JPS60500557A - 微生物学的試験方法および装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 微生物学的試験方法および装置 本発明は、微生物学的試験方法および装置に関する。

臨床検査の慣例として、微生物試験を行なってたとえば尿。

傷壽出物もしくは血液のような腐敗性臨床試料から単離された微生物のそれぞれ 有力な種々の抗微生物治療剤に対する感受性または耐性を確認することが現在知 られている。この目的は、臨床治療上の決定を行ないつる基準を与えることであ る。

被検患者からの試料微生物に対する被験抗微生物剤の最小阻止紫度を決定するだ めのＭＩＣ型の元来の抗生物質感受性試験は、一般に腐敗性（５ｅｐｔｉｃ　） 試料に初期培養を行なってＭＩＣ試験自身に対する接種物を調製し、次いでさら にＭＩＣ試験培地で培養することを必要とする。この種の後培養は、一般に】４ 〜工８時間、たとえば１晩行なわれる。

培養結果を与えると共Ｋ、試験する抗微生物物質に対する微生物の感受性を短時 間で知見するよう、感受性試験を行・う条件を変化させる試みも多数なされてい る。

このような試みを具体化した微生物試験の例は、米国特許第３．５０９，０２６ 　号（リットン・システムス・インコーポレーション社）、米国特許第４，２３ ６，２１１号（ピファイザー社）、米国特許第３，８３２，５３２号（ピファイ ザー社）、および英国特許第１，５５４，１３４号（ピファイザー社）各明細書 に記載されている。

本発明者等の経験によれば、１つの重大な欠点は、短時間（たとえば８時間未満 、時として４〜５時間のような短時間）ノ培養インキューベーションを用いてＭ ＩＣ試験を行なう試みに関連する。この欠点は、ペニシリンに対して耐性を示す 微生物にしばしば認められる。この種の微生物はβ−ラクタマーゼ酵紫を生成し て、ペニシリンを不活性型に変える。しかしながら、多くの場合、ペニシリンの 効果だけ全妨げるβ−ラクタマーゼ＃素の完全な作用は、培養時間の開始後数時 間で現われる。

この結果、微生物の望ましくは短時間培養インキュベーションに頼る微生物培養 試験は、Ｏニジリンに対する微生物の感受性が長期に亘るという誤まった薬観的 評価を与えうる。この問題は、％釦スタフィロコッカス・アウレウス（影玉呻ハ ９μ歴ａｕｒｅｎｓ　）の臨床分離物の場合に深刻となる。

微生物をそのβ−ラクタマーゼ酵素を生成する能力につき試験することが知られ ておシ、％に微生物の培養物をペニシリン自身に露呈させかつ生成されたベニシ ワ酸を検出することにより行なわれる。しかしながら、この種の方法は、抗生物 質感受性試験方法と組み合せて直接に実施するには適していない。

たとえば、産業上「イントララクタム（Ｉｎｔｒａｌａｃｔｕｎ　）　Ｊ試験（ 登録商標）として知られた従来の試験法は、希釈されていない微生物培養物を（ たとえば多数の微生物コロニーに接触したループを用いて）、ベニシロ酸と酸生 成に対し敏感に紫−黄の色変化する物質とを含浸させた湿潤紙片に塗抹しまたは 展延し、かつこの紙を数分間インキュベートすることからなっている。

本発明によれば、微生物学的試験法の便利な装置およびβ−ラクタマーゼ酵素の 生産体である微生物を切電すると同時に抗生物質感受性試験を行なう装置が提供 され、かくして短時間、（たとえば約５時間）の培養期間での抗微生物感受性試 験、並びにたとえば約１８時間の長時間培養期間での試験をより信頼性をもって 便利に使用することができる。

本発明による試験においては、微生物の希釈懸濁物を、たとえば標準設計の多数 のウェルを有するマイクロ測定板における過剰のペニシリンを含むマイクロ測定 ウェルのような適当な容器において、ｐｎ変化に対し殆んど緩衝されない（ｐｏ ｏとｌｙ　ｂｕｆｆｅｒｅｄ　）培地にて、螢光の変化により酸度の発現を示し うる物質の存在下に約１時間以上、たとえば、約１〜４時間、或いはそれより長 時間、たとえば約５時間、或いはたとえば約１８時間までのインキュ４−ジョン 時間にわたりインキュベートする。

