JPH0314801A - 硫酸グリコサミノグリカンの分離プロセス - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はＳＧＡＧと略記される硫酸化グリコサミノグリ
カンの分離に関する。

本発明で検討するＳＧＡＧはヒト又は動物を由来とする
多糖類タイプ生重合体であり、例えば以下がその中に含
まれる。

ー　コンドロイチン４硫酸及び６硫酸 −　デルマタン硫酸 硫酸ケラタン ー　硫酸へパリチン及びペパリン これらのＳＧＡＧ，すなわちムコ多糖類については下記
の文献が詳しい。

−　　Ａｓｐｔｎａｌｌ，Ｇ．Ｏ．，Ｐｏｙｓａｃｃｈ
ａｒｉｄｅｓ，ＰｅｒｇａｍｏｎＰｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏ
ｒｄ（１９７Ｇ）．　　この文献の内容は本書に必要に
応じて、引用されている。

種々の技術部門ではより純度の高いＳＧＡＧに対する需
要が一層高くなっている。この点では人間の皮膚の代替
物などにバイオ素材を利用する医療分野がその例として
挙げられる。

ＳＧＡＧは動物の組織、軟骨、皮膚ならびに結合組織か
ら得られる。これら一次物質からＳＧＡＧを抽出するに
は、一次物質を粉砕して水相での粉砕混合物または氷解
物を得る。粉砕混合物中のプロテアーゼを次いで分解し
、その蛋白質分を除去し、ＧＡＧ．特にＳＧＡＧを含む
錯体媒質を得る。この分解は、スペクトルの広いプロテ
アーゼによる消化、あるいは塩基性物質による加水分解
など、従来技術を用いて行う。

上記の方法で得られる錯体媒質はＳＧＡＧの他に、重合
体その他の、またイオン性の有無を問わない各種の不純
物を含んでいる。不純物の中でも、各種蛋白質、両性ペ
ブチド特にグルタミン酸やアスパラギン酸残滓に担持さ
れたカルボキシル基を有するアミノ酸グループが特筆さ
れる。不純物は一般に錯体媒質のＳＧＡＧと共有結合状
態にはない。

研究、実施両レベルで、出発物質として用いる錯体媒質
中のＳＧＡＧを沈澱によって分解するための種々の方法
が提案されている。

これらの方法のうち特に重要なものは、水溶性媒質中に
ＳＧＡＧを沈澱させ、媒質中で水溶性高分子分解質、特
にキトサンなどのポリアミンと錯化させるものがある。

かかる錯体の生成については下記の文献がある。

（ａ）　　Ｄｉｅ　Ｍａｋｒｏｍｏｌｅｋｕｌａｒｅ　
Ｃｈｅｍ１ｃ　（　ｒ高分子化学Ｊ　’）　１７３．２
２０９−２２１１（１９７４）。　「キトサンを用いた
ベパリンの高分子電解錯体」ヤスオ●キクチ。この論文
ではＳＧＡＧの沈澱に水溶性ポリアミン、又Ｐ５キトサ
ンを用いている。

（ｂ）　　ＥＰ−Ａ−０，０２０，１８３　　明細書。

ここではＳＧＡＧの沈澱にカルボキシメチルキチン、Ｎ
−アシルキトサン、またはこれら２種の物質の誘導体を
用いる。

（ｃ）　　Ｂ１ｏｐｏｔｙｍｅｒｓ，１９７８．１７（
３），ＳＯＳ−１０　　（英語）Ｓ．ヒラメ、Ｃ．ミズ
タニ、　Ｒ．ヤマグチ、Ｏ．ミウラ著。　沈澱には酸の
中で部分的にアセチル化させたキトサンを用いている。

上記文献ではいずれも得られた沈澱物又は錯体からＳＧ
ＡＧをさらに分離する工程を扱っていない。

文献（ａ）は、水／塩酸／メタノールの三体複合体の溶
媒中の錯体溶解度について述べているが、かかるイオン
性高分子錯体の成分についての詳述はない。

文献（ｂ）は、アルカリ性、酸性又は中性溶液における
錯体の溶解度を濃度別に述べているが、イオン性高分子
錯体の２つの成分を特定していず、得られた錯体の成分
手段としてファイバーヌはフィルムの押出しが例に挙げ
られている。水溶液中の錯体の濃度によっては、ゲル、
すなわち錯体の立体高分子構造体を得ることができると
いう記述があり、錯体は水溶性溶媒を捕捉していてその
ためこの構造体は分離不能であるとしている。さらにこ
の文献では用いた沈澱剤、すなわち、カルボキシメチル
キチン、Ｎ−アシルーキトサン又はその誘導体によって
はじめてアルカリ性媒質中でとの錯体が溶解度を発揮す
る点に留意すべきであって、これはキトサンは塩基性水
溶媒質中では不溶性であることによる。

