，０００〜１０，０００の水溶性
   重合物残基を表わす） にて示される重合物のカルボニルジイミダゾール誘導体
   の製造法。