使用するペニシリンの過剰量は、インキュベーショｙ期間中−に接種物中に存在 するβ−ラクタマーゼの作用により加水分解された場合、培地のｐＨを顕著に低 下させてベニシロ酸を生成しかつ指示薬の状態を検出可能に変化させうるような 量である。

好適には、０．１〜０．５Ｎ量−の程度のペニシリンの童を使用することができ る。同時に、過剰のペニシリンを使用しないことが重要である。さもないと、陰 性の培養物がペニシリンの自然加水分解、或いはその他の理由により偽陽性の結 果を与えうるがらである。

使用する培地はｐＨに対し殆んど緩衝能力を持たないように選択され、たとえば 水、ポリビニルアルコールの希釈水溶液もしくけペプトン培地または希釈燐酸塩 溶液とすることができる。必要とされまたは許容しうる緩衝の程度は、培養時間 が長くなる程大きくな衝能力が適しており、初期ｐＨはたとえば約９．２である 。この装置は、ラクタマーゼ生産体と非生産体とを５〜８時間の範囲の７ジ扁ゴ 間の後に区別することを可能にする。

便利な接種レベルは、たとえば１ｙ当り１０８個の微生物の程度である。従来の 試験に比較して本発明の利点の１つは、試験に使用する微生物懸濁物が抗生物質 感受性試験に対する接種物を形成すべく栄養ブロス中でさらに希釈さｔＬｆｃ懸 濁物からの試料でちゃ得、したがって２つの試験の主題が同一であることである 。本発明による試験の他の利点は、インキューベーションを同様に何回も（５１ ｍ１ｌａｒ　ｔｉｍｅｓ　）持続することができ、２つの試験の結果を一回で同 様な透視法または螢光光度法の手段で読み取りうろことである。

使用する指示薬は、たとえば酸性化の際に低レベルから高められ、或いは高レベ ルから低められる螢光を発する指示薬でよい。

極めて適する指示薬の例は、螢光クマリン誘導体、たとえば４−メテルーウンベ リノフエロンであり、その螢光は酸性化によるｐＨの低下と共に低下する。

指示薬のｐＫａは、培養の出発りＨよりも過度に高くないことが重要である。こ の出発ｐＨは便利には７−８の範囲または９．５までの範囲、たとえば約９．２ とすることができ、指示薬のｐＫａは好ましくは６．５−＆５の範囲である。４ −メチル−ラン４１フフエロンのｐＫａは７．９である。

好ましくは、試験結果は螢光光度法で読み取られる。これによれば結果は段階的 に与えられ、強力なβ−ラクタマーゼ産生体と弱いβ−ラクタマーゼ産生体とを 区別することができる。

試験をたとえば下記する方法で行なう場合、インキュベーションに際し４−メチ ル−ウンベリフェロンの螢光を顕著に低下させる試料を、恐らくβ−ラクタマー ゼ生産体と見做すことができる。

本発明によれば、ここに記載した試験を行なうための装置は、明らかな緩衝能力 を示しうる物質の非存在下に螢光の変化により酸性度の発現を検出指示しうる物 質とを含有する。

これらの物質は極めて便利には乾燥した安定型で存在させることができ、たとえ ば容器の内表面に付着する乾燥膜に混入させることができ、たとえばポリビニル アルコールのような「非緩衝性」のフィルム形成性安定化剤からなっている。適 する安定化法は、たとえば英国特許第１，５７４，７０７号（ユニリバー社）に 記載されている。

便利には、試験用の容器はマイクロ測定トレイのウェルであり得る。一般的に使 用されるこの種のトレイは、一般に約０．３ルに約５０μノのインキュベーショ ン物質を含ませて、これらを本発明の試験に便利に使用することができる。

成る種の便利な具体例において、本発明による装置は、安定化剤とペニシリンと 指示薬とを含有する個々の（たとえば複数の）マイクロ測定ウェルとしての試験 容器からなり、このマイクロ測定トレイにおいて残余のウェルはたとえばそれ自 体公知の方法でＭＩＣ試験用に準備される。或いは、指示薬を乾燥板から除外し て、接種物と共に加えることもできる。

さらに、これら具体例において、本発明は、β−ラクタマーゼを産生ずる性質の 存在および／または程度につき微生物全試験すると共に同じ微生物の抗生物質感 受性をも試験する方法を提供し、この方法は（ａｌ微生物培養物を希釈して懸濁 物を作り、その１部を上記の方法でβ−ラクタマーゼ産生につき試験し、かつ（ ｂ）懸濁物の他の一部全栄養ブロス中で希釈して接種物を作り、これを使用して 微生物の抗生物質感受性試験を行なうことからなっている。