文献（Ｃ）では錯体を得た後の処理については何ら記述
がない。

従って先に検討した文献で種々の高分子電解質を用いて
水溶媒質中でＳＧＡＧを分別沈澱させることが記述され
ているのは、本来例えば分析技法でこれらＳＧＡＧを特
性化する目的のためである。

これら文献はＳＧＡＧを錯体媒質中で工業的に分離する
、すなわち比較的高純度のＳＧＡＧを製造することにつ
いては触れていない。

ＧＢ−Ａ−２　，０７４　，１７８によれば、ヘバリン
の選択的沈澱法が記載されており、この方法は −　　ｐＨ度に関係なく水溶媒質中では不溶で、陽イオ
ン樹脂の形態を有し、キトサンなどの多糖類とは化学的
に非常に異なるポリアミンを得ること −　ヘバリンからなる出発媒質を樹脂の存在中に入れて
イオン結合によりヘパリンを捕捉すること 一　塩化ナトリウム水溶液を用いて樹脂を再生すること
によりヘパリンを回収すること。

この際陰イオン性樹脂は再生水溶液中で不溶のまま残る
。

ことからなる。

このような方法には以下の欠点がある。

この方法はヘバリンのみを対象としたもので、すべての
ＳＧＡＧに適用できる。

かかる方法は上述のようにヒアルロン酸などの不純物を
含む錯体媒質に対する選択性が比較的小さいことが判明
している。

樹脂再生相の歩留りが低く、そのため　ＣＢ−Ａ−２．
０７４，１７８の方法の歩留りが低いので、該方法は工
業レベルでの利用には不適である。

陰イオン性樹脂中のヘパリン含有媒質をアミン基または
アミン基の位置に向けて予じめ拡散する必要があること
から考えて、ＳＧＡＧの錯化の反応速度は比較的遅い。

反応速度の低いこともかかる方法の工業的利用を阻んで
いる。

本発明は上記欠点を除去することを目的とし、ＳＧＡＧ
と「共」に不純物も含む錯体媒質から、ＳＧＡＧを、酸
性媒質中の水溶性ポリアミン、例えばキトサンを用いた
高分子イオン媒質による沈澱また錯化により分離するプ
ロセスまたは方法に関するものである。特に、本発明は
工業レベルでの製造に適した歩留り（できるだけ１００
％に近い）と反応速度で、高純度のＳＧＡＧを得るプロ
セスに関する。

本発明によれば、プロセスは基本的には２つの段階から
なる。

ｌ）第１の沈澱段階では、水溶性ポリアミンを出発物質
である錯体媒質と混合しながら、混合物のｐｉｔを遊離
カルボキシル基、不純物及びＳＧＡＧのイオン分離ポテ
ンシャル（ｐＫａ）より低い値に維持して基本的にＳＧ
ＡＧと水溶性ポリアミン間で選択的に析出高分子錯体を
得る。

２）第２の塩析段階では、析出物の懸濁液中でＳＧＡＧ
を可溶化すると同時にポリアミンを不溶状態に維持する
ものであり、懸濁媒質は、中和剤とともに、ＳＧＡＧの
イオン化カルボキシノレ基とポリアミンのイオン化アく
冫基からなる。

本発明によれば、キトサンなどの水溶性ポリアξンは出
発錯体媒質ならびに析出物の懸濁媒質の両方に可溶であ
る。

塩析段階で得られたＳＧＡＧからは、濾過、遠心分離な
どそれ自体公知の適当な方法を用いて目的のＳＧＡＧを
分離することができる。

本発明のプロセスはさらに下記の実質的利点が得られる
。

第２の塩析段階での錯体の溶解はＳＧＡＧについてのみ
選択的であり、そのためその後のＳＧＡＧの回収が容易
になる。場合によっては第２段階そのものでＳＧＡＧの
回収が可能になり、特に中和剤がアルカリ性硫酸である
場合これが可能になる。

塩析段階で得た固体のポリアミンは塩基性媒質中で中和
した後、再利用することもできる。

本発明の塩析では、例えば塩酸ナトリウムのような一価
の陰イオン塩からなる懸濁媒質の場合のようなポリア主
ンによるゲル生成を防ぐことができる。かかるゲルは遠
心分離や濾過がむずかしいため工業レベルでの応用に不
向きである。

本発明プロセスでは分離したＳＧＡＧの物理化学的安定
性が基本的に保たれ、そのため沈澱係数などの物性値も
保たれる。

本発明プロセスでは出発物質である錯体媒質中のＳＧＡ
Ｇ濃度が０．０１重量パーセント台の低いものから２０
重量バーセント台の高いものまで広い範囲にとれるが最
適濃度は０．０５から５重量％までである。

本発明プロセスは安価で、無毒性の物質を用いるため、
分離したＳＧＡＧは医療用として用いることもできる。

好ましい中和剤としては、 一　アルカリ性硫酸など、多価陰イオン塩又は 水酸化ナトリウム又は水酸化カリウムなど強塩基性無機
物 が挙げられる。

さらにこれら２種の中和剤を順に用いてもよい。

第１の場合、硫酸ナトリウムの二価イオンなど、多価陰
イオンは、キトサンなどのポリアミンとともに、下記の
構造を有し、水溶性媒質中では不溶の静電性錯体を生成
する： かかる方法によりイオン高分子錯体の量よりも明らかに
少ない量のポリアミン析出物を得ることができ、そのた
め、乾燥重量で１０％に達するＳＧＡＧ溶液を得るため
の塩析が、低量の懸濁媒質中で可能になる。

この第１の方法は、硫酸へパラチンのよっな、ｐＨがＩ
Ｏ．５〜！１以上の塩基性媒質中で分離の対象であるＳ
ＧＡＧが加水分解可能な第２の方法よりも好ましい。

第２の場合は、無機塩基が下記の反応式によるイオン置
換を生じさせる。

キトサンーＮＨａＱ　　ＳＯ，Ｏ　　ＮＨ．０キトサン
ｓ　ＧＡ　ａ　−　ｓｏ４ｅ　　ＨＮ，０−キトサ７　
＋　２　ＮａＯＨ−　＋これら静電型結合はそれまでの
結合を置換する：ｓａＡＧ−ｓｏ４０　　＊ａ，Ｇ）一
キトサンその結果溶液中にＳＧＡＧを完全に放出させる
。

この放出はＳｏ４−／ＭＨＩ＋　　（キトサン）の割合
が少なくとも０．５になった時ほぼ完了する。

ＳＧＡＧは完全にイオン化されたナトリウム塩の生成に
よって可溶化する。またキトサンはアミン基レベルでの
イオン化の損失により不溶となる。

この第２の方法はそれのみでコンドロイチン４硫酸なら
びに６硫酸の精製に用いることができる。

この第２の方法はＳＧＡＧの放出速度が比較的高く、ポ
リアミンを直接固体として放出できるため、そのまま再
利用が可能となる。

２つの方法を組合わせて、すなわち多価陰イオン塩に続
いて無機の強塩基を用いることにより、例えば濃縮溶液
のようなニナトリウムの形の固体のイオン化ポリアミン
の両方の形でＳＧＡＧを放出させることができる。例え
ばこの方法では、水を用いた錯体懸濁液では、キトサン
錯体中の硫酸イオンとアミン基との比が少なくとも０．
５に等しい量の硫酸ナトリウムが添加される。懸濁液と
雰囲気温度で撹拌し、次いでｐＨが８．５から１１の間
で安定するまで媒質をアルカリ化する。懸濁液を撹拌し
、ＳＧＡＧ溶液を濾過又は遠心分離により回収する。