好ましくは、同じ指示薬法を使用して、両試験の結果を読み取る。たとえば、β −ラクタマーゼ産生は適当な螢光材料（たとえば上記４−メテルーウンイｌＪフ エロン）の螢光光度法により測定することができ、かつ微生物の増殖はたとえば ４−メチル−ウンベリフェロンおよび／またば７−アミン−４−メチルクマリン のような適当な同様の螢光物質の螢光光度法により測定することができ、前記螢 光物質は、微生物の増殖に際したとえば燐酸塩、ノナノエートまたはアラニンエ ステルもしくはペプチドのような対応の加水分解しうる螢光性酵素基質の加水分 解により放出される。

以下、実施例により本発明を説明する。

実施例　１ ２０４．８ＷのペニシリンＧナトリウム塩と３．５２■の４−メチル−ウンベリ フェロンとを含有する無菌の０．５％ポリビニルアルコール溶液１００ゴを調製 し、そしてこれ全英国特許第１．５７４，７０７号の方法によ、！５ＭＩＣ試験 用として作成したマイクロ測定トレイ中の０，５コのプラスチックマイクロ測定 ウェルに２５μｊの量で施こして、安定化乾燥物金得た。

３種の未同定臨床単離微生物の懸濁物音それぞれ別個に特性化した後に、比較の ための慣用方法によりβ−ラクタマーゼの非生産体、弱生産体および強生産体と してそれぞれ得た。非生産体は、非−β−ラクタマーゼ生産性のスタフィロコッ カス・アウレウス（オックスフォード）の一般公知の実験比較菌株と同じである と思われた。

各微生物全１ゴ当り約１０８個の菌体密度にペプトン培地中で懸濁接種物に形成 した。３種の接種物のそれぞれ５０μｉ−１上記のように作成した各マイクロ測 定ウェルに接種し、そして３７℃で４時間培養した。

試験ウェルにおける接種混合物の初期螢光光度値（Ｆｏ）および４時間インキュ ベーション後の螢光光度値（Ｆ４）は次の通りであった。

Ｆｏ　Ｆ４ β−ラクタマーゼ非生産体　２５００　２５００〃　弱生産体　２５００　１８ ００ 〃　強生産体　２５００　８５０ 試験結果は、β−ラクタマーゼの生産体と非生産体との間に良好な差を与えるこ とが判った。

これらの試験に加えて、同じ微生物で抗生物質感受性試験を行なった。この目的 で、各懸濁物の他の部分をさらに栄養プロこのブロスは微生物の増殖に際し加水 分解しうる螢光物質全含有し、この場合４−メチル−ウンベリフェロン燐酸塩、 対応するノナノエートおよび７−アミノル４−メチルクマリンのＬ−アラニル− ペプチドのそれぞれ１００〜１２０μモル濃度を含有し、接種ブロス懸濁物を作 成するのに使用した容器またはクロージャ（たとえばプラスチック蓋）の表面、 或い扛固体の非多孔質表面（たとえば挿入体）に対したとえばポリビニルアルコ ールのような安定化剤と共に前記３種を全て乾燥安定化フィルムとして乾燥させ た。ブロス懸濁物上、標準技術により適当量の抗生物質を含有する乾燥安定化フ ィルムで作成したＭＩＣ板のウェルに入れた。

次いで、ＭＩＣウェルとβ−ラクタマーゼ試験ウェルと’に含む全マイクロ測定 板を４時間インキュベートし、そして結果（増殖／非増殖またはラクタマーゼ／ 弱ラクタマーゼもしぐはラクタマーゼなし）をａ６３ｎｍ（励起）および４５０ ｎｍ（検出）にて操作する螢光光度計を用いる螢光光度法により測定し、こノ螢 光光度計にＦｉｏ〜３乃至１４μモルの範囲の４−メチル−ウンベリフェロン螢 光物質の濃度に対応する螢光値全読み取るべく公知方法で較正しかつパック−オ フしたフォトマルチプライヤ−検出器を配置した。

実施例　２ 実施例１におけると同様に２５μｌの量で施こすべきペニシリン含有の螢光ラク タマーゼ指示薬組成物は、５２７！のポリビニルアルコールと１４０■／ｌの４ −メチル−ウンベリフェロンと２２／ｌのペニシリンＧと０．１％の市販の微生 物用ペプトンと４ミリモルの燐酸二ナトリウムとを含有した。