本発明による２つの塩析法の組合せはあらゆる場合に応
用できる。

また本発明プロセスで用いるキトサンは、甲殻類のキチ
ンのＮ一脱アセチルにより得たものが好ましい。

その分子量は５０ＫＤ以上であるが、５００　ＫＤ以上
であることが好ましく、アセチル化の程度はＯから３０
％、好ましくは０〜２０％である。

本発明の実施の一態様によれば、本プロセスは以下の工
程を連続して行う： ａ）出発物質である錯体媒質をｐＨが１〜４になるまで
酸性化する。

ｂ）ポリアミンの酸溶液をｐＨ１〜４に調製する。

Ｃ）酸性化した錯体媒質とポリアミンの酸溶液を撹拌し
ながら混合して、イオン性巨大分子錯体を得る。

ｄ）ゆっくり撹拌しながら、錯体をｐＨが９〜１３のア
ルカリ性水溶液中に懸濁して錯体を単離しＳＧＡＧを塩
析する。

ｅ）得られたＳＧＡＧの液体の留分を回収する：その方
法は：この液体分を酸によりて中性化すること、この液
体分から塩類を除去すること、による。

上記のようにして得られた溶液中のＳＧＡＧは沈澱、凍
結乾燥、単純な脱水等の適当な公知の方法により固体と
することができる。

出発錯体物質を酸性化するには、塩酸等の無機酸を使う
のが好ましいが、ｐＨ価は２程度であるのが最適である
。

さらに、酢酸等のモノカルボン有機酸を％　ｐＨが３程
度のキトサンの酸性溶液の調製に使うのが都合がよいが
、この溶液のキトサンの濃度は約１％に等しい。

ＳＧＡＧの出発溶液とキトサン酸性溶液の混合液を２０
分から１時間３０分の間、撹拌する。

ＳＧＡＧを塩析するための溶液のアルカリ化は、ゆっく
りと撹拌を２時間から２４時間の間続けながら、水酸化
ナトリウムを使うて行うのが好ましい。

上記の望ましい実施態様の工程ｂ）において、キトサン
はｐＨがＬ．Ｓ〜３．７に維持された有機又は無機の酸
の溶液中に溶解する。この粘稠な溶液はキトサンの含有
率が１．５％以上であってはならない。

濃度１％が使用には好ましい。

ここで注意しておきたいが、出発物質の錯体媒質とキト
サンの酸性溶液はｐＨ価が同一であっても異なってもよ
く、たとえば燐酸又は硫酸等、陰イオン価が１より大き
い酸類を除き、無機又は有機のモノカルボキシル酸の溶
液を加えることにより互いに固定する。

たとえば塩酸などの有機酸を使用する場合、出発物質の
錯体媒質のｐ■は１．５〜２．５でありキトサン酸溶液
も同じ位のｐＨ値に調製する。

酢酸やギ酸等の有機酸が使われる場合は、ｐＨ値は酢酸
については３〜３．７、ギ酸については２．５〜３．５
でなければならない。すべての場合、カルボキシル酸の
種類にかかわらず、ｐ■は３．８以上であってはならず
、同様に、使われる無機酸の種類を問わず、ｐＨは２．
５をこえてはならない。

上述のとおり、工程（Ｃ）で反応させる二つの溶液は、
別々の酸を使ってｐＨを酸性にすることができる。それ
故、塩酸を使って出発錯体媒質のｐ■を２に調製し、ギ
酸を使ってキトサン溶液のＩ）Ｈを３にするか、酢酸を
使ってｐＨを３．５にすることもできる。

組合せはいろいろにすることが可能であるが、出発錯体
媒質は通常無機酸で、好ましくは塩酸で酸性化する。こ
のＳＧＡＧ溶液は、キトサンで析出する前に清澄でなけ
ればならない。硫酸グリコサミングリカン／キトサンの
錯体を、選択的析出により調製するのは、次の工程によ
る。キトサン溶液を出発溶液である硫酸グリコサミング
リカンに徐々に加え、激しく撹拌する。この順序は逆で
あってもよい。

瞬時に白色の析出物が形成され、キトサンの添加は析出
が完了するまで継続する。析出の程度はキトサンが余剰
になると溶液の粘度が増加するので推測することができ
る。

硫酸グリコサミノグリカン基とキトサンアミン基との間
にイオン結合が形成されるため、生成される錯体は析出
媒質中に不溶である。二つのポリマーの多数の鎖の間で
形成される上記の結合は、高分子量の高密度のネットワ
ークを形威させる。

出発錯体媒質中の不純物は上記のとおりであるが、キト
サンと静電気結合をつくることができる。

これらの結合は、アミノ酸のカルボキシル基がイオン化
される時に成立する。これに対して、媒質がイオン化し
にくいものである場合は、キトサンとの静電気的反応は
かなり減少するか、又は全くなくなる。イオン化しにく
い条件は、媒質のｐｌｌを不純物の遊離カルボキシル基
のｐＫａよりもずっと低く酸性化することにより得られ
る。

媒質中に存在する硫酸グリコサミノグリカンは、同一の
分子に、カルポキシル基と硫酸基とを含んでいる。１カ
ルボキシル基のみのイオン化を抑制するためには、該カ
ルボキシル基のｐＫａは３．５に近いので、ＳＧＡＧの
カルボキシル基のｐＫａよりも、媒質のｐＨをずっと低
くなるように酸性化すればよい。これに対して強酸基と
考えられる硫酸基は、ｐ旧．Ｓ〜２．５の間でもイオン
化したままである。このよウな条件の下では、出発物質
錯体媒質中に含まれる分子でキトサンと静電気結合を形
成．できるものは、グリコサミノグリカンのみとなり、
これらの結合は硫酸基のレベルで形威されている。

ｐＨが１．５〜２．５では、硫酸グリコサミノグリカン
の析出は、錯体の形成に介在するキトサンの量が、この
化合物の遊離アミノ基と硫酸グリコサミノグリカン基と
の間の数が同一になったものに対応した時に、完了する
。

析出の終了時に、得られた懸濁液を３０分から１時間の
間撹拌し、その後遠心分離にかけた。上澄液をとりのぞ
き、析出物を体積比でｌＯ〜５０倍の水に、激しく撹拌
するか粉砕して、懸濁した。懸濁液は遠心分離にかけ、
沈析物を回収した。

キトサンとグリコサミノグリカンの錯体は、軟性の粒子
であって凝固すると展性のあるかたまりとなり激しく撹
拌すると細かく砕けた。

本発明のプロセスは、分離相に入って継続し、この結果
、グリコサミノグリカンが塩析される。

この塩析は、いろいろ方法によって行つことができる。

：たとえば硫酸ナトリウム等の塩を使って１リットル当
り０．７〜２モルの濃度になるまで、静電気的に置換す
ること。

：懸濁媒質のｐＨを３．５〜１２．５まで増すことによ
りイオン的に置換すること。

：上記の二つの方法の組合せ。

媒質のアルカリ化は、激しく撹拌しながらキトサン７グ
リコサミノグリカンの錯体を容積比で析出物の５〜ｌＯ
倍の水に拡散したのち懸濁液をｐｌ３９．５〜１２．５
、好ましくは１１に、水酸化ナトリウムや水酸化カリウ
ム等のアルカリ水酸化物の濃縮した溶液を加えることに
より、調製し、２〜２４時間ゆっくりと撹拌することに
より、行われる。この工程の終了時は、たとえば錯体の
粒子のグラニュロメトリーやイオン強度、媒質のｐＨや
温度等の操作条件の一つの関数によって変わってくるが
、これが終了すると、可溶化反応は完了する。こうして
得られたキトサンは固体で、濾過又は遠心分離によりＳ
ＧＡＧ溶液から分離する。これを水で洗浄したのち、＋
４℃で湿った状態で保持するか（加熱、真空、溶媒等）
公知の方法で脱水する。これにより、ＳＧＡＧの精製の
ための他の操作にリサイクルする。

精製のいろいろな工程中のキトサンの損失は、出発時の
重量の２〜４％と推定される。

キトサンが完全になくなったグリコサミノグリカンの溶
液は、ｐ■が２程度になるように中和するか酸性化する
。

硫酸グリコサミノグリカンの精製した混合溶液は、塩の
大部分を除去するために水で透析する。

透析物はこのまま使っても、蒸発や限外濾過等の公知の
方法により、溶液が含有している乾燥物が２〜２０％に
なるまで、濃縮してもよい。

これらの溶液からはＳＧＡＧは、エチルアルコール中で
析出させるか単純に凍結乾燥するか脱水するかして、固
体の形でとり出せる。濃縮の方法として限外濾過を使用
する場合、および、濃縮した溶液から固体の形でＳＧＡ
Ｇをエタノール又は他のアルコールで析出することで得
るようにすれば、透析の工程は省略することができる。

本発明によるプロセスを説明するために、例示的に、以
下に七つの実施例を以下にのべる。

実』０注ユ ナトリウム塩（ヘキリサミンのアッセイ）の形の純粋な
ＳＧＡＧ約１３０ｇを含有するコンドロイチン４硫酸と
６硫酸の乾燥抽出物２００ｇを１０ｋｇの水に溶解し、
溶液を５Ｎ塩酸の水溶液を用いてｐＨを２にした。ヘキ
リサミンのアッセイ溶液を２０分間撹拌した後、２，０
００ｇで１０分間遠心分離した。キトサン溶液を、沈澱
が完了するまで、清澄な上澄み液へ加えた。