指示薬を実施例１に関し記載したと同様に施こしかつ使用した場合、ラクタマー ゼ陽性およびラクタマーゼ隘性の微生物接種物の区別に関し満足しうる結果が、 ウェル中での５時間または１８時間のインキュベーション後に得られた。

実施例　３ 他のペニシリン含有螢光ラクタマーゼ指示薬組成物は、０．２７モルの塩化ナト リウムと１．５２／ｌのペニシリンＧ　（！：　Ｏ−４５ｙ／１の燐酸二ナトリ ウムと４０■／ｌの４−メチル−ウンベリフェロンとを含有し、必要に応じ上記 の如きポリビニルアルコールを含有した。出発ｐＨは９．２に調整した。

実施例１に関して記載したように施こしかつ使用した場合、実施例１および２の 場合と同様な結果が得られた。

上記の説明から当業者には本発明につき多くの変更をなしうろことが明らかであ ジ、上記幾つかの特徴の組み合せは全て本発明の下記請求の範囲内に＠まれるこ とか判るであろう。

国際調査報告

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １．試験する微生物音ペニシリンおよび酸−塩基指示薬と共にインキュベートす ることからなる、β−ラクタマーゼ酵素（ペニシリナーゼ）の生産体である微生 物を同定する微生物学的試験法であって、好ましくは１４当ｒ）　１０８ｍの微 生物を含有する微生物の水性懸濁物ｔ、ｐＨ変化に対し殆んど緩衝されない試験 培地を含む容器内で、螢光の変化により酸性度の発現を示しうる指示薬物質の存 在下に、一般に約１時間を越えるインキュベーション時間、たとえば１〜４時間 もしくは約５時間または約１８時間にわたりインキュベートすることにより試験 を行なうこと全特徴とする微生物学的試験法。 ２、ペニシリンの加水分解で微生物により産生される酸の存在下で螢光の減少を 示す螢光物質を存在させて試験を行なうことを特徴とする請求の範囲第１項記載 の方法。 ３、螢光物質が螢光クマリン誘導体、たとえば４−メチル−ウンベリフェロンで あること全特徴とする請求の範囲第２項記載の方法。 ４、培地の緩衝度が、約５〜１８時間のインキュベーション時間後にラクタマー ゼ陽性および陰性微生物の区別全可能にするのに足る低さであることを特徴とす る請求の範囲第１項、第２項または第３項記載の方法。 ５、試験培地が、約１〜５ミリモルの燐酸塩濃度に相当する緩衝能力および初期 ｐＨ約９，２全有すること全特徴とする請求の範囲第４項記載の方法。 ６、被験懸濁物の微生物を、培養試験にかけて、β−ラクタマーゼに対する試験 に使用する時間と同じ時間にわたり、その抗生物質感受性を測定することを特徴 とする請求の範囲第１項乃至第５項のいずれかに記載の方法。 ７、試験をマイクロ測定板のウェルで行ない、残余のウェル全回じ微生物の抗生 物質感受性試験全行なう念めに使用し、かつ両試験に対する微生物を互いにその 同一性を確保すべく共通の懸濁物から採取すること全特徴とする請求の範囲第１ 項乃至第５項のいずれかに記載の方法。 ８、ペニシリンを有するキャリヤと酸−塩基指示薬とからなる、β−ラクタマー ゼ酵素（ペニシリナーゼ〕の生産体である微生物を同定するための微生物学的試 験装置において、この試験装置は試験すべき微生物の懸濁物を含む容器を備え、 この容器中にはｐＨ変化に対し殆んど緩衝されない試験培地に対する試薬を乾燥 状態で含み、かつペニシリンと螢光変化により酸性度の発現上水しうる指示薬と を、約１時間以上のインキュベーション時間、たとえば１〜４時間もしくは約５ 時間または約１８時間までのインキュベーション時間のｉＫラクタマーゼ生量産 体よび非生産体の区別を可能にするのに充分な量で含むことを特徴とする微生物 学的試験装置。 ９、請求の範囲第２項乃至第７項記載の１つもしくはそれ以上の％機上さらに有 する請求の範囲第８項記載の微生物学的試験装置。 １０、上記説明および実施例における幾つかの特徴の１つもしくはそれ以上を有 する請求の範囲第１項および第８項記載の微生物学的試験法および装置。