キトサンの母液を、精製したキトサン１００ｇを水１　
０ｋｇに溶解し，５Ｎ塩酸を加えてｐＨを２に保ちなが
ら、調製した。

懸濁液を３０分間撹拌したのち、１５分間放置し、上澄
液を取除いた。（アルシアンブルーの沈澱によるグリコ
サミノグリカンの検出は、マイナスであった。） 得られた粘性のある沈澱物を、ｒＴｕｒｒａｘＪなる商
品名で販売されているホモジナイザーを使って５ｋｇの
脱ミネラル水中に粉砕し拡散した後、１５分間撹拌し、
沈澱物をデカンテーシロンで分離した。

沈澱物を１．７ｋｇの水中に拡散して水溶性５Ｎ水酸化
ナトリウムをｐＨが安定して１０になるまで加えた。

次に３時間半撹拌して、懸濁液を濾過した。濾液を８Ｎ
塩酸を使ってｐＨが７にした。キトサンから成る残渣を
１ｋｇの水で洗浄した後乾燥した。洗浄水はｐＨを７に
調整した後に上記の濾液と混合した。

こうして得られた溶液を脱ミネラル化した水に対して連
続して透析して、透析液を４０μｍセルローズで濾過し
た後、蒸発により濃縮して凍結乾燥した。

凍結乾燥して得られた物質の重量は１４１ｇで、約９ｇ
の水と１２７±５ｇのグリコサミングリカン（ヘキソサ
ミンのアッセイ）から成った。

ローリー法により蛋白質のアッセイを行った結果、次の
結果を得た。

−未精製のＳＧＡＧ抽出物：　ＢＳＡ当量３２％一凍結
乾燥物：　ＢＳＡ当量０．３５％ビウレット法を使った
アッセイの結果は、未精製の抽出物が２４％で凍結乾燥
物は検出可能な量（つまり０．５％以下）存在しなかっ
た。

丈息員ユ 上記と同じ工程を用いたが、キトサン溶液はｐＨが３．
５の酢酸中で得た。

又直逍ユ 実施例２と同じ工程を用いたが、酢酸の代りにｐ［Ｉ２
．８のギ酸を使った。

Ｘ立明１ 実施例１と同じ工程を用いたが、ＳＧＡＧとキトサン溶
液を純粋なギ酸を使って、ｐＨが２．８になるまで、酸
化した。

裏鳳員玉 工程は実施例４と同じであったが、ギ酸の代りにｐＩｌ
３．５の酢酸を使った。

Ｘ鳳遇玉 工程は実施例１に同じである。

沈澱物は１．５ｇの水に拡散し、懸濁液にｌｌｉ４ｇの
無水硫酸ナトリウムを激しく撹拌しながら加えた。

撹拌は２４時間継続し、得られた粘性の媒質を濾過した
。析出物を０．８ｋｇの水の中に拡散して２時間撹拌し
た後、懸濁液を遠心分離した。次に上澄み液を前回の上
澄み液と混合し、得られた溶液を５Ｎ水酸ナトリウム溶
液を使ってｐＨ７にした。脱ミネラル化した水を連続し
て透析した後、溶液を４０μｍのセルローズを使って濾
過した。その後に凍結乾燥して、精製したＳＧＡＧをＤ
１ｓｏｄｌｃの形態で得た。

第２回目の遠心分離で得た上記の析出物を２ｋｇの水の
中に懸濁し、ｐＨを５Ｎ水酸化ナトリウム溶液を使って
ｌ１にまであげた。２時間撹拌したのち、懸濁液を濾過
するか遠心分離して、残留物を脱ξネ・ラル化した水で
、流出水が中性になるまで洗浄した。

実ＩＵ生ヱ ５ｋｇのコンドロイチン４硫酸と６硫酸を、２００　ｋ
ｇの脱ミネラル化した水に溶解して得られた溶液を５Ｎ
塩酸を使ってｐＨを２にした。

溶液を、４５分間撹拌した後、２ｓ０００ｇで連続して
遠心分離にかけた。キトサン溶液を清澄な上澄液に沈澱
が完了するまで加えた。

キトサン溶液は、精製したキトサン２．５　ｋｇを、５
Ｎ塩酸を加えてｐＨを２に維持した脱ミネラル化した水
２５０　ｋｇに溶解して、調製した。

析出した媒質を１時間撹拌し、液相を錯体をデカンテー
シロンで分離したのちとり除いた。固体状残渣には、ｐ
Ｈ２の水１５Ｇ　ｋｇを加えて、混合物を１時間撹拌し
、２，ＯＯＯｇで連続して遠心分離にかけ、１５〜２０
ｋｇの粘稠性のかたまりを得た。そのかたまりを５０ｋ
ｇの水に激しく撹拌しながら拡散し、無水硫酸ナトリウ
ムを１．８ｋｇ加えた。懸濁液を４時間撹拌して、ｐＨ
が安定して１０になるまで６Ｎ水酸化ナトリウムの水溶
液を加えた。懸濁液を次に１８時間撹拌して、混合物を
ろ過した。残留物を１０ｋｇの水に再び懸濁し２時間撹
拌した。濾過ののち、濾液を併せて、５ＮＨｃｌを使っ
てｐｌｌを７にした。次に脱ミネラル化した水を使って
連続して透析した。

透析液は４０μｍのセルローズを使って濾液したのち凍
結乾燥した。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、硫酸グリコサミノグリカン（以下ＳＧＡＧと略記す
   る）を少なくとも１種と、特に蛋白質とペプチドなどの
   アミノ基を有する不純物からなる出発錯体溶液からＳＧ
   ＡＧを、水溶性ポリアミン、特にキトサンと錯化させる
   ことにより選択的に析出させて分離するプロセスにおい
   て、 −第１析出段階では、水溶性ポリアミンを出発錯体媒質
   と混合すると同時に、混合物のｐＨを遊離カルボキシル
   基と不純物とＳＧＡＧイオン解離電位（ポテンシャル）
   （ｐＫａ）より低い値に維持し、基本的にはＳＧＡＧと
   水溶性ポリアミン間で析出イオン高分子錯体を選択的に
   得、 −第２塩析段階では、析出物の懸濁媒質中において、Ｓ
   ＧＡＧを可溶化すると同時にポリアミンを不溶状態に維
   持し、該懸濁媒質は中和剤、ＳＧＡＧのイオン化カルボ
   キシル基、ポリアミンのイオン化アミン基と同時に含ん
   でおり、 水溶性ポリアミンは出発錯体媒質と析出物の懸濁媒質の
   両方に可溶であることを特徴とする硫酸グリコサミノグ
   リカンの分離プロセス ２、中和剤が、アルカリ性硫酸などの多価陰イオン塩で
   ある特許請求の範囲第１項に記載の硫酸グリコサミノグ
   リカンの分離プロセス ３、中和剤が、特に水酸化ナトリウム又は水酸化カリウ
   ムなどの、強塩基性無機物である特許請求の範囲第１項
   に記載の硫酸グリコサミノグリカンの分離プロセス ４、析出物懸濁媒質が塩基によりｐＨ８．５〜１１に維
   持されることを特徴とする特許請求の範囲第３項に記載
   の硫酸グリコサミノグリカンの分離プロセス ５、第２の塩析段階を２つのステップ、すなわち二価の
   塩を用いた第１の塩析と、アルカリ性塩析媒質を用いた
   第２のステップとして行うことを特徴とする特許請求の
   範囲第２及び３項に記載の硫酸グリコサミノグリカンの
   分離プロセス ６、ポリアミンが分子量５０ＫＤ以上、アセチル化度が
   ０から３０％であるキトサンである特許請求の範囲第１
   項に記載の硫酸グリコサミノグリカンの分離プロセス ７、第１の析出段階が ａ）出発錯体媒質の酸性化を行ってそのｐＨを１乃至４
   に保ち ｂ）ｐＨ１乃至４のポリアミンの酸性溶液を調製し、 ｃ）酸性化した錯体媒質とポリアミン酸性溶液を撹拌に
   より混合することからなる特許請求の範囲第１項に記載
   の硫酸グリコサミノグリカンの分離プロセス ８、第２段階で得たＳＧＡＧを酸または塩基で中和し、
   次いで中和塩を溶液から分離して精製ＳＧＡＧ分を回収
   することを特徴とする特許請求の範囲第１項に記載の硫
   酸グリコサミノグリカンの分離プロセス